JP2000515511A - 毛包乳頭のアポトーシスによる毛の成長および毛の色素沈着を変える方法ならびにそのための組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、セリンプロテアーゼ、ならびに毛包乳頭においてプログラムされた細胞死およびアポトーシスを誘導するそれらの能力を利用して、哺乳類の毛の成長および毛の色素沈着における変化に影響を及ぼす。トリプシン分子の一部に類似の構造の一部をもつ作用物質を有して、前記作用物質にトリプシンと同一の様式でプログラムされた細胞死およびアポトーシスを誘導させる組成物もまた記述される。

Description

【発明の詳細な説明】 毛包乳頭のアポトーシスによる毛の成長および毛の色素沈着を変える方法ならび にそのための組成物 関連出願の交差引用 本出願は、1996年７月12日に申請された米国仮出願第60/021,829号の利益を請 求し、これはそっくりそのまま引用により組み込まれる。 発明の分野 本発明は、毛包乳頭(follicular papillae)においてプログラムされた細胞死 およびアポトーシスをもたらす方法ならびにそれに有効な組成物に関する。より 具体的には、本発明は、プロテアーゼ、もしくはレセプター仲介性シグナル伝達 経路に影響を及ぼす分子のいずれかの局所適用により毛の成長および毛の色素沈 着の速度を変える方法に向けられる。 発明の背景 哺乳類の毛の一主要機能は環境保護を提供することである。しかしながら、そ の機能はヒトではたいてい喪失されており、ヒトでは毛は本質的に美容の目的上 保たれもしくは除去される。 剃ること、電気分解、抜くこと、および治療的抗男性ホルモンの注入を包含す る多くの処置が、不必要な毛を除去するのに使用される。これらの慣習的方法は それらの欠点なしでない。例えば、剃ることは、皮膚表面の切断および裂傷をも たらすことがあり、毛の再生速度の増大の知覚を残すことがあり、そしてまた望 ましくない切り株状物(stubble)を残すこともある。電気分解は延長期間領域を 不必要な毛がなく保ちうる一方、この方法はしばしば高価かつ痛く、そして瘢痕 形成をさらにもたらしうる。抜くことは痛みおよび不快を生じうるのみならず、 しかしそ れはしばしば短い毛の不十分な除去をもたらす。筋肉に対する影響のようないく つかの所望されない副作用が抗男性ホルモンの使用にしばしば付随する。さらに 、電気分解を除いて、これらの方法の全てはしばしば毎日反復されなければなら ず、使用者にとって不便を創製する。これらの理由から、毛の成長を遅延させる 化学的方法が必要とされる。 アールワリア(Ahluwalia)らにより米国特許第5,455,234号で開示されたように 、哺乳類の毛の成長は皮膚にシステイン経路の酵素阻害剤を適用することにより 変えることができ、これはシステインが関連する毛の成長の速度および特徴に関 して代謝経路を遅延もしくは停止させうる。しかしながら、システインのこの阻 害は処理された領域でのこのアミノ酸の不足もまた引き起こす。同様に、アール ワリア(Ahluwalia)による米国特許第5,095,007号、アールワリア(Ahluwalia)ら による米国特許第5,096,911号および同第5,468,476号、ならびにシャンダー(Sha nder)らによる米国特許第5,132,293号および同第5,143,925号においては、酵素 阻害剤が毛の成長を変えるために利用される。これらの場合のそれぞれにおいて は、生化学的経路が、最終生成物の産生を阻害するように変えられた。 使用者から必要とされるアミノ酸を奪わない、もしくは使用者の望まない副作 用を引き起こさない、毛の成長および毛の色素沈着に化学的に影響を及ぼす方法 を提供することが望ましいであろう。 発明の要約 本発明に従えば、われわれは、 休止期の毛の成長の誘導に関して十分な時間内にプロテアーゼを含む局所的に 活性な組成物の有効量を哺乳動物の皮膚に局所的に適用するこ と、 を含んで成る、これから本質的に成る、もしくはこれから成る、哺乳類の毛の成 長および毛の色素沈着における変化に影響を及ぼす方法を見出した。 本発明の別の態様において、われわれは、 トリプシンの三次元構造の第二部分に形状が類似している第一部分を有する局 所的に活性な作用物質であって、それにより第一部分および第二部分の双方がレ セプター仲介性シグナル伝達を可能にする作用物質を哺乳動物の皮膚に局所的に 適用することを含んで成る、これから本質的に成る、もしくはこれから成る、毛 包乳頭内でプログラムされた細胞死およびアポトーシスを誘導する方法を見出し た。 本発明の別の態様において、われわれは、 ａ）トリプシンの三次元構造の第二部分に形状が類似している第一部分を有す る局所的に活性の作用物質であって、それにより第一部分および第二部分が双方 がレセプター仲介性シグナル伝達を可能にする作用物質；ならびに ｂ）製薬学的にもしくは化粧用に許容できるベヒクル、 を含んで成る、これらから本質的に成る、もしくはこれらから成る、組成物を見 出した。 本発明のなお別の態様において、われわれは ａ）毛包乳頭のアポトーシスを誘導することが可能なプロテアーゼを含む局所 的に活性な作用物質；および ｂ）製薬学的にもしくは化粧用に許容できるベヒクル、 を含んで成る、これらから本質的に成る、もしくはこれらから成る、組 成物を見出した。 本発明の組成物および方法は、毛包乳頭のアポトーシスを誘導することにより 毛の成長および毛の色素沈着を遅延させる独特の都合のよい手段を提供する。 図面の簡単な説明 本特許出願書類はカラーで製作された最低１個の図面を含有する。カラーの図 面（１個もしくは複数）を伴う本特許のコピーは、要求および必要な手数料の支 払いに際して、米国特許商標庁(Patent and Trademark Office)により提供され うる。 引用が本発明の以下の詳述された記述および付随する図面になされる場合に、 本発明はより完全に理解することができ、また、さらなる利点を明らかにするこ とができる。図面において、 図１（ａ）および１（ｃ）は、蛍光トリプシンで標識された未処理のＣ５７Ｂ Ｌ／６マウスの皮膚の断面を図解する表示である。図１（ｂ）は、蛍光トリプシ ンで標識されたマウスのトリプシンでの局所処理後12日のＣ５７ＢＬ／６マウス の皮膚の断面を図解する表示である。 図２はＣ５７ＢＬ／６マウスの皮膚の背面図のカラー表示であり、このいくつ かは、毛の成長の誘導直後にベヒクルもしくはトリプシン（１％）で処理され、 （ａ）毛の成長の誘導後８日；（ｂ）毛の成長の誘導後11日；および（ｃ）毛の 成長の誘導後14日にとられた。図２（ａ）において、左のマウスは処理された一 方、右のマウスは処理されなかった。図２（ｂ）および２（ｃ）において、左の マウスは処理されず、中央のマウスはベヒクルで処理され、そして右のマウスは トリプシンで処理された。 図３Ａは、毛の誘導後（ａ）４日；（ｂ）５日；（ｃ）８日；および（ｄ）12 日の未処理のマウスの皮膚の毛包の組織学的に図解する表示である。図３Ｂは、 毛の誘導後（ａ）４日；（ｂ）５日；（ｃ）６日；（ｄ、ｅ）８日；および（ｆ ）12日のトリプシン処理されたマウスの皮膚の毛包の組織学的に図解する表示で ある。 図４（Ａ）は、毛の誘導後（ａ）１日；（ｂ）２日；および（ｃ）３日の未処 理のマウスのＴＵＮＥＬ染色された皮膚組織の断面を図解する表示である。