JPH0374239B2 - - Google Patents
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- JPH0374239B2 JPH0374239B2 JP58204306A JP20430683A JPH0374239B2 JP H0374239 B2 JPH0374239 B2 JP H0374239B2 JP 58204306 A JP58204306 A JP 58204306A JP 20430683 A JP20430683 A JP 20430683A JP H0374239 B2 JPH0374239 B2 JP H0374239B2
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
技術分野
本発明は、一般に、新規オリゴヌクレオチド誘
導体に関する。さらに具体的には、本発明は、ヌ
クレオチドの5′−末端リン酸基延長上に適度な長
さのスペーサーを介して一級アミノ基を導入して
なるオリゴヌクレオチド誘導体に関する。 先行技術 近年、核酸の科学合成は新しい保護基の導入あ
るいはトリエステル法、ホスフアイト法等の新し
い縮合法の開発により飛躍的に進歩している。ま
た、遺伝子工学の急速な進歩とあいまつて、核酸
の科学合成がこの分野でも重要な意義をもつよう
になつてきた。例えば人工遺伝子を合成し、遺伝
子組換え操作を利用して有用物質の産生が行なわ
れている（インターフエロン：Nature、．281、
544（1979）、白血球由来インターフエロン：
Nature、287、411（1980））。また、ハイブリツド
法のためのプローブ（Nucl、Acids Res.９、897
（1981））としてやmRNAあるいは一本鎖DNAか
ら逆転写酵素あるいはDNAポリメラーゼによつ
て、二本鎖DNAを合成する際に必要な鋳型DNA
に相捕的なDNA断片（プライマー）として利用
（Nucl.Acids Res.８、4057（1980））等の応用例
もある。 このように、核酸の有機化学的合成手段は、生
体から単離できない特殊の配列をもつオリゴヌク
レオチドの合成を可能にし、分子生物学、遺伝子
工学等の研究に多大な寄与をするものである。 本発明者らは現在まで、オリゴヌクレオチドの
有機化学的合成分野で固相法を有力な合成手段と
して、種々のオリゴヌクレオチドの合成を行なつ
てその応用を検討してきたが、特にアフイニテイ
クロマトグラフイー用樹脂あるいは非放射性アフ
イニテイプローブ等を開発すべく鋭意努力を重ね
た結果、これらの構造の際に有用な中間体である
オリゴヌクレオチド誘導体を見出した。 現在まで開発あるいは市販されているアフイニ
イテイクロマトグラフイー用樹脂（Arch.
Biochem.Biophys.、168、561（1974）、J.
Biochem.、83、783（1978）、特開昭52−25795号、
同53−101396号、同53−133283号および同55−
36277号各公報）は、一般に特異性、再現性が悪
く、合成がめんどうであるという共通の難点をか
かえている。 非放射性アフイニテイプローブ（Proc.Natl.
Sci.USA.78、6633−6637（1981））においては、
シトシン誘導体の合成が困難であり、任意でかつ
定められた塩基配列をもつDNAの合成が困難で
ある等の問題点がある。また、アフイニテイ樹脂
合成に際して下記に示す文献のものは、リガンド
の合成に手間がかかる等の難点がある。 J.Chromatog.、97、33（1974Biochem.
Biophys.Acta、304、231（1973）Anal.
Biochem.、71、471（1976） 発明の概要 要 旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的と
し、目的物にのみ他の担体を結合できる官能基
（一級アミノ基）を、ヌクレオチドの5′−末端延
長上に適度の長さのスペーサーを介して導入して
なるオリゴヌクレオチド誘導体によつてこの目的
を達成しようというものである。 従つて、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導
体は、下式〔〕で示されるものであること、を
特徴とするものである。 また、本発明による下式〔〕で示されるオリ
ゴヌクレオチド誘導体の製造法は、下式〔〕で
示される化合物の5′−末端延長上のアミノ基の保
護基R2、3′−末端のCOR4基、塩基部分およびリ
ン酸部分の保護基をすべて除去すること、を特徴
とするものである。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意の
自然数であり、R1は二価の直鎖または分岐鎖の
炭化水素残基であり、Ｂはヌクレオチドを構成す
る塩基である（ＢおよびR0が複数個存在すると
きは、それらは同一でも異なつてもよい）。〕 効 果 本発明者らの合成したオリゴデオキシリボヌク
レオチドは、前記アフイニテイクロマトグラフイ
ー用樹脂あるいは核酸用非放射性アフイニテイプ
ローブの短所を回避できるものであり、下記のよ
