JP2000515741A

JP2000515741A - 感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子

Info

Publication number: JP2000515741A
Application number: JP10506187A
Authority: JP
Inventors: ローリー，ダグラス，アール．; シラー，ジョン，ティー．; ロダン，リチャード，ビー．
Original assignee: Government of the United States of America
Current assignee: Government of the United States of America
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-07-14
Publication date: 2000-11-28
Also published as: EP0922105A2; AU3725697A; DE69734829D1; AU732125B2; WO1998002548A2; EP0922105B1; ATE312178T1; CA2257822A1; US20030207446A1; US6599739B1; WO1998002548A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、（ａ）Ｅ２結合部位と遺伝子および前記遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットとを含有するパピローマウイルスベクターＤＮＡと、（ｂ）Ｌ１およびＬ２構造タンパク質を含んで前記ベクターＤＮＡを包膜するパピローマウイルスキャプシドとを含み、前記遺伝子は第１生物種に由来し、前記Ｌ１構造タンパク質は第２生物種に由来し、前記第１生物種は前記第２生物種と異なる、遺伝子導入に有用な感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子技術分野本発明は、遺伝子導入に有用な感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子に関する。発明の背景遺伝子導入は、真核細胞の遺伝的能力範囲が改変される実験手法である。本質的には、遺伝子導入は、１つ又はそれ以上の遺伝子およびそれらの発現を制御する配列から成る発現カセットの標的細胞への送達を含む。導入工程は、それが適切に機能し得る細胞へのカセットの送達により成し遂げられる。真核細胞中で外来タンパク質を発現させるための送達系を開発するために、かなりの努力がなされてきた。これらの系は２つの種類、即ちトランスフェクションと感染とに分けられる。クローン化ＤＮＡを真核細胞中に導入するための送達系の第一の種類は、トランスフェクションを伴う。リン酸カルシウム−又はＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションは、最も広範に用いられる方法である。ポリカチオンであるポリブレン（Polybrene）は、他の方法によるトランスフェクションに相対的に抵抗性である培養細胞中へのプラスミドＤＮＡの有効且つ安定導入を可能にする(Kawai，S.,and Nishizawa，M.，1984，Mol.Cell．Biol．4,1172;Chaney，W .G.,et al.,1986，Somatic Cell Mol．Genet．12，237)。プロトプラスト融合では、目的プラスミドの多数のコピーを保有する細菌由来のプロトプラストが培養哺乳類細胞と直接混合され、細胞膜の融合がポリエチレングリコールを用いて成し遂げられ、細菌の内容物が哺乳類細胞中に送達されるという結果を生じる（Sc haffner,W.，1980，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77，2163;Rassoulzadegan，M. ，et al.,1982，Nature 295，257）。エレクトロポレーションは、ＤＮＡが細胞質中に直接取り込まれるように哺乳類および植物細胞に電気的パルスを適用することを特徴とする（Neumann，E.，et al.，1982，EMBO J．1,841;Zimmermann，U .，1982， Biochim．Biophys．Acta 694，227）。人工膜小胞、例えばリポソームおよび陽イオン性脂質は、in vitroおよびin vivoでの送達ビヒクルとして有用である（M annino，R.J.，and Gould-Fogerite，S.,1988，Bio Techniques 6，682;Felgner ，P.L.，and Holm，M.，1989，Bethesda Res．Lab．Focus 11，21;Maurer，R.A. ，1989，Bethesda Res．Lab．Focus 11，25）。核への直接マイクロインジェクションは有効であるが、しかし大規模にＤＮＡを導入するために使用することはできない（Capecchi，M.R.，1980，Cell 22，479）。また、裸ＤＮＡは、それ自体、パーティクルボンバードメントにより細胞中に送られる（Yang，N.S.,et al.,1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，9568）か、又は、特に筋肉中に注入される場合には、細胞に取り込まれる（wolff，J.A.，et al.,1990，Science 247，1465）。他方の種類の送達系は感染により媒介され、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（Elder，J.T.，et al.,1981，Annu．Rev．Genet．15，295;Get hing，M.J.，and Sambrook，J.，1981，Nature 293，620;Rigby，P.W.J.，1982 ，Genetic Engineering，R．Williamson，ed.，Academic Press，London，vol.3 ，p.83;Rigby，P.W.J.，1983，J．Gen．Virol．64，255;Doyle，C.，et al.，19 85，J．Cell．Biol．100，704;Sambrook，J.，et al.,1986，Mol．Biol．Med．3 ，459）、ワクシニアウイルス（Mackett，M.，et al.,1985，DNA cloning:A pra ctical approach，D.M．Glover，ed.，IRL Press，Oxford，vol.2，p.191;Moss ，B.，1985，Virology，B.N．Fields，et al.，eds.，Raven Press，New York， p.685;Fuerst，T.R.，et al.，1986，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83，8122;F uerst，T.R.，et al.，1987，Mol．Cell．Biol．7，2538）、アデノウイルス（S oinick，D.,1981，Cell 24，135;Thummel，C.，et al.，1981，Cell 23，825;Th ummel，C.，et al.，1982，J．Mol．Appl．Genet．1，435;Thummel，C.，et al. ，1983，Cell 33，455;Mansour，S.L.，et al.，1985，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 82，1359;Karisson，S.，et al.，1986，EMBO J.5，2377;Berkner，K.L .，1988,Bio Techniques 6，616）、レトロウイルス（Dick，J.E.，et al.，198 6，Trends Genet．2，165;Gilboa，E.，et al.，1986，Bio Techniques 4，50 4;Eglitis，M.A.，and Anderson，W.F.，1988，BioTechniques 6，608）およびバキュロウイルス（Luckow，V.A.，and Summers，M．D.，1988，Bio/Technology 6，47）由来のウイルス発現ベクターの使用を含む。真核細胞中のクローン化遺伝子からのタンパク質の発現は、多数の異なる目的のために使用されてきた。その目的とは即ち、コードされたタンパク質を検出するための免疫学的又は機能的アッセイを用いることによりクローン化遺伝子の同定を確認するため、グリコシル化又はタンパク質分解プロセッシングのような翻訳後修飾を要するタンパク質をコードする遺伝子を発現するため、普通では天然供給源から限定量しか得られない目的生物学的タンパク質を大量に製造するため、種々の種類の細胞中でのそれらの発現後のタンパク質の生合成および細胞内輸送を研究するため、正常および突然変異タンパク質の特性を分析することにより構造−機能関係を明らかにするため、原核細胞中でｍＲＮＡ中に正しく転写され得ないイントロン含有ゲノム配列を発現するため、そして遺伝子発現に関与するＤＮＡ配列エレメントを同定するためである。タンパク質の発現はこのような多くの異なる目的に役立つため、真核細胞中に外来ＤＮＡを入れるという難題に応じ得るような新規の送達系が必要である。本発明は、この必要性を満たす。本発明のこれらのおよびその他の目的は、本明細書を全体的に考慮すれば、当業者には明らかである。発明の概要一態様において、本発明は感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を提供する。別の態様では、本発明はＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝ビリオンを提供する。さらに別の態様では、本発明は、Ｅ２結合部位並びに遺伝子および遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットを含むパピローマウイルスベクターＤＮＡと、Ｌ１およびＬ２構造タンパク質を含んでベクターＤＮＡを包膜(encapsidate )するパピローマウイルスキャプシドとを含み、遺伝子は第１生物種に由来し、Ｌ１構造タンパク質は第２生物種に由来し、そして第１生物種は第２生物種とは異なる、感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を提供する。さらに別の態様で、本発明は、第１生物種がＢＰＶ１であり、第２生物種がＨＰＶ１６である本明細書に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を提供する。異なる態様では、本発明は、パピローマウイルスＥ２ＤＮＡ結合タンパク質並びにＬ１およびＬ２構造タンパク質を発現する細胞系を提供し、Ｅ２結合部位並びに遺伝子および遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットを含むパピローマウイルスベクターＤＮＡであって、パピローマウイルスＥ２結合部位はＥ２ＤＮＡ結合タンパク質のコグネイト結合部位であり、遺伝子は第１生物種に由来し、Ｌ１構造タンパク質は第２生物種に由来し、第１生物種は第２生物種とは異なる、パピローマウイルスベクターＤＮＡで細胞系を形質転換し、Ｌ１およびＬ２構造タンパク質を含むキャプシドによるベクターＤＮＡの包膜(encapsidation )のための条件を提供して粒子を生成し、そして粒子を回収することを含む感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子の製造方法に関する。上記の方法において、細胞系は哺乳類細胞系、昆虫細胞系又は酵母細胞系であってもよい。別の異なる態様では、本発明は本明細書に記載の感染性パピローマウィルス偽ウィルス粒子を含む細胞株に関する。さらに異なる態様では、本発明は、本明細書に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を提供し、培養哺乳類細胞に粒子を感染させて培養哺乳類細胞を遺伝子で形質転換することを含む、培養哺乳類細胞中への遺伝子の導入方法に関する。