JP2000515546A

JP2000515546A - 新規ホウ素酸含有核酸類及び診断剤としてのそれらの使用

Info

Publication number: JP2000515546A
Application number: JP10507945A
Authority: JP
Inventors: エル．ストロウィッツ，マーク; ジェイ．カイザー，ロバート
Original assignee: プロリンクスインコーポレイティド
Priority date: 1996-08-05
Filing date: 1997-07-31
Publication date: 2000-11-21
Also published as: EP0923591A4; EP0923591A1; CA2262618C; WO1998005672A1; US5831045A; US5831046A; AU3809097A; AU729907B2; US5876938A; CA2262618A1

Abstract

(57)【要約】標的遺伝子の検出のためのハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用である修飾されたヌクレオチド及びポリヌクレオチドが供給される。修飾されたポリヌクレオチドは、複合体形成の間、塩基の水素結合能力を妨害しない位置におけるヌクレオチド塩基に結合される少なくとも１つのホウ素酸成分を含む。修飾されたポリヌクレオチドは典型的には、天然に存在するヌクレオチド及び１又は複数の修飾されたヌクレオチドから形成される。

Description

【発明の詳細な説明】新規ホウ素酸含有核酸類及び診断剤としてのそれらの使用発明の分野本発明は、遺伝子プローブ検出の分野、そして特に、標的遺伝子の検出において有用である修飾されたポリヌクレオチドに関する。発明の背景特定のDNA及びRNA配列の検出についての核酸ハイブリダイゼーションは、現在、研究において一般的でありそして診断用途において一般的になっている。それらのハイブリダイゼーションは典型的には、ドットブロット、サザンブロット、ノザンブロット、現場ハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション及びコロニーハイブリダイゼーションのようなアッセイ型式におけるラベルされた核酸プローブの使用を包含する。種々のラベル、たとえば放射性ラベル、化学発光化合物、酵素及び螢光化合物が、それらのアッセイに使用されて来た。種々のラベルのほとんどが、核酸プローブをラベルに結合するための方法に使用される。手短に言及すれば、核酸プローブへのラベルの結合は、直接的又は間接的ないづれかの方法により達成され得る。直接的なラベリングは、典型的には、複合体の形成の前、共有結合による核酸プローブへのラベルの結合の結果である。他方では、ラベルは、挿入により複合体中に非共有的に組込まれ得る。間接的なラベリングに関しては、ハプテンが核酸プローブに結合され、そして後に、ラベルされた特異的結合タンパク質を用いて検出される。間接的ラベリングシステムの１つの例は、Langer，など.，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 78:6633-6637（1981）(この開示は引用により本明細書中に組込まれる)に記載されるビオチンーストレプタビジンシステムである。このシステムにおいては、ビオチン成分が核酸プローブに結合され、そして検出がラベルされたアビジン又はラベルされたストレプタビジンを用いて実施される。ピリミジン（たとえばウリジン）の５−位置、プリン（たとえばグアニジン）の８−位置、及びデアザプリン（たとえば７−デアザグアニジン）の７−位置にビオチンを結合するための方法は、アメリカ特許第4,711,955号、第5,241,060号、第5,328,824 号、第5,449,767号及び第5,476,928号（それらの開示は引用により本明細書中に組込まれる）に記載されている。ビオチンシステムは高い感度により特徴づけられるが、内因性の偏在するビタミン、すなわちビタミンＨが変性基として使用される。これは、特に生物学的サンプルに関して、外来のバックグラウンドシグナルをもたらす。もう１つの間接的な方法は、ハプテンジゴキシゲニンの使用を包含する（Kess ler,など.，Biol．Chem．Hoppe-Seyler 371:917-965（1990）を参照のこと）。このシステムは、ジゴシゲニン、及びジゴキシゲニンに対する羊ポリクローナル抗体に由来する抗体フラグメントを使用する。この方法はまた、ピコグラム以下の感度により特徴づけられ、そしてジギタリス植物においてのみ存在するカルデノリドジゴキシゲニンを用いることによって外来性バックグラウンドの問題を回避する。それにもかかわらず、ジゴキシゲニンは、高価な試薬である。当業界において必要とされるものは、広い適用性を有し、外来性バックグラウンドシグナルを有さず、そして親和性方法により急速に精製され得る修飾された複合体を供給するプローブ：核酸ハイブリッドの間接的ラベリングのための新規方法である。驚くべきことには、本発明は、そのような方法、並びにそこに使用されるモノマー及び修飾された核酸を提供する。発明の要約本発明は、修飾されたポリヌクレオチド、及び標的遺伝子の検出のためのハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用であるポリヌクレオチドを供給する。前記修飾されたポリヌクレオチドは、複合体形成の間、ヌクレオチド塩基の水素結合能力を妨げない位置でのそのヌクレオチド塩基に結合される少なくとも１つのホウ素酸成分を含む。その修飾されたポリヌクレオチドは典型的には、天然に存在するヌクレオチド、及び下記式：〔式中、Ｒ¹，Ｒ²及びＲ³はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、一リン酸エステル、二リン酸エステル又は三リン酸エステルであり；Nuは基、たとえばであり、ここでＸは７〜30個の炭素原子を有する結合基であり、その一部は芳香族環であり；Ｙはホウ素−含有成分、好ましくはホウ素酸（boronic acid）又はホウ素酸エステル(boronic ester)であり；そしてＰは１〜３の整数である〕を有する１又は複数の修飾されたヌクレオチドから形成される。本発明はさらに、修飾されたポリヌクレオチド、及び下記式：〔式中、Ｚは１〜1000の整数であり；個々のＲ¹¹は独立して、−Ｈ又は−OHであり；個々のＲ¹²及びＲ¹³は独立して、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、一リン酸エステル、二リン酸エステル又は三リン酸エステルであり；個々のＰ¹ 及びＰ²は独立して、−Ｐ(Ｏ)(OH)−，−Ｐ(Ｏ)(NH₂)−，Ｐ(Ｓ)(OH)−，−Ｐ( Ｏ)(CH₃)−、又は医薬的に許容できるそれらの塩であり；個々のNu¹¹，Nu¹²及び Nu¹³は独立して、アデニン、グアニン、チミン、又はシトシンであり、ここでＸは７〜30個の炭素原子の結合基であり、その一部は芳香族環であり；Ｙはホウ素−含有成分、好ましくはホウ素酸又はホウ素酸エステル成分であり；そしてＰは１〜３の整数である〕を有するポリヌクレオチドを提供する。上記ポリヌクレオチドに関して、１〜30のNu¹¹,Nu¹²及びNu¹³がアデニン、グアニン、チミン又はシトシン以外のものである。さらに、本発明は、修飾されたポリヌクレオチド、及びサンプルにおける標的核酸の存在を検出するための関連する誘導体の使用方法も提供する。図面の簡単な説明図１は、PBA-XX-dUTPの構造を示し、そしてまた、ホウ素酸複合体化剤により形成される複合体を示す。図２は、PBA-XX-dUTPの調製のための合成スケムを示す。図３は、５−アミノアリル−dUTPにより開始する他のカップリング反応を示す。図４は、標的ポリヌクレオチド検出への修飾されたポリヌクレオチドの使用を示す。図５は、親和性精製への修飾されたポリヌクレオチドの使用を示す。図６は、複合体化剤（ラベル及びホウ素酸複合体化成分）及び形成され得るラベルされた複合体を示す。図７−17は、複合体化剤及びラベルが結合され得る中間体の調製するための反応スケムを提供する。図18は、PCRを用いてのポリヌクレオチド中へのPBA-XX-dUTPの組込みを示すゲルである。図19は、ランダムプライムされたラベリング及びPBA−ラベルされたプライマーを用いてのポリヌクレオチド中へのPBA-XX-dUTPの組込みを示すゲルである。図20は、PBA-XX-dUTPのランダムプライムされたラベリング組込み及びDHBHA− セファロースによる捕獲を示すゲルである。図21は、21−マーのオリゴヌクレオチド中へのPBA-XX-dUTPのターミナルトランスフェラーゼ組込みを示すゲルである。発明の特定の記載略語次の略語が本明細書において使用される：AA、アミノアリル；PBA、フェニルホウ素酸；SHA、サリチルヒドロキサム酸；DHBHA,２，６−ジヒドロキシベンゾ −ヒドロキサム酸；PCR、ポリメラーゼ鎖反応；NHS,Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；PBA-XX-dUTP，５−（３−アミノフェニルホウ素酸スクシンアミドヘキサノイル）−アミノアリルデオキシ−ウリジン５’−三リン酸；PBA-X-dUTP，５− （３−アミノフェニルホウ素酸スクシンアミド）アリルデオキシ−ウリジン５’ −三リン酸。態様の記載核酸プローブの分野は、いくつかの最近の再考の主題であった。Nonisotopic DNA Probe Techniques，Academic Press，Chapter 1,Krichta，ed．(1992)及びN onisotopic Probing，Blotting，and Sequencing，Academic Press，Chapter 2 ，Kessler，ed．(1995)(それぞれは、引用により本明細書中に組込まれる)を参照のこと。本発明は、修飾されたポリヌクレオチドの調製のために有用である修飾された核酸モノマーを提供する。それらのポリヌクレオチドは、下記においてより詳細に記載される核酸検出方法に利用できる。修飾された核酸モノマーは、核酸の複素環式部分に結合されるホウ酸又はホウ素酸成分を含むであろう。その結合は、典型的には、７〜30個の炭素原子の長さであり、芳香族環を含み、そして任意には、１又は複数のアミド、エステル、ジスルフィド、ウレア、カルバメート、ヒドラゾン、エーテル、チオエーテル、アミン又はイミン基により中断される結合基を通して行なわれる。本明細書において使用される場合、用語“芳香族環”とは、炭素環式及び複素環式芳香族環、たとえばフェニル、ナフチル、チエニル、フラニル又はピラゾリル環を包含することを意味する。その結合基はまた、ホウ素酸基が、修飾された核酸がポリヌクレオチド中に組込まれる場合、ホウ素酸複合体化剤と共に複合体を形成することができる十分な長さのものであろう。用語 “ポリヌクレオチド”とは、デオキシリボヌクレオチド、又は５’末端から３’ 末端の方に読取られるリボヌクレオチド塩基の一又は二本鎖ポリマーを言及する。それは、自己−複製プラスミド、すなわちDNA又はRNAの感染性ポリマー、及び非機能的DNA又はRNAのポリマーの両者を含む。ポリヌクレオチドが天然に存在するモノマー核酸及び本発明の１又は複数の修飾された核酸モノマーから構成されている修飾されたポリヌクレオチドがまた供給される。本発明の修飾されたポリヌクレオチドは典型的には、10〜1000個の長さの塩基のものであり、そして１〜約30個の修飾されたモノマーを含むであろう。修飾されたモノマーの数は、ポリヌクレオチドの意図された目的を妨害するよう高くあるべきではない。ホウ素酸及びホウ素酸エステル成分は、一定の極性分子を有する複合体を形成し、そして多くのクロマトグラフィー方法において利用されて来た。それらの方法においては、ホウ素酸基が、固体支持体上に固定され、そして１，２−ジオール、１，３−ジオール、１，２−ヒドロキシ酸、１，３−ヒドロキシ酸、１，２ −及び１，３−ヒドロキシアミン、及び１，２−及び１，３−ジケトンを包含する、必要とされる官能基を有するそれらの極性分子を選択的に保持するために使用される。それらの官能基の個々は、たとえばフェニルホウ素酸と複合体を形成することが知られている。さらに、それらの官能基は、多くの生物学的分子、たとえば炭水化物、カテコールアミン、プロスタグランジン、リボヌクレオシド及びステロイドに存在する。生物学的分子の単離及び分離のためへのホウ素酸クロマトグラフィー媒体の使用は、再考されている。Singhal,など.，Adv．Chromato g．31:293-335(1992);Mazzeo,など.，BioChromatog．4:124-130(1989);及びBerg old.など.，Solid Phase Biochemistry，Scouten，ed.，John Wiley & Sons，Ne w York，pp.149-187（1983）を参照のこと。ホウ酸又はホウ素酸は、ルイス酸であり、そして三面体酸が四面体ホウ素酸アニオンに転換される水和化によりイオン化する。同様に、複合体がホウ素酸により形成される場合、そのホウ素は、ホウ素原子までの平均的な結合の長さが約10 ％長い四面体形態を採用する。より重要なことには、複合体は、多くの場合、pH 依存性態様で形成される。Lorand，など.，J．Org．Chem．24:769(1959)，Sienk iewicz，など.，J．Inorg．Nucl．Chem．42:1559-1571（1980）及びTanner，など．