図４ （Ｂ）は、毛の誘導後（ａ）１日；（ｂ）２日；（ｃ）３日；（ｄ）４日；（ｅ ）５日（（ａ−ｅ）は単回トリプシン適用であった）；および（ｆ）毛の誘導後 ８日（連日のトリプシン適用）のトリプシン処理されたマウスのＴＵＮＥＬ染色 された皮膚組織の断面を図解する表示である。 図５は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）により検出される ような遅延された毛周期の間のトリプシン処理されたマウスの皮膚および未処理 のマウスの皮膚の遺伝子発現の特徴を図解する表示である。図５（Ａ）は遅延さ れた毛周期の第１から11日までのｍＲＮＡレベルを図解する。図５（Ｂ）は遅延 された毛の成長の周期の第８日のｍＲＮＡレベルを図解する。25ng（Ａ）および 250ng（Ｂ）の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物が示される。 発明の詳細な記述 本明細書で使用されるところの「哺乳動物」は、ウェブスター医学机上辞典(W ebster's Medical Desk Dictionary)４０７（1986）に定義されるように「哺乳 類を含む高等脊椎動物の」いずれかの構成員を意味し、また、ヒトを包含するが しかしこれに制限されない。本明細書で使用さ れるところの「（％、ｗ／ｖ）」は、組成物全体の100mlあたりの与えられた成 分のグラム数を意味する。本明細書で使用されるところの「レセプター」は細胞 内および細胞外双方のレセプターを包含し、また、シグナルを受領しかつ伝達す ることが可能な分子を意味する。 本発明の組成物での使用に適する局所的に活性な作用物質は、プロテアーゼ、 トリプシンの三次元構造の一部に本質的に類似の構造を有する化合物、もしくは それらの混合物を包含する。 好ましいプロテアーゼは、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ−Ｙ、プロテ アーゼIV、ズブチリシン、もしくはそれらの混合物を包含するがしかしこれらに 制限されないセリンプロテアーゼである。選択すべきプロテアーゼはトリプシン である。この理論により拘束されることを望まないが、われわれは、毛の成長お よび毛の色素沈着を遅延させることが可能なプロテアーゼは、毛包乳頭内でのプ ログラムされた細胞死およびアポトーシスの誘導を介して毛の成長の周期を変え ることにより、また、この変化はレセプター仲介性シグナル伝達により誘導され るようであると考える。好ましくは、プロテアーゼは、本発明の組成物の総量を 基礎として、約０％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）まで、そしてより好ましく は約0.01％（ｗ／ｖ）から約１％（ｗ／ｖ）までの量で存在する。 本明細書の実施例１０により例証されるように、われわれは、プロテアーゼの タンパク質分解活性がプログラムされた細胞死の誘導に寄与する唯一の因子でな いことを予期せずに見出した。いかなる理論によっても拘束されることを望まな いとは言え、われわれは、レセプター仲介性のシグナル伝達事象もまた毛包乳頭 のプログラムされた細胞死の誘導に寄与し、また、この型の作用物質は局所的に 活性の作用物質の構造成分 に関連しうるとさらに考える。 従って、第二の適する局所的に活性の作用物質は、このレセプター仲介性シグ ナル伝達に影響を及ぼすトリプシン分子の三次元構造の部分（１個もしくは複数 ）に形状が本質的に類似している部分を保有する化合物を包含する。本明細書で 使用されるところの「形状が本質的に類似の」は、それらの化合物が、レセプタ ーを占有しうる、レセプターからリガンドを置き換えうる、もしくはタンパク質 分解性の切断によりレセプターを活性化もしくは不活性化しうるかのいずれかの リガンドのように挙動する十分な量の構造を包含し、そしてそれによりプログラ ムされた細胞死の誘導に寄与しうることを意味する。三次元のトリプシンの一部 の構造に形状が本質的に類似である部分を保有する化合物の例はタンパク質分解 的に不活性なトリプシンを包含するがしかしこれに制限されず、これはコラーゲ ンのようなタンパク質を分解することが不可能であるトリプシンの一形態である 。好ましくは、これらの化合物は、組成物の総量を基礎として、約０％（ｗ／ｖ ）から約５％（ｗ／ｖ）まで、そして最も好ましくは約0.01％（ｗ／ｖ）から約 １％（ｗ／ｖ）までの量で、本発明の組成物中に存在する。 局所的に活性の製薬学的もしくは化粧用作用物質の送達パラメータがそのよう に必要とする場合、本発明の局所的に活性な組成物は、好ましくは、毛包中への 局所的に活性な作用物質の浸透を可能にする送達システムとして機能することが 可能な製薬学的にもしくは化粧用に許容できるベヒクルをさらに含んでいてもよ い。この場合は毛包である適切な皮膚の付属物にプロテアーゼを送達させるため のいかなる商業的に入手可能なベヒクルも製薬学的にもしくは化粧用に許容でき るベヒクルとして の使用に適するが、リポソームが好ましい。リポソームはより好ましくは非イオ ン性であり、また、ａ）グリセロールジラウレートもしくはグリセロールジステ アレート；ｂ）コレステロールで見出されるステロイド骨格を有する化合物；お よびｃ）約12個から約18個までの炭素原子を有する脂肪酸エーテルから成り、こ こでリポソームの構成化合物はそれぞれ約53：10：22ないし約63：20：32、そし て好ましくは約55：12：24から約61：18：30までの比にある。グリセロールジラ ウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテルか ら成るリポソーム（ＧＤＬ）が最も好ましい。好ましくは、リポソームは、組成 物の総量を基礎として、約10mg/mLから約100mg/mLまで、そしてより好ましくは 約25mg/mLから約50mg/mLまでの量で存在する。約58：15：27の比が最も好ましい 。適するリポソームは、好ましくは、実施例２に述べられるプロトコールに従っ て調製されうるが、当該技術分野で普遍的に使用される他の方法もまた許容でき る。 上述された組成物は、適する容器中で所望の成分を組み合わせ、そして、そっ くりそのまま本明細書に引用により組み込まれるニエミエク(Niemiec)ら、"Infl uence of Nonionic Liposomal Composition On Topical Delivery of Peptide D rugs Into Pilosebacious Units:An In Vivo Study Using the Hamster Ear Mod el"、12 Pharm．Res．1184-88(1995)（「ニエミエク(Niemiec)」）に開示される もののような非イオン性リポソーム調製法について当該技術分野で公知のいずれ かの慣習的な高剪断混合手段において周囲環境下でそれら混合することにより調 製されうる。 好ましい態様において、局所的に活性の製薬学的もしくは化粧用組成 物のｐＨは、例えば商品名「ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）」でライフ テクノロジーズ (Life Technologies)から入手可能なＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ ’−２−エタンスルホン酸、もしくは例えば商品名「トリス（Ｔｒｉｓ）」でラ イフ テクノロジーズ(Life Technologies)から入手可能な（ヒドロキシメチル ）アミノメタン、クエン酸、およびそれらの混合物を包含するがしかしこれらに 制限されない既知のｐＨ調整剤で調製されて最終組成物で約２から約８までのｐ Ｈを生じうる。 