別の態様では、本発明は、被験粒子をそれに感染可能な培養哺乳類細胞に投与し、その感染性を評価することを含む感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子のスクリーニング方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は本明細書に記載した感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を含む組成物であって、発現カセット中の遺伝子が、治療を必要とする宿主対象に治療的有効量で投与された場合に治療効果を有し得る物質をコードする組成物を提供する。別の態様では、本発明は本明細書に記載した感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を含む組成物であって、発現カセット中の遺伝子が、免疫原を必要とする宿主対象に免疫原的有効量で投与された場合に免疫原効果を有し得る物質をコードする組成物を提供する。本発明はさらに、本明細書に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子をin vivoでヒトの細胞に感染させることを含み、発現カセット中の遺伝子が免疫原性タンパク質をコードし、細胞が免疫原的有効量の免疫原性タンパク質を発現する、ヒトに免疫原性タンパク質を提供する方法に関する。本発明はさらに、本明細書に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子をin vivoでヒトの細胞に感染させることを含み、発現カセット中の遺伝子が治療性タンパク質をコードし、細胞が治療的有効量の治療性タンパク質を発現する、ヒトに治療性タンパク質を提供する方法に関する。この方法においては、細胞は上皮細胞であってもよく、治療性タンパク質は全身効果を有するものでもよい。または、治療性タンパク質は上皮細胞に局所的効果を有するものでもよい。または、治療性タンパク質は第ＩＸ因子でもよく、この治療性タンパク質の発現は血友病の治療をもたらし得る。または、治療性タンパク質は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼでもよく、この治療性タンパク質の発現は皮膚癌の治療をもたらし得る。この方法は、異なる血清型の連続投与を含んでもよく、したがってヒトの細胞にin vivoで第２感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を感染させることを含み、第２感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子は、第１とは異なる血清型である点で第１感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子とは異なるものであってもよい。本発明はさらに、Ｅ２結合部位並びに遺伝子および遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットを含むパピローマウイルスゲノムと、Ｌ１およびＬ２構造タンパク質を含んでゲノムを包膜するパピローマウイルスキャプシドとを含み、Ｅ２結合部位は第１パピローマウイルス血清型由来であり、Ｌ１構造タンパク質は第２パピローマウイルス血清型由来であり、第１パピローマウイルス血清型は第２パピローマウイルス血清型と異なる、感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子に関する。本発明はさらに、非哺乳類細胞における感染性ウイルス偽ウイルスビリオンの製造方法であって、ウイルスの空キャプシド中にウイルスのウイルスゲノムをパッケージングするためのウイルスの非構造タンパク質を発現し、かつウイルスキャプシドの構造タンパク質を発現する非哺乳類細胞系を提供し、パッケージングシグナルを含み、かつ遺伝子および遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットをさらに含むウイルスゲノムであって、遺伝子は第１生物種由来であり、ウイルスキャプシドは第２生物種由来であり、また第１生物種は第２生物種と異なっている、ゲノムで細胞系を形質転換し、ウイルスキャプシドによるウイルスゲノムの包膜のための条件を提供してビリオンを生成し、ビリオンを回収することを含む方法に関する。図面の簡単な説明図１は、パピローマウイルスビリオンのＬ２媒介集合(assembly)に関するモデルを示す。このモデルは、本文中で詳細に説明されている。手短に言えば、Ｌ２はＰＯＤ内のビリオン成分の濃縮を引き起こすことによりパピローマウイルス集合を媒介するよう作用することが提唱されている。Ｌ２は、他のウイルスタンパク質とは独立に、ＰＯＤ中に局在する。Ｌ２の局在は、結合ゲノムを伴うＥ２とＬ１のその後の集合を引き起こす。これらの事象は、互いに独立である。ＰＯＤ内のこのＬ２−Ｌ１−Ｅ２−ゲノムの会合は、ビリオン集合のための適切な環境および／または濃度を付与する。好ましい実施態様の詳細な説明本発明は、感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を提供することにより、真核細胞中にクローン化ＤＮＡを入れるという難題に応じる新規の送達系の要求を満たす。第Ｉ節は、哺乳類細胞中での感染性ＢＰＶビリオンおよび感染性ＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝偽ウィルス粒子のin vitro生成を説明する。第ＩＩ節は、包膜のためのパピローマウイルスキャプシドタンパク質、ウィルス転写／複製タンパク質、Ｅ２およびＰＯＤ核構造の要件を考察する。第ＩＩＩ節は、非哺乳類細胞中での感染性ＢＰＶビリオンのin vitro生成を詳述する。第ＩＶ節は、特別な場合の遺伝子導入、特別な場合の遺伝子療法および遺伝子免疫化における感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子の使用を説明する。Ｉ．ヒトパピローマウイルス１６型ビリオン擬似型のin vitro生成実施例１に記載したプロトコルを用いて、パピローマウイルスの集合および感染性の分析を促進する、感染性パピローマウイルスをin vitroで生成するための系を開発した。自律的複製ウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ１）ゲノムを保有する培養ハムスターＢＰＨＥ−１細胞に、ＢＰＶ１の構造タンパク質を発現する欠損セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）を感染させた。Ｃ１２７細胞上でプレートすると、Ｌ１およびＬ２を一緒に発現する細胞の抽出物は、ＢＰＶ中和抗体により特異的に阻止され得る多数の形質転換フォーカスを誘発したが、これはＢＰＶ感染がフォーカス形質転換に関与したことを示す。Ｌ１又はＬ２を別々に発現するＢＰＨＥ−１細胞の抽出物は、感染性ではなかった。ＳＦＶ発現Ｌ１はウイルス様粒子中に自己集合したが、ウイルスＤＮＡは、Ｌ２がＬ１と同時発現された場合のみ、粒子中に検出された。このことはゲノム包膜はＬ２を要することを示す。ＢＰＨＥ−１細胞中でヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）のＬ１およびＬ２が一緒に発現されても、感染性ウイルスが生じた。これらの擬似型化ビリオンは、欧州（１１４／Ｋ）又はアフリカ（Ｚ−１１９４）のＨＰＶ１６変異体由来のＨＰＶ１６ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に対する抗血清により中和されたが、ＢＰＶＶＬＰに対する抗血清、不十分集合突然変異体ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質に対する抗血清、又は生殖器ＨＰＶ型に密接に関連するＶＬＰに対する抗血清によっては中和されなかった。哺乳類細胞中で組換え体ＳＦＶから発現されるＢＰＶＬ１はＬ２と結合し、ＶＬＰ中に集合する。ＳＦＶは、単純なプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ｐＳＦＶ−１発現ベクターは、ＳＦＶＲＮＡレプリカーゼの遺伝子、挿入遺伝子およびｃｉｓ作用ビリオンパッケージングシグナルを含む。このベクターからのin v itro合成ＲＮＡは、ＳＦＶ構造遺伝子をコードするヘルパーベクター（pHelper- 2）ＲＮＡと同時トランスフェクトされる。トランスフェクション時に、レプリカーゼは翻訳され、連続回のＲＮＡ複製および翻訳を開始し、それによりウイルスＲＮＡを増幅する。ヘルパーＲＮＡの翻訳は、ＳＦＶビリオンタンパク質の産生および発現ベクターＲＮＡの包膜を引き起こすが、しかしパッケージングシグナルを欠いたヘルパーの翻訳では、これらは生じない。したがって、生成される高力価ウイルスは、それがＳＦＶビリオンタンパク質をコードしないために、欠損がある。感受性細胞（例えば、ＢＨＫ−２１又はＢＰＨＥ−１）の感染時に、レプリカーゼは再び感染ＲＮＡを増幅する。クローン化遺伝子をコードするサブゲノムＲＮＡの増幅は、コードされたタンパク質の高レベル発現を引き起こす。欠損ＢＰＶ１Ｌ１およびＢＰＶ１Ｌ２組換えセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ−ＢＬ１およびＳＦＶ−ＢＬ２）は、in vitro転写Helper-2ＲＮＡ（Life Tec hnologies）（Berglund，P.，et al.，1993，Bio Technology 11，916-920）およびＢＰＶ１Ｌ１又はＢＰＶ１Ｌ２遺伝子をコードする組み換えｐＳＦＶ−１ＲＮＡをＢＨＫ−２１細胞に同時トランスフェクトすることにより生成された。ＢＨＫ−２１細胞に組換え体ＳＦＶを感染させて、７２時間後に回収した。ＢＰＶ１Ｌ１およびＬ２の発現は、Ｌ１に関してはモノクローナル抗体１Ｈ８（Che micon）（Cowsert，L.M.，et al.，1988，Virology 165，613-15）およびＬ２に関しては細菌的産生グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＢＰＶ１Ｌ２融合タンパク質に対するウサギ抗血清（Kirnbauer，R.，et al.，1992，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 89，12180-84）を用いたウエスタンブロット分析により確かめられた。細胞分画試験は、少なくともＬ１およびＬ２の８０％が回収時点で核分画中に残留したことを示した。ＢＨＫ−２１細胞に、３日間、ＳＦＶ−ＢＬ１を単独で又はＳＦＶ−ＢＬ２を単独で感染させるか、あるいは２つの欠損ウイルスを同時感染させた。細胞を回収し、４０％（ｗ／ｖ）スクロースクッションによる遠心分離および塩化セシウム等密度勾配遠心分離（Kirnbauer，R.，et al.，1993，J．Virol．67，6929-36 ）により、ＶＬＰを調製した。約１．２８ｇ／ｃｍ³の密度を有する可視バンドを、ＳＦＶ−ＢＬ１単独およびＳＦＶ−ＢＬ１＋ＳＦＶ−ＢＬ２感染細胞抽出物の塩化セシウム密度勾配から抽出し、０．５ＭＮａＣｌを含有するＰＢＳ中で透析した。対応するバンドは、ＳＦＶ−ＢＬ２のみに感染させた細胞からの抽出物を含有する勾配中には検出されなかった。ＢＰＶ１Ｌ１単独およびＬ１＋Ｌ２試料の透過型電子顕微鏡検査では、Ｌ２単独試料では認められなかったＢＰＶビリオンに似た形態を有する直径５５ｎｍの多数の粒子が示された。１０％クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのＬ１およびＬ１＋Ｌ２試料の分析では、Ｌ１に対応する単一５５ｋＤａタンパク質バンドが明示された。Ｌ１＋Ｌ２試料において、細菌的発現グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＢＰＶ１Ｌ２融合タンパク質に対するウサギ抗血清を用いたウエスタンブロット分析により、全長（〜７０ｋＤａ）Ｌ２が検出されたが、Ｌ１単独の試料では検出されなかった。Ｌ１およびＬ２の同時免疫沈降および同時精製は、Ｌ２がＶＬＰにＬ１と同時集合することを示した。感染性ＢＰＶ１ビリオンはＢＰＨＥ−１細胞中でのＢＰＶ１Ｌ１およびＬ２の同時発現により生成される。組換えＳＦＶの発現は哺乳類細胞中でのＶＬＰの有効な集合、in vitroでの感染性ＢＰＶの生成を引き起こすため、ビリオン形成に必要なキャプシドタンパク質の決定が試みられた。このため、細胞当たり５０〜２００コピーのエピソームＢＰＶ１ゲノムを保持するハムスター細胞系ＢＰＨＥ−１に感染させるために、ＳＦＶ組換え体を用いた（Zhang，Y.L.，et al.，1 987，J．Virol．61，2924-2928）。ＢＰＨＥ−１細胞にＳＦＶ−ＢＬ１単独又はＳＦＶ−ＢＬ２単独を感染させるか、あるいは２つの組換えウイルスを同時感染させた。