J．Am．Chem．Soc．89:6954(1967)を参照のこと。この性質は、下記のモノマー、ポリヌクレオチド及び方法へのホウ素酸の使用のために追加の利点を提供する。ホウ素−含有モノマー１つの態様において、本発明は、下記式：を有する修飾された核酸を提供する。この式において、Ｒ¹，Ｒ²及びＲ³はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、一リン酸エステル、二リン酸エステル、又は三リン酸エステルである。好ましい態様において、Ｒ¹は水素、ヒドロキシル又は保護されたヒドロキシルであり；Ｒ²はヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、又は一リン酸エステルであり；そしてＲ³はヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、一リン酸エステル、二リン酸エステル又は三リン酸エステルである。記号Nu は、基、たとえば、（ここで、Ｘは７〜30個の炭素原子の結合基を表わし、その少なくとも一部が芳香環である）を表わす。前記結合基は任意には、１又は複数のアミド、エステル、ジスルフィド、ウレア、カルバメート、ヒドラゾン、エーテル、チオエーテル、アミン又はイミン基により中断される。Ｙは、典型的には、ホウ素酸、ホウ素又はホウ素酸エステルであるホウ素含有成分を表わす。そのような基の例は、−Ｂ(OH)₂，−Ｂ(OH)(OR)及び−Ｂ(OR)(OR')であり、ここでＲ及びＲ’は、いくつかの態様においては、一緒に結合し、環状エステルを形成することができる１〜６個の炭素原子のアルキル基である。Ｐは、１〜３の整数を表わす。本発明のこの観点に使用される結合基は典型的には、７〜30個の炭素原子を含むであろう。好ましい態様においては、その結合基は、１又は複数のアミド、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、エステル、チオエステル、ウレア及びアミン結合により中断され、そして芳香族環で終結するアルキレン鎖である。そのような結合の例は、次のものを包含する：−CH＝CH−CH₂-NHCOAr−，−CH＝CH− CH₂-NHAr−，−CH＝CH−CH₂-Ｏ−Ar−，−CH＝CH−CONH−Ar−，−CH＝CH−CH₂- CONH−Ar−，−CH＝CH−CH₂-NHCO−（CH₂）_n−NHCO−Ar−、及び−CH＝CH−CH₂ −NHCO−(CH₂)_n−NHCO-(CH₂)_m−CONH−Ar−、ここでArは、フェニル又はナフチルである二価芳香族環を表わし、そしてｎ及びｍは独立して、１〜６の整数を表わす。より好ましくは、Ｘはであり、そしてｎ及びｍは独立して、１〜６の整数を表わす。当業者は、上記の好ましい結合がすべて、モノマーの核酸部分に隣接する不飽和の部位を含むが、本発明はそのようには限定されないことを理解するであろう。Ｘのための必要条件は、より単純には、モノマーがポリヌクレオチド中に組込まれる場合、複合体形成を妨げず、そしてＸが上記モノマーを含むポリヌクレオチドのための複合体安定性に影響を及ぼさないで、複合体化剤の結合に従事するようホウ素酸又はエステル成分（Ｙ）のに十分なクリアランスを提供することである。１つの態様のグループにおいては、−Ｘ及び−（Ｙ）_Pは一緒に取られ、そして基、たとえばを包含し、ここでＸ’は３〜23個の炭素原子を有する結合基フラグメントである。好ましい態様において、前記結合基フラグメントは、−CH＝CH−(CH₂)_n−NHCO −，−CH＝CH−(CH₂)_m−，−CH＝CH−(CH₂)_m−Ｏ−，−CH＝CH−CONH−，−CH＝ CH−(CH₂)_n−CO−，−CH＝CH−CH₂-NHCO−(CH₂)_n−NHCO−、及び−CH＝CH−CH₂- NHCO−(CH₂)_n−NHCO−(CH₂)_m−CO−であり、ここでｎ及びｍは独立して、１〜６の整数を表わす。本発明のこの観点におけるモノマーは、多くの方法により調製され得る。修飾されたピリミジン塩基（たとえば修飾されたウリジン及びシチジン）の調製に関しては、５−アミノアリル−dUTPの調製により開始する合成スケムが好ましい（ Langer，など.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78:6633-6637（1981）を参照のこと；引用により本明細書中に組込まれる）。手短に言及すれば、デオキシウリジン５’−三リン酸がまず、塩化第二水銀を用いて５−位置でクロロ水銀化され、次にカリウムテトラクロロパラデートの存在下でアリルアミンにより処理され、炭素−炭素結合形成がもたらされ、そして５−アミノアリル−dUTPが供給される。他方では、同じ方法が、たとえばデオキシウリジン、デオキシウリジン５’ −リン酸、デオキシウリジン５’−二リン酸、ウリジン５’−三リン酸、ウリジン５’−二リン酸、ウリジン５’−一リン酸、ウリジン及びそれらの対応するシチジン化合物に関して使用され得る。他の態様においては、修飾された核酸が、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン−リン酸（アメリカ特許第5,241,060号（引用により本明細書中に組込まれる）に記載されるような非−グリコシル化ファージＴ₄ DNAの酵素加水分解により調製される）、５−（４−アミノブチルアミノメチル）−２’−デオキシウリジン−リン酸（アメリカ特許第5,241,060号を参照のこと）、５−ホルミル−２’−デオキシウリジン（Mertes，など.，J．Heterocyclic Chem．1;751 （1970）(引用により本明細書中に組込まれる)を参照のこと）、及び５−（オキシ）酢酸−２’−デオキシウリジン（Deschamps,など.，J．Med．Chem．21:228( 1978)(引用により本明細書に組込まれる)を参照のこと）により開始して調製され得る。５−位置での官能基の付加に続いて、リンカーが延長され、そして適切なホウ素酸基が付加される。他方では、より類似するアプローチが取られ得、ここで所望するホウ素酸又はホウ素酸−含有成分が結合基の一部に結合され、そして次にその得られる組合せが５−アミノアリル−dUTPに結合される。図２は、PBA-XX-d UTPの調製のための合成スケムを提供する。このスケムにおいては、３−アミノフェニルホウ素酸がメチルスクシニルクロリドにより処理され、アミド２ａが供給される。エステルの続く鹸化及び活性化基Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)のカップリングは、活性化されたエステル２ｂを供給する。６−アミノヘキサン酸による２ｂの処理は、２ｃを供給し、これが５− アミノアリル−dUTPにより結合され、図１に示されるモノマー(PBA-XX-dUTPとして略される)が供給される。他方では、修飾された核酸が、Hashimoto,など.，J．Org．Chem．58:4194-419 5（1993）及びHashimoto,など.，J．Am．Chem．Soc．115:7128-7134（1993）(それらは引用により本明細書中に組込まれる)に記載される合成方法を用いて調製され得る。手短に言及すれば、修飾されたウリジン及びシチジン類似体が、その対応する５−ヨード−２’−デオキシウリジン及び５−ヨード−２’−デオキシシチジンにより開始して合成される。パラジウム触媒の存在下での適切に保護されたアミノアルキンとヨードーヌクレオチドとの反応は、さらなる拡張のための所望する炭素骨格を供給する。新しく導入されたアルキンの水素化は、炭素上パラジウム触媒上で達成され、飽和された炭素エーテルを通してヌクレオチドに結合される保護されたアミンを有する類似体が供給される。結合基の延長及びホウ素酸成分の結合の残る段階が、上記段階の次に来るであろう。当業者は、他のホウ素酸−含有種、たとえば（４−カルボキシフェニル）ホウ素酸、（３−インチオシアネートフェニル）ホウ素酸、（３−ヨードアセトアミドフェニル）ホウ素酸、（５−カルボキシ−３−イソチオシアネートフェニル）ホウ素酸及び（３−マレイミドフェニル）ホウ素酸により開始する類似する合成方法が使用され得ることを理解するであろう。それらの化合物は、市販されており、又はLinder，など.，Bioconjugate Chem．2:160-170（1991）又はLinder，など.，Bioconjugate Chem．2:407-415(1991)(それらは引用により本明細書中に組込まれる)に記載される方法により調製され得る。適切な誘導体化及び５−アミノアリル−dUTPへの結合の例は、図３に供給されている。図２及び３に供給される一般的な合成方法はすべて、ホウ素酸−含有基のための受容体として５−アミノアリル−dUTPを利用する。しかしながら、当業者は、他の適切に置換された核酸が（たとえば、市販のＮ６−（アミノヘキシル）−dATPが同様に使用され得ることを理解するであろう。修飾されたプリンヌクレオチド及びデアザプリンヌクレオチドの調製はまた、ピリミジンヌクレオシドについての上記のようにして実施され得る。プリン環のＣ８位置及びデアザプリンのＣ７位置の水銀化は記載されている。Dale，など. ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 70:2238（1973）及びDale，など.，Biochemistr y 14:2447(1975)(それらの開示は引用により本明細書中に組込まれる)を参照のこと。ヌクレオチドの水銀化に続いて、アリルアミンが上記で概略された方法を用いて、複素環に結合され得る。次に、本発明のモノマーを供給するための追加の合成が、また上記のようにして実施され得る。ホウ素−含有ポリヌクレオチドもう１つの態様において、本発明は、下記式：を有する修飾されたポリヌクレオチドを供給する。この式において、Ｚは１〜10 00の整数を表わし、そして個々のＲ¹¹は−Ｈ、又は−OHである。Ｒ¹²及びＲ¹³はそれぞれ独立して、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、一リン酸エステル、二リン酸エステル又は三リン酸エステルを表わす。Ｐ¹及びＰ²はそれぞれ独立して、−Ｐ(Ｏ)(OH)−，−Ｐ(Ｏ)(NH₂)−，−Ｐ(Ｓ)(OH)−，−Ｐ(Ｏ)(CH₃)−、又は医薬的に許容できるそれらの塩である。上記式において、個々のNu¹¹，Nu¹²及びNu¹³は独立して、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、又は下記式：を有する修飾された核酸塩基である。上記核酸誘導体は、結合基Ｘにより複素環式の環部分に結合されるホウ素−含有成分を有するように修飾される。典型的には、その結合基は、７〜30個の炭素原子から成り、その一部は芳香族環として存在する。Ｘのための好ましい基は、本発明のモノマーについて上記で記載されたものである。ホウ素−含有成分Ｙは、ホウ素酸置換基、たとえば−Ｂ(OH)₂，− Ｂ(OH)(OR)及び−Ｂ(OR)(OR')であり、ここでＲ及びＲ’は、いくつかの態様において、環状エステルを形成するために一緒に結合され得る、１〜６個の炭素原子のアルキル基である。本明細書において使用される場合、用語“アルキル”とは、直鎖又は枝分れ鎖であり得る飽和炭化水素基（たとえば、エチル、イソプロピル、ｔ−アミル、又は２−メチルフェニル）を言及する。Ｙについての好ましい基は、前記モノマーについて上記で記載されたものであり得る。本発明の修飾されたポリヌクレオチドは、少なくとも１〜30よりも多くないNu¹¹，Nu¹²及びNu¹³がアデニン、グアニン、チミン又はシトシン以外であるよう構成される。当業者は、ポリヌクレオチドにおける修飾された核酸モノマーの数が特定の用途（たとえば、種々のアッセイにおいてホウ素酸成分に究極的には結合される複合体化剤の感度）に一部、依存することを理解するであろう。さらに、修飾されたモノマーは、修飾されたポリヌクレオチドの意図された目的（たとえば標的遺伝子又は標的ポリヌクレオチドとの結合又は複合体形成）を妨害しないよう多く存在すべきである。従って、たとえば20〜30個のモノマーのポリマーは典型的には、１〜５個の修飾されたモノマーを含み、そして1000個のモノマーのポリマーは約30個までの修飾されたモノマーを含むことができる。ホウ素−含有ポリヌクレオチドの調製本発明に使用されるホウ素−含有ポリヌクレオチドは、上記ホウ素−含有モノマー及び他のヌクレオチド塩基を用いて、固相又は溶液において合成され得る。いくつかの態様においては、ホウ素−含有ポリヌクレオチドは、酵素基材の方法、たとえばPCR、ランダムプライムラベリング、テイリング又はニックトランスレーションを用いて調製される。他方では、ポリヌクレオチド合成は、市販のモノマー、たとえばＮ６−（６− アミノヘキシル）−dATPを用いて実施され得る。ポリヌクレオチドが調製された後、１又は複数のホウ素酸−含有成分が、上記方法を用いて及び次の例において、未定のアミノ基に結合され得る。固相合成ホスフィット−トリエステル、ホスホトリエステル及びＨ−ホスホネート化学によるポリヌクレオチドの固相合成のための方法の詳細な記載は広く入手できる。たとえば、Itakura、アメリカ特許第4,401,796号；Caruthers,など.,アメリカ特許第4,458,066号及び第4,500,707号；Beaucage，など.，Tetrahedron Lett.， 22:1859-1862(1981);Matteucci,など.，J．Am．Chem．Soc.，103:3185-3191(198 1);Caruthers，など.