うな長所を有するものである。 (イ) いかなる塩基配列をも有するアフイニテイ樹
脂やプローブを製造することができる。 (ロ) 合成が非常に簡単であつて、大量合成が可能
である。 (ハ) オリゴヌクレオチド中に存在する他の官能基
（水酸基、リン酸基および塩基部分のアミノ基
など）よりも反応性が高い一般アミノ基を有す
るので、脱保護したオリゴヌクレオチドを精製
せずに担体との縮合に用いることができる。す
なわち、反応条件等の設定により選択的にアミ
ノ基部分と結合可能である。 (ニ) 一級アミノ基を介して選択的に、担体、ビオ
チン、ハプテン、酵素、蛍光物質、化学発光物
質などの標識物質を結合でき、非放射性アフイ
ニテイプローブ、プライマーへの応用が可能で
ある。 発明の具体的説明 オリゴヌクレオチド誘導体〔〕 本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、前
記の式〔〕で示されるものである。 式中、記号【式】は、2′−デオキシリボヌク レオシドの3′−および5′−水素基を除いたデオキ
シリボヌクレオシド残基を示すのに慣用されてい
るものであつて、具体的には下記の構造のもので
ある。 【式】 従つて、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導
体は、具体的には、下式で示される。 置換基Ｂはヌクレオチドを構成する塩基を示
し、通常はアデニン、チミン、シトシンまたはグ
アニンである。化合物〔〕中にＢが複数個存在
するときは、それらは同一でも異なつてもよい。 ｍおよびｎは、それぞれ０または自然数を示
す。本発明オリゴヌクレオチド誘導体の重合度が
ｍ＋ｎで表示されているのは、本発明の好ましい
製造法で重合度がそれぞれｍおよびｎのフラクシ
ヨンを縮合させていることによるものである（詳
細後記）。その場合のｍは実用的には０〜６、特
に１〜４、ｎは実用的には０〜40、特に０〜20、
である。 基R1は化合物〔〕のヌクレオチド部分の5′−
末端リン酸基とアミノ基部分とを連結する二価の
直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である。これ
は、特に炭素数２〜20程度の直鎖または分岐鎖の
アルキレン基が適当である。好ましいR1は、炭
素数２〜６のアルキレン基である。 化合物〔〕の合成 一般的説明 化合物〔〕、すなわち本発明によるオリゴヌ
クレオチド誘導体、は合目的的な任意の方法によ
つて合成することができる。 一つの好ましい方法は、下式〔〕で示される
化合物の5′−末端延長上のアミノ基の保護基R2、
3′−末端のCOR4基、塩基部分およびリン酸部分
の保護基をすべて除去すること、を特徴とするも
のである。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意の
自然数であつてｍ＋ｎ≧１であり、R0はリン酸
基を保護する置換基で通常置換されたフエニル基
であり、R1は二価の直鎖または分岐鎖の炭化水
素残基であり、R2はアミノ基の保護基であり、
COR4基はヌクレオチドの3′−末端水酸基の保護
基であり、B′はヌクレオチドを構成する保護さ
れた塩基であつて必要に応じて保護されたもので
あり、Ｂはヌクレオチドを構成する塩基である
（B′またはＢおよびR0が複数個存在するときは、
それらは同一でも異なつてもよい）。〕 すなわち、この方法は前記の式〔〕のオリゴ
ヌクレオチド誘導体、すなわちオリゴデオキシヌ
クレオチドの5′−末端リン酸基に基R1を介して保
護された一級アミノ基を導入し、ヌクレオチドの
塩基部分およびリン酸基部分が保護され、3′−末
端に結合した水酸基の水素原子がCOR4基で置換
されたもの、のすべての保護基を除去することか
らなるものである。 一方、式〔〕の化合物は、他の官能基部分が
保護されたオリゴヌクレオチドの5′−水酸基延長
上での保護された一級アミノ基の導入からなる方
法で合成することができる。 第１図は、この好ましい合成法の一例を示すフ
ローチヤートである。フローチヤート中の記号
は、下記の意味を持つ（その意義ないし詳細は、
後記した通りである）。 R0リン酸基を保護する置換基であつて、通常
オルトクロロフエニル基が用いられる。 R1二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基で
ある。 R2アミノ基の保護基であつて、通常トリフル
オロアセチル基が用いられる。 R3他のすべての保護基が安定な条件で容易に
脱離されて、リン酸ジエステルを与えることがで
きる置換基であつて、通常シアノエチル基が用い
られる。 COR4通常のオリゴヌクレオチド合成法に用い
られる3′−水酸基の保護基である。具体的には、
R4が低級アルキル基、アリール基（特に、フエ
ニル基、またはメチル置換フエニル）、あるいは
固相合成法の際に用いられる適当なスペーサーを
持つ担体（ポリスチレン樹脂、ポリアミド樹脂）
であるもの、がある。 R55′−末端水酸基の保護基であつて、通常ジメ
トキシトリチル基が用いられる。 ｍ ０または任意の自然数。 ｎ ０または任意の自然数。 Ｂ 塩基を示す。 B′ 保護された塩基を示すが、通常はN6−ベン
ゾイルアデニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、
N6−ベンゾイルシトシンおよびチミン（すな
わち保護不要）より選択される。 化合物〔〕の合成 式〔〕で示される化合物は、他の官能基部分
が保護されたオリゴヌクレオチドの5′−水酸基延
長上での保護された一級アミノ基の導入からなる
合目的的な任意の方法によつて合成することがで
きる。 化合物〔〕の合成法をその一実施態様（第１
図）について示せば、下記の通りである。第１図
において、5′−水酸基化合物〔０〕にリン酸化剤
（たとえば、ホスホジトリアゾリド、ホスホジク
ロリドまたはホスホベンゾトリアゾリド等）を作
用させてリン酸化し、ついでアミノ基が保護され
ているアミノアルコール化合物〔〕（この化合
物はアミノアルキレンアルコール（NH2−R1−
OH）のアミノ基をR2で保護することにより得る
ことができる）を縮合させることにより化合物
〔〕を得る。 なお、化合物〔０〕はオリゴヌクレオチドであ
つて、通常のオリゴヌクレオチド合成法で製造可
能である。 一方、通常のオリゴヌクレオチド合成法、好ま
しくは本発明者らの固相合成法（Tetrahedron
Letters1979、3635（1979）、Nucleic Acids
Research８、5473（1980）、Nucleic Acids Rese
−arch８、5491（1980）、Nucleic Acids
Research８、5507（1980）、Nucleic Acids
Research Symposium Series７、281（1980）に
従つて化合物〔〕を合成する。この5′末端の保
護基を除去した化合物〔′〕と先に合成した化
合物〔〕とを縮合剤を用いて縮合させることに
より化合物〔〕を得ることができる。縮合剤と
してはトシルクロリド、メシチレンスルホニルク
ロリド、メシチレンスルホニルテトラゾリドおよ
びメシチレンスルホニルニトロトリアゾリド等が
あるが、メシチレンスルホニルニトロトリアゾリ
ドが好ましい。なお、反応条件等の詳細は後記実
験例を参照されたい。 化合物〔〕の合成 化合物〔〕は、上記化合物〔〕の保護基を
すべて除去することによつて得ることができる。 保護基COR4基、リン酸トリエステル中のオル
トクロロフエニル基および塩基部分のアシル基
は、0.5Mのテトラメチルグアニジン−ピリジン
−２−カルボアルドキシムのジオキサン−水
（９：１（Ｖ／Ｖ））溶液で処理後、アルカリ処理
（濃アンモニア水）を行なうことにより除去され
る。R2がトリフルオロアセチル基の場合は、ア
ンモニア処理により充分脱離されるが、オルトニ
トロフエニルスルフエニル基である場合はメルカ
プトエタノール処理が必要である。R2として他
の保護基を用いた場合は、オリゴヌクレオチド部
分が安定な条件で、さらに別の処理を加えること
も可能である。なお、オリゴデオキシリボヌクレ
オドの合成法は既に各種のものが公知であつて、
保護基の種類およびその導入ないし除去ならびに
縮合その他について上記以外の詳細は核酸の化学
合成に関する成書や総説たとえば「ヌクレオシ
ド・ヌクレオチドの合成」（丸善1977年）、「核酸
有機化学」（化学同人1979年）、「核酸」（朝倉書店
1979年）、Tetrahedron、34、31（1978）、有合化、
34、723（1978）および化学の領域、33、566
（1979）等を参照することができる。 実施例 フローチヤート 第２図のフローチヤートに従つて、本発明の化
合物（同図の化合物を製造した。 第２図で、記号は次の意味を持つ。 B′ ベンゾイル化アデニン Ｂ アデニン DMTr ジメトキシトリチル ｐはポリスチレンの重合度を示す。 R0 オルトクロロフエニル Et エチル CE −シアノエチル ｍ ２ ｎ 12 化合物〔〕（第２図の）の合成 実験１−１ ジメトキシトリチルアデノシン／樹脂〔〕
（樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された目
的化合物は外観的には樹脂そのものと変らないの
で、樹脂に担持された当該化合物を以下において
単に樹脂と呼ぶことにする）300mg（0.033ｍ
mol）をイソプロパノール−塩化メチレン（15：
85、Ｖ／Ｖ）溶液10mlで３回洗浄後、臭化亜鉛の
1.0Mのイソプロパノール−塩化メチレン溶液８
mlで５分間ずつ４回反応（脱トリチル化）させて
樹脂〔〕を得る。樹脂〔〕をイソプロパノー
ル−塩化メチレン溶液10mlで３回洗浄し、これに
ジヌクレオチド〔〕150mg（0.1ｍmol）のピリ
ジン溶液を添加後、共沸させて系を無水とし、メ
シチレンスルホニルニトリロトリアゾリド（以下
MSNTと記す）150mg（0.5ｍmol）と無水ピリジ
ン２mlとを添加して90分間反応（縮合）させる。
反応後、ピリジン10mlで３回洗浄し、触媒量（約
10mg）のジメチルアミノピリジン（以下DMAP）
を含む無水酢酸−ピリジン（１：９、（Ｖ／Ｖ））
溶液10mlを添加し10分間反応させて未反応5′−水
酸基をアセチル化して保護し、これをピリジンで
洗浄して、化合物〔′〕（ｎ＝２）を得る。以上