代替の態様において、局所的に活性の製薬学的もしくは化粧用組成物は、場合 によっては、非独占的にシェービングクリーム、シェービングジェル、シェービ ングパウダー、化学的除毛クリームなどのような化粧用もしくは製薬学的製品を 生産するために、リポソーム構造を破壊しないことができる量で保湿剤、起泡剤 、化粧用補助物質、抗酸化剤、界面活性剤、起泡剤、コンディショナー、湿潤剤 、香料、粘性化剤(viscosifier)、緩衝剤、保存剤などのような他の材料と組み 合わされうる。 本発明の別の態様において、われわれは、毛の成長の誘導の時間ころに動物の 皮膚の表面に局所的に活性の製薬学的もしくは化粧用組成物を適用することから 成る、哺乳類の毛の成長および毛の色素沈着における変化に影響を及ぼす方法を 見出した。 休止期の毛包からの毛の成長の誘導は、剃ること、ワックス除毛、化学的除毛 およびそれらの組み合わせを包含するがしかしこれらに制限されない、当該技術 分野で公知のいずれかの方法により実施され得る。 局所的に活性の製薬学的もしくは化粧用組成物が皮膚に適用される時間、なら びに、組成物が皮膚上に残存する時間の量は変動しうるとは言え、当業者は、過 度の実験なしに、局所的に活性の組成物が、好ましく は休止期状態からの毛の成長の誘導の直前、直後もしくはこれと同時にのいずれ かに皮膚表面に適用されることを容易に認識するとみられる。本明細書で使用さ れるところの「直(immediately)」は約１時間の期間内と定義される。より好ま しくは、局所的に活性の製薬学的もしくは化粧用組成物は、毛の成長の誘導と同 時もしくはその直後のいずれかに適用され、そして毛の成長を遅延させるのに十 分な期間皮膚上に残され、これは好ましくは最低約５分であり、また、より好ま しくは適用の時間後最低約15分である。 局所的に活性な製薬学的もしくは化粧用組成物は、哺乳類の毛の成長および毛 の色素沈着における変化に影響を及ぼすのに有効な量で適用されるべきである。 本明細書で使用されるところの「有効な量」は、毛の成長および毛の色素沈着で の遅延が所望される皮膚表面の領域を覆うのに十分な量を意味する。好ましくは 、組成物は、毛の成長および毛の色素沈着での遅延が所望される場合に、皮膚表 面の平方センチメートルを基礎として約２μｌ/cm²から約８μｌ/cm²までの局所 的に活性な作用物質が存在するように皮膚表面に適用される。 われわれは、予期せずに、セリンプロテアーゼのような局所的に活性な作用物 質が毛の成長の誘導の時間ころに動物の皮膚に局所的に適用される場合、最低約 ９日の毛の成長および毛の色素沈着での有意の遅延が達成されたことを見出した 。われわれは、ヒトについての毛の成長の周期はマウスについてのものよりしば しばより遅いため、ヒトでの毛の成長の遅延は９日よりかなり長くなるとみられ ることがさらにありそうだとさらに考える。 本明細書に具体的に説明して開示される本発明は、本明細書に明確に 開示されないいずれかの成分、材料もしくは段階の非存在下で適して実施されう る。いくつかの実施例が、本発明の性質およびそれを実施する様式をさらに具体 的に説明するために下に述べられる。しかしながら、本発明はその詳細に制限さ れると考慮されるべきでない。 実施例 実施例１：マウスの系での試験対象の除毛 ６〜10週齢でありかつそれらのそれぞれの毛周期の休止期（休止期(telogen) ）にあった、チャールズリバー(Charles River)（ニューヨーク州キングストン ）から得られた12匹のＣ５７ＢＬ／６の雌性マウスの毛の成長を、シュテン(Ste nn)ら、"Glucocorticoid Effect on Hair Growth Initiation:A Reconsideratio n"、6 Skin Pharmacol.、125-134(1993)に述べられた処置に従って、各それぞれ の動物の背部の毛のワックス除毛（抜毛）により誘導した。マウスで公知のよう に、成長期（成長期(anagen)）は除毛の時点で全ての毛包で同時に開始する。 表１に具体的に説明されるように、以下の観察結果が誘導部位で認められた。表１：誘導部位での観察結果 表１に示されるように、毛の成長は、除毛後数日で、動物のピンク色の皮膚が暗 くなり始めた際に見えた。これは毛幹における毛の色素沈着によるとみられる。 なぜなら、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、毛包にのみ黒色細胞を含有しそして表皮に は含有しなかったからである。 12匹の類似のＣ５７ＢＬ／６マウスの休止期からの毛の成長を、各マウスの背 部を濡らすのに十分な量の、商品名「ネア（Ｎａｉｒ）」でカーター ウォーレ ス インコーポレーテッド(Carter-Wallace，Incorporated)から入手可能な除毛 剤での化学的除毛によってもまた誘導した。化学的除毛においては、毛包の下部 分は無傷のままであり、また、前の周期の毛幹の下部分も、新たに成長された毛 により押し出されるまで真皮中で無傷のままであった。新たな毛周期の成長パタ ーンは表１に記述されたものに同一であった。 マウスの毛周期は種の間のみならず、しかし個々の動物の間でもまた変動する ため、２cm×１cmの皮膚サンプルを鋏で各マウスから単離し、スティーヴンス サイエティフィク(Stephens Scientific)から入手可能な、25℃で約6.9〜7.1の ｐＨを有する10％緩衝ホルマリン溶液で固定し、そしてその後公知の手順に従っ てパラフィンブロックに作り上げた。このブロックをその後ミクロトーム処理し (microtomed)、Ｈ＆Ｅ染色で染色し、そして、当該技術分野で公知の処置を使用 して毛周期の相を確かめるために組織学的に検査した。本実施例から得られた組 織学的表示を図３Ａに具体的に説明する。 本実施例は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスについての毛の成長の周期が平均で約25日 になることを示し、また、除毛に使用された方法に関係なく毛包および毛幹の発 達の類似の時機(timing)を報告する。 実施例２：局所的に活性の組成物の調製 十分な量の凍結乾燥された、シグマ アルドリッチ コーポレーション(Sigma -Aldrich Corporation)から入手可能なトリプシンを、生じる溶液のｐＨが約7.4 でありかつ溶液中のトリプシン濃度が約２％（ｗ／ｖ）であったように、商品名 「ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）」でライフ テクノロジーズ(Life Technologies)から 入手可能な0.05MのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンス ルホン酸の緩衝水性溶液に混合した。１体積の生じるトリプシン溶液を、その後 、生じる局所的に活性の組成物中のトリプシンの１％（ｗ／ｖ）濃度を生じるた めに、ニエミエク(Niemiec)に記述された方法により調製した水ベヒクル中の（ ５％）グリセロールジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０ −ステアリルエーテルリポソーム１体積と混合した。 