，Genetic Engineering，4:1-17(1982);Jones，chapter 2 ，Atkinson，など.，chapter 3，and Sproat，など.，chapter 4，in Oligonucl eotide Symhesis:A Practical Approach，Gait(ed.)，IRL Press，Washington D ．C．(1984);Froehler,など.，Tetrahedron Lett.，27:469-472(1986);Froehler ，など.，Nucleic Acids Res.，14:5399-5407(1986);Sinha，など.，Tetrahedro n Lett.，24:5843-5846(1983);及びSinha,など.，Nucl．Acids Res.，12:4539-4 557(1984)(それらは引用により本明細書中に組込まれる)を参照のこと。一般的には、カップリングサイクルに利用されるモノマーヌクレオチドの供給の時期及び濃度は、市販のDNA合成機に使用される市販のホスホラミジットのために典型的なプロトコールとは異ならないであろう。それらの場合、市販の合成機（たとえば、モデル380B，Applied Biosystems，Foster City，California，U SA）上に余分なホスホラミジットを供給される口上のレセプタリルにモノマー含有溶液を単に添加することができる。しかしながら、特定のモノマーのカップリング効率が他のホスホラミジットよりも実質的に低い場合、合成を最適化するために試薬の濃度又は供給の時期を変更することが必要である。低いカップリング効率を補正するためにポリヌクレオチド合成プロトコールを最適化する手段は、当業者に良く知られている。一般的に、より高いカップリング効率を達成するためには供給される試薬の濃度又は量を単に高める。たとえば、５’−ヒドロキシル保護基がジメトキシトリチル(DMT)である場合、カップリング効率は、DMT基の酸性除去の間、DMTカチオン濃度を測定することによって決定され得る。DMTカチオン濃度は通常、酸洗浄を分光光学的にモニターすることによって決定される。酸／DMT溶液は、明るいオレンジ色である。他方では、カップリングは、カップリング失敗したポリヌクレオチドのさらなる延長を妨げるので、カップリング効率は、たとえば細管電気泳動又はHPLCを用いて十分な長さのポリヌクレオチドに切断される比率を比較することによって評価され得る。固相ポリヌクレオチド合成は、多くの固体支持体を用いて実施され得る。適切な支持体は、合成されたポリヌクレオチドにおいて３’末端塩基になるであろう保護されたモノマーの結合のための官能基を供給する支持体である。支持体は、特定の合成化学に使用される試薬に対して不活性であるべきである。適切な支持体は、当業者に良く知られている。固体支持体材料は、ポリアクリロイルモルホリド、シリカ、調節された孔サイズのガラス(CPG)、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、及びカルボキシル−官能化されたテフロンを包含するが、但しそれらだけには限定されない。好ましい支持体は、アミノ−官能価された、調節された孔サイズのガラス及びカルボキシル官能価されたテフロンである。固相ポリヌクレオチド合成は、出発点として、固体支持体に結合される十分に保護されたモノマー（たとえば保護されたヌクレオチド）を必要とする。このカップリングは典型的には、３’−ヒドロキシルを通してである。典型的には、リンカー基は、一端上で３’−ヒドロキシルに共有結合され、そして他端上で固体支持体に共有結合される。次に、最初の合成サイクルは、３’−５’ホスホジエステル結合を形成する縮合反応を通して結合されたヌクレオシドの５’−ヒドロキシルに、その３’−ホスフェートを通してヌクレオチドモノマーを結合せしめる。続く合成サイクルは、最後の結合されたヌクレオチドの５’−ヒドロキシルにヌクレオチドモノマーを付加する。この態様においては、ポリヌクレオチドは、固体支持体に結合されるその３’末端を有する“成長”ポリヌクレオチドを生成する３’→ ５’方向に合成される。固体支持体にヌクレオシドモノマーを結合する多くの手段は、当業者に知られているが、但し、調節された孔サイズのガラスにスクシネート又はヘミスクシネートを通して共有結合されるモノマーが一般的に好ましい。調節された孔サイズのガラスにヘミスクシネートを通して結合される従来の保護されたヌクレオシドは、多くの源（たとえば、Glen Research，Sterling，Vermont，USA;Applied Bi osystems，Foster City，California，USA;及びPharmacia LKB，Piscataway，Ne w Jersey，USA）から市販されている。十分な長さのポリヌクレオチドが合成されるとすぐに、そのポリヌクレオチドは保護され、そして使用の前、固体支持体から切断される。切断及び保護は、いづれかの順序で同時に又は連続的に存在し得る。それらの２つの方法は、いくつかの保護基が、固体支持体から切断される前、ポリヌクレオチドから除去され、そして他の基が溶液において、切断されたポリヌクレオチドから保護解除されるよう、散在され得る。その現象の順序は、存在する特定のブロッキング基、固体支持体に対する特定結合、及び合成を実施する個人の選択に依存する。保護解除が切断より先に起こる場合、保護基は、固体支持体上に結合したまま存続するポリヌクレオチドから洗浄され得る。逆に言えば、保護解除が切断の後に起こる場合、除去された保護基は、ポリヌクレオチドと共に溶液に残るであろう。しばしば、ポリヌクレオチドは、使用の前、それらの保護基からの単離を必要とするであろう。好ましい態様において及びほとんどの商業的なDNA合成においては、５’−ヒドロキシル上の保護基は合成の最終段階で除去される。次に、ポリヌクレオチドが固体支持体から切断され、そして残る保護解除が溶液において起こる。５’− ヒドロキシル保護基の除去は典型的には、次のヌクレオチドモノマーを結合する前、末端５’−ヒドロキシル保護基を除去するために合成を通して利用される同じ試薬による処理を必要とする。５’−ヒドロキシル保護基がジメトキシトリチル基である場合、保護解除は、酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸又はトリフルオロ酢酸による処理により達成され得る。ポリヌクレオチドがリボヌクレオチドであり、そして２’−ヒドロキシル基が tert−ブチルジメチルシリル(TBDMS)成分によりブロックされる場合、後者の基は、合成の最後で、テトラヒドロフラン中、テトラブチルアンモニウムフルオリドを用いて除去され得る。Wu，など.，J．Org．Chem．55:4717-4724（1990）を参照のこと。フェノキシアセチル保護基は、アルコール中、無水アンモニアにより除去され得る（それらの条件下で、TBDUS基は安定し、そしてポリヌクレオチドは切断されない）。シチジンのベンゾイル保護基はまた、アルコール中、無水アンモニアにより除去される。切断され、そして十分に保護解除されたポリヌクレオチドは直接的に使用され得（保護解除試薬を除去するために凍結乾燥又は蒸発の後）、又はそれらは使用の前、精製され得る。合成ポリヌクレオチドの精製は一般的に、保護解除段階において除去された保護基から、及びより重要なことには、次のヌクレオチドモノマーによる結合を失敗したポリヌクレオチドが、合成の間、キャップされる場合に形成される切断されたポリヌクレオチドから、十分な長さのポリヌクレオチドを単離するために所望される。ポリヌクレオチド精製技法は、当業者に良く知られている。それらの方法は、シリカプレート上での薄層クロマトグラフィー(TLC)、ゲル電気泳動、サイズ分別（たとえばSephadexカラムを用いての）、逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）及びアニオン交換クロマトグラフィー（たとえば、mono−Ｑカラムを用いての、Pharmacia-LKB，Piscataway，New Jersey，USA）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ポリヌクレオチド精製の議論については、McLaughl in，など.，Chapter 5，及びWu，など.，Chapter 6，Oligonucleotide Synthesi s:A Practical Approach，Gait(ed.)，IRL，Press，Washington，D．C.，(1984) を参照のこと。酵素−基材の方法上記修飾されたモノマーを含む修飾されたポリヌクレオチドの合成はまた、下記に示される例に詳細に記載されるように酵素基材の方法により達成され得る。複素環式環に結合されるホウ素酸成分を含む、ピリミジン、プリン及びデアザプリンヌクレオシド三リン酸が、原核及び真核起源の広範囲の種類の精製された核酸ポリメラーゼのための基質として使用され得る。それらは、Taq DNA ポリメラーゼ、Ｅ．コリのDNAポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ４ DNAポリメラーゼ、ネズミ（Ａ−ａ）及びヒト（HeLa）細胞からのDNAポリメラーゼα及びβ、及びヘルペス単純ウィルスのDNAポリメラーゼを包含する。ニックトランスレーション、ランダムプライムラベリング、及びターミナルトランスフェラーゼティリングがまた、ポリヌクレオチド中への修飾された核酸モノマーの組込みのための有用な方法である。ニットトランスレーションは、Rigby,など.， J．Mol．Biol．113:237-251（1977）(引用により本明細書に組込まれる)に記載のように実施され得る。ランダムプライムラベリングは、修飾されたモノマーがdTTPの代わりに使用される、Feinberg，など.，Anal．Biochem．132:6-13(198 8)の方法の変法を用いて実施され得る。組込みは、DHBHA−セファロース上へのプローブ（又は修飾されたポリヌクレオチド）の捕獲により確証され得る。ティリング、又はターミナルトランスファーは、修飾された（ホウ素酸−含有）モノマーがdTTP中に希釈される、Abhay,など.，Anal．Biochem．169:376-382（1988 ）の方法を用いて実施され得る。上記のように、修飾されたモノマーの組込みは、DHBHA−セファロース上へのプローブの捕獲により確証され得る。ホウ素−含有ポリヌクレオチドを用いる方法本発明のホウ素−含有ポリヌクレオチドは、多くの診断方法に適用される。図４は、DNAプローブ検出システムへの修飾されたポリヌクレオチドの使用のための１つの用途を示す。図４ａにおいては、修飾されたポリヌクレオチドが、ランダム−プライムされたDNAラベリング、及びホウ素−含有モノマーとしてのPBA-X X-dUTPを用いて調製される。当業者は、上記モノマーのいづれか、及びポリマー形成の他の方法（たとえばニックトランスレーション、固相合成及びターミナルトランスフェラーゼ）がまた使用され得ることを理解するであろう。PBA−ラベルされたプローブの調製に続いて、ラベルされたプローブが、ハイブリダイゼーションがプローブと標的ポリヌクレオチドとの間で起こる条件下で、フィルター結合されたDNAに適用される（図４ｂ）ブロットハイブリダイゼーションが実施され得る。次に、標的ポリヌクレオチドの存在が、たとえば酵素結合された検出を用いて決定され得る。図４ｃに示されるように、ホウ素酸複合体化合物、たとえばサリチルヒドロキサム酸(SHA、ダイヤモンド形状として図４ｃに表わされる)に結合されるアルカリホスファターゼが、プローブのホウ素酸部分（図４ａ−ｃにおいて“Ｙ”により表わされる）に複合体化する。検出できる生成物を形成するアルカリホスファターゼのための基質による続く処理（図４ｃにおけるＳ→Ｐ）は、標的核酸又はポリヌクレオチドの存在が検出され得る手段を提供する。他方では、本発明の修飾されたポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの親和性精製のために使用され得、これは図５に示されている。本発明のこの観点においては、プローブは記載のようにして調製され、そして標的ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの混合物に添加される。ハイブリダイゼーションに続いて、結合されたホウ素酸複合体化成分を有する磁気ビーズが前記混合物に配置され、そしてPBA−ラベルされたプローブへの結合が生じる。ビーズ（結合されたプローブ及び標的物を有する）が磁気プレートに引き寄せられ、そして残る材料が洗浄される。さらに、修飾されたポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのピログラム量を単離し、そして検出するユニーク方法を提供するために他の精製及びラベリング方法と組合して使用され得る（下記例を参照のこと）。従って、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）標的核酸に修飾されたポリヌクレオチドをハイブリダイズし、それによりハイブリダイズされた複合体を形成するのに十分な条件下で、標的核酸に対して実質的に相補的である修飾されたポリヌクレオチドとサンプルとを接触せしめ；（ｂ）検出可能成分又はインジケーター及びホウ素酸複合体化成分を含んで成る複合体化剤と前記ハイブリダイズされた複合体とを接触せしめ；そして（ｃ）前記検出可能成分又はインジケーターの存在を検出し、それにより、標的核酸の存在を検出することを含んで成る。