細胞を３０時間保持し、回収して、超音波処理により溶解し、抽出物を３７℃で１時間、単層のマウスＣ１２７線維芽細胞の培地中でインキュベートした。細胞を洗浄し、完全培地中に３週間保持して、染色し、フォーカスを計数した（Dvoretzky，I.，et al.，1980，Virology 103，369-375）。複数の実験において、約５０個のフォーカスが、ＢＰＶＬ１およびＬ２の両方を発現するＢＰＨＥ−１抽出物で処理したＣ１２７細胞のプレート中に生じたが、ＢＰＶＬ１のみ又はＢＰＶＬ２のみを発現する抽出物によっては、フォーカスは生じなかった。フォーカス形質転換がＢＰＶ１ＤＮＡのマウスＣ１２７細胞への導入によるものか否かを確定するために、６つのフォーカスを環状クローン化し、さらに分析するためにエキスパンドした（Law，M.F.，et al.，1981，Proc．Nat．Acad． Sci．USA 78，2727-2731）。６つのクローンの各々からのHirt抽出物（Hirt，B. ，1967，J．Mol．Biol．26，365-369）を０．８％アガロースゲル上で分離し、サザーンブロッティングして、ＢＰＶゲノムの［³²Ｐ］−標識断片でプローブした。エピソームＢＰＶゲノムＤＮＡの多数のコピーが、６つすべてのクローンの抽出物中に検出された。ＢＰＶＤＮＡは、in vitro生成ビリオンによる感染ではなくトランスフェクションによりＣ１２７細胞に導入されたという可能性がある。そこで、中和抗体はトランスフェクションを阻止しないはずであるから、Ｌ１およびＬ２同時発現ＢＰＨＥ−１細胞の抽出物を、Ｃ１２７細胞への添加前に、ＢＰＶ１又はＨＰＶ１６Ｌ１ＶＬＰ（昆虫細胞から精製）あるいは変性ＢＰＶビリオン（ＤＡＫＯ）に対するウサギ抗血清の１：１００希釈液（１０μｌ）の存在下で、４℃で１時間インキュベートした。ＢＰＶＶＬＰに対する抗血清で処理したＬ１＋Ｌ２抽出物はいかなるフォーカスも生じなかったが、一方ＨＰＶ１６ＶＬＰ又は変性ＢＰＶビリオン（ＢＰＶを中和しない）に対する抗血清で処理した抽出物は未処理抽出物と同様の数のフォーカスを生じた。同一抽出物を、ＢＰＶを中和するモノクローナル抗体５Ｂ６（Roden，R.B.S.，et al.，1994，J．Virol．68，7570- 74）で処理した場合もフォーカス形成は阻止されたが、同一ＩｇＧサブタイプの対照モノクローナル抗体（ＰＡｂ１０１）の場合は阻止されなかった。フォーカス形成活性の立体配座依存性およびタイプ特異性中和は、ＢＰＶビリオンによる感染はＣ１２７細胞の形質転換に関与したが、ＢＰＶＤＮＡのトランスフェクションは関与しなかったことを示す。Ｌ２はＢＰＶゲノムの有効な包膜に必要とされる。Ｌ１は真核細胞中で発現された場合、ＶＬＰに集合するが、感染性ウイルス生成におけるＬ２の機能はそれほど明らかでない（Kirnbauer，R.，et al.，1992，Proc．Natl.Acad．Sci．USA 89，12180-84）。Ｌ２は、感染過程のある段階に必要であり、および／又はゲノムの包膜に必要である可能性がある（Zhou，J.，et al.,1993，J．Gen．Virol ．74，763-68）。後者の可能性をさらに調べるために、ＢＰＨＥ−１細胞の５００ｃｍ²プレート１０個にＳＦＶ−Ｌ１を単独で又はＳＦＶ−Ｌ２を単独で感染させるか、あるいはＳＦＶ−Ｌ１およびＳＦＶ−Ｌ２を同時感染させた。感染後３０時間目に細胞を回収し、超音波処理し、ＤＮＡｓｅｌ（２０００Ｕ）で３７ ℃で１時間処理し、粒子を精製した。塩化セシウム勾配を分画し、各画分の密度を測定した。核酸を各分画の２００μｌから精製し、ＢＰＶＤＮＡをサザーンブロット分析により検出した。ＢＰＶ−ｐＭＬプラスミドＤＮＡの０．１ｎｇを未切断、ＤＮＡｓｅｌ−耐性ＢＰＶゲノムに関するサイズ標準として試験した（ Sarver，N.，et al.，1982，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79，7147-7151）。Ｌ１およびＬ２の両方を発現するＢＰＨＥ−１抽出物からの画分のみが、ＤＮＡｓｅｌ耐性ＢＰＶＤＮＡの有意の蓄積を示した。この画分は、同一条件下で疣から得られた感染性ＢＰＶビリオンの密度（１．３２ｇ／ｍｌ）と一致する密度（１．３１ｇ／ｍｌ）を有した。この画分を、低温電子顕微鏡法で検査した。ネガティブ染色粒子の透過型電子顕微鏡法の場合とは異なり、低温電子顕微鏡法は、空粒子の低電子密度コアに対照するものとして、中実キャプシド内部のＤＮＡを高電子密度コアとして直接可視化する。高電子密度コアを有する多数の十分形成された粒子、および、低密度コアを有する、又は損傷された、又は棒状形の小分画が観察された。Ｌ１はウエスタンブロット分析で測定して多数の画分全体に分布したので、中実粒子対空粒子の数又はパーセンテージを推算することはできなかった。しかしながら、標準としてクローン化ＢＰＶゲノムを用いる比較サザーンブロット分析は、約１ｎｇの全長ＤＮＡｓｅｌ耐性ＤＮＡがこれらの抽出物中に観察され、これは約１０⁸ ＤＮＡ分子に対応することを示した。これに対比して、この試料からは１０⁴感染単位のみが単離され、このことは粒子対感染力比が高く、約１０⁴であることを示す。同一手順を用いて、ウシパピローマから精製されたＢＰＶビリオン試料中に存在する感染単位の数およびＤＮＡｓｅｌ耐性ＢＰＶゲノムＤＮＡの量を測定した。得られた粒子対感染力（Ｃ１２７細胞のin vitro転換によって測定）比の値は、疣から単離された（２ｘ１０⁴）又はＢＰＨＥ−１細胞中に生成された（１ｘ１０⁴）ＢＰＶビリオンの値に非常に似ていた。感染性ＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝偽型化(pseudotyped)ビリオンの生成および中和。ＢＰＶ１Ｌ１およびＬ２の同時発現はＢＰＶゲノムの包膜を結果的に生じ得ることが示されたが、ゲノム包膜が型特異性であるか否かという疑問があった。そこで、ＨＰＶ１６由来のＬ１およびＬ２を、ＢＰＶゲノムを包膜し、それにより感染性偽型化ビリオンを生成する能力に関して試験した。野生型ＨＰＶ１６単離体（１１４Ｋ）由来のＬ１およびＬ２をＳＦＶベクター中にクローン化し、ＢＰＨＥ−１細胞中で発現させた（Heino，P.，et al.，1996，Virology 214，3 49-359;Kirnbauer，R.，et al.，1993，J．Virol．67，6929-36）。発現は、Ｌ１に関してはモノクローナル抗体ＣａｍＶｉｒ−１（Pharmingen）、Ｌ２に関しては細菌的発現性グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＨＰＶ１６Ｌ２融合タンパク質に対するウサギ抗血清を用いたウエスタンブロット分析により確認された。感染性ビリオンの産生は、前述のように、Ｃ１２７フォーカス形成アッセイを用いて評価された。ＢＰＨＥ−１細胞中でのＨＰＶ１６由来のＬ１およびＬ２の発現は、ＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝ウイルスと呼ばれる感染性ビリオンを一貫して産生したが、しかしＢＰＶＬ１およびＬ２の約５〜１０分の一以下の効率であった。ＢＰＶＬ１およびＨＰＶ１６Ｌ２、又は、ＨＰＶ１６Ｌ１およびＢＰＶＬ２が同時発現された場合にはフォーカスは観察されなかったが、しかし異種ペアのキャプシドタンパク質による低効率包膜は減少しなかった。ＨＰＶ１６のキャプシド集合欠損突然変異体由来のＬ１およびＬ２のＢＰＨＥ−１細胞中での発現は、いかなるフォーカスも生じなかった（Kirnbauer，R.，et al.，1993，J． Virol．67，6929-36;Seedorf，K.，et al.，1985，Virology 145，181-185）。偽型化ビリオンの型特異的中和。１１４ＫＨＰＶ１６ＶＬＰに対するウサギ抗血清の５又は５０μｌでＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝抽出物を処理するとフォーカス形成が阻止されたが、一方ＢＰＶ１ＶＬＰ、変性ＢＰＶビリオン又は原型株の集合欠損ＨＰＶ１６Ｌ１に対する抗血清を添加しても、フォーカス形成は阻止されなかった。ＨＰＶ１６Ｌ１単独に対する抗血清およびＬ１／Ｌ２ＶＬＰに対する抗血清はともに、中和性であった。ＨＰＶ１６の分岐性(divergent)Zai rian単離体のＬ１ＶＬＰに対して生成された抗血清もＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝ビリオンを中和した（Cheng，G.，et al.，1995，J．Infect．Dis．172，1584-1 587）。この知見は、ＢＰＶキャプシドではなくＨＰＶ１６キャプシドを有する感染性ウイルスが産生されたということ、そしてＣ１２７細胞の感染が生じたが、ＢＰＶＤＮＡによるトランスフェクションは起きていなかったことを示す。低危険性ＨＰＶ６ｂ又は１１および高危険性(high risk)ＨＰＶ１８、３１、３３又は４５由来のＶＬＰに対して生じた抗血清の、ＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝ビリオンによる感染を防止する能力も試験した。これらの血清はすべて、ＥＬＩＳＡおよび血球凝集抑制アッセイにおいてその対応するＶＬＰを認識する高力価の抗体（≧１０⁴。Roden，R.B.S.，et al.,1996，J．Virol．70，3298-3301に記載）を含有する。しかしながら、どの血清も、偽ビリオン抽出物に５０μｌ（又は５μ ｌ）を添加した場合、ＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝ビリオンの感染を防止できなかった。考察。多少の進歩はあるものの、感染性パピローマウイルスビリオンをin vit roで生成し、そしてそれらを遺伝子的に操作する難しさにより、依然としてこの腫瘍ウイルスの研究が制限されている（Hagensee，M.，and Galloway，D.，1993 ,Papillomavirus Report 4，121-124）。マウス異種移植系の使用により、ＨＰＶ１１の限定的な産生およびin vivo感染性アッセイが成し遂げられた（Christe nsen，N．D.，and Kreider，J.W.,1990，J．Virol．64，3151-3156;Kreider，J. W.，et al.,1987，J．Virol．61，590-93）。代替的アプローチとして、ヒトケラチノサイトの筏培養(raft culture)は、相対的に正常な最終的分化(terminal differentiation)を経て、それにより後期タンパク質の発現およびビリオン生合成を可能にし得る（Dollard，S.C.，et al.，1992，Genes Dev．6，1131-42;Me yers，C.，et al.，1992，Science 257，971-73）。少量の形態学的に適正なＨＰＶ３１ｂビリオンがこの方法により生成されたが、しかしこの系を用いた定量的感染アッセイは開発されていない（Meyers，C.，et al.，1992，Science 257 ，971-73）。さらに、異種移植と筏培養のどちらも遺伝子操作を容易に行うことはできない。ＢＰＶ１Ｌ１およびＬ２のためのベクターとして組み換えワクシニアウイルスを用いて、Zhouらは、Ｌ１およびＬ２がともに、ウイルスＤＮＡを包膜し、感染性ＢＰＶビリオンを生成するために必要である、とかねて結論づけている（Zh ou，J.，et al.,1993，J．Gen．Virol．763-68）。彼等のＢＰＶ試料は、Ｃ１２７を含む多数の種類の細胞に対して細胞毒性である感染性ワクシニアウイルスを含有していたため、彼等は感染性のマーカーとしてウイルスＲＮＡの一過性発現を用いた。その研究で報告された結果と本明細書で得られた結果の間の顕著な差異の一つは、彼等の感染性マーカーが変性ＢＰＶ１ビリオン（ＤＡＫＯ）に対する抗血清により中和されたことであった。これに対比して、本発明のＳＦＶ由来又は畜牛パピローマ由来のビリオンがフォーカス形質転換を誘発し、それが試験したこの血清の数ロットのいずれによっても抑制されず、これは変性ビリオンに対するＤＡＫＯ血清又はその他の血清が非中和性であるという従来の報告と一致した。したがって、Zhou等の研究の結果は、曖昧である。本明細書中に記載したように、感染性パピローマウイルスは、無傷ウイルスゲノムを含有する細胞中で、欠損ＳＦＶベクターを介して、ビリオンキャプシドタンパク質をin transで発現させることにより産生されている。感染性ＢＰＶの産生は、標準的、定量的in vitroＢＰＶ感染性アッセイによりモニタリングされた（Dvoretzky，I.