実施例３：毛包へのトリプシンの送達 チャールズ リバー(Charles River)（ニューヨーク州キングストン）から入 手可能な、４匹のＣ５７ＢＬ／６の雌性の７ないし８週齢のマウスの皮膚表面の 約６cm×２cmの区分から毛を抜いた12日後、約100μＬ／マウスの実施例２の局 所的に活性の組成物をそこに適用した。本実施例で使用されたトリプシンは、そ の付随するプロトコール(1997)に従い、かつ、モレキュラー プローブス イン ク(Molecular Probes，Inc.)から入手可能なフルオレセインイソチオシアネート （ＦＩＴＣ）蛍光ラベルを使用して、またモレキュラー プローブス インク(M olecular Probes，Inc.)から入手可能なフルオレポーター(FluoReporter)タンパ ク質標識キットで蛍光的に標識した。 蛍光トリプシン処理の適用後１および４時間に、各マウスの皮膚表面の２cm× １cmのサンプルを単離し、そしてパラフィンブロックを作り上げ、これをその後 ミクロトーム処理し、そして実施例１に述べられた手順に従って組織学的に検査 した。 図１に示されるように、ほぼ全ての蛍光標識が毛包内で見出された。マウスを 、１時間（図１（ｃ））間隔で検査し、そして４時間（図１（ａ））間隔は、後 の時間点で付加的な皮膚浸透を伴わずに同一の組織学的染色パターンを表した。 この観察結果は、プロテアーゼによる可能な非特異的細胞外マトリックス分解に 対抗することを示唆し、これはおそらく後の時間点での角質層中への蛍光染色の より深い浸透を示すことができた。 本実施例を、４匹の類似のＣ５７ＢＬ／６の雌性の７ないし８週齢のマウスで 、しかしマウスを実施例２の１％（ｗ／ｖ）トリプシン処理を 用いてもまた誘導後12日間毎日処理したことを除いて反復した。誘導後12日目の 蛍光トリプシン処理の適用４時間後に、マウスの皮膚を類似の組織学的方法を使 用して分析した。図１ｂに具体的に説明されたように、処理された皮膚の毛包へ のトリプシンの送達経路においては大きな変化は観察されなかった。しかしなが ら、トリプシン処理された皮膚の角質層の外側部分での最小の染色は障壁の完全 性の若干の喪失を示した。 本実施例は、成長期の動物の皮膚表面へのトリプシンを含有する局所的に活性 な組成物の適用が、短期および長期双方の使用後に主として毛包へのトリプシン の送達をもたらしたことを示す。 実施例４：トリプシンは毛の成長および毛の色素沈着を遅延させる 実施例２で調製された局所的に活性な組成物の単回局所適用を、実施例３に述 べられた方法に従った毛の成長の誘導直後の12匹のＣ５７ＢＬ／６の雌性の７な いし８週齢のマウスに適用した。 図２に示されるように、毛の成長の誘導後に適用されたトリプシンの単回適用 は毛の成長および毛の色素沈着の双方を遅延させた。より暗い皮膚の色は毛周期 のより前進的な段階を示し、これは毛幹の可視前である。未処理のおよびリポソ ーム（ベヒクル）処理された対照は毛の成長の誘導後７〜８日に暗い皮膚を表し た（図２ａ；左は処理されそして右は処理されない）一方、それらの毛幹は11〜 13日に見えた（図２ｂ；左は処理されず；中央はベヒクルであり；右は処理され ている）。対照的に、トリプシン処理された動物は第８日までピンク色のままで あり（図２ａ；左のマウス）；第11日にわずかにより暗いピンク色であり（図２ ｂ：右のマウス）；そして第14日までに灰色の皮膚を表した（図２ｃ；右のマウ ス）。トリプシン処理された動物の毛幹は最初、第15ないし17 日に見えたとは言え、これらの毛幹は低下された質のものであり、また、対照と 同じほど太くなかったが；しかしながら、追加の約４ないし７日以内に、これら の毛幹は、長さを除いた全ての特徴が対照でのものとほとんど区別できなかった 。 本実施例は、トリプシンが毛の成長および毛の色素沈着の双方の遅延に有効で あったことを示す。 実施例５：トリプシン処理された毛包の組織学 実施例２で調製されたような単回の局所的に活性な組成物を、実施例３で述べ られた方法に従った毛の誘導後の３匹のＣ５７ＢＬ／６の雌性の７ないし８週齢 のマウスの皮膚表面に適用した。 未処理、ベヒクル処理された（示されない）およびトリプシン処理されたマウ スの皮膚の１cm×２cmのサンプルを得、Ｈ＆Ｅ染色し、その後実施例１に述べら れた手順を介して組織学的に検査した。図３に具体的に説明されるように、染色 されたサンプルの組織学的分析は、トリプシン処理されたマウスでの毛包の発達 が有意に遅延されたことを例証した。より具体的には、特徴的な層状構造、膨脹 された毛包乳頭および新たな毛の色素沈着が、未処理およびベヒクル処理された 対照でのこうした特徴の最初の観察の日付より数日より遅く最初に観察された。 加えて、トリプシン処理されたマウスの皮膚の毛包は、図３Ｂ（ａ−ｅ）に最も 良好に具体的に説明されるように拡大された漏斗を表し、これは図３Ａ（ａ−ｂ ）に示されるように未処理およびベヒクル処理されたマウスで存在しなかった。 この観察結果は、トリプシンを含有する組成物での処理が、低下された質を有す る、すなわちより薄くかつよりまばらな毛の成長もまたもたらしたという事実を 支持する。トリプシンでの処理後７〜８日 に、若干の処理された毛包の下部分は、図３Ｂ（ｄ−ｅ）に具体的に説明される ように表皮の層をなす構造の形成を開始したが、しかし、上部分は、図３Ｂ（ｄ ）に最も良好に示されるように空の(empty)構造をなお表した。トリプシンでの 処理後11〜12日までに、処理された毛包の大部分は成熟したが、しかしなお、誘 導後４ないし５日の未処理の毛包の特徴に類似した、低下された毛の色素沈着お よびより短い毛幹の長さを表した（図３Ａ（ｄ）を図３Ｂ（ｆ）と比較せよ）。 本実施例は、毛の成長が誘導されたマウスの皮膚へのトリプシンの局所適用が 毛の成長および毛の色素沈着を有意に遅延させたことを、組織学的分析を介して さらに示した。 実施例６：トリプシンは毛包乳頭におけるアポトーシスを誘導する 実施例２で調製されたような単回の局所的に活性の組成物を、実施例３で述べ られた方法に従った毛の誘導後の３匹のＣ５７ＢＬ／６の雌性の７ないし８週齢 のマウスの皮膚表面に適用した。 未処理およびトリプシン処理されたマウスの皮膚の１cm×２cmのサンプルを実 施例１に述べられた手順を介して得、その後、ガブリエリ(Gavrieli)ら、"Ident ification of Programmed Cell Death in situ Via Specific Labelling of Nuc lear DNA Fragmentation"、119 Jl．Cell Biology 493-501(1992)（「ガブリエ リ(Gavrieli)」）に開示されたようなＴｄＴ−仲介性ｄＵＴＰ−ビオチンニック エンドラベリング(nick end labeling)（「ＴＵＮＥＬ」）処置を介して分析し た。この処置の間、皮膚の調製されたパラフィン切片を、ガブリエリ(Gavrieli) に記述されたような断片化されたＤＮＡ端の標識を基礎とする、オンコール イ ンク(Oncor Inc.)による「アポプタグ［ApopTag］（商標）プラス イン シトゥアポトーシス検出キット(Plus InSitu Apoptosis Detection Kit)」プロ トコール（1995年２月）に明記されるように、オンコール インク(Oncor，Inc. )から入手可能な「アポプタグ［ApopTag］（商標）プラス インシトゥアポトー シス検出キット」を使用して染色した。