本発明のこの観点に使用される修飾されたポリヌクレオチドは、下記式：により表わされる。この式において、Ｚは１〜1000の整数を表わし、そして個々のＲ¹¹は−Ｈ、又は−OHである。Ｒ¹²及びＲ¹³はそれぞれ独立して、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、−リン酸エステル、二リン酸エステル又は三リン酸エステルを表わす。Ｐ¹及びＰ²はそれぞれ独立して、−Ｐ(Ｏ)(OH)−，−Ｐ( Ｏ)(NH₂)−，−Ｐ(Ｓ)(OH)−，−Ｐ(Ｏ)(CH₃)−、又は医薬的に許容できるそれらの塩である。上記式において、個々のNu¹¹，Nu¹²及びNu¹³は独立して、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、又は下記式：を有する修飾された核酸塩基である。上記核酸誘導体は、結合基Ｘにより複素環式の環部分に結合されるホウ素−含有成分を有するように修飾される。典型的には、その結合基は、３〜30個の炭素原子から成る。Ｘのための好ましい基は、本発明のモノマーについて上記で記載されたものである。ホウ素−含有成分Ｙは、ホウ素酸置換基、たとえば−Ｂ(OH)₂,−Ｂ(OH)(OR)及び−Ｂ(OR)(OR')であり、ここでＲ及びＲ’は、いくつかの態様において、環状エステルを形成するために一緒に結合され得る。Ｐは１〜３の整数を表わす。Ｙのための好ましい基はまた、モノマーについて上記で記載されたものでもある。本発明の修飾されたポリヌクレオチドは、少なくとも１〜30よりも多くないNu¹¹ ，Nu¹²及びNu¹³がアデニン、グアニン、チミン又はシトシン以外であるよう構成される。当業者は、ポリヌクレオチドにおける修飾された核酸モノマーの数が特定の用途（たとえば種々のアッセイにおいてホウ素酸成分に究極的には結合される複合体化剤の感度）に一部依存するであろうことを理解するであろう。さらに、修飾されたモノマーは、修飾されたポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチド（たとえば標的遺伝子又は標的オリゴヌクレオチド）との間で起こる複合体形成を妨害しないよう多くであるべきである。従って、たとえば20〜30個のモノマーのオリゴマーは典型的には１〜５個の修飾されたモノマーを含み、そして1000 個のモノマーのポリマーは約30個までの修飾されたモノマーを含むことができる。修飾されたポリヌクレオチドの配列は、標的ポリヌクレオチドに対して実質的に相補的である配列である。本明細書において使用される場合、用語“相補的又は実質的に相補的”とは、ヌクレオチドと核酸との間で、たとえば二本鎖DNA分子の二本の鎖間で、又は配列決定されるか又は増幅されるべき一本鎖核酸上のポリヌクレオチドプライマーとプライマー結合部位との間でのハイブリダイゼーション又は塩基対合を言及する。相補的ヌクレオチドは一般的に、Ａ及びＴ（又はＡ及びＵ）、又はＣ及びＧである。２つの一本鎖RNA又はDNA分子は、１つの鎖のヌクレオチドが最適に一直線に並べられ、そして比較され、そして適切なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って、他の鎖のヌクレオチドの少なくとも約80％、通常少なくとも90％〜95％、及びより好ましくは約98〜100％のヌクレオチドと対をなす場合、実質的に相補的であるといわれる。他方では、実質的な相補性は、RNA又はDNA鎖が、選択的ハイブリダイゼーション条件下でその補体に対してハイブリダイズするであろう場合に存在する。典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも14〜25個の長さのヌクレオチドに対して少なくとも約65％、好ましくは少なくとも約75％、より好ましくは少なくとも約90％の相補性が存在する場合に生じるであろう。M．Kanehisa，N ucleic Acids Res．12:203（1984）(引用により本明細書中に組込まれる)を参照のこと。緊縮ハイブリダイゼーション条件は典型的には、約１Ｍ以下、より通常には約 500mM以下、及び好ましくは約200mM以下の塩濃度を包含するであろう。ハイブリダイゼーション温度は５℃ほどの低さであり得るが、しかし典型的には、22℃以上、より典型的には約30℃以上、及び好ましくは約37℃以上である。より長いフラグメントは、特定のハイブリダイゼーションのためには、より高いハイブリダイゼーション温度を必要とする。他の因子がハイブリダイゼーションの緊縮性、たとえば相補的鎖の塩基組成及び長さ、有機溶媒の存在、及び塩基ミスマッチの程度に影響を及ぼすので、パラメーターの組合せが、いづれか１つのみの絶対的測定よりも重要である。ハイブリダイズされた複合体が本発明のホウ素−含有ポリヌクレオチドと標的核酸との間で形成されると、その複合体は、検出可能成分（ラベル）又はインジケーター、及びホウ素酸複合体化成分を含んで成る複合体化剤により処理されるであろう。種々のホウ素酸複合体化成分が、本発明のこの観点において有用である。複合体化のためには、複合体化成分は、ホウ素酸エステル又はジエステルを形成するためにホウ素酸基と反応することができる官能価を有すべきである。他方では、修飾されたポリヌクレオチド及び複合体化剤から形成されるホウ素酸複合体は、ホウ素リガンドの１つがアミン基、アミド基又はヒドロキサム酸エステル基の窒素原子である、ホウ素−含有三価構造体を含んで成る（図１を参照のこと）。従って、ホウ素酸複合体化剤のための好ましい官能価は、１，２−ジオール、１，２−アミノアルコール、１，３−アミノアルコール、オルト−ヒドロキシベンゾヒドロキサム酸、オルト−ヒドロキシ安息香酸、及びオルト−ヒドロキシベンズアミドを包含する。多くのホウ素酸複合体化成分が、継続出願USSN08／188,460 、08／188,531、08／188,958及び08／182,176(それぞれは、1994年１月28日に出願された；引用により本明細書に組込まれる)に記載されている。ホウ素酸複合体化成分の追加の例は、１又は複数の上記出願の一部継続出願として、1996年８月５日に出願された（アトニニードケット番号81741．P005C，81741．P006C，81 741．P007C及び81741．P008C）継続出願USSN に記載されている。複合体化剤はさらに、検出できる成分（ラベル）又はインジケーターを含むであろう。用語“検出できる成分”又は“ラベル”とは、分光分析、光化学、生化学、免疫化学又は化学的手段により検出できる組成物を言及する。たとえば、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてホウ素酸複合体化剤と共に有用なラベルは、³²Ｐ，³⁵Ｓ、螢光色素、電子密集試薬、酵素（たとえば、ELIS Aにおいて通常使用されるような）、ビオチン、ジオキシゲニン又はハプテン、及び抗血清又はモノクローナル抗体が入手できるタンパク質を包含する。本明細書に記載される核酸ハイブリダイゼーション及び接合技法への使用のために適切な広範囲の種類のラベルが知られており、そして科学及び特許文献の両者に多く報告されている。ラベルグループの個々は一般的に、ホウ素酸複合体化剤中への組込み及び標的核酸の続くラベリングのために本発明に適用できる。適切なラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、螢光成分、化学発光成分、磁気粒子、及び同様のものを包含する。ラベリング剤は任意には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、タンパク質、又は他のポリマー、たとえば親和性マトリックス、炭水化物又は脂質を包含する。得られる二本鎖核酸の検出は、いづれかの既知方法、たとえばイムノブロッティング、放射性又は生物発光マーカーの追跡、サザンブロッティング、ノザンブロッティング、サウスウエスターンブロッティング、ノースウエスターンブロッティング、又はサイズ、電荷又は親和性に基づいて分子を追跡する他の方法により進行する。使用される特定のラベル又は検出可能グループ、及び特定のアッセイは、本発明の決定的観点ではない。検出可能成分は、検出できる物理的又は化学的性質を有するいづれかの材料であり得る。そのような検出できるラベルは、ゲル、カラム、固体支持体の分野において十分に開発されており、そして一般的には、そのような方法において有用なラベルは本発明に適用できる。従って、ラベルは、分光分析、光化学、生化学、免疫化学、電気、光学、又は化学的手段により検出できるいづれかの組成物である。本発明における有用なラベルは、螢光色素（たとえばフルオレセインイソチオシアネート、Texas Red、ローダミン及び同様のもの）、放射性ラベル（たとえば³Ｈ，¹²⁵Ｉ，³⁵Ｓ，¹⁴Ｃ又は³²Ｐ）、酵素（たとえばLacZ，CAT、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及び検出できる酵素として、マーカー遺伝子生成物として又はELISAにおいて通常に使用される他のもの）、核酸挿入体（たとえば臭化エチジウム）、及び比色ラベル、たとえばコロイド状金、又は着色されたガラス又はプラスチック（たとえばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、等）ビーズを包含する。ラベルは、当業界において良く知られている方法に従って、ホウ素酸複合体化成分に直接的又は間接的に結合される。上記で示したように、広範囲の種類のラベルが使用され、そしてラベルの選択は、必要とされる感度、化合物の接合の容易性、安定性の必要条件、利用できる装置、及び捨棄規定に依存する。非−放射性ラベルがしばしば、間接的手段により結合される。一般的に、リガンド分子（たとえばビオチン）がポリマーに共有結合される。次に、リガンドが、生得的に検出できるか、又はシグナルシステム、たとえば検出可能酵素、螢光化合物又は化学発光化合物に共有結合される抗−リガンド（たとえばストレプタビジン）分子に結合する。多くのリガンド及び抗−リガンドが使用され得る。リガンドが天然の抗−リガンド、たとえばビオチン、チロキシン、及びコルチゾールを有する場合、それはラベルされた抗−リガンドと共に使用され得る。他方では、いづれかのハプテン又は抗原性化合物が抗体と組合して使用され得る。ラベルはまた、たとえば酵素又は螢光団との接合により、シグナル生成化合物に直接的に接合され得る。ラベルとしての興味ある酵素は主に、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、又はオキシドレダクターゼ、特にペルオキシダーゼであろう。螢光化合物は、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、等を包含する。化学発光化合物は、ルシフェリン、及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン、たとえばルミノールを包含する。従って、たとえばラベルが放射性ラベルである場合、検出のための手段はシンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィーにおけるような写真フィルムを包含する。ラベルが螢光ラベルである場合、それは適切な光の波長を有する螢光色素を励起し、そして得られる螢光を、たとえば顕微鏡、眼での観察、写真フィルム、電子検出機、たとえば電荷連結の装置(CCD)又は光電子増倍管及び同様のものにより検出することによって検出され得る。VLSIPS^TMアレイでの検出のためには（アメリカ特許第5,143,854 号を参照のこと；引用により本明細書中に組込まれる）、螢光ラベル及び検出技法、特に顕微鏡が好ましい。同様に、酵素ラベルは、酵素を適切な基質に供給し、そして得られる反応生成物を検出することによって検出され得る。最後に、単純な比色ラベルがしばしば、ラベルに関係する色を観察することによって単純に検出される。従って、種々のディプスティクアッセイにおいては、接合された金がしばしばピンク色に出現し、そして種々の接合されたビーズがそのビーズの色彩を表わす。いくつかの態様においては、ラベルは、ホウ素酸複合体化成分に結合されるリポソーム又はラテックスキャリヤーに含まれるであろう。複合体化剤を一緒に形成する、ラベル又はインジケーター及びホウ素酸複合体化成分は典型的には、共存結合又は結合基により一緒に連結される。１つの態様のグループにおいて、その結合基は、ヌクレオチドモノマーのホウ素酸成分及び複素環式塩基を一緒に連結するために上記の基に類似するであろう。より特定には、複合体化剤の化合物の連結に使用される結合基は、約３〜約30 個の炭素原子を含み、任意には、１又は複数のアミド、エステル、ジスルフィド、ウレア、カルバメート、ヒドラゾン、エーテル、チオエーテル、アミン又はイミン基により中断されている。結合基の必要条件は、検出可能な成分又はラベルに結合される場合、それがラベルの意図された目的又は機能を妨害しないことである。同様に、ホウ素酸複合体化成分への結合基の結合は、修飾されたポリヌクレオチドと反応する複合体化成分の能力を妨害すべきではない。１つの態様グループにおいて、複合体化剤は、下記式：〔式中、Ｘ²はOH，OR，NH₂，NHR，NHOH又はNHORであり、ここでＲは１〜６個の炭素原子の枝分れ鎖又は直鎖のアルキル基である〕を有する。Ｙ²はＯ，Ｓ又はN H、好ましくはＯである。Ｚ²は結合基であり、そしてＬ²はラベル又はインジケーターである。