CZ7099A3

CZ7099A3 - Způsoby ovlivnění vlasového růstu a vlasové pigmentace apoptózou ve folikulární papile a kompozice určené k provádění těchto způsobů

Info

Publication number: CZ7099A3
Application number: CZ9970A
Authority: CZ
Inventors: Miri Seiberg; Stanley S. Shapiro; Gerard F. Cauwenbergh; Stephen J. Wisniewski
Original assignee: Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc.
Priority date: 1996-07-12
Filing date: 1997-06-25
Publication date: 1999-09-15
Also published as: PL331082A1; IL127806A0; JP2000515511A; CA2260966A1; EP0996409A1; DE69721329T2; DE69721329D1; KR20000023665A; ATE238024T1; AU3577897A; EP0996409B1; BR9710303A; AU722917B2; CN1225575A; ES2196348T3; PT996409E; WO1998002134A1; DK0996409T3

Description

(57) Anotace:

Řešení využívá serinproteázy a jejich schopnost Indukovat programovanou buněčnou smrt a apoptózu ve follkulární papile k vyvolání změn v růstu ochlupení a pigmentace ochlupení u savců. Řešení se rovněž týká kompozic obsahujících činidlo, které má část struktury podobnou části trypsínové molekuly, která umožňuje uvedenému činidlu Indukovat programovanou buněčnou smrt a apoptózu stejným způsobem jako trypsin.

CZ 70-99

liLMIm-IU:;:.:

(.7

01-2998-98 Če

Způsoby ovlivnění růstu ochlupení a pigmentace ochlupení apoptózou ve folikulární papile a kompozice určené k provádění těchto způsobů

Oblast techniky

Vynález se týká způsobů stimulace programované buněčné smrti a apoptózy ve folikulární papile a kompozic určených k provádění těchto způsobů. Vynález se týká zejména způsobů ovlivňujících rychlost růstu ochlupení a pigmentace ochlupení, které spočívají v topické aplikaci proteázy nebo molekuly, která ovlivňuje cestu přenosu signálu mediovaného receptoru.

Dosavadní stav techniky

Jednou z hlavních funkcí ochlupení savců je poskytnutí ochrany před okolním prostředím. Nicméně tuto funkci ochlupení u lidí, kteří si ochlupení udržují nebo odstraňují čistě jen z kosmetických důvodů, v podstatě ztratilo.

K odstranění nežádoucího ochlupení se používá celá řada metod včetně holení, elektrolýzy, vytrhávání a injektování terapeutických antiandrogenů. Tyto konvenční metody nejsou zcela bez nežádoucích vedlejších účinků. Při holení může například dojít k pořezání pokožky. Kromě toho holení urychluje růst nového ochlupení a může za sebou zanechávat nežádoucí strniště. Elektrolýza sice může udržovat plochu pokožky bez nežádoucího ochlupení relativně dlouhou dobu, nicméně tento způsob je často drahý a » * · · · « · .· · ·

01-2998-98 Ce • * ♦ · * ·

........

• · · · · · · · bolestivý a v některých případech může na pokožce zanechat jizvy. Pokud jde o vytrhávání, nejen že způsobuje bolest a nepohodlí ale navíc není schopno dokonale odstranit krátké ochlupení. Použití antiandrogenů je často doprovázeno řadou nežádoucích vedlejších svalovány. Kromě toho, s účinků, například ovlivnění výjimkou elektrolýzy, se musí všechny tyto metody často opakovat, což je pro uživatele nepohodlné. Z těchto důvodů jsou žádoucí chemické metody, které pozastavují růst ochlupení.

Jak uvádí patent US 5,455,234 (Ahluwalia a kol.), růst ochlupení savců lze ovlivnit aplikací enzymového inhibitoru cysteinové cesty na pokožku, který zpomalí nebo zastaví metabolické cesty, pro rychlost a charakter růstu ochlupení, se kterými je cystein spojován. Nicméně tato inhibice cysteinu rovněž způsobuje nedostatek této aminokyseliny v ošetřené oblasti. Rovněž v patentu US 5,095,007 (Ahluwalia a kol.), v patentu US 5,096,911 a 5,468,476 (Ahluwalia a kol.) a v patentu US 5,132,293 a 5,143,925 (Shander a kol.) se k ovlivnění ochlupení využívají enzymové inhibitory. Ve všech těchto případech se biochemická cesta ovlivňuje s cílem inhibovat produkci finálního produktu.

Z výše uvedeného vyplývá, že by bylo žádoucí poskytnout způsob, který by chemicky ovlivňoval růst a pigmentaci ochlupení a který by současně nepřipravoval uživatele o potřebné aminokyseliny nebo nezpůsoboval nežádoucí vedlejší účinky.

01-2998-98 Če • · · • · · · · • · « · * • · · · *» «·

Podstata vynálezu

Jak již bylo uvedeno, vynález se týká způsobu vyvolávajícího změny v růstu ochlupení savců a pigmentace ochlupení, který zahrnuje, v podstatě sestává z nebo sestává z topické aplikace účinného množství topicky účinné kompozice obsahující proteázu na kůži savce v době dostatečně odpovídající telogenní indukci růstu ochlupení.

Další provedení vynálezu se týká způsobu stimulace programované buněčné smrti a apoptózy ve folikulární papile, který zahrnuje, v podstatě sestává z nebo sestává z topické aplikace topicky účinného činidla, které má první část tvarově podobnou druhé části trojrozměrné struktury trypsinu, přičemž první část a druhá část jsou společně schopny přenášet signál, medíovaný receptorem, na kůži savce.

Další provedení vynálezu se týká kompozice obsahující, v podstatě sestávajíc! nebo sestávající z:

a) topicky účinného činidla, které má první část tvarově podobnou druhé části trojrozměrné struktury trypsinu, přičemž první část a druhá část jsou společně schopny přenášet signál, mediovaný receptorem; a

b) farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelného vehikula.

Ještě další provedení vynálezu se týká kompozice obsahující, v podstatě sestávající nebo sestávající z:

a) topicky účinného činidla obsahujícího proteázu schopnou indukovat apoptózu ve folikulární papile; a

b) farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelného vehikula.

• ·

01-2998-98 Če * · ·

Kompozice a způsoby podle vynálezu poskytují jedinečný konvenční prostředek pro pozdržení růstu ochlupení a pigmentace ochlupení indukcí apoptózy ve folikulární papile.

Stručný popis obrázků

Podání této patentové přihlášky obsahuje alespoň jeden obrázek provedený v barvě. Kopie této patentové přihlášky s barevným obrázkem známkovým úřadem poplatku.

(obrázky) bude poskytnuta Patentovým a po vyžádání a zaplacení nezbytného

Vynález se stane zřejmějším po prostudování, následujícího podrobného popisu vynálezu a doprovodných výkresů, na kterých:

obr. 1A a 1C znázorňují řez kůží neošetřené myši C57BI/6, označené fluorescenčním trypsinem. Obr. IB znázorňuje řez kůží myši C57BI/6, označené fluorescenčním trypsinem, 12 ční po topickém ošetření trypsinem.

Obr. 2 znázorňuje barevný dorsální pohled na kůži myší C57BI/6, z nichž některé jsou ošetřeny vehikulem nebo trypsinem (1%) bezprostředně po indukci růstu ochlupení: (2A) osm dní po indukci růstu ochlupení; (2B) jedenáct dní po indukci růstu ochlupení; a (2C) čtrnáct dní po indukci růstu ochlupení. Na obr. 2A je levá myš ošetřená, zatímco pravá myš je neošetřená. Na obr. 2B a 2C je levá myš neošetřená, prostřední myš je ošetřena vehikulem a pravá myš je ošetřena trypsinem.

β

01-2998-98 Če

Obr. 3A znázorňuje histologii folikul ochlupení pokožky kůže neošetřených myší: (a) čtyři dny; (b) pět dní; (c) šest dní; (d) osm dní; a (e) dvanáct dní po indukci růstu ochlupení. Obr. 3B znázorňuje histologii folikul ochlupení kůže myší ošetřených trypsinem (a) čtyři dny; (b) pět dní; (c) osm dní; a (d) dvanáct dní po indukci růstu ochlupení.