，et al.,1980，Virology 103，369-375）。Ｃ１２７細胞のＢＰＶ誘発性フォーカス形質転換は、感染性試料を中和性ＢＰＶ−抗血清とともにインキュベートすることにより特異的に抑制されたが、これは形質転換がＢＰＶ感染に起因するもので、ウイルスＤＮＡのトランスフェクションに依るのではないことを確証した。ウイルス産生のこの方法は、ビリオン形成におけるビリオンタンパク質の機能を決定し、特異的修飾を有するビリオンを生成する機会を提供する。Ｌ１単独又はＬ２単独ではなく、Ｌ１＋Ｌ２を発現する抽出物中のＤＮＡｓｅ１耐性全長ＢＰＶＤＮＡの存在は、Ｌ２がＢＰＶゲノムの包膜に必要であることを示す。ＨＰＶ１６由来のＬ１およびＬ２の、ＢＰＶゲノムを包膜する能力は、パピローマウイルスゲノムに関して存在する何らかのウイルスＤＮＡパッケージングシグナルがＢＰＶ１およびＨＰＶ１６の間で保存され、そして、ＢＰＶ１およびＨＰＶ１６が非常に高度に進化的に分岐していることから、このようなシグナルはパピローマウイルス間でさらに保存されている、ということを示す。ＢＰＶＬ１およびＨＰＶ１６Ｌ２、又は、ＨＰＶ１６Ｌ１およびＢＰＶＬ２を用いて感染性ウイルスは生成できないということは、広範に分岐したパピローマウイルス由来のＬ２が感染性ウイルスの生成を阻止したことを意味するが、しかしこの結果が密接に関連するパピローマウイルスに関して生じるとは予測されないであろう。ＢＰＶゲノムを含有する細胞中でのＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２の発現は、ＨＰＶ１６キャプシドを有する感染性偽型ビリオンを生じた。それらは典型的ＢＰＶ型フォーカスを誘発し、その感染性はＨＰＶ１６抗血清により中和され、ＢＰＶ抗血清によっては中和されなかった。ＨＰＶ１６は他の高危険性ＨＰＶ型より密接にＢＰＶ１に関連するものではないため、ＨＰＶ１６に関して本明細書中で報告されたものと同様の方法を用いて他の高危険性ＨＰＶに対する、そしておそらくはあらゆるパピローマウイルスに対する感染性偽型を生成し得る、と予期される（実施例４参照）。フォーカス形質転換アッセイは２〜３週間を要するがしかし、この問題は、原則として、ＢＰＶゲノムに迅速かつ容易に検出可能なマーカーを組み入れることにより回避すべきである。多数の実験室からの結果は、それらの宿主範囲が厳密に限定されているにもかかわらず、パピローマウイルスは多様な種に由来する種々の種類の細胞と結合することを示している（Muller，M.，et al.，1995，J．Virol．69，948-54;Roden ，R.B.S.，et al.，1994，J．Virol．68，7260-66;Volpers，C.，et al.，1995 ，J．Virol．69，3258-3264.）。Ｃ１２７細胞のフォーカス形質転換を誘発するＨＶＰ１６｛ＢＰＶ１｝ビリオンの能力は、Ｃ１２７細胞がＨＰＶ１６ビリオンに対する細胞表面受容体を発現し、そしてウイルス感染を開始するのに必要なインターナリゼーションおよびアンコーティングのその後の工程を実行する能力があることを示す。これらの観察の最も簡単な解釈は、ＢＰＶおよびＨＰＶ１６が共通の感染の細胞内経路および共通の細胞表面受容体を共有するというものである。ＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝偽型化ウイルスのin vitro生成は、感染性ＨＰＶ１６又はその他の高危険性ＨＰＶの供給源もＨＰＶ１６又はその他の高危険性ＨＰＶのゲノムに関する容易に値を得られる定量的アッセイもないため、ＨＰＶ１６及びその他の高危険性ＨＰＶに関する抗体中和アッセイの開発をはじめて可能にしたものである。ワクチン接種により生じる中和抗体の力価は、動物パピローマウイルス防御試験（Breitburd，F.,et al.，1995，J．Virol．69，3959-63，Suzic h，J.A.，et al.，1995，Proc．Natl.Acad．Sci．USA 92，11553-11557）に関しても真実であると思われるように、大半の過去に開発された予防ワクチンに対する防御に最も良く相関する（Robbins，J.B.，et al.，1995，J．Infect．Dis．1 71，1387-98）。したがって、ＨＰＶ１６ＶＬＰが高力価の中和抗体を生じるか否かを調べること、そして種々の生殖器ＨＰＶ型間の交差防御の程度を測定することが重要である。今日まで、中和に関する代用アッセイ、例えばＥＬＩＳＡおよび血球凝集抑制に頼る必要があった（Roden，R.B.S.，et al.，1995，J．Viro l．69，5147-51， Roden，R.B.S.，et al.，1996，J．Virol．70，3298-3301，Rose，R.C.，et al. ，1994，J．Gen．Virol.75，2445-49）。中和と比較した場合、非中和抗体を認識し得るためにＶＬＰＥＬＩＳＡは相対的に非厳密性(non-stringent)であり、一方血球凝集は、中和抗体の一種（ＢＰＶ、ＣＲＰＶおよびＨＰＶ１１に関して規定）がそのアッセイで測定されないため、過度に厳密性である（Roden，R.B.S .，et al.，1996，J．Virol．70，3298-3301）。記載した定量的in vitro中和アッセイにより、中和に関するこれらの代用アッセイによる必要はもはやない（実施例５参照）。基準ＨＰＶ１６株の集合欠損突然変異体Ｌ１は検出可能な中和抗体を生じなかったが、これは、大半の中和エピトープが無傷粒子でのみ提示されるという概念を補強するものである。７個のＬ１アミノ酸で１１４／ＫＨＰＶ１６単離体と異なる分岐集合コンピテント変異体（Zaire 1194（Cheng，G.，et al.，1995，J． of Infect．Dis．172，1584-1587））に対する抗体は、１１４／Ｋ単離体から作られたＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝ビリオンを有効に中和し得る、という観察は、単一ＨＰＶ１６変異体のＶＬＰが分岐ＨＰＶ１６変異体に対する防御を誘導することを示唆する（Cheng，G.，et al.，1995，J．of Infect．Dis．172，1584-1587 ）。しかしながら、偽型化ビリオンは、６つの生殖器ＨＰＶ型又はＢＰＶ１由来のＶＬＰに対する抗血清により中和されなかった。これは、試験した２つのＶＬＰ型、即ちＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３がＨＰＶ１６に最も密接に関連し、それぞれアミノ酸配列相同性が８４％および８１％である場合でさえ、当てはまった。これらの抗ＶＬＰ血清は、同種ＶＬＰ型に基づくＥＬＩＳＡおよび血球凝集アッセイで、少なくとも１０，０００の力価を有した（Roden，R.B.S.，et al.，1 996，J．Virol．70，3298-3301）。したがって、ＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝中和アッセイにおける負の結果は、これらのＶＬＰに対する不十分な抗体反応によるものではなかった。データは、ＨＰＶ１６が他の遺伝子型とは異なる単一血清型である、という考え方を支持する。集合化ＨＰＶ１６ＶＬＰにより誘導された抗体がＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝ビリオンによる感染を有効に阻止し得るという知見は、予防ワクチン候補としてこれらのＶＬＰを用いる可能性を支持する。生殖器ＨＰＶ感染を防止するための多価ＶＬＰベースのワクチンの成分に関する、情報に基づく決定を成すためには、ある型のＨＰＶＶＬＰに対して生成した抗体が他の型による感染を中和する程度を評価することが必要である。他の生殖器ＨＰＶ型由来のＶＬＰに対して生成したウサギ抗体がＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝感染を中和しなかったというデータは、これらの生殖器ＨＰＶに対してヒトで中和抗体により得られた防御が型特異性であることを示唆する。ＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝とともに、他のＨＰＶ型の偽型化ビリオンの開発は、動物試験における、そしてヒトのワクチン試験の初期における交差中和の問題をより広範に調べるために用い得る。ＩＩ．パピローマウイルス小キャプシドタンパク質Ｌ２はビリオン成分およびウイルス転写／複製タンパク質Ｅ２のＰＯＤ核構造への局在化を誘導する実施例２に記載のプロトコルを用いて、培養細胞中での構造および非構造性のウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）タンパク質の細胞下局在を、免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡法により調べた。別々に発現される場合、大キャプシドタンパク質であるＬ１は散在性核分布を示したが、一方小キャプシドタンパク質であるＬ２は、ＰＭＬ癌遺伝子ドメイン（ＰＯＤ）として同定される斑点状(punctate) 核領域に局在することが判明した。Ｌ１およびＬ２の同時発現は、ＰＯＤ中へのＬ１の移動を誘発し、Ｌ１およびＬ２の共局在化を生じた。ウイルスＤＮＡゲノム並びにゲノムおよびウイルスＤＮＡ合成の保持に必要な非構造性ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２の分布に及ぼすＬ２発現の影響を調べた。Ｅ１タンパク質の局在化は、Ｌ２発現の影響を受けなかった。しかしながら、抗Ｅ２染色のパターンは、Ｌ２発現細胞で劇的に変化した。Ｌ１と同様に、Ｅ２は散在性核付近からＰＯＤ中に移り、Ｌ２と共局在した。Ｌ２による全長Ｅ２の補充(recruitment)は、他のウイルス成分の非存在下で生じた。さらに、ＢＰＶで形質転換された線維芽細胞では、自律的複製ＢＰＶゲノムがＬ２依存的に隣接核領域中で合着されることが判明した。Ｌ２は、本発明で、感染性ＢＰＶの生成に不可欠であることが示された。最新の結果は、異なる核ドメインにそれらを補充することによるビリオン成分の組織化におけるＬ２の役割に関する証拠を提供する。このＬ２依存性共局在化は、おそらく、ビリオン成分の局所的濃度を増大することにより、又は有効なパッケージングおよび集合に必要な物理的構造を提供することにより、パピローマウイルスの集合を促すメカニズムとして役立つのであろう。データはさらに、ＰＯＤへのウイルスゲノムの局在化に際して、パピローマウイルスゲノム中の保存配列モチーフを結合する非構造性ウイルスタンパク質Ｅ２の役割を確立する。ＢＰＶキャプシドタンパク質の副核局在化。ＢＰＨＥ−１は、自律的複製ＢＰＶゲノムの多重コピーで潜伏感染されたハムスター線維芽細胞系であり、非構造性ウイルスタンパク質を発現する（Zhang，Y.L.，et al.，1987，J．Virol．61 ，2924-2928）。ＳＦＶ発現系を用いて、Ｌ２小キャプシドタンパク質をＢＰＨＥ−１細胞に導入し、免疫蛍光染色およびレーザー走査共焦点顕微鏡法によりＬ２タンパク質の局在を調べた。ＳＦＶ感染後６時間目のＬ２の典型的分布は、タンパク質が明確な核内斑点状パターンで現れたものである。この分布がＢＰＨＥ−１細胞中でのＢＰＶ成分に依存したという可能性を除外するために、パピローマウイルス配列を保有しない細胞中で、ＳＦＶベクターを介してＬ２を発現させた。同様の斑点状核パターンのＬ２染色は、これらの他の細胞型、例えばＣＯＳ−７、ＢＨＫ−２１およびヒト線維芽細胞系１６３４でも観察された。したがって、この明確なＬ２局在化は細胞性因子にのみ依存し、細胞系系統に無関係であると思われる。この局在化がパピローマウイルスＬ２の一般的特徴であるか否かを確定するために、ＳＦＶベクターを介して発現されたヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）Ｌ２タンパク質の分布をこれらの細胞系でさらに調べた。ＨＰＶ１６Ｌ２タンパク質によるパターンはＢＰＶＬ２で観察されたものと同様で、この局在化がパピローマウイルスＬ２の特徴であることが確立された。Ｌ２含有斑点状構造はＰＯＤである。ＢＰＶＬ２タンパク質が局在した核ドメインを同定するために、多数の前述の核タンパク質およびＬ２に対する二重染色実験を実施した。Ｌ２タンパク質の共局在化は、コイル化体(coiled body)、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３又はスプライシング因子ＳＣ３５に関しては、見出されなかった。