従って、Ｘ²及びＹ²を含んで成る官能価と共にヒドロキシ−置換された芳香族環は、ホウ素酸複合体化成分である。それらの態様における結合基は、典型的には、１又は複数のジスルフィド結合により任意に中断される、１〜 10個の炭素原子の飽和又は不飽和アルキレン鎖である。例は、図６に提供される。従って、結合基がハロゲン化アルキルに由来する場合、ペンダントチオール基を有するラベルが結合され得る。他方では、結合基がエステルに由来する場合、そのエステルは、酸ヒドラジドに転換され得、そしてペンダントアルデヒド基（炭水化物のペリオデート酸化の結合物であり得る）を有するラベルに結合され得る。さらに、結合基がカルボン酸に由来する場合、それはジシクロロヘキシルカルボジイミド(DCC)及び活性化基、たとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（SNHS）との反応によりさらに官能化され得る。その得られる活性化されたエステルは、ペンダントアミン成分を有するラベルを結合するために使用され得る。特に好ましい態様において、複合体化剤は、図７に概略される方法により調製され得る。たとえば、アミノサリチル酸が、図７におけるアミド７ａを生成するためにメチルスクシニルクロリドにより処理され得る。Ｎ−メトキシベンズアミドへのカルボン酸官能価の転換、続くエステルの鹸化は、７ｂをもたらす。活性化基NHSによるエステル化は、化合物７ｃを供給する。その活性化された化合物７ｃは、下記に詳細に記載される、ラベル又は抗体を結合するために使用され得る。もう１つの態様グループにおいて、複合体化剤は、下記式：〔式中、Ｌ²，Ｘ²，Ｙ²，Ｚ²及びＲは上記の通りである〕を有する。この一般式の複合体化剤は、図８〜12に示されるようにして調製された中間体を用いて、標準の合成方法により調製され得る。図８において、３−、４−又は５−メチルサリチル酸がメタノール及び酸によりエステル化され、次にＮ−ブロモスクシンイミドにより臭素化される。得られるベンジルブロミドは、DMF中、アジ化ナトリウムによりベンジルアミドに転換される。前記アジ化物のアミンへの還元は、触媒水素付加を用いて達成される。図９において、ベンゾエートエステルのエステル交換は、まず、アミンをそのｔ−ブチルカルバメート(ｔ−BOC)として保護し、メチルエステルを鹸化し、RX（ここで、Ｘは脱離基、たとえばハロゲン化物又はトシレートを示す）により再エステル化し、そして保護基を切断することによって実施される。図10は、メチルエステル（図８の）アルチルヒドロキサム酸への転換を示す。このスケムにおいては、アミンはそのベンジルオキシカルバメートとして保護され、そしてヒドロキシル基がそのベンジルエーテルとして保護される。次に、メチルエステルが鹸化され、そして得られる酸化そのアルキルヒドロキサム酸に転換される。両保護基の除去は、触媒水素付加により達成される。次に、図８〜10において生成される化合物は、図11及び12に概略されるような適切なラベルの結合のための追加の結合基及び反応性官能価を供給する。前記ラベルの適切な反応性官能価の選択及び続く結合は、結合されるべきラベル上に存在する官能価に依存するであろう。適切な選択のための基準は、上記に記載されており、そして当業者に良く知られている。さらにもう１つの態様グループにおいては、複合体化剤は、下記式：〔式中、Ｌ²，Ｘ²，Ｙ²，Ｚ²及びＲは上記意味を有する〕を有するであろう。中間体の調製のためのスケムは、図13〜17に示される。適切な中間体へのラベルの結合は、上記方法に従い、そして当業者に知られている。いくつかの好ましい態様においては、複合体化剤のラベル部分は、マーカー酵素、たとえばアルカリホスファターゼ及びホースラディシュペルオキシダーゼ(H RP)であろう。アルカリホスファターゼがラベル又はインジケーターとして使用される場合、検出は典型的には、色素基質、生物発光又は化学発光を用いて、当業者に知られている技法に従って達成される。たとえば、Marich，など.，Nonra dioactive Laveling and Detection of Biomolecules（Kessler，ed.）pp.143-1 49，Springer-Verlag，Berlin/Heidelberg，及びMiska,など.，J．Biolumin．Ch emilumin．4:119-128(1990)(それらの開示は、引用により本明細書中に組込まれる)を参照のこと。複合体化剤とハイブリダイズされた複合体との接触に続いて、いづれかの過剰の複合体化剤が典型的には、従来の技法、たとえばゲル濾過又はクロマトグラフィーを用いて除去される。次に、結合された複合体化剤を有するハイブリダイズされた複合体が、上記のようにして及び再考、たとえばNonisotopic DNA Probe Techniques，Academic Press，Chapter 1，Krichta，ed．(1992)及びNonisotopi c Probing，Blotting，and Sequencing，Academic Press，Chapter 2，Kessler ，ed．(1995)(それらは引用により本明細書中に組込まれる)におけるような従来の手段により検出され得る。他の観点においては、修飾されたポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの親和性精製のために使用され得る。たとえば、標的核酸を含むサンプルが、本発明の修飾されたポリヌクレオチドにより、複合体が形成される条件下で処理され得る。結合されたホウ素酸成分を有する複合体を含むその得られる溶液が、結合されたホウ素酸複合体化剤を有する固体支持体上への配置により精製され得る。固体支持体に結合しない材料が除去され、そして次に、標的ポリヌクレオチド／複合体が従来の方法（たとえばホウ酸洗浄）によりカラムから除去され得る。次の例は、単に例示目的のためであり、そして本発明を限定するものではない。例１この例は、PBA-XX-dUTPの調製を示す。１.１ PBA-X-NHSの合成３−アミノフェニルホウ素酸スクシンナム酸(PBA-X-CO₂H) この材料の合成は、Weith,など.，Biochemistry 9:4396-4401（1970）における方法の変法を用いて達成された。３−アミノーフェニルホウ素酸ヘミスルフェート(100ｇ,0.535モル)を、無水ピリジン(240ml)に懸濁した。その混合物を磁気撹拌し、そして無水窒素の雰囲気下で氷／水の浴において急冷した。無水琥珀酸（56.5ｇ,0.565モル）をフラスコに添加し、そしてその反応混合物を室温に暖めた。一晩（少なくとも12時間）の撹拌の後、すべての固体を溶解した。ピリジンの大部分を回転蒸発器上で除去し（浴温≦55℃）、粘性の琥珀色シロップを得た。そのシロップを水(100ml)と共に同時蒸発し、そして残留物を水(700ml)に溶解した。その琥珀色溶液を氷−水浴において急冷し、そして濃塩酸（30〜50ml）をゆっくり添加し、１の最終pHを得た（pH紙）。この添加の間、白色固体が沈澱した。その懸濁液を４℃で１時間、急冷した。固体を濾過し、そして冷水(100ml) により洗浄した。次に、固体を温水から結晶化し、そしてKOHペレット上で真空乾燥せしめた。収量：100ｇ（80％）；m．p．171- 172℃（開放細管、補正されていない）。 HPLC:生成物の保持時間，Applied Biosystems/Brownlee Aquapore Butyl 2.1×2 20mmカートリッジを用いて8.6±0.1分、及び次のような混合されたグラジエント溶出：Ａ,0.1Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート、pH6.5;Ｂ，メタノール、 100％Ａ／０％Ｂにより開始して５分間、次に０％Ａ／100％Ｂまで30分間、周囲温度で、0.5ml／分の流速で、検出をダイオードアレイ検出機を用いて実施した：260nm，280nm，300nm。サンプル量は、メタノール１ml当たり５mgであった。トリメチレン−３−アミノフェニルボロネートスクシナム酸スクシンイミジルエステル(PBA-X-NHS) この材料の合成を、Ho，など.，Biochemistry 20:64-67（1981）における方法の変法を用いて行なった。PBA-X-CO₂H(28.4ｇ,0.120モル)を無水ジオキサン(120 ml)に懸濁し、そして１，３−プロパンジオール(9.1ｇ,0.120モル)を添加した。その混合物を、すべての固体が溶解するまで（約10分間）、軽く加熱した。溶媒を回転蒸発機により除去し、淡黄色のシロップを得、これをジオキサン（それぞ50ml）と共に２度、同時蒸発した。次に、残留物をジオキサン（450ml）に溶解し、そしてＮ−ヒドロキシスクシンイミド（14.9ｇ,0.130モル）、続いてＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（26.3ｇ,0.128モル）を添加した。その溶液を、無水窒素の雰囲気下で４時間、室温で撹拌し、この間、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルウレアの白色沈澱物が形成した。沈澱物を濾過し、そしてジオキサン（50ml）により洗浄した。組合された濾液を約100mlに濃縮した。無水ジエチルエーテル(400m l)を、撹拌された濃縮物にゆっくりと添加し、白色固体の沈澱を引き起した。その混合物を、氷／水浴において１時間、急冷し、次に濾過した。固体を無水エーテル(100ml)により洗浄し、そして真空乾燥せしめた。収量：42.5ｇ（95％）；m ．p．163-170℃（開放細管、補正されていない）。１.２ PBA-XX-NHSの合成３−アミノフェニルホウ素酸スクシンアミドヘキサン酸(PBA-XX-CO₂H) ６−アミノヘキサン酸(5.8ｇ,0.044モル)を、無水ジオキサン(300ml)に懸濁し、そしてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（15ml）を添加した。その懸濁液を、氷／水浴において急冷しながら、激しく撹拌した。PBA-X-NHS（15.0ｇ,0.04 0モル）を添加し、そしてその混合物を無水窒素下で５分間、撹拌した。次に、メタノール（300ml）を添加し、氷浴を除去し、そして反応を室温に暖めた。１時間後、固体のほとんどは溶解し、そしてその反応混合物を蒸発乾燥せしめ、淡黄色シロップを得た。このシロップを水と共に２度（それぞれ40ml）、同時蒸発し、そして次に、水(200ml)に溶解した。その水溶液を氷／水浴において急冷し、そしてその溶液を濃塩酸（約１ml）により約pH１に滴定した。白色沈澱物がこの間に形成した。前記懸濁液をさらに１時間、急冷し、そして次に濾過した。固体を冷水（10ml）により洗浄し、そして次に、KOHペレット上で真空乾燥せしめた。収量：10.0ｇ（70％）；m．p．174-177℃（開放細管、補正されていない）。 HPLC：生成物の保持時間、Applied Biosystems/Brownlee Aquapore Butyl 2.1× 220mmカートリッジを用いて14.3±0.1分、及びグラジエント溶出は次の通りである：溶離剤Ａ,0.1Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート、pH6.5、及びＢ、メタノール、100％Ａ／０％Ｂにより開始して５分間、次に０％Ａ／100％Ｂまで30 分間、周囲温度で、0.5ml／分の流速で、生成物の検出はダイオードアレイ検出機を用いて行なわれた：260nm，280nm，300nm。トリメチレン−３−アミノフェニルボロネートスクシンアミドヘキサン酸スクシンイミジルエステル(PBA-XX-NHS) PBA-XX-CO₂H（6.3ｇ,0.018モル）を、無水ジオキサン（60ml）に懸濁した。１，３−プロパンジオール(1.4ｇ,0.018モル）を添加し、そしてその混合物を、すべての固体が溶解するまで（約10分）、軽く加熱した。溶媒を回転蒸発機により除去し、淡黄色シロップを得、これをジオキサンにより２度（それぞれ30ml）、同時蒸発した。次に、残留物をジオキサン(225ml)に溶解し、そしてＮ−ヒドロキシスクシンイミド(2.3ｇ，0.20モル)、続にＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド(4.1ｇ,0.020モル)を添加した。その溶液を無水窒素の雰囲気下で６時間、室温で撹拌し、この間、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルウレアの白色沈澱物が形成した。沈澱物を濾過し、そしてジオキサン（50ml）により洗浄した。組合された濾液を約30mlに濃縮した。無水ジエチルエーテル(200ml)を前記撹拌された濃縮物にゆっくり添加し、白色固体の沈澱を引き起した。その混合物を氷／水浴に１時間、急冷し、次に濾過した。固体を無水エーテル（50ml）により洗浄し、そして真空乾燥せしめた。収量：8.0ｇ（91％）；m．p．111-117℃（開放細管、補正されていない）。 HPLC:生成物の保持時間、上記条件下で18.2±0.1分。１.３５−アミノアリル−dUTPの合成この材料の合成は、Langer，など.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，78:6633-6 637（1981）における方法の変法を用いて行なわれた。５−クロルメルクリデオキシウリジン５’−三リン酸（５−ClHg-dUTP）デオキシウリジン５’−三リン酸(600mg、約１ｍモル）を、0.1Ｍの水性酢酸ナトリウム（pH6.0;100ml）に溶解した。