Obr. 4A znázorňuje řez tkání TUNEL-zabarvené kůže neošetřené myši: (a) jeden den; (b) dva dny; a (c) tři dny po indukci růstu ochlupení. Obr. 4B znázorňuje řez tkání TUNEL-zabarvené kůže myší ošetřené trypsinem: (a) jeden den; (b) dva dny; (c) tři dny; (d) čtyři dny; (e) pět dní po indukci růstu ochlupení ((a-e) byly jediné aplikace trypsinu); a (f) osm dní po indukci růstu ochlupení (denní aplikace trypsinu).

Obr. 5 znázorňuje profil genové exprese kůže myší ošetřené trypsinem a kůže myši neošetřené trypsinem během zpožděného cyklu růstu ochlupení, který byl detekován reverzní transkripcí a polymerní řetězovou reakcí („RT-PCR). Obr. 5A znázorňuje hladiny mRNA první až jedenáctý den zpožděného cyklu růstu ochlupení. Obr. 5B znázorňuje hladiny mRNA osmý den zpožděného růstu ochlupení. Rovněž jsou 2de znázorněny RT-PCR produkty celkové RNA, které činí 25 ng (A) resp. 250 ng (B).

Výraz „savec, jak je zde uveden, znamená libovolného zástupce vyšších obratlovců, tvořících třídu Mammalia, definovanou ve Webster's Medical Desk Dictionary 407 (1986) a zahrnujících neomezujícím způsobem lidi. Výraz „(procento, hmotn./obj.), jak je zde uveden, znamená gramy

01-2998-98 Če • · ·

4· dané složky na 100 ml celkové kompozice. Výraz „receptor, jak je zde uveden, zahrnuje jak intracelulární tak extracelulární receptory a označuje molekuly, které jsou schopné přijímat a přenášet signál.

Topicky účinná činidla, která jsou vhodná pro použití v kompozici podle vynálezu, zahrnují proteázy, sloučeniny, které mají strukturu v podstatě shodnou s částí trojrozměrné struktury trypsinu, nebo jejich směsi.

Výhodnými proteázami jsou serinproteázy, které zahrnují neomezujícím způsobem trypsin, karboxypeptidázu-Y, proteázu IV, subtilysin, nebo jejich směsi. Zvolenou proteázou je trypsin. Aniž bychom se vázali na konkrétní teorií, dá se předpokládat, že proteázy jsou schopny zpozdit růst ochlupení a pigmentaci ochlupení ovlivněním cyklu růstu ochlupení indukcí programované buněčné smrtí a apoptózy ve folikulární papile a že tato změna cyklu je pravděpodobně vyvolána přenosem signálu mediovaného receptoru. Kompozice podle vynálezu výhodně obsahuje přibližně 0 % (hmotn./obj.) až 5 % (hmotn./obj , vztaženo k celkovému objemu kompozice, a výhodně přibližně 0,01 % (hmotn./obj.) až 1 % (hmotn./obj.

Jak je zřejmé ze zde uvedeného příkladu 10, neočekávaně se zjistilo, že proteolytická účinnost proteázy není jediným faktorem, který přispívá k indukci programované buněčné smrti. Aniž bychom se vázali na určitou teorii, dá se rovněž předpokládat, že přenos signálu, mediovaného receptorem, může také přispívat k indukci programované buněčné smrti folikulární papily a že tento typ činidla by mohl souviset se strukturní složkou topicky účinného činidla.

01-2998-98 Če ·« ·« » » · ·

Druhé vhodné topicky účinné činidlo tedy zahrnuje sloučeniny, které mají část v podstatě tvarově shodnou s částí (částmi) trojrozměrné struktury trypsinové molekuly, která ovlivňuje přenos signálu mediovaného receptorem. Výraz „v podstatě tvarově shodný, jak je zde uveden znamená, že sloučeniny obsahují dostatečné množství struktury chovající se jako ligand, který může být obsazen receptorem, který může nahradit ligand v receptorů nebo který může aktivovat nebo inaktivovat receptor proteolytickým štěpením a tím přispívat k indukci programované buněčné smrti. Příklady takových sloučenin, které mají částí v podstatě tvarově shodné se strukturou části trojrozměrného trypsinu, zahrnují například proteolyticky inaktivní trypsin, což je forma trypsinu, který není schopen digerovat proteiny, například kolagen. Kompozice podle vynálezu obsahuje výhodně přibližně 0 % (hmotn./obj.) až 5 % (hmotn./obj.) těchto sloučenin, vztaženo k celkovému objemu kompozice a nejvýhodněji přibližně 0,01 % (hmotn./obj.) až 1 % (hmotn./obj.).

Pokud jsou vyžadovány dopravní parametry topícky účinného farmaceutického nebo kosmetického Činidla, potom může být topicky účinná kompozice podle vynálezu dále výhodně tvořena farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelnými vehikulem schopným fungovat jako dopravní systém, který umožňuje topicky účinnému činidlu pronikat do folikuly chlupu. Přesto, že jako vhodné farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelné vehikulum lze použít libovolné komerčně dostupné vehikulum, určené pro dopravu proteázy do příslušné přídatné části pokožky, kterou je v tomto případě folikula chlupu, výhodným vehikulem jsou v tomto případě liposomy. Liposomy jsou výhodněji neiontové a sestávají z a) glycerodilaurátu nebo glyceroldistearátu; b) sloučenin

4

I · · 4 4 » * * · > · · ¹ • « · ·

I t 4 4

4*4 <

01-2998-98 Če majících steroidový hlavní řetězec, který se nachází v cholesterolu; a c) esterů mastných kyselin, které mají přibližně 12 až 18 atomů uhlíku, přičemž sloučeniny tvořící liposomy jsou zastoupeny v poměru přibližně 53:10:22 až přibližně 63:20:32 a výhodně v poměru přibližně 55:12:24 resp. přibližně 61:18:30. Nejvýhodnějšími liposomy jsou liposomy tvořené glyceroldilaurátem, cholesterolem a polyoxyethylen-10-stearyletherem (GDL). Kompozice podle vynálezu výhodně obsahuje přibližně 10 mg/ml až 100 mg/ml liposomů, vztaženo k celkovému objemu kompozice, a výhodněji přibližně 25 mg/ml až 50 mg/ml. Nej výhodnějším poměrem jednotlivých složek v liposomech je poměr 58:15:27. Vhodné liposomy lze výhodně připravit postupem, který uvádí protokol popsaný ve zde uvedeném příkladu 2, nicméně přijatelné jsou i další metody běžně používané v této oblasti.

Výše popsanou kompozici lze připravit smísením požadovaných složek ve vhodné nádobě a jejich mícháním za okolních podmínek pomocí libovolného konvenčního vysokosmykového prostředku, který se běžně používá pro přípravu neiontových liposomových přípravků, například pomocí prostředku popsaného Nieiecem a kol. v „iníluencc of Nonionic Liposomal Composition On Topical Delivery of Peptide Drugs Into Pilosebacious Units: An In Vivo Study Using the Hamster Ear Model, 12 Pharm. Res. 1184-88 (1995) („Niemiec). U výhodného provedení lze pH finální topicky účinné farmaceutické nebo kosmetické kompozice nastavit pomocí známých regulátorů pH, například pomocí kyseliny N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonové od Life Technologies, která má obchodní označení „Hepes, nebo (hydroxymethyl)aminomethanu od Life Technologies, který má

V

01-2998-98 Če

obchodní označení „Tris, kyseliny citrónové a jejich směsí, přibližně na 2 až 8.

U alternativních provedení lze farmaceuticky nebo kosmeticky účinnou kompozici případně sloučit s dalšími přísadami, například se zvlhčovadly, napěňovadly, kosmetickými adjuvansy, antioxidanty, povrchově aktivními činidly, kondicionéry, vůněmi, činidly regulujícími viskozitu, pufrovacími činidly, konzervačními látkami apod. v množství, které nebude nežádoucím způsobem ovlivňovat strukturu liposomů, a tak připravit kosmetické nebo farmaceutické produkty, například holící krémy, holící gely, holící pudry, chemické depilační krémy apod.