図４は組織学的分析を示し、ここで染色 はペルオキシダーゼの終末点（褐色）およびメチルグリーンの反対染色(counter -stain)を有する。 同様に、ＴＵＮＥＬ染色に適するパラフィン切片をマウスの未処理の皮膚から 調製した。これらの切片を染色しそして組織学的に分析し；その生じる表示を図 ４（ａ−ｃ）に提供する。 図４に具体的に説明されるように、ＴＵＮＥＬ染色されたサンプルは、形態学 （圧縮されたもしくは断片化された核および細胞質すなわちアポトーシス体）な らびにその染色の色（圧縮された核内の断片化されたＤＮＡは褐色に染色された ）の双方によりアポトーシス細胞を定義した。より具体的には、図４Ｂ（ａ−ｅ ）は、アポトーシス体が毛の成長の誘導後の最初の週の間中、処理された毛包乳 頭内で検出されたことを具体的に説明した。しかしながら、毛包、表皮もしくは 真皮の他の部分はトリプシン処理により影響を及ぼされなかった。対照的に、最 小レベルのアポトーシスが、図４Ａ（ａ−ｃ）のＴＵＮＥＬ染色された未処理の サンプルで具体的に説明されたように未処理の成長期初期の毛包でときに検出さ れたが；しかしながら、アポトーシスは常に毛包の峡部であり、そしてかように 毛包乳頭の十分上であった。未処理の毛包の大部分はいかなる細胞死も表さなか った。 本実施例は、除毛された皮膚へのトリプシンの適用が、未処理もしくはベヒク ル処理されたかのいずれかの対照のものに関して、トリプシン 処理された毛包の毛包乳頭内でのアポトーシス像の増加をもたらしたことを示し た。 実施例７：トリプシンは毛周期の間の遺伝子発現の変化を誘導する 実施例２で調製されたような単回の局所的に活性の組成物を、実施例３で述べ られた方法に従った毛の誘導後の６匹のＣ５７ＢＬ／６の雌性の７ないし８週齢 のマウスの皮膚表面に適用した。 図５に示された時間間隔で、未処理のマウスおよびトリプシン処理されたマウ スの皮膚を実施例１に記述されたように得、その後、それらの全ＲＮＡを、チョ ムチンスキ(Chomczymski)、"Single Step Method of RNA Isolation By Acid Gu anidium Thiocyanate-phenol-chloroform extraction"、162 Anal．Biochem．15 6-59(1987)に記述されたようにテルーテスト「Ｂ」インコーポレーテッド(Tel-T est"B,"Incorporated)から入手可能な「ＲＮＡスタット−６０(RNA Stat-60)」 試薬を使用して抽出した。商品名「ＲＱ１ ＲＮアーゼ フリー ＤＮアーゼ(R Q1 RNase-free DNase)」でプロメガ コーポレーション(Promega，Corporation) から入手可能なＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼの十分量を、その後、各それぞ れの産物が、200ngのＤＮアーゼ処理されたＲＮＡを含有するように、プロメガ コーポレーション(Promega，Corporation)により出版された「ＲＮアーゼ フ リー ＤＮアーゼ(RNase-free DNase)」プロトコール（1995年５月）に述べられ た手順を使用して、各マウスからの抽出されたＲＮＡに添加した。生じる200ng のＤＮアーゼ処理されたＲＮＡを、ライフ テクノロジーズ インコーポレーテ ッド(Life Technologies，Incorporated)から商業的に入手可能であるランダム プライマーのようなランダムヘキサマーを使用して、ギブコ−ＢＲＬ(Gibco -BRL)（現在、ライフ テクノロジーズ インコーポレーテッド(Life Technolog ies，Incorporated)）により出版されたプロトコール「スーパースクリプトII(S uperscript II)逆転写酵素」（1992年４月）に述べられた手順を介して逆転写し た（「ＲＴ」）。 生じるＲＴ産物を、その後、商品名「Ｔａｑポリメラーゼ」でパーキン エル マー シータス コーポレーション(Perkin-Elmer-Cetus Corporation)から商業 的に入手可能である熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ約0.5単位（100μｌの反応あた り）、および、クロンテック ラボラトリーズ インク(Clontech Laboratories ，Inc.)（「クロンテック(Clontech)」）から入手可能な、もしくはマウスのグ リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、転写因子およ びサイトカインについてのクロンテック(Clontech)からのプライマーに付随する プロトコールに述べられる手順に従って表２に述べられるように設計された、す なわち表２に記述されるような遺伝子特異的プライマー約0.1μｍｏｌ／反応、 を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を介して増幅した。 表２は、使用されたＤＮＡプライマーのいくつか、ＰＣＲ反応に必要とされた 塩化マグネシウムの量、およびＰＣＲサイクルの長さを具体的に説明する。表２:ＲＴ-ＰＣＲアッセイで利用されたＤＮＡプライマー^★★★ ＰＣＲ産物を、その後、２％アガロース／臭化エチジウムゲルにより分析し、 そして、トリプシン処理されたおよび未処理の双方のマウスの毛周期の間のある 遺伝子の発現のレベルを比較するための当該技術分野で公知の方法に従って分析 した。より良好な可視化に必要な場合は、生じるＰＣＲ産物を公知の手順に従っ てエタノールで沈殿させた。Ｇ３ＰＤＨのためのプライマーが使用された場合は 、ＰＣＲ反応産物の10％のみを使用した。逆転写されなかった、Ｃ５７ＢＬ／６ の雌性の７ないし８週齢のマウスの皮膚からのＲＮＡサンプルを、各ＰＣＲ増幅 のための陰性対照として使用した。非同時性の毛周期を有する６月齢のＣ５７Ｂ Ｌ／６の雌性マウスの皮膚からのＲＮＡサンプルを、陽性対照が商業的に入手で きなかった場合に陽性対照として使用した。ゲル上でのＲＴ−ＰＣＲ産物の移動 は、常に、陽性対称のもの、および報告されたアンプライマー(amplimer)の大き さのものに同一であった。 各それぞれのＲＴ−ＰＣＲ反応産物の相対的質を、その後、各それぞれの産物 中のＧ３ＰＤＨすなわち「ハウスキーピング」遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析す ることにより比較した。図５に具体的に説明されるように、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子発 現は検査された全ての時間点で類似であることが見出され、これはそれにより所 望の遺伝子の遺伝子発現の相対的レベルの比較を可能にした。 毛包の発達における遅延が非特異的刺激もしくは炎症応答の結果でなかったこ とを確かめるため、われわれは、こうした情況の間に典型的にアップレギュレー ションされる遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析した。