のような操作を６回くり返して、化合物〔〕
（ｎ＝12）を得る。 一方、5′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔〕
800mg（0.71ｍmol）とオルトクロロフエニルホ
スホジトリアゾリドとを後者のジオキサン溶液
（1.0ｍmol、６ml）中で２時間反応させ、続いて
トリフルオロアセチル−６−アミノヘキサノール
300mg（1.4ｍmol）および１−メチル−イミダゾ
ール115mg（1.4ｍmol）を加えてさらに２時間反
応させる。反応終了後、溶媒を留去し、残渣をク
ロロホルムに溶解した後、水、0.5Mリン酸二水
素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液および５％の塩化ナトリウム水溶液でそれぞ
れ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。クロ
ロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製
（溶出液として０〜４％のメタノール含有クロロ
ホルムを使用）し、溶出液を濃縮後ペンタン中に
滴下し粉末状の化合物〔〕を得る。 上記で合成した化合物〔〕（ｎ＝12）115mg、
（3.45μmol）を前述と同様の方法で脱トリチル化
したもの〔〕に、化合物〔〕60mg（0.04ｍ
mol）をトリエチルアミン−ピリジン−水（１：
３：１、Ｖ／Ｖ）溶液３mlで処理（脱シアノエチ
ル化）した化合物〔〕を加え、無水にしたの
ち、MSNT50mg（0.2ｍmol）およびピリジン１
mlを加え90分間反応（縮合）させ、反応終了後ピ
リジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥して、完
全に保護されたオリゴヌクレオチド誘導体〔〕
を得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔〕15mgを0.5M
テトラメチルグアニジン−ピリジン−２−カルボ
アルドジキシムのジオキサン−水（９：１、
（Ｖ／Ｖ）溶液200μlを加え、遠沈管中、室温で24
時間反応させる。反応後、濃アンモニア水（2.5
ml）を加えて密閉し、50℃で一夜反応させる。反
応終了後、過し、液を濃縮後、水に溶解させ
てからエーテルで抽出を行なう。水層を濃縮後、
セフアデツクスＧ−50（φ1.5×120cm、溶出液は
0.05Mの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液PH
7.5）で脱塩精製しペンタデカアデニル酸誘導体
〔〕を得た。 また、同様の方法で実験１−２、１−３、１−
４、１−５および１−６のオリゴヌクレオチド誘
導体を得た。実験例１−１〜１−６の化合物の塩
基配列その他を第１表に示す。 【表】 【表】 ただし、この表でＡはアデニン、Ｔはチミン、
Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す。 実験例１−１、１−２および１−４についての
セフアデツクスおよび高速液体クロマトグラフイ
ーの結果を第３〜４、５〜６および７〜８図に示
す。これらの結果より、化合物〔〕が生成して
いることがわかる。
導体に関する。さらに具体的には、本発明は、ヌ
クレオチドの5′−末端リン酸基延長上に適度な長
さのスペーサーを介して一級アミノ基を導入して
なるオリゴヌクレオチド誘導体に関する。 先行技術 近年、核酸の科学合成は新しい保護基の導入あ
るいはトリエステル法、ホスフアイト法等の新し
い縮合法の開発により飛躍的に進歩している。ま
た、遺伝子工学の急速な進歩とあいまつて、核酸
の科学合成がこの分野でも重要な意義をもつよう
になつてきた。例えば人工遺伝子を合成し、遺伝
子組換え操作を利用して有用物質の産生が行なわ
れている（インターフエロン：Nature、．281、
544（1979）、白血球由来インターフエロン：
Nature、287、411（1980））。また、ハイブリツド
法のためのプローブ（Nucl、Acids Res.９、897
（1981））としてやmRNAあるいは一本鎖DNAか
ら逆転写酵素あるいはDNAポリメラーゼによつ
て、二本鎖DNAを合成する際に必要な鋳型DNA
に相捕的なDNA断片（プライマー）として利用
（Nucl.Acids Res.８、4057（1980））等の応用例
もある。 このように、核酸の有機化学的合成手段は、生
体から単離できない特殊の配列をもつオリゴヌク
レオチドの合成を可能にし、分子生物学、遺伝子
工学等の研究に多大な寄与をするものである。 本発明者らは現在まで、オリゴヌクレオチドの
有機化学的合成分野で固相法を有力な合成手段と
して、種々のオリゴヌクレオチドの合成を行なつ
てその応用を検討してきたが、特にアフイニテイ
クロマトグラフイー用樹脂あるいは非放射性アフ
イニテイプローブ等を開発すべく鋭意努力を重ね
た結果、これらの構造の際に有用な中間体である
オリゴヌクレオチド誘導体を見出した。 現在まで開発あるいは市販されているアフイニ
イテイクロマトグラフイー用樹脂（Arch.