Další provedení vynálezu se týká způsobů, které způsobují změny růstu savčího ochlupení a pigmentace ochlupení a které spočívají v aplikaci topicky účinné farmaceutické nebo kosmetické kompozice na povrch kůže živočicha přibližně v době indukce růstu ochlupení.

Indukce růstu ochlupení z telogenních folikul lze realizovat libovolnou v daném oboru známou metodou, například holením, voskovou depilací, chemickou depilací a jejich kombinacemi.

Ačkoliv může být doba, kdy se topicky účinná farmaceutická nebo kosmetická kompozice aplikuje na kůži, a rovněž doba, po kterou zůstane kompozice na pokožce, různě dlouhá, je odborník v daném oboru schopen aplikovat bez provádění dodatečných experimentů kompozici podle vynálezu na kůži savce, přičemž výhodně se tato kompozice aplikuje na kůži bezprostředně před, bezprostředně po nebo současně s indukcí růstu ochlupení z telogenního stavu. Výraz „bezprostředně, jak je zde použit, definuje časovou

01-2998-98 Če

9· * · · · • · · · • · · · · • · · »* ·· k * « · » ♦ · ·

Μ* * · · • · • · · · periodu odpovídající přibližně jedné hodině. Výhodněji se topicky účinná farmaceutická nebo kosmetická kompozice aplikuje bud’ současně s indukcí růstu ochlupení nebo bezprostředně po ní a ponechává se na kůží po dobu dostatečnou pro zpoždění růstu ochlupení, tj. výhodně přibližně alespoň pět minut a výhodněji přibližně alespoň patnáct minut po aplikaci.

Topicky účinná farmaceutická nebo kosmetická kompozice hv se měla aplikovat v množství účinném pro vyvolání změn v růstu ochlupení u savců a v pigmentaci ochlupení. Výraz „účinné množství, jak je zde použit, znamená množství, které je dostatečné pro pokrytí plochy pokožky, na které je žádoucí zpozdit růst chlupů a pigmentaci chlupů. Pokud je žádoucí zpozdit růst a pigmentací ochlupení, aplikuje se na kůži výhodně přibližně 2 μΐ/crn² až 8 μΐ/cm² topicky účinné složky kompozice.

Neočekávaně se zjistilo, že pokud se topicky účinná činidla, například serinproteázy, topicky aplikují na kůži živočicha přibližně v době, kdy dochází k indukci růstu ochlupení, dosáhne se zpoždění růstu a pigmentace ochlupení alespoň o 9 dní. Dále se dá předpokládat, že vzhledem k tomu, že cyklus růstu ochlupení u lidí je často pomalejší než u myší, že zpoždění vlasového růstu u lidí bude podstatně delší než 9 dní.

Zde popsaný vynález lze vhodně realizovat za absence libovolné složky, přísady nebo kroku, který zde není specificky popsán. Dále je třeba uvést, že níže uvedené příklady provedení vynálezu mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

01-2998-98 Če • * « » • I · • 9

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Depilace testovaných subjektů v myším systému

Růst ochlupení u dvanácti samiček myší C57BI/6, které poskytl Charles River (Kingston, NY) , šest až deset týdnů starých a jejichž cyklus růstu ochlupení se nacházel v klidové (telogenní) fázi, se indukoval voskovou depilací (vytrháváním srsti na zádech zvířat), k níž se použil postup Stenna a kol., popsaný v „Glucocorticoid Effect on Hair Growth Initiation: A Reconsideration, 6 Skin

Pharmacol., 125-134 (1993), Jak je známo, u myší růstová fáze (anagena) začíná souběžně ve všech chlupových váčcích v okamžiku depilace.

Tabulka 1 shrnuje pozorování, prováděná v indukčním místě.

Tabulka 1

Pozorování v indukčním místě

Počet dní po indukci	Morfologická a histologická
	pozorování v indukčním místě

1-2 (raný anagen)	Zahájení růstu nového váčku
3-4	Chlupové váčky se zcela vyvinuly, ale středové části chlupů nebyly ještě viditelné
8 (pozdní anagen)	Všechny myši měly velmi tmavou kůži; středové části chlupů byly histologicky viditelné

01-2998-98 Če · ··

»« * pokračování

11-12	Středové části chlupů začaly pronikat epidermem
14	Všechny myši byly pokryty krátkými chlupy
19	Histologicky byla pozorována regrese váčku (katagen)
21-25	Chlupový váček byl opět v klidové fázi

Jak ukazuje tabulka 1/ růst chlupů byl viditelný několik dní po depilaci, jakmile růžová kůže zvířat začala tmavnout. Toto ztmavnutí je pravděpodobně způsobeno pigmentací chlupů ve středové části chlupu, protože myši C57BI/6 měly melanocyty pouze v chlupových váčcích a nikoliv v epidermu.

Růst chlupů z klidové fáze se u dvanácti podobných myší C57BI/6 indukoval rovněž chemickou depilací pomocí depilátoru ochlupení „Nair od společnosti Carter-Wallace, který se aplikoval v množství dostatečném pro zvlhčení zad každé myší. Pří chemické depilaci nebyla ovlivněna spodní část váčku a spodní části středních částí chlupů předcházejícího cyklu zůstaly v dermu neovlivněny, dokud nebyly vytlačeny ven nově vyrostlými chlupy. Růstový vzor nového cyklu byl identický s cyklem růstu ochlupení, popsaným v tabulce 1.

Protože k odchylkám v cyklu vlasového růstu u myší dochází nejen mezi jednotlivými druhy ale rovněž mezi jednotlivými zvířaty, pomocí nůžek se z každé myši izoloval vzorek kůže o rozměrech 2 cm x 1 cm, který se fixoval 10% pufrovaným formalinovým roztokem s pH hodnotou při 25°C

01-2998-98 Če přibližně 6,9 až 7,1, od společnosti Stephens Scientific, a následně se zabudoval známými postupy do parafinového bloku. Tento blok se následně rozřezal pomocí mikrofonu, zabarvil barvivém H&E a histologicky analyzoval za účelem ověření fáze cyklu růstu ochlupení. Histologické výsledky, získané v tomto příkladu, jsou znázorněny na obr. 3A.

Tento příklad ukazuje, že cyklus růstu chlupů u myší C57BI/5 trvá přibližně dvacet pět dnů a že načasování vývoje chlupového váčku a střední chlupové části není závislé na způsobu použité depilace.

Příklad 2

Příprava topicky účinných kompozic

Dostatečné množství lyofilizovaného trypsinu od společnosti Sigma-Aldrich Corporation se vmísila do pufrovaného vodného roztoku 0,5 M kyseliny N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonové od společnosti Life Technologies, jejíž obchodní označení je „Hepes, takže pH hodnota výsledného roztoku byla přibližně 7,4 a koncentrace trypsinu v roztoku byla přibližně 2 % (hmotn./obj.). Jeden objem výsledného trypsinového roztoku se následně smísil s jedním objemem (5 %) liposomů tvořených glyceroldilaurátem, cholesterolem a polyoxyethylenem-10-stearyletherem ve vodném vehikulu , které se připravily Niemiecovým způsobem, čímž se získala finální topicky účinná kompozice obsahující 1 % (hmotn./obj.) trypsinu.

« v

01-2998-98 Če « ·· · · · * · * · * · • * ·<« · · · · · * ··· ··· * « ·♦··· * *

Příklad 3

Doprava trypsinu do chlupových váčků

Dvanáct dní po vytrhání chlupů z plochy (6 cm x 2 cm) kůže čtyř sedm až osm týdnů starých samiček myší C57BI/6, které dodal Charles River (Kingston, NY), se na tyto plochy aplikovalo přibližně 100 pm/rnyš topicky účinné kompozice z příkladu 2. Trypsin, použitý v tomto příkladu, byl fluorescenčně značený pomocí FluoReporter protein labelling kit od společnosti Molecular Probes, lne. a doprovodného protokolu (1997) a za použití fluorescenčního isothíokyanátu (FITC) jako fluorescenčního značení, rovněž od společnosti Molecular Probes, lne.

Jednu až čtyři hodiny po aplikaci fluorescenčního trypsinu se z každé myši izoloval vzorek kůže o rozměru 2 cm x 1 cm, který se zabudoval do parafinového bloku a následně rozřezal pomocí mikrofonu a histologícky analyzoval za použití postupu popsaného v příkladu 1.