抗ＳＣ３５抗体に関して観察された染色パターンは抗Ｌ２抗体に関して観察されたものに類似したが、これらの領域が排他的であることは併合画像から明らかであった。しかしながら、Ｌ２タンパク質の分布を抗前骨髄性白血病（ＰＭＬ）タンパク質染色と比較すると、タンパク質分布のほぼ完全な重複が観察された。ＰＭＬタンパク質は、ＰＯＤと呼ばれる副核細胞小器官中に局在する推定上の成長抑制遺伝子生成物である（Chang，K.S.，et al.，1995，Blood 85，3646-36 53;Dyck，J.A.，et al.，1994，Cell 76，333-43）。ＰＭＬ分布は、Ｌ２タンパク質の発現により影響を及ぼされないようであり、ＰＯＤ中のＬ２の局在化は細胞中のＬ２のレベルに無関係であった。これは、細胞が高レベル、中レベル、低レベルのいずれのＬ２を発現中であろうと、観察された。Ｌ２を発現する細胞はすべて、同様の斑点状分布を示したが、この場合、Ｌ２はすべての細胞においてＰＭＬと共局在した。したがって、この共局在化は過剰発現の人為的結果であるとは考えられない。Ｌ２はＬ１をＰＯＤに向け直す。Ｌ１およびＬ２がキャプシド中に同時集合するので、Ｌ１はＬ２と同様の核染色パターンを示し得るか否かという疑問があった。しかしながら、Ｌ１がＢＰＨＥ−１細胞中で発現された場合、Ｌ１タンパク質の分布はかなり異なった。Ｌ１は、核小体排除に伴って、散在性配置からわずかに点在する配置まで変化する核パターンで存在した。この結果が、Ｌ１タンパク質の非細胞性分布がＬ２の同時発現に影響され得るという可能性の探求へと導いた。したがって、ＢＰＨＥ−１細胞に組換えＬ１ＳＦＶおよび組み換えＬ２ＳＦＶを同時感染させた。これは、ＢＰＨＥ−１細胞中での感染性ＢＰＶ生成が誘導される条件である。Ｌ１染色パターンは、Ｌ１ＳＦＶ感染単独の後に認められた散在性核パターンから劇的に変化した。同時感染細胞中でのＬ２染色パターンは、Ｌ１の非存在下で観察されたＬ２の分布と一致した。Ｌ１およびＬ２の分布は、２つの画像を併合した場合、実質的に重複した。概して、Ｌ１はＬ２とぴったり合着したとは認められなかった。いくつかの細胞では、Ｌ１は、Ｌ２ドメインと重複するのではなく、多くは取り囲んでいるのが観察された。この変動は、個々の細胞の感染の動力学の差によるか、又はＬ１移動における中間段階を反映するのかもしれない。Ｌ２はＰＯＤに実質的割合のＬ１の向け直し(redirection)を誘導する、という結論が引き出される。Ｌ２はＥ２の共局在化を誘導する。次に、ウィルスゲノム複製およびウイルス転写に関与する非構造性ウイルスタンパク質Ｅ２の分布に及ぼすＢＰＶキャプシドタンパク質の発現の影響を試験した（Chiang，C.M.，et al.，1992，Proc．Na tl．Acad．Sci.USA，89，5799-5803;Spalholz，B.A.，et al.，1985，Cell 42， 183-191;Ustav，M.，and Stenlund，A.，1991，EMBO J．10，449-457）。ＢＰＨＥ−１細胞では、Ｅ２は拡散性分布を示す核タンパク質として検出された。Ｌ１キャプシドタンパク質がこれらの細胞中で発現された場合に、このタンパク質の局在化に及ぼす明らかな影響は認められなかった。これに対比して、Ｌ２発現は、抗Ｌ２染色パターンで観察されたのと同様にＥ２を斑点状領域に移した。それはＥ２の局在化の測定を妨げなかったが、しかしＥ２のレベルは、おそらくはＳＦＶによる宿主タンパク質合成の十分実証済みの阻害のために、組換えＳＦＶ感染中にしばしば実質的に低減した（Strauss，J.H.，and Strauss，E.G.，1994， Micro．Rcv．58，491-562）。この作用は、部分的には、ＳＦＶによるＮａ＋Ｋ＋輸送体妨害によるものである（Carrasco，L.，1977，FEBS Lett．76，11-15;G arry，R．F.，et al.，1979，Virology 96，108-120）。Ｅ２の低減は、無関係なＳＦＶ組換え体による対照感染においても観察された。１００ｍＭＫＣｌの存在下での感染は、この問題をなくすのに役立った。Ｌ２がＥ２タンパク質のＬ２染色ＰＯＤ中への再分布を誘導するか否かを確定するために、Ｌ２−ＳＦＶによる感染後にＢＰＨＥ−１細胞の二重染色を実施した。大多数の細胞は、拡散的分布核パターンのＥ２染色を示した。しかしながら、多数の細胞は、Ｅ２の斑点状パターンへの配置転換を示した。Ｌ２発現細胞はすべて、Ｌ２染色の斑点状パターンのみを示した。Ｅ２およびＬ２染色の同所共在は、検出可能レベルのＥ２を保持する感染細胞において顕著であった。Ｌ２は、全長Ｅ２を再分布させるのに十分である。自律性複製ゲノムを有するＢＰＶ形質転換細胞は、３つの形態のＥ２タンパク質を発現する。即ち、ゲノム複製および転写的トランス活性化で機能する全長４８ｋＤ形態と、ウイルス転写のレプレッサーとして作用する２つの小型形態である（Hubbert，N.L.，et al. ，1988，proc．Natl．Acad．Sci．USA 85，5864-5868;Lambert,P.F.，J．Virol ．63，3151-3154;McBride，A.A.，et al.，1991，J．Biol．Chem．266，18411-1 8414）。免疫蛍光試験に用いられた抗体は、３つのタンパク質すべてに共通のＣ末端ＤＮＡ結合ドメイン中のエピトープを認識し、それらを識別しない。ＢＰＨＥ−１細胞の別の特徴は、未知の割合のＥ２分子がウイルスゲノムと結合することである。したがって、ＢＰＨＥ−１におけるＥ２のＬ２依存性再分布が細胞中のウイルスゲノムの存在によるものか否かは明らかでなかった。ＢＰＨＥ−１細胞で観察されたＥ２のＬ２依存性再分布が、ウイルスゲノムとは無関係に、Ｌ２および全長Ｅ２タンパク質の間で起こり得るか否かを確定するために、ＢＨＫ−２１細胞（パピローマウイルスゲノムを含有しない）にＬ２− ＳＦＶ組換え体および全長Ｅ２を発現するＳＦＶ組換え体の両方を感染させた。Ｅ２のＲＮＡは細胞質中でＳＦＶＲＮＡ依存性ポリメラーゼにより完全に産生されたため、代替的Ｅ２ｍＲＮＡの産生は除外された。予測通り、ＳＦＶ−Ｅ２感染細胞抽出物のウエスタンブロットでは、４８ｋＤ形態のみが検出された。前記のように、ＢＨＫ−２１細胞中のＬ２分布は、ＢＰＨＥ−１細胞に関して観察されたものと同様であった。Ｌ２の非存在下で、Ｅ２がＢＨＫ−２１細胞中で発現されると、大多数のタンパク質は散在性核分布で存在した。細胞にＬ２およびＥ２を同時感染させると、Ｌ２パターンは変化しなかったが、Ｅ２は２つのタンパク質を同時発現した細胞中でＬ２の斑点状染色パターンを呈した。これらの結果は、ＰＯＤへの全長Ｅ２のＬ２依存性局在化が、Ｌ２以外のウイルスゲノムおよびウイルス遺伝子生成物とは無関係であることを示す。Ｌ２はＥ１の再分布を誘導しない。ウイルスＤＮＡ複製に関与し、したがっておそらくはＢＰＨＥ−１細胞中で発現されるＥ１の局在化を試験した。ＢＰＨＥ −１細胞における抗Ｅ１抗体による免疫染色は、弱かった。定常状態自律的複製ＢＰＶゲノムからの低レベルのＥ１発現のみが報告されているため、この結果は予測された（Sun，S.，et al.，1990，J．Virol．64，5093-5105）。点在性染色パターンの変化は、いずれかのキャプシドタンパク質のＳＦＶ媒介性発現後で観察されなかった。染色の強度は非常に低く、そしてＢＰＨＥ−１の親系統は対照として利用できなかったため、これらの細胞でのＥ１分析からは確実な結論は引き出せなかった。これらの問題を克服するために、ＢＨＫ−２１細胞にＥ１組換えＳＦＶを感染させると、点在性核パターンの明確な免疫染色が生じたが、未感染細胞は陰性であった。Ｌ２およびＥ１組換えＳＦＶによる同時感染は典型的斑点状Ｌ２染色パターンを生じたが、しかしこの発現は同時感染細胞におけるＥ１パターンを変えなかった。したがって、Ｌ２タンパク質は、Ｅ１の再分布を直接誘導しない。しかしながら、これらの結果は、Ｅ２およびウイルスゲノムによるその十分実証済みの相互作用により間接的に、Ｅ１がＰＯＤに局在し得るという可能性を排除しない（下記参照）（Mohr，I.J.，1990，Science 250，1694-99;Wi1son，V.G.， and Ludes-Meyer，J.，1991，J．Virol．65，5314-5322）。ウイルスゲノムの分布はＬ２発現により変えられる。各々のＢＰＨＥ−１核はＢＰＶゲノムの５０〜２００の自律的複製コピーを含有する、と概算されている（Zhang，Y.L.,et al.，1987，J．Virol．61，2924-2928）。ＢＰＶビリオンタンパク質の発現がＢＰＶゲノムの分布に影響し得るか否かを確定するために、Ｌ１又はＬ２組換えＳＦＶに感染させたＢＰＨＥ−１細胞についてＦＩＳＨ分析を実施した。フルオレセイン標識ＰＣＲプローブをゲノムの上流調節域に対して作成し、ＤＮＡ変性後にin situでハイブリダイズした。Ｌ１−ＳＦＶに未感染の又は感染させた細胞中でゲノム分布を調べた場合、かすかな散在性蛍光小斑点のみが検出された。しかしながら、Ｌ２タンパク質を発現したいくつかの細胞では、蛍光プローブはより離散した融合領域と結合した。蛍光シグナルはＤＮａｓｅによる細胞の前処理により除去されたが、ＲＮａｓｅ処理による影響は受けなかった。ゲノムの位置をＬ２−ＰＯＤ構造の位置と比較した場合、ＤＮＡはこれらのドメインに隣接して位置することが判明した。ＦＩＳＨ後に実施した抗Ｌ２染色により、ハイブリダイゼーションおよび洗浄手法で、従来観察されたよりも低強度のタンパク質検出が生じることが明示された。それにもかかわらず、Ｌ２の特徴的斑点状パターンは依然として認められた。未感染の細胞は、散在性の、かろうじて検出可能な蛍光を示した。しかしながら、高レベルのＬ２を発現した細胞では、蛍光プローブは、核内の約１０〜１２スポットで強力に結合した。併合画像では、ＢＰＶＤＮＡおよびＬ２タンパク質は隣接するドメインにあることは明白であった。このハイブリダイゼーションパターンは、Ｌ２を発現しない細胞では検出されなかった。しかしながら、この分布は、Ｌ２発現細胞の２０〜２５％のみに現れた。この変動は、感染細胞のコピー数の差、特定の感染の時期又は細胞周期変動によるものと思われるが、しかしビリオン成分およびウイルスタンパク質のＰＯＤへの局在化を誘導するＬ２についての結論の評価を減じるものではない。考察。本明細書に記載したように、小キャプシドタンパク質Ｌ２は、その他のウイルス成分の非存在下でＰＯＤに局在する固有の能力を有することが判明した。さらに、ＰＯＤにおけるＬ２の存在は、大キャプシドタンパク質Ｌ１、非構造タンパク質Ｅ２、およびウイルスゲノムの補充に関連する。したがって、ＰＯＤがパビローマウイルスが集合する主要構造であると推測することは興味深い。ＰＯＤは、ほとんどの細胞で０．３〜０．５ｍｍの平均直径を有するクロマチン間マトリックス結合核体である。ＰＯＤの細胞性機能は、ほとんど分かっていない（Ascoli，C.，and Maul，G.J.,1991，J．Cell．Biol．112，785-795;Grand e，M.A.，et al.，1996，J.Cell．Biochem．63，280-91）。それらはＫｒ体、又は、細胞当たりの平均数に基づいて核ドメイン１０（ＮＤ１０）とも呼ばれているが、しかしそれらの数は実際には変化し、形質転換細胞では多い（Ascoli ，C.，and Maul，G.J.,1991，J．Cell．Biol．112，785-795;Lamond，A.I.，and Carmo-Fonseca，M.,1993，Trends in Cell．Biol．3，198-204）。ＰＯＤは、それらの断片化が急性前骨髄性白血病でしばしば認められるので、骨髄細胞の正常成熟に必要であると思われる（Dyck，J.A.，et al.，1994，Cell 76，333-43 ）。この白血病におけるＰＯＤの破壊は、正常ＰＭＬタンパク質と特徴的ｔ（１５；１７）染色体トランスロケーションに起因するＰＭＬ−レチノイン酸受容体（ＰＭＬ−ＲＡＲａ）融合タンパク質との間のヘテロダイマー形成に関連する（ de The，H.，et al.，1990，Nature 347，558-561;de The，H.，et al.，1991， Nature 347，558-561;Kakizaka，A.，et al.，1991，Ccll 66，663-674）。ＰＭＬの他に、ＰＯＤは少なくとも６つのその他のタンパク質を含有する。これらの例としては、ＳＰ１００タンパク質（これは、元々、原発性朋汁性肝硬変患者における自己抗原として同定された）、Ｉｎｔ−６、ＰＩＣ−１タンパク質、並びに５２ｋＤ（ＮＰ５２）、５５ｋＤ（ＮＤＰ５５）および６５ｋＤタンパク質が挙げられる（Ascoli，C.，and Maul，G.J.,1991，J．Cell．Biol．