Biochem.Biophys.、168、561（1974）、J.
Biochem.、83、783（1978）、特開昭52−25795号、
同53−101396号、同53−133283号および同55−
36277号各公報）は、一般に特異性、再現性が悪
く、合成がめんどうであるという共通の難点をか
かえている。 非放射性アフイニテイプローブ（Proc.Natl.
Sci.USA.78、6633−6637（1981））においては、
シトシン誘導体の合成が困難であり、任意でかつ
定められた塩基配列をもつDNAの合成が困難で
ある等の問題点がある。また、アフイニテイ樹脂
合成に際して下記に示す文献のものは、リガンド
の合成に手間がかかる等の難点がある。 J.Chromatog.、97、33（1974Biochem.
Biophys.Acta、304、231（1973）Anal.
Biochem.、71、471（1976） 発明の概要 要 旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的と
し、目的物にのみ他の担体を結合できる官能基
（一級アミノ基）を、ヌクレオチドの5′−末端延
長上に適度の長さのスペーサーを介して導入して
なるオリゴヌクレオチド誘導体によつてこの目的
を達成しようというものである。 従つて、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導
体は、下式〔〕で示されるものであること、を
特徴とするものである。 また、本発明による下式〔〕で示されるオリ
ゴヌクレオチド誘導体の製造法は、下式〔〕で
示される化合物の5′−末端延長上のアミノ基の保
護基R2、3′−末端のCOR4基、塩基部分およびリ
ン酸部分の保護基をすべて除去すること、を特徴
とするものである。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意の
自然数であり、R1は二価の直鎖または分岐鎖の
炭化水素残基であり、Ｂはヌクレオチドを構成す
る塩基である（ＢおよびR0が複数個存在すると
きは、それらは同一でも異なつてもよい）。〕 効 果 本発明者らの合成したオリゴデオキシリボヌク
レオチドは、前記アフイニテイクロマトグラフイ
ー用樹脂あるいは核酸用非放射性アフイニテイプ
ローブの短所を回避できるものであり、下記のよ
うな長所を有するものである。 (イ) いかなる塩基配列をも有するアフイニテイ樹
脂やプローブを製造することができる。 (ロ) 合成が非常に簡単であつて、大量合成が可能
である。 (ハ) オリゴヌクレオチド中に存在する他の官能基
（水酸基、リン酸基および塩基部分のアミノ基
など）よりも反応性が高い一般アミノ基を有す
るので、脱保護したオリゴヌクレオチドを精製
せずに担体との縮合に用いることができる。す
なわち、反応条件等の設定により選択的にアミ
ノ基部分と結合可能である。 (ニ) 一級アミノ基を介して選択的に、担体、ビオ
チン、ハプテン、酵素、蛍光物質、化学発光物
質などの標識物質を結合でき、非放射性アフイ
ニテイプローブ、プライマーへの応用が可能で
ある。 発明の具体的説明 オリゴヌクレオチド誘導体〔〕 本発明によるオリゴヌクレオチド誘導体は、前
記の式〔〕で示されるものである。 式中、記号【式】は、2′−デオキシリボヌク レオシドの3′−および5′−水素基を除いたデオキ
シリボヌクレオシド残基を示すのに慣用されてい
るものであつて、具体的には下記の構造のもので
ある。 【式】 従つて、本発明によるオリゴヌクレオチド誘導
体は、具体的には、下式で示される。 置換基Ｂはヌクレオチドを構成する塩基を示
し、通常はアデニン、チミン、シトシンまたはグ
アニンである。化合物〔〕中にＢが複数個存在
するときは、それらは同一でも異なつてもよい。 ｍおよびｎは、それぞれ０または自然数を示
す。本発明オリゴヌクレオチド誘導体の重合度が
ｍ＋ｎで表示されているのは、本発明の好ましい
製造法で重合度がそれぞれｍおよびｎのフラクシ
ヨンを縮合させていることによるものである（詳
細後記）。その場合のｍは実用的には０〜６、特
に１〜４、ｎは実用的には０〜40、特に０〜20、
である。 基R1は化合物〔〕のヌクレオチド部分の5′−
末端リン酸基とアミノ基部分とを連結する二価の
直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である。これ
は、特に炭素数２〜20程度の直鎖または分岐鎖の
アルキレン基が適当である。好ましいR1は、炭
素数２〜６のアルキレン基である。 化合物〔〕の合成 一般的説明 化合物〔〕、すなわち本発明によるオリゴヌ
クレオチド誘導体、は合目的的な任意の方法によ
つて合成することができる。 一つの好ましい方法は、下式〔〕で示される
化合物の5′−末端延長上のアミノ基の保護基R2、
3′−末端のCOR4基、塩基部分およびリン酸部分
の保護基をすべて除去すること、を特徴とするも
のである。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意の
自然数であつてｍ＋ｎ≧１であり、R0はリン酸
基を保護する置換基で通常置換されたフエニル基
であり、R1は二価の直鎖または分岐鎖の炭化水
素残基であり、R2はアミノ基の保護基であり、
COR4基はヌクレオチドの3′−末端水酸基の保護
基であり、B′はヌクレオチドを構成する保護さ