Jak ukazuje obr. 1, téměř všechno fluorescenční značení se nachází ve chlupovém váčku. Myši, které se testovaly po jedné hodině (obr. 1C) a po čtyřech hodinách (obr. 1A) vykazovaly identické vzory histologického zabarvení bez žádného dalšího pozdějšího pronikání pod kůži. Tyto výsledky stojí proti možné digeraci nespecifické extracelulární matrice proteázou, která by pravděpodobně vykazovala hlubší penetraci fluorescenčního barviva do stratae corneae v pozdějším stadiu.

Tento příklad se zopakoval na čtyřech podobných samicích C57BI/6 sedm až osm týdnů starých myší ale s tou výjimkou, že se tyto myši denně, od dvanáctého dne po

01-2998-98 Ce

φφ indukci, ošetřovaly 1% (hmotn./obj.) tripsynem z příkladu 2. Čtyři hodiny po aplikaci fluorescenčního trypsinu, dvanáctý den po indukcí, se kůže myší analyzovala za použití podobných histologických metod. Jak ukazuje obr. IB, u dopravní cesty trypsinu do chlupových váčků ošetřené kůže nebyly pozorovány žádné podstatné změny. Nicméně minimální zabarvení na vnější části stratae corneae trypsinem ošetřené kůže naznačilo určitou ztrátu bariérové integrity.

Tento příklad ukazuje, že aplikace topicky účinné kompozice obsahující trypsin na povrch kůže anagenních zvířat způsobuje dopravu trypsinu přímo do chlupového váčku jak krátkodobě, tak dlouhodobě.

Příklad 4

Trypsin zpožďuje růst ochlupení a pigmentaci ochlupení

Na dvanáct samiček C57BI/6 sedm až osm týdnů starých myší se bezprostředně po indukci růstu ochlupení, způsobem popsaným v příkladu 3, aplikovala jedna dávka topicky účinné kompozice připravené v příkladu 2.

Jak ukazuje obr. 2, jedna aplikace trypsinu, aplikovaného po indukci růstu ochlupení, zpožďuje jak růst chlupů, tak pigmentaci chlupů. Tmavší barva kůže naznačuje progresivnější stadium cyklu růstu ochlupení, které předchází zviditelnění středových částí chlupů. Neošetřené a liposomem (vehikulem) ošetřené kontrolní myši měly sedmý až osmý den po indukci růstu ochlupení tmavou kůži (obr. 2A; levá myš je ošetřená a pravá je neošetřená) , zatímco středové části chlupů byly viditelné jedenáctý až »· • · φ φφφφ to φ · φ · φ φ Φ ·

ΦΦ

01-2998-98 Če φ φ Φ · φ φ φ Φ φφφ »·· « ♦ «· ·· • I ·* « φ φ * φ · · · φ φ φφφ φ φ · φφ ·· třináctý den (obr. 2Β; levá myš je neošetřená,' střední je ošetřena vehikulem; pravá je ošetřena účinnou látkou}. Trypsinem ošetřená zvířata, která zůstala růžová až do osmého dne po indukci (obr. 2A, levá myš), jedenáctý den mírně ztmavla (obr. 2B; pravá myš) a čtrnáctý den měla šedou kůži (obr. 2C; pravá myš). Patnáctý až sedmnáctý den byly u myší ošetřených trypsinem poprvé viditelné středové části chlupů, které byly tenčí a jejichž množství bylo menší než u kontrolních myší, nicméně po dalších čtyřech až sedmi dnech nebyly tyto středové části chlupů téměř odlišitelné od kontrolních, pokud jde o posuzování všech vlastností s výjimkou délky.

Tento příklad ukazuje, že trypsin je účinný jak pří zpožďování růstu ochlupení, tak při zpožďování pigmentace ochlupení.

Příklad 5

Histologie chlupových váčků ošetřených trypsinem

Na tří samičky C57BL/6 sedm až osm týdnů starých myší se po indukci růstu ochlupení, způsobem popsaným v příkladu 3, aplikovala jedna dávka topicky účinné kompozice připravené v příkladu 2.

Od neošetřených myší, myší ošetřených vehikulem (není znázorněno) a myší ošetřených trypsinem se získal vzorek kůže o rozměrech 1 cm x 2 cm, který se zabarvil pomocí H&E a následně histologicky analyzoval za použití postupu popsaného v příkladu 1. Jak ukazuje obr. 3, histologická analýza zabarvených vzorků je důkazem toho, že vývoj chlupových váčků u myší ošetřených trypsinem se značně ·

01-2998-98 Če zpozdil. Konkrétněji, charakteristická vrstvená struktura, rozšířená folikulární papila a nová pigmentace ochlupení, byly prvně spatřeny o několik dní později než u neošetřených a vehikulem ošetřených kontrolních myší. Kromě toho váčky v kůží trypsinem ošetřených myší ukazovaly vymizení ínfundibula, jak je nejlépe patrné na obr. 3B (a-e), k němuž nedocházelo u neošetřených a vehikulem ošetřených myší, jak ukazuje obr. 3A (a-b). Z těchto pozorování lze usuzovat, že ošetření kompozicí obsahující trypsin má rovněž za následek růst chlupů se zhoršenou kvalitou, tj. tenčích. Sedmý až osmý den po ošetření trypsinem spodní část některých ošetřených folikul začala tvořit epitelovou vrstvenou strukturu, jak ukazuje obr. 3B (d-e), ale horní část se stále jevila jako prázdná struktura, jak nejlépe ukazuje obr. 3B (d) . Jedenáctý až dvanáctý den po ošetření trypsinem většina ošetřených folikul dozrála, ale stále vykazovala sníženou pigmentaci ochlupení a kratší středovou část chlupu, které odpovídaly vlastnostem neošetřeného váčku čtvrtý až pátý den po indukci (srovnání obr. 3A (d) a obr. 3B (f)).

Tento příklad dále ukazuje prostřednictvím histologické analýzy, že topická aplikace trypsinu na kůži myší, u nichž byl indukován růst ochlupení, podstatně zpožďuje růst ochlupení a pigmentaci ochlupení.

Příklad 6

Trypsin indukuje apoptózu ve folikulární papile

Na povrch kůže tří samiček C57BL/6 sedm až osm týdnů starých myší se po indukci ochlupení způsobem popsaným v

01-2998-98 Če

• · * příkladu 3 aplikovala jedna dávka topicky účinné kompozice připravené v příkladu 2.

Vzorky kůže neošetřených myší a trypsinem ošetřených myší o rozměrech 1 cm x 2 cm se získaly postupem popsaným v příkladu 1 a následně analyzovaly postupem „TUNEL (TdTmediated dUTP-biotin nick end labellíng), kterou popsal Gavrieli a kol. v „Identification of Programmed Cell Death in sítu Via Specific labellíng of Nuclear DNA Fragmentation, 119 JI. Cell Biology 493-501 (1992) („Gavrieli). Během tohoto postupu se připravené řezy kůží zabarvily pomocí „ApopTag Plus InSitu Apoptosis Detection Kit od společnosti Oncor, lne. způsobem, specifikovaným v „ApopTag Plus InSitu Apoptosis Detection Kit protokol společností Oncor, lne. (únor 1995), jehož podstatou je značení konců fragmentů DNA, které popsal Gavrieli. Obr. 4 ukazuje histologickou analýzu, při které vybarvení zahrnuje hnědý peroxidázový koncový bod a zelené methylové protizabarvení.

Podobné parafinové řezy, vhodné pro barvení „TUNEL se připravily z kůže neošetřených myší. Tyto řezy se zabarvily a histologicky analyzovaly. Získané výsledky jsou znázorněny na obr. 4A (a-c).