ＲＴ−ＰＣＲ産物からの遺伝 子のｍＲＮＡレベルの検査後、われわれは、表３に具体的に説明されるように、 ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＧＭ− ＣＳＦのｍＲＮＡレベルの無変化、ＴＮＦαのわずかなアップレギュレーション 、ＴＮＦβおよびＴＮＦ−ＲＩのわずかなダウンレギュレーション、ならびにマ クロファージ誘導性タンパク質(Macrophage Inducible Protein)（ＭＩＰ）での 中程度のダウンレギュレーションが存在したことを見出した。 表３：遺伝子発現のパターン ^★ＲＴ-ＰＣＲは半定量的にすぎないことに注意せよ。 比較は、異なる毛周期内での各増幅された配列についてのみ妥当であり、 また、異なる遺伝子の間で妥当でない。 - 検出可能な発現なし + 強いバンド +/-- 非常に弱いバンド ++ より強いバンド +/- 弱いバンド +++ 非常に強いバンド 表３の遺伝子発現の特徴は、炎症反応もしくは真皮の刺激に対する応答に対抗す ることを示唆する。 中等度のアップレギュレーションが、培養物中の毛の成長の阻害に関連する遺 伝子ＩＬ−１αのｍＲＮＡレベル（図５ｂおよび表３）で観察された。ＩＬ−１ αの誘導はまた表皮の障壁機能の喪失からも生じ得たため、われわれは経表皮水 分喪失（ＴＥＷＬ）を測定することにより障壁の完全性を分析した。ＴＥＷＬを 、最初に蒸発計を周囲湿度で標準化し、そしてその後プローブを試験対象の背側 の皮膚に置くことにより、セルヴォメド(Servomed)ＡＢから入手可能な「蒸発計 (Evaporimeter)ＥＰＩ」蒸発計で測定した。結果は、表４に示されるようにトリ プシン濃度に相関しなかった、ＴＥＷＬでの中等度の増加のみを示した。 表４：トリプシン処理された皮膚におけるＴＥＷＬ 従って、表３および図５に具体的に説明されるようなわれわれのＲＴ−ＰＣＲ産 物中のＩＬ−１αのいかなるアップレギュレーションも毛の成長の阻害と関連す るとみられる。 図５ａ−ｂおよび表３に具体的に説明されるように、ｍＲＮＡレベルでのより 強い増加がＩＬ−１βおよびＩＦＮγについて立証された。これらは双方とも、 円形脱毛症でアップレギュレーションされること、および毛の成長の阻害に関連 することが既知である。これは、トリプシンによりアップレギュレーションされ る唯一の炎症関連遺伝子が毛の成長の阻害に関連するものであったことをさらに 示唆した。 表３に具体的に説明されるように、わずかな低下がｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃお よびｃ−ｆｏｓのｍＲＮＡレベルで検出された一方、ｃ−ｊｕｎのレベルは遅延 期間を通じてわずかに増大した。ＡＰ−１応答要素を介して調節される遺伝子コ ラゲナーゼも同様にわずかに低下された。いくつかの遺伝子のｍＲＮＡレベルに おける全般的なわずかな低下のこの観察結果は、トリプシン処理された皮膚の毛 の成長での全体的な減速をさらに反映した。 図５Ａおよび表３に具体的に説明されるように、毛の色素沈着に関して重要な 酵素チロシナーゼは毛の成長期間の遅延の間にダウンレギュレーションされた一 方、そのｍＲＮＡレベルは毛包が遅延の克服を開始した際に増大した。メラニン 産生ペプチド黒色細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）の前駆体ＰＯＭＣは、図５Ａおよ び表３に示されるように、遅延期間の間に中等度にダウンレギュレーションされ た。これら２種の遺伝子のダウンレギュレーションはトリプシンが毛の色素沈着 の調節にもまた影響を及ぼしたことを示した。 本実施例は、毛周期のトリプシンの混乱(perturbation)が遅延期間の間の一連 の遺伝子の発現パターンの検査により理解されうることを示した。毛周期に沿っ たｍＲＮＡレベルでのトリプシンに誘導された変化が明らかに証明され、毛の成 長および毛の色素沈着におけるトリプシンの調節的役割を示した。さらに、本実 施例は、毛の成長および毛の色素沈着の遺伝子に対するトリプシンの局所適用の 特異性をさらに反映した。 実施例８：毛の成長に影響を及ぼす他のセリンプロテアーゼ 実施例２で調製されたような単回の局所的に活性の組成物を、実施例３で述べ られた方法に従った毛の誘導後のＣ５７ＢＬ／６の雌性の７ないし８週齢のマウ スの皮膚表面に適用した。 実施例３の手順を、しかしトリプシンについてそれぞれカルボキシペプチダー ゼ−Ｙ、プロテアーゼIVおよびズブチリシンの代用を伴い反復した。 処理後8日後に、各それぞれのマウスの皮膚を、それらのそれぞれの皮膚の色 を比較するため、ミノルタ クロマメーター(Minolta Chromameter)モデルＣＲ ３００色度計を使用して検査した。 われわれは、アルギニンおよびリシンのＣ側でタンパク質を切断するエンドペ プチダーゼファミリーの一構成員のトリプシンが毛の成長において最長の遅延を 誘導したことを観察した。対照的に、タンパク質のＣ末端でＬ−アミノ酸を加水 分解するカルボキシペプチダーゼ−Ｙ、および中性のｐＨでペプチド結合の56％ を切断する非特異的エンドペプチダーゼファミリーの一構成員のプロテアーゼIV は、最小限の遅延させる効果のみを有した一方、アルカリ性のｐＨでペプチド結 合を切断する非特異的ペプチダーゼファミリーの一構成員のズブチリシンは毛の 成長速度 をわずかに増大させたのみであった。本実施例の結果を表５に具体的に説明する 。 表５：セリンプロテアーゼ処理された皮膚の色の測定 （The L^★尺度：０＝黒色および100＝白色は、皮膚表面から見られるような毛の 色素沈着の尺度である） 表５に具体的に説明されるように、トリプシン処理された毛包は最も少なく発 達し、そして従って皮膚に最も明るい色を与えるようであった。本実施例は、皮 膚の色の外見が毛包での毛の発達に関連することを示唆する。 トリプシン処理された皮膚から得られた結果はトリプシンが毛の成長および毛 の色素沈着の遅延に比較的優れていることを示したため、本実施例は、毛の成長 および毛の色素沈着に対するトリプシンの効果が独占的に非特異的タンパク質分 解性切断の結果ではないことができるが、しかしむしろそれはまたプログラムさ れた細胞死経路の活性化を引き起こすトリプシンにより誘導される特異的活性の 結果でもまたありうるという確信を支持する。 実施例９：トリプシンは毛の成長の誘導の初期段階に影響を及ぼす 実施例２で調製されたような単回の局所的に活性の組成物を、実施例 ３で述べられた方法に従った毛の誘導後の３匹のＣ５７ＢＬ／６の雌性の７ない し８週齢のマウスの皮膚表面に適用した。この処置を９匹の付加的マウスで反復 したが、しかし処置はそれぞれ週に２、３もしくは７回のいずれか適用した。 マウスの皮膚の色を８日間観察した後、処理されたマウスの皮膚は未処理の対 照についてのものより明るかった。これは、トリプシン処理された毛包は最も少 なく発達され、そして従って皮膚に最も明るい色を与えたようであったことをさ らに示唆した。 それぞれに処理されたマウスの皮膚の１cm×２cmのサンプルを得、Ｈ＆Ｅ染色 し、その後実施例１に述べられた手順を介して組織学的に検査した。染色された サンプルの組織学的分析は、トリプシンでの動物の付加的な連日の処理が毛の成 長での遅延を延長しなかったという事実を支持する。これは、セリンプロテアー ゼによる細胞死の誘導が特異的かつ時宜を得た事象から生じたことを示した。 この特異的事象の時機(timing)を決定するため、実施例２に記述されたような 単回の局所的に活性の組成物を、処理が表６に示されるような多様な時間間隔で 適用されたことを除き、実施例３で述べられた方法に従った毛の誘導後のＣ５７ ＢＬ／６の雌性の７ないし８週齢のマウスの皮膚表面に適用した。 