その溶液を油浴（浴温度50〜55°）において暖め、そして塩化第二水銀(1.6ｇ，５ｍモル)を添加した。その溶液を50 〜55℃で４時間、撹拌し、次に室温に冷却した。塩化リチウム(424mg，10ｍモル )を添加し、そしてその溶液を30分間、撹拌した。この間、溶液は濁ごった。次に、その水性混合物を酢酸エチルにより５度（それぞれ100ml）、抽出した。抽出に続いて、その水溶液を氷／水浴において急冷し、激しく撹拌し、そして氷冷却されたエタノール(400ml)を添加した。ふわふわした白色沈澱物が形成した。固体を−20℃で一晩集め、次に濾過し、冷エタノール(150ml)及び次に、ジエチルエーテル(100ml)により洗浄し、そして60℃で真空乾燥せしめた。収量：772mg 。λ_max：267nm[ε=10,000Ｍ^-1cm^-1]（0.1Ｍの酢酸ナトリウム、pH5.0）５−アミノアリルデオキシウリジン５’−三リン酸（５−AA-dUTP）５−ClHg-dUTP（160mg）を、0.1Ｍの水性酢酸ナトリウム（pH5.0;10ml）に溶解し、わずかに濁った溶液を得た。この溶液のアリコート（５ml）を、0.1Ｍの酢酸ナトリウム（pH5.0;1.0ml）により希釈し、そして紫外線スペクトルを測定した。次に、５−ClHg-dUTP原液の濃度を、消衰係数、及び20mMの希釈因子、又は溶液10ml中、200μモルの５−ClHg-dUTPから計算した。次に、４Ｍの水性酢酸 (8.5ml)中、新鮮な、氷冷却されたアリルアミンの溶液(1.5ml)のアリコート(1.2 ml,2.4ｍモル)を、前記撹拌された５−ClHg-dUTP溶液に添加し、続いて、水(1.6 ml)中、カリウムテトラクロロパラデート（65mg,200μモル）の溶液を添加した。その反応混合物は急速に暗くなり、そして黒色沈澱物が形成した。反応を室温で４時間、次に４℃で一晩、進行せしめた。混合物を0.45mmのナイロン膜を通して濾過した。生成物を、Alltech HEMA-IEC BIO 1000 DEAEカラム(250×7.5mm)及び25mMのMES緩衝液中、0.0Ｍ〜0.5Ｍの塩化リチウムのグラジエント(pH6.1)を用いて、イオン交換HPLCにより20分間、淡黄色濾液から単離した。流速は2.0ml／分であった。吸光度を320nmでモニターした。濾液の1.0mlアリコートを個々の試験のために注入した。約13分でのピークは、所望する生成物を含み、そして集めた。生成物画分を組合し、そして約５mlに濃縮した。氷冷却されたエタノール（ 20ml）を生成物溶液に添加し、そして白色沈殿物が形成した。その混合物を−20 ℃で一晩、急冷した。沈澱物を遠心分離（3000rpm,20分，４℃）によりペレット化した。上清液をデカントし、そしてペレットを0.5mlの脱イオン水に溶解した。生成物溶液の濃度を、290nmでの吸光度から計算した（ε＝7100Ｍ^-1cm^-1）。収率は約30％であった。この原液を凍結貯蔵した。 λ_max：240，290nm;λ_min：264nm（水）。１.４ PBA-XX-dUTPの合成５−（３−アミノフェニルホウ素酸スクシンアミドヘキサノイル）−アミノアリルデオキシ−ウリジン５’−三リン酸(PBA-XX-dUTP) ５−AA-dUTP（水中、原液475ml、約51μモル）を、１Ｍの水性炭酸水素ナトリウム（pH＝約8.5;100ml）と共に混合し、そしてその溶液を氷／水浴において冷却した。無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド(100μｌ)中、PBA-XX-NHS（25mg;51 μモル）を添加し、そしてその十分に混合された反応を室温で１時間、次に４℃ で一晩、静置した。生成物を、Applied Biosystems/Brownlee Aquapore Butylカラム(220×10mm)及び0.1Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液(pH6.5) 中、メタノールのグラジエントを用いて、逆相HPLCにより20分間にわたって単離した。流速は4.0ml／分であった。吸光度を260nmでモニターした。その反応混合物の0.1mlアリコートを個々の試験のために注入した。２つの主要ピークが観察され；約18分でのピークは所望する生成物を含み、そして集めた。生成物画分を組合し、そして約0.5mlに濃縮した。氷冷却されたアセテート（６ml）を生成物溶液に添加し、そして白色沈澱物が形成した。その混合物を−20℃で一晩、冷却した。沈澱物を遠心分離(3000rpm、20分、４℃)によりペレット化した。上清液をデカントし、そしてペレットを0.5mlの脱イオン水に溶解した。その生成物溶液の濃度を、290nmでの吸光度から計算した（ε＝7000Ｍ^-1cm^-1）。収率は約50％であった。この原溶液を凍結貯蔵した。λ_max：251，290nm;λ_min；2 71nm(水)。HPLC：上記のようなカラム、流速、緩衝液／溶媒及び検出を用いての保持時間、20.4±0.1分。使用されるグラジエントは、100％Ａ／０％Ｂ（10分）、次に50％Ａ／50％Ｂ（20分）であった。 PBA-X-dUTPを、上記反応において、PBA-XX-NHSをPBA-X-NHS(上記)により置換することによって、類似する態様で調製した。例２この例は、PBA-XX-dUTPによるPCRを用いての修飾されたポリヌクレオチドの調製のための他の方法；NH₂-dATP、続く、NHS−活性化されたPBA基との反応によるニックトランスレーション；及びランダムプライムラベリング、ニックトランスレーション及びターミナルトランスファーティリングを用いてのPBA-XX-dUTPのオリゴヌクレオチド中への組込みを提供する。２.１ PCR反応 PCR反応のためのプロトコールは、Saiki,など.，Science 239:487-494(1988) により記載されるポリメラーゼ鎖反応の変法であった。λ DNA配列6371-7172の増幅のためのPCRプライマー（21マー）を、５’−ビオチンラベル、３又は４個の５’−PBAラベル、又はラベルなしのいづれかにより合成した。PBAを、PBA-XX -dUTPのポリメラーゼ挿入により、又はPBA−ラベルされたプライマーの延長により801bpの生成物中に組込んだ。 PBA-XX-dUTPの組込みのための標準のPCR反応を次の通りに設定した：λ DNAを、１×PCR緩衝液（Perkin Elmer，Foster City，California，USA），1.5mMのMg Cl₂，200μＭのdATP,200μＭのdCTP,200μＭのdGTP,200μＭのPBA-XX-dUTP,１μ Ｍのビオチン−6371プライマー、１μＭの7172−プライマー、及び8.3Ｕ／mlのT aq DNA ポリメラーゼ（Perkin Elmer）の溶液に懸濁した(167ng／ml)。そのPCR反応混合物を、初期の１〜７分の変性サイクル（92℃）、続く変性（10秒、95℃）、アニーリング（20秒、62℃）及び延長（30秒、72℃）の30〜35サイクルによりプログラムされたサーモサイクラー（Perkin Elmer）に配置した。５分間（72℃）の最終延長の後、PCR反応を４℃で維持した。約50〜100ngの増幅された生成物(801bp )を生成した。上記PCRサンプルを、DHBHA−セファロースと共に室温で15分間、混合した。DHBHA−セファロースからの溶離液を、１％アガロース、10μｇ／ml の臭化エチジウム、50mMのトリス、100mMのボレート、２mMのEDTA,pH8.3のゲル上での電気泳動により出発PCRサンプルと比較した。対照PCR生成物（レーン１）は、DHBHA−セファロース（レーン２）に対して実質的に結合せず、そしてPBA-X X-dUTP含有PCR生成物は、出発サンプル（それぞれ、レーン３，５及び７）に比較して、定量的に結合された（レーン４，６及び８）。 PBA−ラベルされたプライマーの延長のための標準のPCR反応を次の通りに設定した：λ DNAを、１×PCR緩衝液（Perkin Elmer）,1.5mMのMgCl₂，200μＭのdAT P,200μＭのdCTP,200μＭのdGTP,200μＭのdTTP，１μＭのビオチン−6371プライマー、１μＭのPBA−ラベルされた7172−プライマー及び8.3Ｕ／mlのTaq DNA ポリメラーゼ（Perkin Elmer）の溶液に懸濁した(167ng／ml)。PCR反応混合物を、１分間の変性サイクル（92℃）、続く変性（10秒、95℃）、アニーリング（20 秒、62℃）、及び延長（30秒、72℃）の30〜35サイクルによりプログラムされたサーモサイクラー（Perkin Elmer）に配置した。５分間（72℃）の最終延長の後、PCR反応を４℃で維持した。１％アガロース、50mMのトリス、100mMのボレート、２mMのEDTA,pH8.3のゲル上で、修飾されていないPCR生成物に対しての移動度の見掛の遅延を有さない約200〜400ngの増幅された生成物(801bp)を生成した。図19は、他の方法により調製されたPBA−ラベルされたプローブを比較するゲルである。レーン１は、標準の１kbのラダーである。レーン２は、801bp の生成物中へのPBA-XX-dUTP挿入の生成物である。レーン３〜９は、PBA-XX-dUTP 及びdTTPの混合物を用いて挿入反応により調製された生成物を含む。レーン10は、PBA−ラベルされたプライマーの延長により調製された生成物である。２.２ NH₂-dATPラベルされた核酸からのPBA−ラベルされたプローブの調製ニックトランスレーション反応、すなわちRigby,など.，Journal of Molecula r Biology 113:237-251（1977）により記載される反応の変法を、Ｎ６−（６− アミノヘキシル）−dATPにより実施した。１μｇの線状pBR322DNAを、0.1mMのＮ６−（６−アミノヘキシル）−dATP(Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland，USA) ,0.125mMのdCTP,0.125mMのdGTP,0.125mMのdTTP，１×緩衝液（Boehringer Mannh eim，Indianapolis，Indiana，USA)、及び１／10体積のDNA-アーゼＩ／DNAポリメラーゼ混合物(Boehringer Mannheim)に懸濁した。その反応を15℃で90分間インキュベートし、そしてEDTA（50mM）の添加により停止せしめた。アミン−ラベルされたDNAを、tRNAキャリヤー（10μｇ），１／10体積の４ＭのLiCl、及び2.6 体積のエタノールを添加することによって沈澱せしめた（10〜20分、−20℃）。 14,000rpm(５℃)での15分間の遠心分離の後、上清液をデカントし、そしてペレットをすぐに70％エタノールにより洗浄した（５℃）。ペレットを乾燥せしめ、 30〜40μｌの脱イオン水に懸濁し、そして７mg／mlのNHS-PBA,0.36ＭのNaHCO₃及び35％のジメチルホルムアミドにより調節した。室温での１時間後、NHS−エステル反応DNAの一部を、LiCl／エタノール沈澱により沈澱せしめた。得られるDNAペレットを少体積の脱イオン水に懸濁した。精製された又は租NHS−反応DNAを、ナイロン膜上に固定されるpBR322DNAに対するハイブリダイゼーションに使用した。２.３ PBA−ラベルされたプローブの調製（ａ）ランダムプライムラベリングランダムプライムラベリング反応は、dTTPの代わりにPBA-XX-dUTPを用いての、Feinberg，など.，Anal．Biochem．132:6-13(1983)の変法であった。１μｇの DNAを変性した(100℃、10分)。そのDNAをすばやく、ドライアイス／エタノール浴において冷却した。２μｌの10×ヘキサヌクレオチド混合物（Boehringher Ma nnheim）及び２μｌの10×dNTPラベリング混合物(１mMのdATP，１mMのdCTP，１m MのdGTP，１mMのPBA-XX-dUTP)を添加した。その混合物を溶解し、そして１μｌのクレノウを添加した。そのサンプルを２〜16時間インキュベートし（37℃）、そして反応を、EDTA（50mM）の添加により停止した。PBA-XX-dUTPの組込みを、D HBHA−セファロース上へのプローブの捕獲により確証し、１％アガロース、10μ ｇ／mlの臭化エチジウム、50mMのトリス、100mMのボレート、２mMのEDTA,pH8.3 のゲル上での溶離後の電気泳動により示した（図20を参照のこと）。dTTPによりラベルされたDNA(レーン１)は、DHBHA−セファロース（レーン２）により捕獲されなかった。しかしながら、PBA-XX-dUTPによりラベルされたDNA(レーン３)は、 DHBHA−セファロース（レーン４）により定量的に捕獲された。（ｂ）ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼターミナルトランスフェラーゼ反応は、dTTP中に希釈されるPBA-XX-dUTPを用いての、Abhay,など.，Anal．Biochem．169:376-382（1988）により記載される反応の変法であった。１μｇのポリヌクレオチドを、２mMのdATP，２mMのdCTP，２mMのdGTP、及び２ mMのPBA-XX-dUTP又は２mMのPBA-XX-dUTP＋dTTP,1.5mMのCOCl₂,１×TdTT緩衝液（ Boehringher Mannheim）、及び25Ｕのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの溶液に懸濁した。