Jak ukazuje obr. 4, vzorky zabarvené metodou „TUNEL definovaly apoptotické buňky morfologicky (kondenzovaná nebo fragmentovaná jádra a cytoplasma nebo apoptotická těla) a na základě barvy jejich zabarvení (fragmenty DNA v kondenzovaných jádrech se zbarvily hnědě). Konkrétněji, obr. 4B (a-e) ukazuje, že apoptotická těla bylo možné u ošetřených folikulárních papil detekovat po celý první týden po indukci růstu ochlupení. Nicméně žádné další části váčku, epidermu nebo dermu nebyly trypsinovým ošetřením • ·

01-2998-98 Če • « * · · ovlivněny. Na druhou stranu, jak ukazuje neošetřený vzorek zabarvený metodou „TUNEL na obr. 4A (a-c), v neošetřených, raně anagenních folikulách byla příležitostně detekována nízká hladina apoptózy, nicméně k této apoptóze docházelo vždy ve zúženém miste folikuly a tedy přesně nad folikulární papílou. Většina neošetřených folikul nevykazovala žádnou buněčnou smrt.

Tento příklad ukazuje, že aplikace trypsinu na depilovanou kůži vede ke zvýšení apoptických obrazů ve folikulární papile trypsinem ošetřených folikul v porovnání s neošetřenými nebo vehikulem ošetřenými kontrolními vzorky.

Příklad 7

Trypsin indukuje změny v genové expresi během cyklu růstu ochlupení

Na povrch kůže šesti samiček C57BL/6 sedm až osm týdnů starých myší se po indukci ochlupení způsobem popsaným v příkladu 3 aplikovala jedna dávka topicky účinné kompozice připravené v příkladu 2.

V časových intervalech naznačených na obr. 5 se získaly, stejně jako v příkladu 1, vzorky kůže neošetřených myší a trypsinem ošetřených myší, z nichž se následně extrahovaly pomocí reakčního činidla „RNA Stat-60 (od společnosti Tel-Test „B) celé RNA způsobem, který popsal Chomczymski v „Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidium Thiocyanate-phenol-chloroform Extraction, 162 Anal. Biochem. 156-159 (1987). Do RNA, extrahované z jednotlivých myší, se následně přidalo, způsobem popsaným v

01-2998-98 Če „RNase-free DNase protokolu, publikovaném společností Promega Corporation (květen 1995), dostatečné množství RNázy prosté DNázy od společnosti Promega Corporation s obchodním označením „RQ1 RNase-free DNase, takže každý produkt obsahoval 200 ng DNázované RNA. Výsledných 200 ng DNázované RNA se reverzně přepsalo postupem popsaným v „Superscript II Reverse Trancriptase protokolu publikovaném společností Gibco-BRL (nyní součástí Life Technologies) (duben 1992) a za použití nahodilých hexamerů, například nahodilých primerů, které jsou komerčně dostupné od společnosti Life Technologies, lne.

Výsledné RT produkty se následně amplifikovaly polymerázovou řetězovou reakcí („PCR) za použití přibližně 0,5 jednotky (na 100 μΐ reakční směsi) termostabilní DNA polymerázy, která je komerčně dostupná od společnosti Perkin-Elmer-Cctus Corporation pod obchodním označením „Taq Polymerase a přibližně 0,1 pmol/reakční směs genově specifických primerů od společností Clontech Laboratories lne. („Clontech) nebo navržené způsobem, který naznačuje tabulka 2, za použití postupů popsaných v protokolu, který doprovází primery od společnosti Clontech, určené pro myši glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (G3PDH), transkripční faktory a cytokiny nebo primery, popsané v tabulce 2.

Tabulka 2 ukazuje některé z použitých DNA primerů, množství chloridu hořečnatého pro PCR reakci a délku PCR cyklu.

« ·

01-2998-98 Če « · · • fl · · « · · • · · · ·

Tabulka 2

DNA primery použité v

RT-PCR testu***

Primer (viz přiložený sekvenční protokol)	Množství MgCls (mM)	Cyklus (min) 0°C	Počet cyklů	DNA SEQ ID NO:
Smyslná transglutamináza AACCCCAAGT TCCTGAAG	2,5	1 0 94; 2 @ 55; 3 0 72	35	1
Protismyslná transglutamináza TTTGTGCTGG GCCACTTC	2,5	1 0 94; 2 0 45; 3 0 72	35	2
Smyslná tyrosináza TCAGCCCAGC ATCCTTCTTC	5	1 0 94; 2 0 45; 3 0 72	35	3
Protismyslná tyrosináza CAGCCATTGT TCAAáAATAC TGTCC	5	1 0 94; 2 0 55; 3 0 72	35	4
Smyslný propiomelanokortin („PCMC) AAAAGAAGAG AGAAGAGCGA C	2,5	1 0 94; 2 0 55; 3 0 72	35	5
Protismyslný PCMC AGAGCTGAGA	2,5	1 0 94; 2 0 55; 3 0 72	35	6
Smyslná kolagenáza AAGACCCCAA CCCTAAGCAC	2,5	1 0 94; 2 0 53; 3 0 72	35	7
Protismyslná kolagenáza CAGCACTGAC GGTTTTCACC	2,5	1 0 94; 2 0 53; 3 0 72	35	8

01-2998-98 Če »· ·· • · · « · · • ··♦

PCR produkty se následně analyzovaly 2% agarózoethidiumbromidovými gely za použití metod, v tomto oboru známých pro porovnání hladiny exprese určitých genů během cyklu růstu ochlupení myší ošetřených trypsinem a neošetřených myší. Pokud to bylo nezbytné pro lepší vízualizaci, potom se výsledné PCR produkty vysrážely za použití známých postupů ethanolem. Pokud se použily primery pro G3PDH, potom se použilo pouze 10 % PCR reakčních produktů. RNA vzorek, získaný z kůže samic C57BL/6 sedm až osm týdnů starých myší, který se nepodrobil reverzní transkripci, se použil jako negativní kontrola pro jednotlivé PCR amplifikace. RNA V2orek, získaný z kůže Šestiměsíční samice myši C57BI/6, která měla nesynchronizovaný cyklus růstu ochlupení, se použila jako pozitivní kontrola v případě, že pozitivní kontroly nebyly komerčně dostupné. Migrace RT-PCR produktů na gelech byla vždy identická s migrací pozitivních kontrol a s migrací zaznamenaných velikostí amplimeru.

Relativní množství jednotlivých RT-PCR reakčních produktů se následně porovnala analyzováním mRNA hladiny G3PDH, tj . „provozního genu, v jednotlivých produktech. Jak ukazuje obr. 5, G3PDH genová exprese byla ve všech analyzovaných časových obdobích podobná, což umožnilo provést srovnání relativních hladin genové exprese pro požadované geny.

Aby se ověřilo, zda zpoždění folikulárního vývoje není výsledkem nespecifického podráždění nebo zánětlivé odezvy, provedla se analýza mRNA koncentrací genů, které jsou zpravidla během těchto situací zvýšené. Na základě analýzy mRNA hladin genů RT-PCR produktů se zjistilo, že nedošlo k

I· «· *» ·· ·· »·

01-2998-98 Če ί ί ί * ϊ ί : ’ *·

,. .. ·· *· ·· ·· žádné změně u mRNA hladin IL-6, IL-10 a GM-CSF, k mírnému zvýšení TNFa, mírnému snížení TNFP a TNF-RI a střednímu snížení makrofágového indukovatelného proteinu (MIP), jak ukazuje tabulka 3.

Tabulka 3

Vzory genové exprese

Gen	Neošetřený	Ošetřený trypsinem
IL-6	-	-
IL-10	+/-	+ /-
GM-CSF	-	-
TNFa	+/-	+
ΤΝΕβ	+	v-
TNF-RI	+/-	+/- -
TNF-RII	-	-
MIP	4-	-
IL-la	+	+ +
IL-Ιβ	+/-	+ + +
I1-1R	-	-
IFNy	-	+ + +
c-myc	+	-
c-myb	+ +	+
c-fos	+	+/-
c-jun	+/-	+
Kolagenáza	+	+/-
Tyrosináza	+ + +	+ / ^_
POMC	+	+/-
Transglutamináza	+	+

01-2998-98 Če * Poznámka

RT-PCR je pouze semikvantitativní a srovnání jsou platná pouze pro jednotlivé amplifikované sekvence v různých cyklech růstu ochlupení ale nikoliv mezi různými geny.

nedetekovatelná expres +/- - velmi slabý pás +/- slabý pás + silný pás + + silnější pás + + + velmi silný pás

Profil genové exprese v tabulce 3 vyvrací domněnku, že by bylo zpoždění růstu ochlupení způsobeno zánětlivou reakcí nebo odezvou na dermální podráždění.