れた塩基であつて必要に応じて保護されたもので
あり、Ｂはヌクレオチドを構成する塩基である
（B′またはＢおよびR0が複数個存在するときは、
それらは同一でも異なつてもよい）。〕 すなわち、この方法は前記の式〔〕のオリゴ
ヌクレオチド誘導体、すなわちオリゴデオキシヌ
クレオチドの5′−末端リン酸基に基R1を介して保
護された一級アミノ基を導入し、ヌクレオチドの
塩基部分およびリン酸基部分が保護され、3′−末
端に結合した水酸基の水素原子がCOR4基で置換
されたもの、のすべての保護基を除去することか
らなるものである。 一方、式〔〕の化合物は、他の官能基部分が
保護されたオリゴヌクレオチドの5′−水酸基延長
上での保護された一級アミノ基の導入からなる方
法で合成することができる。 第１図は、この好ましい合成法の一例を示すフ
ローチヤートである。フローチヤート中の記号
は、下記の意味を持つ（その意義ないし詳細は、
後記した通りである）。 R0リン酸基を保護する置換基であつて、通常
オルトクロロフエニル基が用いられる。 R1二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基で
ある。 R2アミノ基の保護基であつて、通常トリフル
オロアセチル基が用いられる。 R3他のすべての保護基が安定な条件で容易に
脱離されて、リン酸ジエステルを与えることがで
きる置換基であつて、通常シアノエチル基が用い
られる。 COR4通常のオリゴヌクレオチド合成法に用い
られる3′−水酸基の保護基である。具体的には、
R4が低級アルキル基、アリール基（特に、フエ
ニル基、またはメチル置換フエニル）、あるいは
固相合成法の際に用いられる適当なスペーサーを
持つ担体（ポリスチレン樹脂、ポリアミド樹脂）
であるもの、がある。 R55′−末端水酸基の保護基であつて、通常ジメ
トキシトリチル基が用いられる。 ｍ ０または任意の自然数。 ｎ ０または任意の自然数。 Ｂ 塩基を示す。 B′ 保護された塩基を示すが、通常はN6−ベン
ゾイルアデニン、Ｎ−イソブチリルグアニン、
N6−ベンゾイルシトシンおよびチミン（すな
わち保護不要）より選択される。 化合物〔〕の合成 式〔〕で示される化合物は、他の官能基部分
が保護されたオリゴヌクレオチドの5′−水酸基延
長上での保護された一級アミノ基の導入からなる
合目的的な任意の方法によつて合成することがで
きる。 化合物〔〕の合成法をその一実施態様（第１
図）について示せば、下記の通りである。第１図
において、5′−水酸基化合物〔０〕にリン酸化剤
（たとえば、ホスホジトリアゾリド、ホスホジク
ロリドまたはホスホベンゾトリアゾリド等）を作
用させてリン酸化し、ついでアミノ基が保護され
ているアミノアルコール化合物〔〕（この化合
物はアミノアルキレンアルコール（NH2−R1−
OH）のアミノ基をR2で保護することにより得る
ことができる）を縮合させることにより化合物
〔〕を得る。 なお、化合物〔０〕はオリゴヌクレオチドであ
つて、通常のオリゴヌクレオチド合成法で製造可
能である。 一方、通常のオリゴヌクレオチド合成法、好ま
しくは本発明者らの固相合成法（Tetrahedron
Letters1979、3635（1979）、Nucleic Acids
Research８、5473（1980）、Nucleic Acids Rese
−arch８、5491（1980）、Nucleic Acids
Research８、5507（1980）、Nucleic Acids
Research Symposium Series７、281（1980）に
従つて化合物〔〕を合成する。この5′末端の保
護基を除去した化合物〔′〕と先に合成した化
合物〔〕とを縮合剤を用いて縮合させることに
より化合物〔〕を得ることができる。縮合剤と
してはトシルクロリド、メシチレンスルホニルク
ロリド、メシチレンスルホニルテトラゾリドおよ
びメシチレンスルホニルニトロトリアゾリド等が
あるが、メシチレンスルホニルニトロトリアゾリ
ドが好ましい。なお、反応条件等の詳細は後記実
験例を参照されたい。 化合物〔〕の合成 化合物〔〕は、上記化合物〔〕の保護基を
すべて除去することによつて得ることができる。 保護基COR4基、リン酸トリエステル中のオル
トクロロフエニル基および塩基部分のアシル基
は、0.5Mのテトラメチルグアニジン−ピリジン
−２−カルボアルドキシムのジオキサン−水
（９：１（Ｖ／Ｖ））溶液で処理後、アルカリ処理
（濃アンモニア水）を行なうことにより除去され
る。R2がトリフルオロアセチル基の場合は、ア
ンモニア処理により充分脱離されるが、オルトニ
トロフエニルスルフエニル基である場合はメルカ
プトエタノール処理が必要である。R2として他
の保護基を用いた場合は、オリゴヌクレオチド部
分が安定な条件で、さらに別の処理を加えること
も可能である。なお、オリゴデオキシリボヌクレ
オドの合成法は既に各種のものが公知であつて、
保護基の種類およびその導入ないし除去ならびに
縮合その他について上記以外の詳細は核酸の化学
合成に関する成書や総説たとえば「ヌクレオシ
ド・ヌクレオチドの合成」（丸善1977年）、「核酸
有機化学」（化学同人1979年）、「核酸」（朝倉書店
1979年）、Tetrahedron、34、31（1978）、有合化、
34、723（1978）および化学の領域、33、566
（1979）等を参照することができる。 実施例 フローチヤート 第２図のフローチヤートに従つて、本発明の化