112，785-795 ;Boddy，M.N.，et al.，1996，Oncogene 13，971-982;Desbois，C.，et al.，19 96，Science 273，9 51-53;Epstein，A.L.，1984，J.Virol．50，372-379;Szostecki，D.，et al.，1 990，J．Immunol.145，4338-4347）。いくつかの関連がＰＯＤとその他のＤＮＡウイルスの複製との間で報告されている。生産的ウイルス複製は、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）、アデノウイルス５（Ａｄ−５）およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に関してはＰＯＤと関連して開始すると思われる（Carvalho，T.，et al.,1995，J．Cell．Bi ol．131，45-56;Doucas，V.，et al.，1996，Genes Dev．10，196-207;Everett ，R.D.，and Maul，G.G.，1994，EMBO J．13，5062-69;Jiang，W.O.，et al.， 1996，Exp．Cell．Res．229，289-300;Maul，G.G.，et al.，1996，Virology 21 7，67-75;Puvion-Dutilleul，F.，1995，Exp．Cell．Res．218，9-16）。これら３つの遺伝的に無関係なウイルスに関するこの構造への顕著な収斂にもかかわらず、この局在化がウイルス−細胞相互関係で果たす役割は、依然として明らかでない。ウイルス複製において可能性のある多数の役割が、ウイルス成分とＰＯＤとの関連に対して示唆されてきた。ＰＯＤ会合は、初期ウイルス複製を限定するよう進化した細胞メカニズムであるかもしれない、ということが提示されている（Is hov，A.M.，and Maul，G.G.，1996，J．Cell．Biol．134:815-826）。Ａｄ−５Ｅ４−ＯＲＦ３およびＨＳＶ−１ＩＣＰＯが、感染が進行するときにＰＯＤを崩壊させるタンパク質をコードするという事実は、この可能性を支持する証拠と解釈されてきた（Doucas，V.，et al.，1996，Genes Dev．10，196-207;Everett ，R.D.,and Maul，G.G.，1994，EMBO J．13，5062-69;Maul，G.G.，et al.，199 6，Virology 217，67-75;Puvion-Dutilleul，F.，1995，Exp．Cell．Res．218， 9-16）。さらに、インターフェロンがＰＯＤタンパク質の発現をアップレギュレートするという観察は、ＰＯＤが抗ウイルス防御メカニズムとして作用することと一致する（Chelbi-Alix，M.K.，et al.，1995，Leukemia 9，2027-2033;Grotz inger，T.，et al.，1996，Mol.Cell．Biology 16，1150-56;Lavau，C.，et al. ，1995，Oncogene11，871-876）。あるいは、ＰＯＤ会合は、おそらくはウイルス複製において正の役割を果たし得る。この局在化は、１）ウイルス生成物の局所濃度を増大し、したがって集合を促進し、２）それらの初期複製の通常部位である上皮細胞における正常分化および／またはウイルスに対するアポトーシス反応を妨害し、３）細胞性転写および／または複製因子への接近を促し（しかし、ＰＯＤがこれらの機能を有するという証拠はほとんどない）、４）ウイルス生成物の必須プロセッシングを促進するかもしれない。後者に関しては、ユビキチン依存性プロテアーゼがＰＯＤ関連であることが近年示されたことは、興味深い（Boddy，M.N.，et al.，1996，Onc ogene 13，971-982）。in vitro系での潜伏性パピローマウイルス感染から生産的パピローマウイルス感染への転換がＰＯＤへの関連ウイルス生成物の再分布に関連するというここに報告された知見は、ＰＯＤがパピローマウイルスの複製において正の役割を果たすという見解に強力な支持を提供する。Ａｄ−５、ＨＳＶ、ＳＶ４０およびエプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ）の試験では、ＰＯＤと相互作用し、いくつかの場合には脱集合する初期遺伝子の生成物が同定されたが、一方、いずれの遺伝子がビリオン成分のＰＯＤ局在化に関与するかは確定されなかった（Doucas，V.，et al.，1996，Genes Dev．10，196 -207;Everett，R.D.,and Maul，G.G.，1994，EMBO J．13，5062-69;Jiang，W.O. ，et al.，1996，Exp．Cell．Res．229，289-300;Maul，G.G.，et al.，1996，V irology 217，67-75;Puvion-Dutilleul，F.，1995，Exp．Cell．Res．218，9-16 ）。この試験では、生産性感染中の種々のパピローマウイルス成分とＰＯＤとの会合は、Ｌ２小キャプシドタンパク質に依っている、ということが実証された。感染性ウイルスの生成に不可欠であるＬ２の非存在下では、その他のウイルス成分は、不明瞭な不均一分布を示す。結果は、Ｌ２がビリオン集合に必要なその他の成分の共局在化を誘導することによりビリオン産生を促すよう機能することを示す。ＰＯＤへの補充は、生産性パピローマウイルス感染と潜伏性パピローマウイルス感染とを区別する重要な特徴を示すと思われる。潜伏性からの脱出に関与したＰＯＤ結合タンパク質ＨＳＶ−１ＩＣＰＯおよびＥＢＶＥＢＮＡ−５は、それらのそれぞれのウイルスに対して類似の機能を供することができる。この試験の結果は、パピローマウイルス生活環の生産性期に関する以下のモデルを示唆する（図１）。Ｌ１およびＬ２発現が感染上皮細胞における分化特異的シグナルにより誘導されると、生産性周期が始まる（Dollard，S.C.，et al.，1 992，Genes Dev．6，1131-42;Meyers，C.，et al.，1992，Science 257，971-73 ）。これら２つの遺伝子のＳＦＶ媒介性発現は、本発明の系におけるこの誘導発現の代わりのものであり、分化それ自体はウイルス産生に必要でないことを示す。ウイルス集合は、Ｌ２のＰＯＤとの会合およびＬ１の共局在化が引き金となると思われる。安定なＬ１／Ｌ２複合体はin vivoでは完全集合化ＶＬＰに、in vitro ではＬ１五量体を含む部分的集合化ウイルスキャプシド構造になるので、Ｌ１のＰＯＤとの会合は、Ｌ１とＬ２との直接相互作用の結果であると考えられる。Ｌ１はＬ２の非存在下でＶＬＰに自己集合し得る（Kirnbauer，R.，et al.，1992 ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．89，12180-84;Kirnbaucr，R.，et al.，1993， J．Virol．67，6929-36）が、しかしＬ２は昆虫細胞で４倍、哺乳類細胞で１００倍、ＶＬＰ産生を増大する（Hangensee，M.E.，et al.，1993，J．Virol．67 ，315-22;Kirnbauer，R.，et al.，1993，J．Virol．67，6929-36;Zhou，J.，et al.，1993，J．Gen．Virol．74，763-68）。このより大きい効果は、ＰＯＤでのＬ１のＬ２介在性濃縮の結果としてのキャプシド集合速度の増大の結果である可能性がある。Ｌ２を含有するいくつかの細胞では、Ｌ１タンパク質は、それらに重複するのではなくＬ２ドメインの周囲を主に取り囲む、と考えられる。感染はすべて、２つのパターンの混合物を示すと思われるため、これらの変動は、個々の細胞のＳＦＶ感染における一時的な差を反映するものであろう。種々のＬ１集合状態は、ここで用いられる抗Ｌ１抗体により検出されたようである。in vitroでは、抗体は五量体のＬ１および無傷ビリオンを認識する。ＰＯＤ周囲で検出されるＬ１は集合の部位から放出された成熟ビリオンによるものであり、抗Ｌ２抗体との反応性の減少を示す、と考えられる。あるいは、周囲の抗Ｌ１染色は、Ｌ２との集合過程におけるＬ１五量体によるものであろう。Ｌ２はさらに、Ｅ２の再分布を誘導した。ＢＨＫ−２１細胞での実験は、ＰＯＤとのＥ２会合はＬ２依存性であるが、しかしＬ１、その他の初期パピローマウイルス遺伝子産物又はウイルスゲノムとは無関係である、ということを明瞭に示した。しかしながら、Ｅ２がＬ２と直接相互作用するという証拠はない。同時免疫沈降実験およびショ糖勾配における同時沈降を含めたかなりの努力にもかかわらず、可溶性Ｅ２−Ｌ２複合体は、in vivo又はin vitroで検出されなかった。目下、Ｌ２およびＥ２が比較的低親和性で結合するのか、Ｅ２がＬ２により変えられたＰＯＤの成分と結合するのか、あるいはＥ２、Ｌ２およびＰＯＤ成分が三分子複合体を形成するのかという可能性を区別することは実行不可能である。個々のキャプシドタンパク質又は集合化ＶＬＰは配列特異的にゲノムと結合しないので、パピローマウイルスが優先的に細胞性ＤＮＡ全体の中のそれらのゲノムを如何にパッケージするかは明らかでない（Mallon，R.G.,et al.，1987，J． Virol．61，1655-1660;Zhou，J.，et al.，1994，J．Virol．68，619-25）。ウイルスゲノムの分布に関する本知見は、この過程を理解するために重要な意味を有する。潜伏的感染細胞では、ウイルスＤＮＡは分散性分布を示す。これに対比して、本発明の分析は、感染性ビリオンを産生し得る培養中の少なくともいくつかの細胞でＰＯＤへウイルスＤＮＡが局在することを示したが、これは、ウイルスゲノムのビリオン中への優先的パッケージングが、少なくとも部分的には、この特定位置の局在化に起因することを示唆する。ウイルスゲノムのこの再局在化に関するメカニズムは実験的に調べられてはいないが、Ｅ２はウイルスゲノム上の多数の部位に強く結合するので、それは、ＰＯＤへのＥ２の移動によっていると推測し得る（Androphy，A.J.,et al.,1987， Nature 325，70-73;Li，R.，et al.,1989，Genes Dev．3，510-526）。畜牛疣から抽出した感染性ＢＰＶビリオン中でＥ２を検出できていないため、Ｅ２は、ビリオン集合の過程で触媒的に作用すると考えられる。そのウイルスの非構造性タンパク質であるＳＶ４０Ｔ抗原は、これに関してはＥ２に機能的に類似する。Ｔ抗原はＰＯＤと関連する、ウイルスゲノム結合性転写／複製因子であるが、しかしそれらの破壊を引き起こさない（Jiang，W.O.，et al.，1996，Exp．Cell．Re s．229，289-300）。ビリオン中へのそのパッケージングに必要とされるＳＶ４０ウイルスケノムに関するシグナルは、Ｔ抗原結合部位を含むウイルスＤＮＡ上のセグメントにマッピングされている（Oppenheim，A.，1992，J．Virol.66，53 20-5328）。ＩＩＩ．昆虫細胞中での感染性ＢＰＶビリオンのin vitro生成実施例３に記載されたプロトコルを用いて、全長環状ＢＰＶＤＮＡで細胞をトランスフェクトし、ＢＰＶタンパク質の種々の組合せを発現するバキュロウイルスをそれらに感染させることにより、感染性ＢＰＶをＳｆ９昆虫細胞で得た。感染性ＢＰＶの産生はＥ２を要する。ＢＰＶゲノムに感染させたＳｆ９細胞に、Ｌ１単独、Ｌ２単独、又はＬ１およびＬ２を一緒に発現するバキュロウイルスを感染させて、抽出物をＣ１２７細胞で試験した場合、フォーカス形質転換は得られなかった。しかしながら、Ｌ１＋Ｌ２およびＥ２を発現するバキュロウイルスを感染させたＢＰＶＤＮＡトランスフェクト化Ｓｆ９細胞からの抽出物を試験した場合、典型的ＢＰＶフォーカスがＣ１２７細胞で得られた。Ｌ１＋Ｌ２およびＥ２バキュロウイルスの他に、Ｅ１を発現したさらに別のバキュロウイルスを付加すると、実際に、Ｃ１２７細胞により少数のフォーカスを誘発する抽出物を生じ、そしてＬ１＋Ｌ２およびＥ１を発現するバキュロウイルスによる感染はＣ１２７細胞にフォーカス形成活性を生じなかった。さらに、Ｃ１２７細胞でのフォーカス形質転換は、Ｌ１＋Ｌ２およびＥ２バキュロウイルスを感染させた細胞が、単離再結合化ＢＰＶゲノムではなくＢＰＶｐＭＬプラスミドでトランスフェクトされていた（ＢＰＶゲノム内に挿入された細菌ｐＭＬ−２ｄプラスミドを含有する）場合には、得られなかった。感染性ＢＰＶを用いた場合と同様に、Ｃ１２７細胞のフォーカス形質転換は、Ｌ１、Ｌ２およびＥ２バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞からの感染性抽出物を中和抗ＢＰＶ血清とともにインキュベートした場合には、阻止される。