表６に具体的に説明されるように、実施例８で述べられた方法に従って得られ た皮膚の色の色度測定(chromametric measurement)は、毛の成長の誘導とトリプ シン適用との間の増大された時間と相関した暗さの増大（より多い色素、より少 ない遅延）を立証した。毛の成長の誘導直後に処理されたマウスは毛の成長およ び毛の色素沈着において最長の遅延 を示した。毛の成長の誘導後２時間および４時間に処理されたマウスもまた、遅 延されたしかし前進的により短い毛周期を表した。除毛後６もしくはそれ以上の 時間に処理されたマウスは毛の成長について遅延されず、また、未処理の対照と 区別できなかった。 表６：トリプシン処理された皮膚の色の測定 ^{★★ ★★}皮膚サンプルは除毛後８日に試験した。 本実施例は、皮膚へのトリプシンの適用が、毛の成長の誘導後約４時間以内に 、かつ好ましくはその直後に適用される場合に毛の成長および毛の色素沈着を遅 延させるのに有効であることを示す。 実施例１０：トリプシンの効果はレセプター仲介性経路を必要としうる 実施例２で調製されたような単回の局所的に活性の組成物を、トリプシンの濃 度が１％（ｗ／ｖ）ないし0.01％（ｗ／ｖ）の間（４×10^-4M〜４×10^-6M）で変 動したことを除き、実施例３で述べられた方法に従った毛の誘導後のＣ５７ＢＬ ／６の雌性の７ないし８週齢のマウスの皮膚表面に適用した。除毛後９日に、マ ウスを実施例９で述べられた手順を介して比色的に分析した。 表７に具体的に説明されるように、比色分析の結果は、トリプシン濃 度の減少および毛周期の遅延での増大と相関した明るさ（Ｌ*、より白い、より 少ない色素）の増大を示した。 表７：トリプシン処理された皮膚の皮膚明るさ ^★★ Ｌ^★尺度：０＝黒色、100＝白色^★★ サンプルは除毛後９日に分析した。 本実施例はより高用量での脱感作を包含するレセプター仲介性の機構の存在を示 唆する。 実施例１１：トリプシンのタンパク質分解活性は毛の成長の遅延に不必要である 実施例２の組成物を室温で48時間インキュベーションした後、そのタンパク質 分解活性を、パンヴェラ コーポレーション(PanVera，Corporation)から入手可 能なセリンプロテアーゼ活性検出キットを介して分析し、これはこの調製物が検 出可能なタンパク質分解活性を有しなかったことを示した。不活性の組成物を、 実施例１０に述べられた方法に従った毛の誘導後の３匹のＣ５７ＢＬ／６の雌性 の７ないし８週齢のマウスの皮膚表面に適用した。除毛後９日に、マウスを実施 例８で述べられた手順を介して比色的に分析した。表７に具体的に説明されるよ うに、ト リプシンのタンパク質分解活性の欠如は毛の成長の遅延におけるこの調製物の活 性を低下させなかったことが明らかであった。 本実施例を、インキュベーションされたトリプシンを100℃の温度で10分間煮 沸されたトリプシンで置き換えたことを除いて、反復した。この結果は、同様に タンパク質分解的に不活性であった煮沸されたトリプシンの使用が毛の成長に対 する遅延する効果を有しなかったことを示した。トリプシンの三次元構造を変性 させた煮沸の行為は、トリプシンの三次元構造が毛周期に対する遅延する効果に 寄与し、そしてただそのタンパク質分解活性だけが寄与しなかったことを示唆し た。トリプシンが生存シグナルを封鎖したか、もしくはこの過程を誘導する死の レセプターを活性化したかに関係なく、本実施例は、トリプシン分子の形状(con figuration)が、毛包乳頭におけるプログラムされた細胞死およびアポトーシス の誘導の原因でもまたあることができたことを示唆した。 実施例１２：トリプシンを含有する組成物の使用 グリセロールジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ス テアリルエーテルのリポソームを、ニエミエク(Niemiec)に述べられた手順に従 って調製する。ここでこのリポソームの構成化合物はそれぞれ約58：15：27の比 にある。 生じるリポソームを約40℃の温度に冷却した後、リポソームを、最終組成物中 の濃厚化剤の量が約１〜３％（ｗ／ｖ）であるように、商品名「セピゲル(SEPIG EL)３０５」でセピック インク(Seppic，Inc.)から入手可能な、ポリアクリル アミド（および）Ｃ13−Ｃ14イソパラフィン（および）ラウレス(laureth)−７ から成る一定量の濃厚化剤に通常の攪拌を伴い添加する。 十分量のトリプシンをその後それに添加して１％トリプシン（ｗ／ｖ）組成物 を調製する。本組成物は即座の局所適用に適切である。 生じる生成物は有効なシェービングジェルの特徴および特性を保有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 コーエンバーグ，ジエラルド・エフ・エ ム・ジエイ アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08536 プレインズボロ・ビーチツリーレイン10 (72)発明者 ウイスニーウスキ，ステフエン・ジエイ アメリカ合衆国ペンシルベニア州18901ド イルスタウン・ポイントプレザントパイク 6280

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．休止期の毛の成長の誘導に関して十分な時間内にプロテアーゼを含む局所的 に活性な組成物の有効量を哺乳動物の皮膚に局所的に適用すること、 を含んで成る、哺乳類の毛の成長および毛の色素沈着における変化に影響を及ぼ す方法。 ２．プロテアーゼがセリンプロテアーゼである、請求の範囲１の方法。 ３．プロテアーゼが、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ−Ｙ、プロテアーゼ IV、ズブチリシンもしくはそれらの混合物から選択される、請求の範囲２の方法 。 ４．プロテアーゼがトリプシンである、請求の範囲３の方法。 ５．プロテアーゼが、局所的に活性の組成物の総量を基礎として、約０％（ｗ／ ｖ）から５％（ｗ／ｖ）までの量で存在する、請求の範囲４の方法。 ６．プロテアーゼが、局所的に活性の組成物の総量を基礎として、約0.01％（ｗ ／ｖ）から約１％（ｗ／ｖ）までの量で存在する、請求の範囲５の方法。 ７．前記変化の一が毛の成長および毛の色素沈着での遅延である、請求の範囲１ の方法。 ８．前記局所的に活性の組成物が製薬学的にもしくは化粧用に許容できるベヒク ルをさらに含んで成る、請求の範囲１の方法。 ９．前記製薬学的にもしくは化粧用に許容できるベヒクルがリポソームもしくは その混合物である、請求の範囲８の方法。 １０．前記リポソームが非イオン性である、請求の範囲９の方法。 １１．前記リポソームが、 ａ）グリセロールジラウレート、グリセロールジステアレートもしくはそれらの 混合物； ｂ）コレステロールで見出されるようなステロイド基幹を有する化合物もしくは それらの混合物；および ｃ）約12個から約18個までの炭素原子を有する脂肪酸エーテルもしくはそれらの 混合物 から成る、請求の範囲１０の方法。 １２．前記リポソームが、 ａ）グリセロールジラウレート； ｂ）コレステロール；および ｃ）ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル から成る、請求の範囲１０の方法。 １３．前記リポソームの成分が、それぞれ約53：10：22ないし約63：20：32の比 で存在する、請求の範囲１１の方法。 １４．前記製薬学的にもしくは化粧用に許容できるベヒクルが、前記局所的に活 性の組成物の総量を基礎として、約０mg/mLから約100mg/mLまでの量で存在する 、請求の範囲８の方法。 １５．休止期の毛の毛の成長の誘導が、剃ること、電気分解、ワックス除毛、化 学的除毛もしくはそれらの組み合わせを含む方法により実施される、請求の範囲 １の方法。 １６．前記時間が、休止期の毛包の前記毛の成長の誘導の直前、直後もしくはこ れと同時である、請求の範囲１の方法。 １７．前記時間が、毛の成長の誘導と同時もしくはその直後のいずれか である、請求の範囲１６の方法。 １８．組成物が、界面活性剤、保湿剤、湿潤剤、コンディショナー、香料、着色 料もしくはそれらの混合物をさらに含んで成る、請求の範囲１の方法。 １９．前記組成物が、シェービングクリーム、ジェービングジェル、シェービン グパウダー、化学的除毛クリーム、その目的が毛の除去を助長することかもしく は実際に毛を除去することかのいずれかである他の製品、またはそれらの組み合 わせの形態にある、請求の範囲１８の方法。 ２０．前記組成物を、前記変化に影響を及ぼすのに十分な期間、前記皮膚上に残 すことをさらに含んで成る、請求の範囲１の方法。 ２１．前記期間が最低約15分である、請求の範囲２０の方法。 ２２．前記プロテアーゼを、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２− エタンスルホン酸、（ヒドロキシメチル）アミノメタンもしくはそれらの混合物 を含む緩衝液と混合することをさらに含んで成る、請求の範囲１の方法。 ２３．形状がトリプシンの三次元構造の第二部分に類似である第一部分を有する 局所的に活性な作用物質であって、それにより前記第一部分および前記第二部分 の双方がレセプター仲介性シグナル伝達を可能にする作用物質を哺乳動物の皮膚 に局所的に適用することを含んで成る、哺乳動物の毛包乳頭内でプログラムされ た細胞死およびアポトーシスを誘導する方法。 ２４．前記作用物質が、トリプシン、タンパク質分解的に不活性のトリプシンも しくはそれらの組み合わせである、請求の範囲２３の方法。 ２５．ａ）形状がトリプシンの三次元構造の第二部分に類似である第一 部分を有する局所的に活性な作用物質であって、それにより前記第一部分および 前記第二部分の双方がレセプター仲介性シグナル伝達を可能にする作用物質；な らびに ｂ）製薬学的にもしくは化粧用に許容できるベヒクル、 を含んで成る組成物。 ２６．局所的に活性な作用物質が、トリプシン、タンパク質分解的に不活性のト リプシンもしくはそれらの組み合わせである、請求の範囲２５の組成物。 ２７．局所的に活性な作用物質が、組成物の総量を基礎として、約０％（ｗ／ｖ ）から約５％（ｗ／ｖ）までの量で存在する、請求の範囲２５の組成物。 ２８．局所的に活性な作用物質が、組成物の総量を基礎として、約0.01％（ｗ／ ｖ）から約１％（ｗ／ｖ）までの量で存在する、請求の範囲２５の組成物。 ２９．製薬学的にもしくは化粧用に許容できるベヒクルがリポソームである、請 求の範囲２５の組成物。 ３０．前記リポソームが非イオン性である、請求の範囲２９の組成物。 ３１．前記リポソームが、 ａ）グリセロールジラウレート、グリセロールジステアレートもしくはそれらの 混合物； ｂ）コレステロールで見出されるようなステロイド骨格を有する化合物もしくは それらの混合物；および ｃ）約12個から約18個までの炭素原子を有する脂肪酸エーテルもしくはそれらの 混合物 から成る、請求の範囲３０の組成物。 ３２．前記リポソームが、 ａ）グリセロールジラウレート； ｂ）コレステロール；および ｃ）ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル から成る、請求の範囲３０の組成物。 ３３．前記リポソームの成分が、それぞれ約53：10：22ないし約63：20：32の比 で存在する、請求の範囲３１の組成物。 ３４．製薬学的にもしくは化粧用に許容できるベヒクルが、組成物の総量を基礎 として約０mg/mLから約100mg/mLまでの量で存在する、請求の範囲２５の組成物 。 ３５．組成物が、界面活性剤、保湿剤、湿潤剤、起泡剤、化粧用補助物質、緩衝 剤、保存剤、抗酸化剤、コンディショナー、香料、着色料もしくはそれらの混合 物をさらに含んで成る、請求の範囲２５の組成物。 ３６．前記組成物が、シェービングクリーム、ジェービングジェル、シェービン グパウダー、化学的除毛クリーム、その目的が毛の除去を助長することかもしく は実際に毛を除去することかのいずれかである他の製品、またはそれらの組み合 わせの形態にある、請求の範囲３５の組成物。 ３７．ａ）毛包乳頭においてアポトーシスを誘導することが可能なプロテアーゼ を含んで成る局所的に活性な作用物質；および ｂ）製薬学的にもしくは化粧用に許容できるベヒクル を含んで成る組成物。 ３８．界面活性剤、保湿剤、湿潤剤、起泡剤、化粧用補助物質、緩衝剤、保存剤 、抗酸化剤、コンディショナー、香料、着色料もしくはそれらの 混合物から選択される成分をさらに含んで成る、請求の範囲３７の組成物。 ３９．前記プロテアーゼがセリンプロテアーゼである、請求の範囲３７の組成物 。 ４０．前記プロテアーゼが、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ−Ｙ、プロテ アーゼIV、ズブチリシンもしくはそれらの混合物から選択される、請求の範囲３ ９の組成物。 ４１．局所的に活性な作用物質が、組成物の総量を基礎として、約０％（ｗ／ｖ ）から約５％（ｗ／ｖ）までの量で存在する、請求の範囲３７の組成物。 ４２．局所的に活性な作用物質が、組成物の総重量を基礎として、約0.01％（ｗ ／ｖ）から約１％（ｗ／ｖ）までの量で存在する、請求の範囲３７の組成物。 ４３．製薬学的にもしくは化粧用に許容できるベヒクルがリポソームである、請 求の範囲３７に記載の組成物。 ４４．前記リポソームが非イオン性である、請求の範囲４３に記載の組成物。 ４５．前記リポソームが、 ａ）グリセロールジラウレート、グリセロールジステアレートもしくはそれらの 混合物； ｂ）コレステロールで見出されるようなステロイド骨格を有する化合物もしくは それらの混合物；および ｃ）約12個から約18個までの炭素原子を有する脂肪酸エーテルもしくはそれらの 混合物 から成る、請求の範囲４３の組成物。 ４６．前記リポソームが、 ａ）グリセロールジラウレート； ｂ）コレステロール；および ｃ）ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル から成る、請求の範囲４３の組成物。 ４７．前記リポソームの成分が、それぞれ約53：10：22ないし約63：20：32の比 で存在する、請求の範囲４５の組成物。 ４８．製薬学的にもしくは化粧用に許容できるベヒクルが、組成物の総量を基礎 として約０mg/mLから約100mg/mLまでの量で存在する、請求の範囲３７の組成物 。 ４９．前記組成物が、シェービングクリーム、ジェービングジェル、シェービン グパウダー、化学的除毛クリーム、その目的が毛の除去を助長することかもしく は実際に毛を除去することかのいずれかである他の製品、またはそれらの組み合 わせの形態にある、請求の範囲３７の組成物。