U hladiny IL-Ία mRNA (obr. 5B a tabulka 3), genu souvisejícího s inhibici růstu ochlupení v kultuře, bylo pozorováno mírné zvýšení. Vzhledem k tomu, že IL-Ία indukce by mohla být rovněž důsledkem ztráty epidermální bariérové funkce, provedla se analýza bariérové integrity, k níž se použilo měření ztráty transepidermální vody (TEWL). TEWL se měřila pomocí výparoměrů „Evaporimeter EPI od společnosti Servomed AB tak, že se výparoměr nejprve normalizoval okolní vlhkostí a následně se na dorsální kůži testovaného subjektu umístila sonda. Výsledky ukázaly pouze střední zvýšení TEWL, které, jak ukazuje tabulka 4, neodpovídalo koncentraci trypsinu.

01-2998-98 Če «· ··

I · » *«· ···

Tabulka 4

TEWL v trypsinem ošetřené kůži

Ošetření	Velikost vzorku	TEWL
Neošetřený	6	27,1 + 3, 8
0,01% Trypsin	L	3 6,89 + 4,6
0,1% Trypsin	4	43,2 + 5,2
0,5% Trypsin	4	34,53 + 4,9
1% Trypsin	4	37,5 + 3,9
1% Trypsin - inaktivní (mírný)	3	33,99 + 6,2

Je tedy pravděpodobné, že veškeré zvýšení IL-Ια v testovaném RT-PCR produktu, jak ukazuje tabulka 3 a obr. 5, souvisí s ínhibicí růstu ochlupení.

Jak ukazují obrázky 5A až 5B a tabulka 3, k podstatnějšímu zvýšení hladin mRNA došlo u IL-Ιβ a IFNy. Je známo, že k tomuto zvýšení dochází v případě Alopecie Areaty a že souvisí s ínhibicí vlasového růstu. Z toho dále vyplývá, že trypsinem byly zvýšeny pouze ty geny, které jsou spojovány jak se záněty, tak s ínhibicí růstu ochlupení.

Jak ukazuje tabulka 3, po celou periodu prodlevy byly mírně sníženy mRNA hladiny c-myb, c-myc a c-fos, zatímco hladina c-jun byla mírně zvýšena. Kolagenáza, tj . gen regulovaný AP-1 odezvovým prvkem, byla rovněž mírně snížena. Tato pozorování, která ukazují obecně na mírné snížení hladin mRNA několika genů, dále odráží celkové zpomalení růstu ochlupení na kůži ošetřené trypsinem.

• ·

01-2998-98 Če ·· • ♦ ·

Jak ukazuje obr. 5A a tabulka 3, hladina tyrosinázy, tj. klíčového enzymu pro pigmentaci ochlupení, se během prodlevové periody růstu ochlupení snížila a jakmile folikuly začaly překonávat prodlevu, hladina její mRNA se zvýšila. Hladina POMC, tj . prekurzoru melanogenního peptidmelanocvtového stimulačního hormonu (MSH), byla po celou periodu prodlevy středně snížena (viz obr. 5A a tabulka 3). Snížení hladiny těchto dvou genů naznačuje, že trypsin rovněž ovlivňuje regulaci pigmentace ochlupení.

Tento příklad ukazuje, že trypsinové ovlivnění cyklu růstu ochlupení lze vysvětlit na základě analýzy expresního vzoru řady genů po dobu prodlevy. Trypsinem indukované změny v koncentracích mRNA během cyklu růstu ochlupení, které byly jasně doloženy, staví trypsin do role regulátoru růstu ochlupení a pigmentace ochlupení. Navíc tento příklad dále odráží specifičnost topické aplikace trypsinu pro geny růstu ochlupení a pigmentace ochlupení.

Příklad 8

Další serinproteázy, které ovlivňují růst ochlupení

Na povrch kůže samiček C57BL/6 sedm až osm týdnů starých myší se po indukcí růstu ochlupení způsobem popsaným v příkladu 3 aplikovala jedna dávka topicky účinné kompozice připravené v příkladu 2.

Zopakoval se postup z příkladu 3 ale s tou výjimkou, že se trypsin nahradil karboxypeptidázou-Y, proteázou IV resp. subtilysinem.

ΦΦ ·· » Φ · » φ Φ·· • Φ · φ · φ

01-2998-98 Če ί Ζ’** φ Φ φ ·

Osm dní po ošetření se kůže jednotlivých myší analyzovala pomocí chromametru Minolta Chromameter Model CR300 s cílem porovnat barvu kůže jednotlivých myší.

Ukázalo se, že trypsin, tj. člen endopeptidázové rodiny, který stříhá protein v C-místě argininu a lysinu, indukoval nejdelší prodlevu v cyklu růstu ochlupení. Na druhé straně karboxypeptidáza-Y, která hydrolyzuje L-aminokyseliny na C-koncích proteinů, a proteáza IV, tj . člen nespecifické endopeptidázové rodiny, který stříhá 56 % peptidových vazeb při neutrálním pH, mají pouze minimální zpožďující efekt, zatímco subtilysin, tj. člen nespecifické peptidázové rodiny, který stříhá peptidázové vazby při alkalickém pH, pouze mírně zvyšuje rychlost růstu ochlupení. Výsledky tohoto příkladu jsou shrnuty v tabulce 5.

φ· · ♦♦· * ♦ «· ··

Tabulka 5

Měření barvy kůže ošetřené serinproteázou

Ošetření	Velikost vzorku	L*
Neošetřený	6	49 ± 0,30
1% Trypsin	6	56,1 ± 0, 81
1% Subtilysin	4	42,9 ± 2,87
1% Endopeptidáza	4	51,8 ± 0,11
1% Karboxypeptidáza-Y	4	51,9 ± 0,47

(Stupnice L*: 0 = černá a 100 = bílá, je míra pigmentace ochlupení, jak je patrná z povrchu kůže.)

Jak ukazuje tabulka 5, trypsinem ošetřené chlupové váčky byly nejméně vyvinuté a udílely kůži světlejší barvu.

II ·· • · ·* ·· • · · ·

01-2998-98 Če ί : ϊ ·· ·

Z tohoto příkladu vyplývá, že vzhled barvy kůže souvisí s vývojem chlupů v chlupovém váčku.

Vzhledem k tomu, že výsledky, získané pro kůži ošetřenou trypsinem, ukázaly že trypsin je relativně zcela výjimečný při zpožďování růstu ochlupení a pigmentace ochlupení, podporuje tento příklad předpoklad, že vliv trypsinu na růst ochlupení a pigmentaci ochlupení nemusí být výlučně výsledkem nespecifické proteolytické digerace ale mohl by být spíše důsledkem specifické aktivity indukované trypsinem, která způsobí aktivaci cesty programované buněčné smrti.

Příklad 9

Trypsin ovlivňuje raný krok při indukci růstu ochlupení

Na povrch kůže tří samiček C57BL/6 sedm až osm týdnů starých myší se po indukci růstu ochlupení způsobem popsaným v příkladu 3 aplikovala jedna dávka topicky účinné kompozice připravené v příkladu 2. Tento postup se zopakoval na devíti dalších myších, u kterých se ale ošetření opakovalo dvakrát, třikrát resp. sedmkrát za týden. Pozorování barvy kůže myší, prováděné osm dní po aplikaci, ukázalo že kůže ošetřených myší je světlejší než kůže neošetřených kontrolních myší. Z toho dále vyplývá, že trypsinem ošetřené chlupové váčky byly nejméně vyvinuté a udílely tedy kůži světlejší barvu.

Způsobem popsaným v příkladu 1 se připravily vzorky kůže příslušným způsobem ošetřených myší o rozměrech 1 cm x 2 cm, ty se následně obarvily barvivém H&E a následně histologícky analyzovaly. Výsledky histologické *4

01-2998-98 Ce

Φ Φ φ φ φφφ φφ ·· « φ · * φφφ· • · * · · φ · · · • · · analýzy obarvených vzorků podporují fakt, že další denní ošetření zvířat trypsinem již neprodloužilo prodlevu v růstu ochlupení. To naznačuje, že indukce buněčné smrti, způsobená serínproteázou, je výsledkem specifické a načasované události.