外因性Ｅ２の要件。感染性ウイルスを得るための、Ｌ１およびＬ２の他の、Ｅ２バキュロウイルスに関する要件は、哺乳類細胞系の場合とは異なった。外因性Ｅ２を必要としない哺乳類細胞系との差に関する考え得る説明の一つは、ＢＰＶゲノムを保有する哺乳類細胞に対比して、非構造性ウイルスタンパク質をコードするＢＰＶ遺伝子がＢＰＶＤＮＡトランスフェクト化Ｓｆ９昆虫細胞中で発現されないというものである。この可能性を試験するために、ＢＰＶＤＮＡでトランスフェクトしたＳｆ９細胞を、λＣＩＩＢＰＶＥ６融合タンパク質に対するウサギ抗血清の１：５００希釈液でプローブすることにより、ＢＰＶＥ６タンパク質の発現に関してウエスタンブロットで試験した（Androphy，E.J.，et a l.，1985，Science 230，442-445）。Ｅ６発現は、これらの条件下では検出されなかった。これらの結果は、哺乳類細胞に対比して、ＢＰＶ遺伝子がトランスフェクト化ＢＰＶゲノムから発現されなかったということを示す。Ｅ２はウイルス転写／複製レギュレーターである。ＢＰＶ全長Ｅ２遺伝子は、すべてのパピローマウイルスの上流調節領域（ＵＲＲ）中に多数コピーで存在する配列と結合する二量体として機能するタンパク質をコードする（Turek，L.，1 994，Adv．Virus Res．44，305-356）。Ｅ２タンパク質は、ウイルスＲＮＡ合成およびウイルスＤＮＡ合成を刺激することが示されている。これらの活性はともに、Ｅ２のＵＲＲのそのコグネイト結合部位との結合（Ｅ２ＢＳ）に依っているが、一方ウイルスＤＮＡ複製は、Ｅ２タンパク質の他にウイルスＥ１遺伝子を必要とする（Chiang，C.M.，et al.，1992，Proc．Natl.Acad．Sci．USA 89，5799 -5803）。外因性Ｅ２はＢＰＶ転写を刺激しない。ＢＰＶＤＮＡトランスフェクト化Ｓｆ９細胞中でのＥ２発現がビリオン集合に必要なその他のパピローマウイルス遺伝子の発現を活性化し得るか否かを決定するために、ＢＰＶＥ６タンパク質（哺乳類細胞中でのその発現はＥ２により調節される）の存在を、Ｅ２バキュロウイルスで感染後に調べた。ウエスタンブロット分析により、それらがＥ２バキュロウイルスにのみ感染した場合も、Ｅ２およびＬ１＋Ｌ２バキュロウイルスに感染した場合も、Ｅ６発現は、Ｅ２を発現するＢＰＶＤＮＡトランスフェクト化Ｓｆ９細胞中では検出されなかった。これらの知見は、非構造性ウイルス遺伝子の発現がこれらの条件下では活性化されなかったことを示す。外因性Ｅ２はＢＰＶＤＮＡ合成を刺激しない。Ｅ２バキュロウイルスがトランスフェクト化Ｓｆ９細胞中での投入ＢＰＶＤＮＡのＢＰＶＤＮＡ複製を促進しているという可能性を調べるために、ＢＰＶＥ１，Ｅ２，Ｌ１およびＬ２をＢＰＶＤＮＡトランスフェクト化Ｓｆ９細胞中で別々に、そして組合せて、組換え体バキュロウイルスから発現させた。３日後、細胞を回収して、Ｈｉｒｔ抽出物（Hirt，B.，1967，J．Mol．Biol．26，365-369）を調製した。ＤｐｎＩによる消化に対する耐性の出現を用いて、Ｓｆ９細胞中でのＢＰＶＤＮＡ複製に関してアッセイした。染色体外ＤＮＡを余分量のＤｐｎＩで消化し、１％アガロースゲル上で分離して、サザーンブロット処理した。ＢＰＶＤＮＡのＳｐｅＩ −ＫｐｎＩ断片からのランダムプライミングにより生成された［³²Ｐ］標識プローブを用いて、ＢＰＶＤＮＡの存在を検出した。ＤｐｎＩ耐性ＢＰＶＤＮＡの証拠は観察されなかった（試料当たり１ｎｇのＤＮＡの感受性に対して）。これらの結果は、ウイルス複製がＥ１又はＥ２又は両方のタンパク質の存在下では昆虫細胞中では生じなかった、ということを示す。したがって、Ｅ２は、パッケージングのためにＢＰＶゲノムを複製するのに、ＢＰＶＤＮＡトランスフェクト化Ｓｆ９細胞では必要でなかった。外因性Ｅ２はＢＰＶＬ１又はＬ２の量を増大しない。Ｅ２がＳｆ９細胞中で非構造性ウイルス遺伝子の発現を刺激した、あるいはＢＰＶＤＮＡの複製を助長したということを除外するため、Ｅ２発現がＬ１又はＬ２の量をビリオン集合にとって決定的なレベルに増大し得るか否か調べた。この可能性に関し、ウエスタンブロット分析を用いて、全組合せで、Ｌ１、Ｌ２およびＥ２を発現する組換えバキュロウイルスを感染させて、３日間保持したＢＰＶＤＮＡトランスフェクト化Ｓｆ９細胞中でＬ１およびＬ２のレベルを評価した。Ｅ２はキャプシド遺伝子発現のレベルを増大しなかった。むしろ、ＢＰＶトランスフェクト化Ｓｆ９細胞のプレートの各感染に用いた異なるバキュロウイルスの数の増加は、各々からの遺伝子発現を低減させる傾向があった。考察。ＢＰＶＤＮＡゲノムの多数のコピーを安定保有する哺乳類細胞では、セムリキ森林熱ウイルスベクターを介したＢＰＶＬ１およびＬ２の発現は、感染性ＢＰＶ（ＢＰＶ抗血清により中和可能）を生じさせる。同一系において、セムリキ森林熱ウイルスベクターを介したＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２の発現は、ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２キャプシドに取り囲まれたＢＰＶゲノムから成る感染性偽型（ＨＰＶ１６抗血清で中和可能）を生じさせる。ウイルスＤＮＡの包膜および感染性ウイルスの生成はともにＬ１およびＬ２の発現を要するが、しかしＬ１はそれ自体で、空キャプシドを作る。昆虫細胞では、感染性ＢＰＶは、ＢＰＶＤＮＡゲノムが細胞中に導入され、細胞が適切な組合せのＢＰＶタンパク質を発現するバキュロウイルスに感染すると得られる。ＨＰＶを含むその他のパピローマウイルスに対する同様のアプローチも、その血清型の感染性ウイルスを産生する、と予測される。さらに、このアプローチは、酵母を含むその他の非哺乳類系に対して首尾よく行くと予測されるが、この場合、構造性ウイルスタンパク質の発現は、適正にフォールドされたウィルスキャプシドの自己集合を生じる（Sasagawa，T.，et al.，Virology 206， 126-35）。昆虫細胞で実行された試験からの主要知見は、これらの細胞中での感染性ＢＰＶの産生は、ウイルスゲノムおよびウイルス構造タンパク質Ｌ１およびＬ２の他に、Ｅ２の外因性産生を要する。哺乳類細胞における外因性Ｅ２に関する要件の欠如は、Ｅ２が哺乳類細胞ではエピソームＢＰＶゲノムから発現されるが、一方昆虫細胞の場合はそうではない、という事実から生じると結論される。ＢＰＶは哺乳類ウイルスであるため、哺乳類細胞はウイルスゲノムからの非構造遺伝子の発現を許す（Turek，L.，1994，Adv．Virus Res．44，305-356）が、一方進化的に分岐した昆虫細胞はウイルスゲノムからのこれらの遺伝子の発現を許さない、ということは意外ではない。昆虫細胞で実行した実験の結果は、外因性Ｅ２が、組換えバキュロウイルスから発現された場合、ＢＰＶＤＮＡ合成、ＢＰＶ転写を刺激し、あるいはＢＰＶＬ１又はＬ２タンパク質の量を増大するという可能性を否定する。Ｅ２は、構造ウイルスタンパク質によるＢＰＶゲノムの包膜を媒介するという異なる役割を有する、と想像される。この結果を得るためにＥ２が機能するメカニズムは分かっていないが、しかしモデルを仮定し得る。このモデルでは、Ｅ２二量体は、ウイルスゲノム中のそれらのコグネイトＥ２結合部位に結合すると、それは十分に集合化された粒子に生成される際、ウイルスキャプシドと会合する複合体を形成する。おそらくは、Ｅ２−ＤＮＡ複合体のある態様は、ウイルスＤＮＡの包膜を助長する様式で、集合中のウイルスキャプシドを認識する。このモデルでは、Ｅ２はウイルスゲノムとともにウイルスキャプシド中に取り込まれる。あるいは、ウイルスＤＮＡの包膜はＥ２の放出を生じ得、この場合、それは再利用されてその他のウイルスＤＮＡゲノムの包膜を助けるのかもしれない。この後者の可能性は、ウシ疣からの感染性ＢＰＶの実験が今までのところ、Ｅ２検出（１０ビリオン当たり１分子のＥ２の感度で）に失敗しているので、好都合である。このモデルの鍵となる特徴は、ウイルスＤＮＡ配列とのＥ２の十分立証済みの高親和性結合によるゲノム包膜の特異性をそれが提供することである。すべてのパピローマウイルスはこのメカニズムによりそれらのケノムを包膜する、と予測される。Ｌ２がＥ２およびウイルスゲノムをＰＯＤに補充することを示す結果は、このモデルと一致する。哺乳類細胞中でＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２によりＢＰＶゲノムを偽型化する能力は、包膜のメカニズムがパピローマウイルスの間で保存されているということを示す。さらに、非構造性ＤＮＡ結合タンパク質がウイルスＤＮＡを形成中のビリオンにもたらすモデルは、他のウイルスにも同様に適用し得る。ほとんどの場合、ＤＮＡ結合タンパク質（又はＲＮＡウイルスに関してはＲＮＡ結合タンパク質）は、ウイルスコード化される。しかしながら、ＤＮＡ結合タンパク質が細胞コード化されるウイルスが存在し得る（実施例６参照）。このモデルの一般的特徴を基礎にして、パピローマウイルス機構によるＤＮＡの包膜には、ＤＮＡがＥ２ＢＳを含むことが必要である。これは、遺伝子および好ましい調節エレメントのようなあらゆるＤＮＡ配列が、それがＥ２ＢＳを含む限り、パピローマウイルス偽型として包膜される、ということを意味する。Ｅ２ＢＳの数および位置に関する規則の決定、並びにＥ２ＢＳ含有ＤＮＡがさらにエピソーム性、環状および約８ｋｂでなければならないか否かは、経験的事項である。さらに、ＤＮＡからほとんどすべてのウイルス遺伝子を排除し、パピローマウイルスキャプシドタンパク質により有効に偽型化されたＥ２ＢＳ含有ＤＮＡをなお保持させることができる、と予測される。ＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２はＢＰＶゲノムを偽型化し得るという知見は、Ｅ２が異種キャプシドとともに機能し得る、ということを示す。これは、新規のウイルス偽型の作成が同種Ｅ２の使用を必要としないことを意味する。その代わりとして、要件は、Ｅ２に関連して異種であり得るパピローマウイルスキャプシドを伴う、Ｅ２ＤＮＡ結合タンパク質およびパピローマウイルスベクターＤＮＡ中に取り込まれたそのコグネイトＤＮＡ結合部位である。そのメカニズムがその他のウイルスに適用し得る程度まで、それはさらにそれらに拡大されることができる。パピローマウイルス偽型は、哺乳類細胞で作製され得る（第Ｉ節）。昆虫細胞での感染性ＢＰＶの作製に際して成功が示され（第ＩＩＩ節）、細胞がＥ２、Ｌ１およびＬ２を発現するという条件で、昆虫細胞中でパピローマウイルス偽型を作ることができるということがさらに予測される。Ｌ１およびＬ１／Ｌ２ウイルス様粒子は酵母で作られている（Sasagawa，T.，et al.，1995，Virology 206， 126 -35）ため、そしてＥ２はここではＥ２ＢＳ依存性転写因子として機能することが示されている（Lambert，P.，et al.，1989，Genes Dev．3，38-48;Morrissey ，L.，et al.，1989，J．Virol．63，4422-4425）ために、酵母中でパピローマウイルス偽型を作ることができると予測され、酵母での要件は、昆虫細胞、そしておそらくは哺乳類細胞の場合と同様である。酵母又は昆虫細胞で機能するＤＮＡ複製起点の付加（パピローマウイルスはすでに、哺乳類細胞で機能する複製起点を有する）は、同種系における感染性ウイルス産生を増大し得る。さらに、ウイルス様粒子は、現在、細菌で発現されており（Nardelli-Haefliger et al.，1 -6 Dec．1996，15 Intl．Papillomavirus Workshop，290）、この知見は、パピローマウイルス偽型がＥ２、Ｌ１およびＬ２遺伝子を機能的にコードするよう遺伝子工学処理された細菌中で作られる、という期待を導く。まとめて解釈すると、これらの特性はパピローマウイルス偽型の産生を相対的に安価にし得る。さらに、細胞を用いることなく、試験管中でウイルス偽型を作ることができるはずである。Ｅ２と他のウイルス成分、Ｌ１、Ｌ２およびＥ２ＢＳ含有ＤＮＡとの相互作用は、ウイルスＤＮＡのin vitroパッケージングの要件を決定するためのアッセイの開始点を提供する。有効なパッケージングはさらに、例えばＰＯＤ中に存在するような細胞成分又は構造を必要とするが、実際には経験的に決定されるであろう。パピローマウイルス偽型は広範な細胞に対して感染性であるため、それらは遺伝子導入に広範な用途を有すると予測される。ＩＶ．