その反応を37℃で１〜16時間インキュベートし、そしてEDTA（50mM）の添加により停止した。組込みを、DHBHA−セファロース上へのプローブの捕獲により（示されていない）、又は１％アガロース、10μｇ／mlの臭化エチジウム、50mMのトリス、100mMのボレート、２mMのEDTA,pH8.3のゲル上での移動度シフトにより（図21を参照のこと）確証した。オリゴヌクレオチド（レーン２）を、dTTP（レーン３）又はdTTPにおけるPBA-XX-dUTPの希釈溶液（レーン４〜７）により末端化した。PBA-XX-dUTPの存在は、dTTP末端化されたオリゴヌクレオチド（レーン３）に比較して末端化されたオリゴヌクレオチド（レーン４〜７）の移動度を遅延せしめた。（ｃ）ニックトランスレーションニックトランスレーション反応は、dTTPの代わりにPBA-XX-dUTPを用いての、R igby,など.，J．Mol．Biol．113:237-251(1977)により記載される反応の変法であった。１μｇのDNAを、0.2mMのdATP,0.2mMのdCTP,0.2mMのdGTP,0.2mMのPBA-XX -dUTP，１×緩衝液（Boehringher Mannheim）、及び１／10体積のDNAアーゼＩ／ DNAポリメラーゼ混合物（Boehringher Mannheim）に懸濁した。その反応を90分間（15℃）インキュベートし、そしてEDTA（50mM）の添加により停止した。組込みは、DHBHAセファロース上へのプローブの捕獲により確証された。例３この例は、下記捕獲／検出方法において有用である結合されたホウ素酸結合成分（又はストレプタビジン）を有する磁気粒子の調製を示す。さらに、結合されたホウ素酸複合体化剤を有する被覆タンパク質の調製がまた記載される。それらの被覆タンパク質はまた、精製方法において、及びマイクロタイタープレートにおけるプローブ捕獲物としても有用である。３.１ SHA−及びSA−磁気粒子の調製（ａ）ストレプタビジン−Ｍ280ビーズ調製 Dynal Ｍ280非変性ビーズ（Oslo Norway,製品142.10;ロット3490;100ml）を、稀土類アロイ磁石（Dynal，Oslo Norway）を用いて、50mlの円錐形管において40 mlに濃縮した。ビーズを水により３度洗浄し、そして次に、40mlの25.50及び75 ％水性CH₃CNにおいて５分間、連続してインキュベートすることによってCH₃CN(E M Science，Gibbstown，NJ)中に脱水した。次に、ビーズをCH₃CNにより３度、及び無水ジオキサン（Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI）により１度洗浄した。ビーズを、50mg／mlの１，１’−カルボニルジイミダゾール(Aldrich Chemi cal Co.，Milwaukee，WI)を含む40mlのジオキサンに懸濁し、そして室温で１時間、回転せしめた。ビーズをCH₃CNにより３度洗浄し、そして0.1ＭのNaHCO₃中、 10mg／mlのストレプタビジン（Prozyme，San Leandro，California，USA）の溶液５mlに懸濁した。１ＭのNaHCO₃の５mlアリコートを添加し、そしてその懸濁液を室温で５時間、回転せしめた。エチレンソルビタンモノラウレート、Sigma Chemical Co.，St．Louis，Missour i，USAからの）により２度洗浄し、そして0.1ＭのNaHCO₃（45ml）に懸濁した。（ｂ） SHA−Ｍ280ビーズ調製 Dynal Ｍ280ビーズ（142.10；ロット3490;100ml）を濃縮し、そして水により３度洗浄し、そして上記のようにしてCH₃CN中に脱水した。ビーズをCH₃CN 10mlにより３度、10mlのCH₂Cl₂(Aldrich Chemical Co.，M ilwaukee，WI)により１度洗浄し、そして50mlの円錐形管における18mlのCH₂Cl₂ に懸濁した。２mlのDMSO(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)を添加し、そしてビーズをドライアイス／イソプロパノール浴において５分間、冷却した。塩化オキサリルの200μｌアリコートを４回、添加し(Aldrich Chemical Co.，Milw aukee，WI)、そして反応を、ドライアイス浴において10分間、ときおり混合した。トリエチルアミン(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)を添加し、そして反応を、氷浴において５分間、及び次に、室温で５分間、ときおり混合した。ビーズをCH₃CNにより３度洗浄し、そして上記脱水工程を逆にすることによって再水和化し、そして水により１度洗浄した。次に、ビーズを、400μｌのDMSOに溶解された36.4mgのSHAヒドラジド（SHA-X-NH-NH2、ロットrk02.43，fw=346.8，59 μモル）に懸濁し、そして0.1ＭのNaOAc＋１ＭのNaCl溶液(pH5.5)20mlに希釈した。ビーズ反応物を室温で一晩回転せしめ、そして水により広範に洗浄した。ビーズを水45mlに懸濁し、そして４℃で５mlアリコートで貯蔵した。（ｃ） SHA−Ｍ450ビーズ調製 Dynal Ｍ450ビーズ（Dynal，Oslo Norway，10ml）を水により３度洗浄し、そして上記のようにしてCH₃CN中に脱水した。ビーズを10mlのCH₃CNにより３度、10 mlのCH₂Cl₂により１度洗浄し、そして１mlのDMSO中、９mlのCH₂Cl₂に懸濁した。ビーズを50mlの円錐形管に移し、そしてドライアイス／イソプロパノール浴において５分間冷却した。塩化オキサリルの200μｌアリコートを２回添加し、そして反応を、氷浴において10分間、ときおり混合した。トリエチルアミン(500μｌ )を添加し、そして反応を、氷浴において５分間、及び次に、室温で５分間、ときおり混合した。CH₃CN(10ml)を添加し、磁石によるビーズからの反応混合物の除去を促進せしめた。ビーズをCH₃CN により３度洗浄し、そして脱水工程を逆にすることによって水中に再水和化した。ビーズを水により３度洗浄し、そして125μｌのDMSOに溶解され、そして0.1ＭのNaOAc＋0.1ＭのNaCl溶液(pH5.5)５mlに希釈された18.5mgのSHA-X-NHNH₂に懸濁した。ビーズ反応物を室温で一晩回転せしめ、水により６度洗浄し、そして水10 mlに懸濁した。ビーズを４℃で貯蔵した。３.２ SHA−アレート被覆タンパク質の調製（ａ）プレート被覆のためのSHA−抗体ヤギ抗−マウスポリクローナル抗体（Rockland，Gilbertsville，PA、製品210 -1103）の１つのバイアルを0.1ＭのNaHCO₃（５ml）に溶解し、１mg／mlの抗体が１cmのキュベットにおいて1.4の280nmでの吸光度を有するものとして分光分析的に決定されるような8.8mg／mlの溶液を生成した。118ｎモルの抗体を含むものとして仮定される抗体溶液２mlを、145μｌのDMSOに1.6mgのNHSエステルを溶解し、そしてその溶液100μｌを抗体に室温で１時間、添加することによって調製された、2,350ｎモルのSA(OMe)-X-NHS(rk01.222;fw:378)により接合した。その接合反応のpHを、10ＮのNaOH５μｌにより9.6に調節し、そして２ＭのNH₂ OH（pH10）2.1mlを添加した。その反応物を室温で３日間インキュベートし、そして2.5×８cmのＧ−25(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)上で50mMのNaHCO₃ により脱塩した。タンパク質画分が集められ、そして12mlの体積を有した。脱塩された接合体のUVスペクトルを、Hewlett Packard 8453ダイオードアレイ分光計上で測定した。接合体の濃度を、接合体の抗体成分からＡ₂₈₀を推定するために、そのＡ₂₈₀からＡ₃₂₀を控除することによって推定した。接合体濃度は、1.75mg ／mlであることが推定された。接合体を４℃で貯蔵した。例４この例は、捕獲された複合体上の１つの鎖がPBA−ラベルされ、そして相補的鎖が結合されたビオチンを有する、ポリヌクレオチドの捕獲検出を示す。４.１ SHA−磁気粒子に結合されるPBA-ラベルされたPCR生成物の検出 PBA−ラベルされたPCR生成物（0.02μｌ〜５μｌ）を、1.5ＮのNaCl,150mMのクエン酸ナトリウム、pH７の溶液25〜100μｌ中に希釈し、そしてSHA−磁気粒子（10〜50μｌ）を含むポリプロピレンマイクロタイタープレートに添加した。粒子及びPCR生成物を十分に混合し、そして結合が室温で生じた（30〜60分）。磁気粒子を磁気プレートに取り出し、そして150mMのNaCl，20mMのトリス−HC のストレプタビジンアルカリ−ホスファターゼ（１mg/mlのBSAのNaCl、トリス− HCl,pH８において0.2Ｕ／ml；Boehringher Mannheim，Indianapolis，Indiana， USA）又はストレプタビジン−ホースラディシュペルオキシダーゼ（１mg／mlのB SA,NaCl、トリス−HCl,pH８において0.1Ｕ／ml；Boehringher Mannheim）を添加し、そして磁気粒子と共に十分に混合した。30分後（室温）、磁気粒子を磁気プレートに取り出し、そして150mMのNaCl，20mMのトリス−HCl，アルカリホスファターゼ（１Ｍのジエタノールアミン、２mMのMgCl₂，0.2mMのZn Cl₂,pH10.4中、１mg／mlのパラ−ニトロフェニルホスフェート）、又はホースラディシュペルオキシダーゼ(ABTS１−Step^TM，Pierce Chemical Co.)のために添加した。基質進行（37℃）は、10〜60分間、生じた。１μｌ又はそれ以下のPCR 生成物（≧50 pg）が検出され得た。４.２ SHA−被覆されたマイクロタイタープレートに結合されるPBA−ラベルされたPCR生成物の検出ポリスチレンマイクロタイタープレート（Falcon，Becton Dickinson，Baltim ore，Maryland，USA）を、200μｌのSHA−プレート被覆タンパク質(0.1ＭのNaHC O₃中、30μｌ／ml，pH9.0)によりウエルを十分に満たすことによって被覆し、そして一晩（４℃）インキュベートし、又は60分間（37℃）インキュベートした。プレートを溶液により５度洗浄し、そしてBSA(0.2ＭのNaHCO₃中、５mg／ml，pH9.0)により1 .5時間（RT）裏面被覆した。プレートを、150mMの５度洗浄し、PBA−ラベルされたPCR生成物（0.02μｌ〜５μｌが1.5ＮのNaCl,15 0mMのクエン酸ナトリウム溶液(pH7.0)25〜100μｌに希釈された）を、SHA被覆されたマイクロタイタープレートに添加し、そして結合せしめた（RT；30〜60分）。プレートを、150 より５度洗浄した。100μｌのストレプタビジンアルカリ−ホスファターゼ（１m g／mlのBSA,NaCl、トリス−HCl,pH８において0.2Ｕ／ml；Boehringher Mannheim ）又はストレプタビジン−ホースラディシュペルオキシダーゼ（１mg／mlのBSA, NaCl、トリス−HCl,pH８において0.1Ｕ／ml；Boehringher Mannheim）を添加した。30分後（室温）、プレートを、150mMのNaCl，20mMのトリス−HCl,0.02％ファターゼ（１Ｍのジエタノールアミン、２mMのMgCl₂，0.2mMのZnCl₂,pH10.4の溶液中、１mg／mlのパラ−ニトロフェニルホスフェート）、又はホースラディシュペルオキシダーゼ(ABTS I-Step T^TM， Pierce Chemical Co.)のための基質を添加した。基質進行（37℃）は、1.0〜10 分間生じた。１μｌ又はそれ以下のPCR生成物(≧1.5ng)が検出され得た。例５この例は、SHA−ラベルされた酵素によるPBA−ラベルされた核酸の検出を示す。５.１アルカリホスファターゼのDHBHA接合１mlのアルカリホスファターゼ（６mg／ml，Sigma，P-6774;ウシ腸から）を、１μｌの0.1ＭのNaHCO₃に対して透析し、そして714ｎモルのDHBA(OMe)-X-NHS（D MF中、68mMの10.5μｌ）により氷上で２時間、接合せしめた。接合体のメチルエステルを、２ＭのNH₂OH(pH10)１mlを添加し、そしてその混合物を４℃で６日間インキュベートすることによって、ヒドロキサム酸に転換した。次に、NH₂OH反応混合物を、0.1ＭのNaHCO₃に対して透析し、そして４℃で貯蔵した。５.２アルカリホスファターゼのSHA接合１mlのアルカリホスファターゼ(6.9mg／ml，Sigma，P-6774;ウシ腸から)を、１ｌの0.1ＭのNaHCO₃に対して透析し、そして668ｎモルのSA(OMe)-X-NHS（DMF中、57mMの11.7μｌ）により氷上で２時間、接合せしめた。接合体のメチルエステルを、２ＭのNH₂OH(pH10)１mlを添加し、１ＮのNaOHによりpHを調節し、そしてその混合物を４℃で７日間インキュベートすることによって、ヒドロキサム酸に転換した。次に、NH₂OH反応混合物を、0.1ＭのNaHCO₃に対して透析し、そして４ ℃で貯蔵した。５.