Za účelem stanovení načasování této specifické události se na povrch kůže samiček C57BL/6 sedm až osm týdnů starých myší, po indukci způsobem popsaným v příkladu 3, aplikovala jedna dávka topicky účinné kompozice popsané v příkladu 2, přičemž tato dávka se aplikovala v různých časových intervalech, které jsou naznačeny v tabulce 6.

Jak ukazuje tabulka 6, výsledky chromametrických měření barvy kůže prováděných způsobem popsaným v příkladu 8 demonstrují ztmavnutí (více pigmentu, kratší prodleva) a zkrácení prodlevy, které odpovídá prodloužení doby mezi indukcí růstu ochlupení a aplikací trypsinu. Myši ošetřené bezprostředně po indukci růstu ochlupení vykazovaly nejdelší prodlevu v růstu ochlupení a pigmentace ochlupení. Myši ošetřené dvě hodiny až čtyři hodiny po indukci růstu ochlupení rovněž vykazovaly zpoždění, ale čím delší byla prodleva mezi indukcí růstu ochlupení a aplikací trypsinu, tím kratší byl cyklus růstu ochlupení. Myši ošetřené šest nebo více hodin po depilaci nevykazovaly žádné zpoždění růstu ochlupení a byly nerozlišitelné od neošetřených kontrolních myší.

01-2998-98 Če »* ·· ·· ♦· * · · · · · · .

• · · · · · ! · · · »·· . · · · · * · · · · · *

.. i· ·· ·· ·· • · · · • · · · • ·

Tabulka 6

Měření barvy kůže** ošetřené trypsinem

Ošetření	Velikost vzorku	Ih
Neosetřený	6	49 ± 0, 32
1% Trypsin, bezprostředně po ošetření	6	56,1 ± 1,54
1% Trypsin, po 2 hodinách	4	54,4 ± 1,30
1% Trypsin, po 4 hodinách	4	53, 3 ± 1,23
1% Trypsin, po 6 hodinách	4	48,0 ± 2,01
1¾ Trypsin, po 18 hodinách	4	49,2 ± 1,07
1% Trypsin, po 48 hodinách	4	50,4 ± 1,01

** Vzorky kůže se testovaly osm dní po depilaci.

Tento příklad ukazuje, že aplikace trypsinu na kůži je účinná v případě zpoždění růstu ochlupení a pigmentace ochlupení, pokud se aplikuje přibližně během čtyř hodin po indukci růstu ochlupení a výhodně bezprostředně po této indukci.

Přiklad 10

Trypsinový účinek může receptorem zahrnovat cestu mediovanou sedm až osm týdnů ochlupení způsobem

Na povrch kůže samiček C57BL/6 starých myší se po indukci růstu popsaným v příkladu 3 aplikovala jedna dávka topicky účinné kompozice připravené v příkladu 2 s tou výjimkou, že se koncentrace trypsinu měnila od 1 % (hmotn./obj.) do 0,01 %

·« • 0 0 0

01-2998-98 Če ; · '··· .· ·· (hmotn./obj . ) (4 x 10⁴M až 4 x 10^_5M) . Devět dní po depilaci se myši kolorimetricky analyzovaly za použití způsobu popsaného v příkladu 9.

Jak ukazuje tabulka 7, výsledky kolorimetrické analýzy ukazují zvýšení jasnosti kůže (L*, více bílé, méně pigmentu), které odpovídá snížení koncentrace trypsinu a prodloužení prodlevy cyklu růstu ochlupení.

Tabulka 7

Měření barvy trypsinem ošetřené kůže*^

Ošetření	Velikost vzorku	L*
Neosetřený	6	45 + 0,97
0,01% Trypsin	4	48,6 ± 1,01
0,1% Trypsin	d	4 9,5 ± 1, 07
0,5% Trypsin	4	47,7 ± 0,3
1% Trypsin	4	47,9 ± 0,08
1% Trypsin - inaktivní (mírně)	3	52,2 ±0,17

Stupnice IM: 0 = černá, 100 = bílá ** Vzorky se analyzovaly devět dní po depilací

Z tohoto příkladu vyplývá přítomnost mechanizmu mediovaného receptorem, který zahrnuje znecitlivění vyššími dávkami.

01-2998-98 Če

Příklad 11

Proteolytická aktivita trypsinu není nezbytná pro zpoždění růstu ochlupení

Potom, co se kompozice z příkladu 2 48 hodin inkubovala při pokojové teplotě, se analyzovala její proteolytická aktivita pomocí detekční sady „Serme Protease Activity Detection Kit od společnosti PanVera Corporation a výsledky této analýzy ukázaly, že v přípravku nebyla detekována žádná proteolytická aktivita. Inaktivní kompozice se po indukci růstu ochlupení aplikovala způsobem popsaným v příkladu 10 na povrch kůže tří samiček C57BL/6 sedm až osm týdnů starých myší. Devět dní po depilaci se myši kolorimetricky analyzovaly za použití postupu popsaného v příkladu 8. Jak je patrné z tabulky 7, je evidentní, že nedostatek proteolytické aktivity trypsinu neredukuje aktivitu tohoto přípravku, pokud jde o zpoždění růstu ochlupení.

Tento příklad se zopakoval s tou výjimkou, že se inkubovaný trypsin nahradil trypsinem, který se vařil 10 minut při teplotě 100°C. Výsledky ukázaly, že použití vařeného trypsinu, který byl rovněž proteolyticky inaktivní, nemělo žádný zpožďující účinek na růst ochlupení. Vzhledem k tomu, Že vaření denaturuje trojrozměrnou strukturu trypsinu, z výše uvedených výsledků vyplývá, že ke zpožďujícímu efektu v případe růstu ochlupení nepřispívá proteolytická aktivita trypsinu ale jeho trojrozměrná struktura. Bez ohledu na to, zda trypsin blokoval signál pro přežití nebo zda aktivoval smrtící receptor, aby indukoval tento proces, z tohoto příkladu vyplývá, že molekula trypsinu by mohla být rovněž

01-2998-98 Če

4« · ♦· · * · * • · 4 ··

4 4 ··

4 4 44 4 zodpovědná za indukci programované buněčné smrti a apoptózy ve folikulární papile.

Příklad 12

Použití kompozice obsahující trypsin

Niemiecovým postupem se připravily liposomy tvořené glyceroldilaurátem, cholesterolem a polyoxyethylen-10stearyletherem, ve kterých byly zastoupeny v poměru přibližně 58 : 15 jednotlivé složky 27.

Po ochlazení výsledných liposomů, přibližně na teplotu 40 ^eC, se za normálního míchání liposomy přidaly do určitého množství zahušťovacího činidla tvořeného polyakrylamidem (a) isoparafinem se 13 až 14 atomy uhlíku (a) laurethem-7 od společnosti Seppic lne., dodávaného pod obchodním označením „SEPIGEL 305, takže množství zahušťovacího činidla ve finální kompozici tvořilo přibližně 1 % (hmotn./obj.) až 3 % (hmotn./obj.).

Následně se přidalo dostatečné množství trypsinu pro získání 1% trypsinové (hmotn./obj.) kompozice. Tato kompozice je vhodná pro bezprostřední topickou aplikaci.

Výsledný produkt vykazoval charakteristiky a vlastnosti účinného holícího gelu.

01-2998-98 Če »·

9 9

9« «9

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob vyvolání změn v růstu ochlupení a pigmentací ochlupení u savců, vyznačený tím, že zahrnuje topíckou aplikaci účinného množství topicky účinné kompozice obsahující proteázu, na kůži savce v době dostatečně odpovídající telogenní indukci růstu ochlupení.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že proteázou je serinproteáza.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že se proteáza zvolí z trypsinu, karboxypeptidázy-Y, proteázy IV, subtilysinu nebo jejich směsí.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačený tím, že proteázou je trypsin.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že topicky účinná kompozice obsahuje přibližně 0 % (hmotn./obj.) až 5 % (hmotn./obj.) proteázy, vztaženo k celkovému objemu topicky účinné kompozice.