合物（同図の化合物を製造した。 第２図で、記号は次の意味を持つ。 B′ ベンゾイル化アデニン Ｂ アデニン DMTr ジメトキシトリチル ｐはポリスチレンの重合度を示す。 R0 オルトクロロフエニル Et エチル CE −シアノエチル ｍ ２ ｎ 12 化合物〔〕（第２図の）の合成 実験１−１ ジメトキシトリチルアデノシン／樹脂〔〕
（樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された目
的化合物は外観的には樹脂そのものと変らないの
で、樹脂に担持された当該化合物を以下において
単に樹脂と呼ぶことにする）300mg（0.033ｍ
mol）をイソプロパノール−塩化メチレン（15：
85、Ｖ／Ｖ）溶液10mlで３回洗浄後、臭化亜鉛の
1.0Mのイソプロパノール−塩化メチレン溶液８
mlで５分間ずつ４回反応（脱トリチル化）させて
樹脂〔〕を得る。樹脂〔〕をイソプロパノー
ル−塩化メチレン溶液10mlで３回洗浄し、これに
ジヌクレオチド〔〕150mg（0.1ｍmol）のピリ
ジン溶液を添加後、共沸させて系を無水とし、メ
シチレンスルホニルニトリロトリアゾリド（以下
MSNTと記す）150mg（0.5ｍmol）と無水ピリジ
ン２mlとを添加して90分間反応（縮合）させる。
反応後、ピリジン10mlで３回洗浄し、触媒量（約
10mg）のジメチルアミノピリジン（以下DMAP）
を含む無水酢酸−ピリジン（１：９、（Ｖ／Ｖ））
溶液10mlを添加し10分間反応させて未反応5′−水
酸基をアセチル化して保護し、これをピリジンで
洗浄して、化合物〔′〕（ｎ＝２）を得る。以上
のような操作を６回くり返して、化合物〔〕
（ｎ＝12）を得る。 一方、5′−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔〕
800mg（0.71ｍmol）とオルトクロロフエニルホ
スホジトリアゾリドとを後者のジオキサン溶液
（1.0ｍmol、６ml）中で２時間反応させ、続いて
トリフルオロアセチル−６−アミノヘキサノール
300mg（1.4ｍmol）および１−メチル−イミダゾ
ール115mg（1.4ｍmol）を加えてさらに２時間反
応させる。反応終了後、溶媒を留去し、残渣をク
ロロホルムに溶解した後、水、0.5Mリン酸二水
素ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液および５％の塩化ナトリウム水溶液でそれぞ
れ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。クロ
ロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製
（溶出液として０〜４％のメタノール含有クロロ
ホルムを使用）し、溶出液を濃縮後ペンタン中に
滴下し粉末状の化合物〔〕を得る。 上記で合成した化合物〔〕（ｎ＝12）115mg、
（3.45μmol）を前述と同様の方法で脱トリチル化
したもの〔〕に、化合物〔〕60mg（0.04ｍ
mol）をトリエチルアミン−ピリジン−水（１：
３：１、Ｖ／Ｖ）溶液３mlで処理（脱シアノエチ
ル化）した化合物〔〕を加え、無水にしたの
ち、MSNT50mg（0.2ｍmol）およびピリジン１
mlを加え90分間反応（縮合）させ、反応終了後ピ
リジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥して、完
全に保護されたオリゴヌクレオチド誘導体〔〕
を得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔〕15mgを0.5M
テトラメチルグアニジン−ピリジン−２−カルボ
アルドジキシムのジオキサン−水（９：１、
（Ｖ／Ｖ）溶液200μlを加え、遠沈管中、室温で24
時間反応させる。反応後、濃アンモニア水（2.5
ml）を加えて密閉し、50℃で一夜反応させる。反
応終了後、過し、液を濃縮後、水に溶解させ
てからエーテルで抽出を行なう。水層を濃縮後、
セフアデツクスＧ−50（φ1.5×120cm、溶出液は
0.05Mの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液PH
7.5）で脱塩精製しペンタデカアデニル酸誘導体
〔〕を得た。 また、同様の方法で実験１−２、１−３、１−
４、１−５および１−６のオリゴヌクレオチド誘
導体を得た。実験例１−１〜１−６の化合物の塩
基配列その他を第１表に示す。 【表】 【表】 ただし、この表でＡはアデニン、Ｔはチミン、
Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示す。 実験例１−１、１−２および１−４についての
セフアデツクスおよび高速液体クロマトグラフイ
ーの結果を第３〜４、５〜６および７〜８図に示
す。これらの結果より、化合物〔〕が生成して
いることがわかる。
第１図は、本発明の化合物を合成する方法の一
例を示すフローチヤートである。第２図は、実験
例で示した本化合物のフローチヤートである。第
３、５および７図は、化合物〔〕（それぞれ実
験例１−１、１−２および１−４）についてのセ
フアデツクスＧ−50での溶出パターンを示したも
のである。第４，６および８図は、化合物〔〕
（それぞれ実験例１−１、１−２および１−４）