３ SHA−酵素による、ストレプタビジン−磁気ビーズに結合されるPBA− ラベルされたポリヌクレオチドハイブリッドの検出ポリヌクレオチドPBA−7172及びビオチン−補体6371を、1.5ＮのNaCl,150mMのクエン酸ナトリウム、pH７の溶液において、相補的42マーの反対端に、10分間（ RT）ハイブリダイズせしめ、そして冷却した。そのハイブリッドサンドイッチを、SHA−Ｍ450磁気粒子(10〜50μｌ）を含むポリプロピレンマイクロタイタープレートのウエルに添加した。粒子及びハイブリッドサンドイッチを十分に混合し、そして結合を室温又は45℃（30〜60分）で生ぜしめた。磁気粒子を、磁気プレートに取り出し、そして150mMのNaCl，20mMのト 100μｌのSHA−アルカリ−ホスファターゼ（１mg／mlのBSA,NaCl、トリス−HC l,pH８において１μｇ／ml；Boehringher Mannheim）又はSHA−ホースラディシュペルオキシダーゼ（１mg/mlのBSA,NaCl、トリス−HCl,pH８の溶液において１ μｇ／ml；Boehringher Mannheim）を添加し、そして磁気粒子と共に十分に混合した。30分（室温）後、磁気粒子を磁気プレートに取り、そして150mMのNaCl，度洗浄した。アルカリホスファターゼ（１Ｍのジエタノールアミン、２mMのMgCl₂ ,0.2mMのZnCl₂,pH10.4において１mg／mlのパラ−ニトロフェニルホスフェート）又はホースラディシュペルオキシダーゼ(ABTS1−Step^TM，Pierce Chemical Co .)のための基質を添加した。基質進行（37℃）は、10〜60分間、生じた。45pg又はそれ以上の42マーが検出され得た。５.４ストレプタビジン−被覆されたマイクロタイタープレートに結合されるPBA−ラベルされたポリヌクレオチドハイブリッドの検出ポリスチレンマイクロタイタープレート（Falcon，Becton Dickinson）を、20 0μｌのストレプタビジン−Plus−(0.1ＭのNaHCO₃， pH9.0中、30μｇ／ml；Prozyme)によりウエルを満たすことによって被覆し、そして一晩（４℃）インキュベートし、又は60分（37℃）インキュベートした。プレートを、150mMのNaCl，20mMのトリス BSA（0.2MのNaHCO₃(pH9.0)中、５mg/ml）により1.5時間（RT）、裏被覆した。プレートを、150mMのNaCl，20mMのトリス−HCl,0. チドPBA−7172及びビオチン−補体6371を、1.5ＮのNaCl,150mMのクエン酸ナトリウム、pH７において10分間（RT）、相補的42マーにハイブリダイズせしめ、そして冷却した。ハイブリッドサンドイッチを、ストレプタビジン−被覆されたマイクロタイタープレートに添加し、そして組合せしめた（RT；30〜60分）。プレートを、150 より５度洗浄した。100μｌのSHA−アルカリ−ホスファターゼ（１mg／mlのBSA, Nacl、トリス−HCl,pH８の溶液において１μｇ／ml；Boehringher Mannheim）又はSHA−ホースラディシュペルオキシダーゼ（１mg／mlのBSA，NaCl）トリス−HC l,pH８の溶液において１μｇ／ml）を添加した。30分（RT）後、プレートを、15 0mMのNa ５〜７度洗浄した。アルカリホスファターゼ（１Ｍのジエタノールアミン、２mM のMgCl₂，0.2mMのZnCl₂,pH10.4中、１mg／mlのパラ−ニトロフェニルホスフェート）又はホースラディシュペルオキシダーゼ(ABTS1−Step^TM，Pierce Chemical Co.)のための基質を添加した。基質進行（37℃）は、10〜60分間、生じた。５.５膜上に固定される核酸にハイブリダイズされるPBA−プローブ−SHA− アルカリホスファターゼの検出 PCR生成物(801bp)又はpBR322 DNAを、NaOHを添加して、0.56Ｎにすることによって変性した（10分、RT）。サンプルを等体積の２Ｍの酢酸アンモニウムと共に混合し、Nytran膜（SchleiCher and Scheull）に適用し、そして 80℃で１〜24時間ベークし又は60秒間、UV−照射した。膜を150mMのNaCl，20mM のトリス−HCl,0.02％のTw BoehringherMannheim）において、１時間（RT）又は一晩（４℃）ブロックした。ブロッキング溶液を除去した。 50ngのPBA−オリゴ又は変性されたPBA−ラベルされたプローブを、5.3〜26.5 μｇのSHA−アルカリホスファターゼと共に混合し、そしてインキュベートした（10分、RT）．複合体希釈剤(150mMの .5mg/mlのBSA)を、プローブ−酵素混合物に添加し、１mlにした（１分、RT）。その混合物を、９mlのハイブリダイゼーション溶液（１ＭのNaCl，20mMのトリス −HCl,pH7.5,１mMのEDTA，0.05％のTween 20）において存在するブロックされた膜に添加した。ハイブリダイゼーションを１時間〜一晩の間、実施した（RT〜37 ℃）。膜を、液により５〜７度洗浄し、そして基質溶液(103mMのニトロブル−テトラゾリウム、759mMの５−プロモ−４−クロロ−３−インドイル−ホスフェート、0.1Ｍのトリス−HCl,pH9.0，0.1ＭのNaCl，50mMのMgCl₂)を添加した。色彩の進行は、１〜 16時間、暗やみにおいて生じた。４pgほどのDNAが、プローブのタイプ、プローブの濃度、ハイブリダイゼーション時間、及び基質インキュベーション時間に依存して、検出され得た。本明細書に言及されるすべての出版物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の出版物、特許又は特許出願が引用により本明細書に組込まれることを特別に且つ個々に示された場合と同じ程度に明細書中に引用により組込まれる。上記の記載は例示的であって、限定的ではない。本発明の多くの変動が、この開示の再考に基づいて当業者に明らかになるであろう。従って、本発明の範囲は、上記の記載に関係なく決定されるべきであるが、しかし代わりに、添付される請求の範囲に関係して決定されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者カイザー，ロバートジェイ. アメリカ合衆国，ワシントン 98021，ボセル，ノースイーストワンハンドレッドフォーティセブンスストリート 7804

Claims

【特許請求の範囲】 1. 下記式：〔式中、Ｒ¹，Ｒ²及びＲ³は、水素、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、モノホスフェートエステル、ジホスフェートエステル及びトリホスフェートエステルから成る群から独立して選択された個々のメンバーであり； Nuは、から成る群から選択された基であり、ここでＸは７〜30個の炭素原子から成る結合基であり、この一部は芳香族環であり；そしてＹは−Ｂ(OH)₂，−Ｂ(OH)(OR)及び−Ｂ(OR)(OR')（ここで、ＲおびＲ’は、それぞれ独立して、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル基である）から成る群から選択されたメンバーであり；そしてＰは１〜３の整数である〕を有する化合物。 2. Ｙが−Ｂ(OH)₂である請求の範囲第１項記載の化合物。 3. −Ｘ−及び−（Ｙ）_Pが、一緒に取られる場合、から成る群から選択された基を含んで成り、ここでＸ¹は、３〜23個の炭素原子から成る結合基フラグメントである請求の範囲第１項記載の化合物。 4. −Ｘ−及び−（Ｙ）_Pは、一緒に取られる場合、から成る群から選択された基を含んで成り、ここでＸ¹は３〜23個の炭素原子から成る結合基フラグメントである請求の範囲第１項記載の化合物。 5. 前記結合基Ｘが、前記Nuの複素環式部分に直接的に結合される−CH＝CH− を含んで成る請求の範囲第１項記載の化合物。 6. Ｘが−CH＝CH−CH₂-NHCOAr−，−CH＝CH−CH₂-NHAr−，−CH ＝CH−CH₂-Ｏ−Ar−，−CH＝CH−CONH−Ar−，−CH＝CH−CH₂-CONH−Ar−，−CH ＝CH-CH₂-NHCO−（CH₂）_n−NHCO−Ar−、及び−CH＝CH−CH₂-NHCO−(CH₂)_n−NHC O−(CH₂)_m−CONH−Ar−から成る群から選択されたメンバーであり、ここでArがフェニル及びナフチルから成る群から選択された二価の芳香族環を表わし、そしてｎ及びｍが独立して、１〜６の整数を表わす請求の範囲第１項記載の化合物。 7. Ｘが、であり、ここでｎ及びｍが独立して１〜６の整数を表わし、Ｙが−Ｂ(OH)₂であり、そしてＰが１又は２である請求の範囲第１項記載の化合物。 8. 下記式：を有する請求の範囲第１項記載の化合物。 9. 下記式：〔式中、Ｚは１〜1000の整数であり；個々のＲ¹¹は独立して、−Ｈ及び−OHから成る群から選択され；Ｒ¹²及びＲ¹³は、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、モノホスフェートエステル、ジホスフェートエステル及びトリホスフェートエステルから成る群から独立して選択された個々のメンバーであり；個々のＰ¹及びＰ²は独立して、−Ｐ(Ｏ)(OH)−，−Ｐ(Ｏ)(NH₂)−，−Ｐ(Ｓ)( OH)−，−Ｐ(Ｏ)(CH₃)及び医薬的に許容できるそれらの塩から成る群から選択され；個々のNu¹¹，Nu¹²及びNu¹³は、独立して、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンから成る群から選択され；ここで、Ｘは７〜30個の炭素原子から成る結合基であり、この一部は芳香族環であり；そしてＹは−Ｂ(OH)₂，−Ｂ(OH)(OR)及び−Ｂ(OR)(OR')（ここでＲ及びＲ’はそれぞれ独立して、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル基である）から成る群から選択されたメンバーであり；そしてＰは１〜３の整数であるが、但し、少なくとも１つ及びわずか30のNu¹¹，Nu¹²及びNu¹³がアデニン、グアニン、チミン又はシトシン以外である〕を有する修飾されたポリヌクレオチド。 10．Ｒ¹²がヒドロキシルであり、そしてＲ¹³がモノホスフェートエステルである請求の範囲第９項記載の修飾されたポリヌクレオチド。 11．Ｚが約５〜約100の整数である請求の範囲第９項記載の修飾されたポリヌクレオチド。 12．Ｚが約10〜約30の整数である請求の範囲第９項記載の修飾されたポリヌクレオチド。 13．Nu¹¹，Nu¹²又はNu¹³の１つが、から成る群から選択されたメンバーであり、ここで−Ｘ−及び−（Ｙ）_Pが、一緒に取られる場合、から成る群から選択された基を含んで成り、ここでＸ¹は３〜23個の炭素原子を含んで成る結合基フラグメントである請求の範囲第９項記載の修飾されたポリヌクレオチド。 14．サンプルにおける標的核酸の存在を検出するための方法であって、（ａ）前記サンプルと、前記標的核酸に対して実質的に相補的である修飾されたポリヌクレオチドとを、前記標的核酸に前記修飾されたポリヌクレオチドをハイブリダイズせしめ、それによりハイブリダイズされた複合体を形成するのに十分な条件下で接触せしめ、ここで前記修飾されたポリヌクレオチドが、下記式：〔式中、Ｚは１〜1000の整数であり；個々のＲ¹¹は独立して、−Ｈ及び−OHから成る群か選択され；Ｒ¹²及びＲ¹³は、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、モノホスフェートエステル、ジホスフェートエステル及びトリホスフェートエステルから成る群から独立して選択された個々のメンバーであり；個々のＰ¹及びＰ²は独立して、−Ｐ(Ｏ)(OH)−，−Ｐ(Ｏ)(NH₂)−，−Ｐ(Ｓ)( OH)−，−Ｐ(Ｏ)(CH₃)及び医薬的に許容できるそれらの塩から成る群から選択され；個々のNu¹¹，Nu¹²及びNu¹³は、独立して、アデニン、グアニン、チミン及びシトシンから成る群から選択され；ここで、Ｘは７〜30個の炭素原子から成る結合基であり、この一部は芳香族環であり；そしてＹは−Ｂ(OH)₂，−Ｂ(OH)(OR)及び−Ｂ(OR)(OR')（ここでＲ及びＲ’はそれぞれ独立して、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル基である）から成る群から選択されたメンバーであり；そしてＰは１〜３の整数である〕を有し；（ｂ）前記ハイブリダイズされた複合体とホウ素酸複合体化剤とを接触せしめ、ここで前記剤がインジケーターを含んで成り；そして（ｃ）前記インジケーターの存在を検出し、それにより、前記標的核酸の存在を検出することを含んで成る方法。 15．前記インジケーターが、螢光インジケーター、電子密集物、又は検出可能な物質を生成する酵素である請求の範囲第14項記載の方法。 16．前記インジケーターが酵素であり、そして前記検出可能な物質が比色又は化学発光技法を用いて検出される請求の範囲第15項記載の方法。 17．前記インジケーターが、フェリチン、ヘモシアニン及びコロイド状金から成る群から選択された電子密集インジケーターである請求の範囲第15項記載の方法。 18．前記インジケーターが、多くの螢光化合物を含むラテックス球体又はリポソームである請求の範囲第14項記載の方法。 19．前記ホウ素酸複合体化剤がさらに、サリチルヒドロキサム酸及びジヒドロキシベンゾヒドロキサム酸から成る群から選択された成分を含んで成る請求の範囲第14項記載の方法。 20．前記ホウ素酸複合体化剤がさらに、アルキル１，３−ジオール、及び置換されたオルト−ヒドロキシベンゾヒドロキサム酸から成る群から選択された成分を含んで成る請求の範囲第14項記載の方法。