01—2996—99 Če

6. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že topicky účinná kompozice obsahuje přibližně 0,01 % (hmotn./obj.) až 1 % (hmotn./obj.) proteázy, vztaženo k celkovému objemu topicky účinné kompozice.

7. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že jednou z uvedených změn je zpoždění růstu ochlupení a pigmentace ochlupení.

8. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že uvedená topicky účinná kompozice dále obsahuje farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelné vehikulum,

9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelným vehikulem je liposom nebo jeho směs.

10. Způsob podle nároku 9, v y z n a č e n ý t í m , že liposom je neiontový. 11. Způsob podle nároku 10, v y z n a č e n ý t í m , že liposom je tvořen: (a) glyceroldilaurátem, glyceroldistearátem nebo jejich směsí; (b) sloučeninou mající steroidový hlavní řetězec, který se nachází v cholesterolu nebo její směs; a

01-2998-98 Če (c) ether mastné kyseliny přibližně s 12 až 18 atomy uhlíku nebo jeho směs.

12. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že liposom je tvořen:

(a) glyceroldilaurátem;

(b) cholesterolem; a (c) polyoxyethylen-10-stearyletherem.

13. Způsob podle nároku 11, vyznačený tím, že jednotlivé složky liposomů jsou přítomny v poměru přibližně 53 : 10 : 22 až 63 : 20 : 32.

14. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že topicky účinná kompozice obsahuje přibližně 0 mg/ml až 100 mg/ml farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelného vehikula, vztaženo k celkovému objemu topicky účinné kompozice.

15. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že indukce růstu ochlupení telogenního chlupu se provádí způsobem zahrnujícím holení, elektrolýzu, voskovou depilaci, chemickou depilaci nebo jejích kombinace.

16. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že dobou dostatečně odpovídající indukci růstu • ·

01-2998-98 Če telogenního chlupu je doba bezprostředně předcházející indukci růstu telogenních chlupových váčků, bezprostředně následující po této indukci nebo doba přesně odpovídající.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačený tím, Se dobou dostatečně odpovídající indukci růstu telogenního chlupu je doba indukce růstu ochlupení nebo doba bezprostředně po této indukci následující.

18. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že kompozice dále obsahuje povrchově aktivní činidla, zvlhčovadla, kondicionéry, vůně, barviva nebo jejich směsi.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačený tím, že kompozice má formu holících krémů, holících gelů, holících pudrů, chemických depilačnícn krémů a dalších produktů, jejíchž cílem je buď usnadnit odstraňování chlupů nebo chlupy skutečně odstranit, nebo jejích kombinací.

20. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že dále zahrnuje ponechání kompozice na kůži po dobu dostatečnou pro vyvolání uvedených změn.

01-2998-98 Če tím,

Způsob podle nároku 20, že touto dobou je přibližně vyznačený alespoň 15 minut.

22. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že dále zahrnuje smísení proteázy s pufrem obsahujícím kyselinu N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2ethansulfonovou, (hydroxymethyl)aminomethan nebo jejich směsi.

23. Způsob indukce programované buněčné smrti a apoptózy ve folikulární papile savce, vyznačený tím, že zahrnuje topickou aplikaci topicky účinného činidla, které má první část tvarově podobnou druhé části trojrozměrné struktury trypsinu, přičemž jak první část, tak druhá část jsou schopny přenášet signál mediovaný receptorem, na kůží savce.

24. Způsob podle nároku 23, vyznačený tím, že uvedeným činidlem je trypsin, proteolyticky inaktivní trypsin nebo jejich kombinace.

25. Kompozice, vyznačená tím, že obsahuje:

(a) topicky účinné činidlo, které má první část tvarově podobnou druhé části trojrozměrné struktury trypsinu, přičemž jak první část, tak druhá část jsou schopny přenášet signál mediovaný receptorem; a

01-2998-98 Če (b) farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelné vehikulum.

26. Kompozice podle nároku 25, vyznačená tím, že topicky účinným činidlem je trypsin, proteolyticky inaktivní trypsin nebo jejich kombinace.

27. Kompozice podle nároku 25, vyznačená tím, že topicky účinná kompozice obsahuje přibližně 0 % (hmotn./obj.) až 5 % (hmotn./obj.) topicky účinného činidla, vztaženo k celkovému objemu topicky účinné kompozice.

28. Kompozice podle nároku 25, vyznačená tím, že topicky účinná kompozice obsahuje přibližně 0,01 % (hmotn./obj.) až 1 % (hmotn./obj.) topicky účinného činidla, vztaženo k celkovému objemu topicky účinné kompozice.

29. Kompozice podle nároku 25, vyznačená tím, že farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelným vehikulem je liposom.

30. Kompozice podle nároku 29, vyznačená tím, že liposom je neiontový.

01-2998-98 Če

31. Kompozice podle nároku 30, vyznačená tím, že liposom je tvořen:

(a) giyceroldilaurátem, glyceroldistearátem nebo jejich směsí;

(b) sloučeninou mající steroidový hlavní řetězec, který se nachází v cholesterolu nebo její směs; a (c) ether mastné kyseliny přibližně s 12 až 18 atomy uhlíku nebo jeho směs.

32. Kompozice podle nároku 30, vyznačená tím, že liposom je tvořen:

(a) giyceroldilaurátem;

(b) cholesterolem; a (c) polyoxyethylen-10-stearyletherem.

33. Kompozice podle nároku 31, vyznačená tím, že jednotlivé složky liposomu jsou přítomny v poměru přibližně 53 : 10 : 22 až 63 : 20 : 32.

34. Kompozice podle nároku 25, vyznačená tím, že topicky účinná kompozice obsahuje přibližně 0 mg/ml až 100 mg/ml farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelného vehikula, vztaženo k celkovému objemu topicky účinné kompozice.

35. Kompozice podle nároku 25, vyznačená tím, že kompozice dále obsahuje povrchově aktivní

01-2998-98 Če « » · · · · · «· «* »· ♦· ·· ·· činidla, zvlhčovadla, napěňovadla, kosmetické adjuvansy, pufrovací činidla, konzervační činidla, antzoxidanty, kondicionéry, vůně, barviva nebo jejich směsi.

36. Kompozice podle nároku 35, vyznačená tím, že kompozice má formu holících krémů, holících gelů, holících pudrů, chemických depílačních krémů a dalších produktů, jejíchž cílem je buď usnadnit odstraňování chlupů nebo chlupy skutečně odstranit, nebo jejich kombinací.

37. Kompozice, vyznačená tím, že zahrnuj e:

(a) topicky účinné činidlo obsahující proteázu, která je schopná indukovat apoptózu ve foiikulární papile; a (b) farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelné vehikulum.

38. Kompozice podle nároku 37, vyznačená tím, že kompozice dále obsahuje povrchově aktivní činidla, zvlhčovadla, napěňovadla, kosmetické adjuvansy, pufrovací činidla, konzervační činidla, antíoxidantv, kondicionéry, vůně, barviva nebo jejich směsi.

39. Kompozice podle nároku 37, vyznačená tím, že proteázou je serinproteáza.

01-2998-98 Če • φ φ φφφ

40. Kompozice podle nároku 39, tím, že se proteáza zvolí peptidázy-Y, proteázy IV, subtilysinu vyzná z trypsinu, nebo jejich č e n á karboxysměsí.

41. Kompozice podle nároku 37, vyznačená tím, že topicky účinná kompozice obsahuje přibližně 0 % (hmotn,/obj.) až 5 % (hmotn./obj.) topicky účinného činidla, vztaženo k celkovému objemu topicky účinné kompozice.

42. Kompozice podle nároku 37, vyznačená tím, že topicky účinná kompozice obsahuje přibližně 0,01 % (hmotn./obj.) až 1 % (hmotn./obj.) topicky účinného činidla, vztaženo k celkovému objemu topicky účinné kompozice.

43. Kompozice podle nároku 37, vyznačená tím, že farmaceuticky nebo kosmeticky přijatelným vehikulem je liposom.

44. Kompozice podle nároku 37, vyznačená tím, že liposom je neiontový.

45. Kompozice podle nároku 43, vyznačená