についての高速液体クロマトグラフイーの溶出パ
ターンを示したものである。
例を示すフローチヤートである。第２図は、実験
例で示した本化合物のフローチヤートである。第
３、５および７図は、化合物〔〕（それぞれ実
験例１−１、１−２および１−４）についてのセ
フアデツクスＧ−50での溶出パターンを示したも
のである。第４，６および８図は、化合物〔〕
（それぞれ実験例１−１、１−２および１−４）
についての高速液体クロマトグラフイーの溶出パ
ターンを示したものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下式〔〕で示されるものであることを特徴
とする、オリゴヌクレオチド誘導体。 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれ０または任意の
自然数であつてｍ＋ｎ≧１であり、R1は二価の
直鎖または分岐鎖の炭化水素残基であり、Ｂはヌ
クレオチドを構成する塩基である（Ｂが複数個存
在するときは、それらは同一でも異なつてもよ
い。）〕 ２ 塩基Ｂがアデニン、チミン、シトシンおよび
グアニンからなる群より選ばれたものである、特
許請求の範囲第１項記載のオリゴヌクレオチド誘
導体。 ３ R1が炭素数２〜20の直鎖または分岐鎖のア
ルキレン基である、特許請求の範囲第１項または
第２項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。 ４ ｍが０または６までの自然数、ｎが０または
40までの自然数である、特許請求の範囲第１〜３
項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド誘
導体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58204306A JPS5993100A (ja) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | オリゴヌクレオチド誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58204306A JPS5993100A (ja) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | オリゴヌクレオチド誘導体 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57138136A Division JPS5927900A (ja) | 1982-08-09 | 1982-08-09 | 固定化オリゴヌクレオチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5993100A JPS5993100A (ja) | 1984-05-29 |
| JPH0374239B2 true JPH0374239B2 (ja) | 1991-11-26 |
Family
ID=16488294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58204306A Granted JPS5993100A (ja) | 1983-10-31 | 1983-10-31 | オリゴヌクレオチド誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5993100A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1223831A (en) | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| USRE43096E1 (en) | 1984-01-16 | 2012-01-10 | California Institute Of Technology | Tagged extendable primers and extension products |
| US5821058A (en) * | 1984-01-16 | 1998-10-13 | California Institute Of Technology | Automated DNA sequencing technique |
| EP2028272B1 (en) | 2006-06-06 | 2014-01-08 | Panasonic Corporation | Method of modifying nucleotide chain |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57106696A (en) * | 1980-12-25 | 1982-07-02 | Teijin Ltd | 1-(beta-d-arabinofuranosyl)cytosine derivative and its preparation |
-
1983
- 1983-10-31 JP JP58204306A patent/JPS5993100A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5993100A (ja) | 1984-05-29 |
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