遺伝子療法および遺伝子免疫感作における感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子の使用遺伝子療法および遺伝子感作のための遺伝子導入は、体細胞の遺伝的能力範囲が治療的又は免疫原的目的のために改変される臨床的手法である（Crystal，R.G .，1995，Science 270，404-410;Mulligan，R.C.，1993，Science 260，926-932 ）。本質的に、遺伝子導入は、この場合、１つ又はそれ以上の遺伝子から成る発現カセットおよびそれらの発現を制御する配列の、標的細胞への送達を含む。これは、実験室で、カセットが細胞に導入され、次に改変細胞が受容対象に注入される手法で、ex vivoに実行され得る。あるいは、遺伝子導入は、発現カセットが個体内の細胞に直接導入される手法で、in vivoに実行され得る。いずれの手法でも、導入工程は、通常は、それが適切に機能し得る細胞にカセットを送達するベクターに手助けされる。 ex vivo又はin vivo手法の選択、そして発現カセットを保有させるために用いられるベクターの選択は、臨床的標的により定められる。データが臨床試験から取得可能なベクター系（レトロウイルス、アデノウイルスおよびプラスミド−リポソーム複合体）は、異なるメカニズムにより発現カセットを導入し、したがって、異なる用途に関して別個の利点および欠点を有する。複製欠損性組換えレトロウイルスベクターは、９ｋｂまでの外因性情報を収容し得る。レトロウイルスは、それらの遺伝子情報を標的細胞のゲノム中に導入する。これは、遺伝性および慢性疾患を治療する場合には有益であるが、しかし、慢性過剰発現又は挿入性突然変異誘発に関連した毒性の可能性を含む危険性を有する。レトロウイルスベクターの使用は、不活性化に対するベクターの感受性により、プロウイルスＤＮＡをゲノム中に組み込むために標的細胞が増殖しなければならないという事実により、および、組換え、再配列および低力価に関連した産生問題により、限定される。一般的使用でのアデノウイルスベクターは、発現カセットを７．５ｋｂまで収容する。アデノウイルスベクターは、それらが高力価で産生され、そして遺伝子を非増殖および増殖細胞に効率よく導入するため、導入に用いるのに十分適している。導入遺伝情報は、染色体外に残存し、したがって、細胞遺伝子型の恒久的変化の、又は挿入性突然変異誘発の危険性を回避する。しかしながら、一般的使用におけるアデノウイルスベクターは、非特異的炎症および抗ベクター免疫を引き起こす。これらの反応は、染色体外の発現カセットの位置と合わさり、発現の継続期間を数週間〜数ケ月の範囲に制限する。したがって、アデノウイルスベクターは、周期的に再注入されて、その継続的発現を保持するものである。反復注入が危険であるとは思えないけれども、ベクターキャプシドタンパク質に対する抗体かこれらのベクターの反復注入の効能を制限するか否かは分からない。理論的には、プラスミド−リポソーム複合体は、本質的に非限定サイズの発現カセットを導入するために用いられ、感染性因子を形成するための複製又は組換えができず、そしてそれらがタンパク質を欠くためにより少ない炎症又は免疫反応しか引き起こさないという点において、遺伝子導入ベクターとしての多数の利点を有する。これらのベクターの欠点は、それらが非効率的で、遺伝子導入を首尾よく行うためには、数千のプラスミドが標的細胞に対して提示される必要がある。遺伝子導入を首尾よく行うための障害の一つは、完全なベクターを得ることである。理想的ベクターは、現在のベクターが示したハードル、例えばレトロウイルスベクターにおける挿入性突然変異誘発に対する危険性の低減、アデノウイルスにより喚起される免疫および炎症の量の最小化、並びにプラスミド−リポソーム複合体に関する細胞への遺伝子の送達増強といったハードルを克服する。遺伝子療法および遺伝子免疫感作にパピローマウイルスベクターを用いることの利点は、それがベクターとして多数の望ましい特質を有することであり、例えば、レトロウイルスベクターの挿入性突然変異誘発特性に対する危険性を低減し（その独特の生活環に基づいて）、アデノウイルスベクターに関与する免疫および炎症の量を最小限にし（下記参照）、そして、プラスミド−リポソーム複合体に固有の問題に対比して送達を増強する（それが動物ウイルスであることに基づく）。パピローマウイルスベクターの魅力的な特徴は、中和抗体が不十分にしか交差反応しないか、又は全く反応しない多数の異なる血清型が存在することである。中和抗体はウイルス感染を妨害するため、多血清型の存在は、あるパピローマウイルス血清型に対する中和抗体を発現した患者がなお他のウイルス血清型による感染に感受性である、ということを意味する。異なる型のキャプシドでの同一ＤＮＡの包膜は、送達の有効性の漸進的損失を伴わずに、遺伝子療法又は遺伝子免疫感作プロトコルにおける多重「ブースト(boost)」を可能にする。Ｌ１分子を交換することにより血清型を変えるのは合理的であるが、しかしＬ２分子をＬ１と同様に交換することも必要なことがある。Ｌ１はメジャー中和エピトープを含有するが、Ｌ２もマイナー中和エピトープを含有する。この点が、継続的投与プロトコルでは重要である。動物ウイルスを用いて送達を増大することの利点は、これらのウイルスが哺乳類細胞中で増殖されねばならないという制限により相殺される。この種の増殖は、ヒトに対して感染性で且つ病原性であり得る不顕性ウイルスによる汚染の可能性のために、経費がかかり且つ危険の可能性がある。パピローマウイルスベクターの強みは、それが動物ウイルスであっても、例えば昆虫および酵母細胞のような非哺乳類細胞中で増殖でき、したがって、落とし穴を回避しながら、動物ウイルスであることの利益を享受し得るというものである。本発明の偽ウイルス粒子は、遺伝子療法および遺伝子免疫感作のこのような関係において有用である。パピローマウイルスベクターは、ベースとしてＥ２ＢＳ含有ＤＮＡを用い、ウイルス遺伝子はおそらくウイルスから欠失される。発現カセットが挿入され、ウイルスをパッケージするのに必要なタンパク質を提供するＥ２、Ｌ１およびＬ２配列を含有するパッケージング細胞系中に感染性パピローマウイルスが産生される。その発現カセットを有するベクターは特異的受容体を介して標的細胞に入り、細胞質中にインターナライズされて、核中に発現カセットを有するＤＮＡゲノムを送達するためにアンコーティングされ、そして、それは染色体上で機能してその生成物の発現を導く（実施例７参照）。いくつかの場合、Ｅ１をコードする遺伝子をパピローマウイルスベクター中に提供するのが望ましく、これはエピソームとしてウイルスゲノムを安定保持するのに必要なことが知られている。この付加は、宿主ゲノム中へのＤＮＡの組込みを妨げる傾向がある。もちろん、発現カセットのサイズは対応して調整されねばならないであろう。発現カセットに保有される遺伝子の例としては、発現生成物、例えば遺伝子療法又は遺伝子免疫感作に有用なタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド（グリコシル化、リン酸化又はアミド化等により修飾される）をコードする遺伝子が挙げられる（下記参照）。それらの発現を制御する配列は、プロモーター（例えば、ＲＳＶ又はＣＭＶ）、エンハンサー、リーダーペプチド、終止およびポリアデニル化シグナル、スプライシングシグナル、ウイルスレプリコンおよび選択可能マーカーをコードする遺伝子を含む。遺伝子療法は、遺伝性疾患の治療に、そしてさらに、心臓血管性疾患から癌からエイズに及ぶ後天性疾患の治療に適用可能であると理解される。癌の例としては、黒色腫、腎細胞癌、卵巣癌、頸部癌、神経芽細胞腫、脳、頭部および頸部の癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌、中皮腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫および皮膚癌が挙げられる。遺伝子療法を受けることが可能なその他の疾患の例としては、異常ヘモグロビン症、重度複合型免疫欠損、血友病、家族性高コレステロール血症、遺伝性気腫、嚢胞性線維腫、筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、ゴシェ病、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症、α−１抗トリプシン欠損症、ファンコーニ貧血、ハンター症候群、慢性肉芽腫、慢性関節リウマチ、末梢血管性疾患、パーキンソン病、糖尿病、骨粗鬆症、慢性創傷、乾癬およびアトピー性皮膚炎が挙げられる。遺伝子免疫感作に関しても同様に、所望の免疫反応を発生させ、所望の抗体を生成し、又は所望のＣＴＬ反応を引き起こすために適用可能であると理解される。それは、典型的には、疾病に対する防御を生じる。これらの疾病としては、感染性疾患、例えばウイルス性疾患（例えば、ウイルス性インフルエンザ）、細菌性疾患および寄生虫性疾患が挙げられる。本発明の偽ウイルス粒子により保有される遺伝子の例は、ヘモグロビンの構成成分、アデノシンデアミナーゼ、血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子）、受容体（例えば、ＬＤＬ受容体、ＡＣｈ受容体、ホルモン受容体）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、α−１抗トリプシン、イオンチャンネル（例えば、ＣＦＴＲ）、ジストロフィン、リソソーム酵素、インスリン、カルシトニン、ホルモン、成長因子、サイトカイン；成長ホルモン、エリスロポイエチン、上皮小体ホルモン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＩＧＦ、ＭＤＲ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターフェロン、ｐ５３；自殺遺伝子生成物（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、vericellaチミジンキナーゼ）；抗体およびその断片、ＭＨＣ複合体の成分（例えば、ＨＬＡ−Ｂ７）およびマイナー組織適合性抗原；アンチセンスおよび三重らせん物質；癌遺伝子；腫瘍抑制遺伝子；ウイルス性抗原、細菌性抗原、寄生虫性抗原；結合組織タンパク質（例えば、コラーゲン、エラスチンおよびフィブロネクチン）および外来タンパク質（例えば、リゾチームおよびＢＳＡ）をコードするものであるが、これらに限定されない。本発明の偽ウイルス粒子は、細胞に感染させることにより遺伝子導入に用いられる、と理解される。ex vivoアプローチはもっともらしいと思われるが、in vi voプロトコルが好ましい。いずれかのシナリオを用いて、粒子が侵入するのに適切な細胞表面受容体を発現するあらゆる細胞が、感染を受けることができる。上皮細胞へのパピローマウイルス偽ウイルス粒子媒介性遺伝子導入は、特に有用である。組織の使用は、（疾患を治療するための全身性放出のためのタンパク質を生成するよう）バイオリアクターとして、あるいは組織それ自体を治療するよう意図される。上皮、特に表皮の使用は、したがって、バイオリアクターとして、あるいは上皮又は表皮それ自体を治療するものと理解される。本発明の薬理学的又は生物学的活性化合物は一般に、動物、特にヒトに投与される。これらの活性化合物は、ガレノス薬学の慣用的方法にしたがって加工処理し、患者、例えばヒトを含めた哺乳類への投与のための医薬を製造することができる。本発明の化合物は、慣用的賦形剤、即ち活性化合物と有害作用しない非経口、経腸（例えば、経口）又は局所的適用に適した医薬上許容可能な有機又は無機担体物質と混和して用い得る。適切な医薬上許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、植物性油、合成脂肪ビヒクル等が挙げられる。製剤は、助剤、例えば活性化合物と有害反応しない滑剤、防腐剤、安定剤等と混合し得る。また、所望により、その他の活性剤、例えばビタミンと組み合わせ得る。非経口適用に関しては、特に適した処方物は、注射可能な滅菌溶液、好ましくは油性又は水性溶液、並びに懸濁液、乳濁液、あるいはインプラントである。これらの処方物は、所望により、助剤、例えば防腐剤、安定剤、緩衝剤又は浸透圧に影響を及ぼすための塩と混合される。経腸的適用に関しては、特に適しているのは、錠剤、糖衣丸剤、液体、ドロップ、座薬又はカプセルである。甘味ビヒクルを用いる場合には、シロップ、エリキシル等が用いられる。局所適用に関しては、これらは、局所適用に適合性の担体を含み、好ましくは水より大きい動的粘度を有する非噴霧可能形態、粘性〜半固体又は固体形態として用いられる。適切な処方物としては、溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、軟膏、粉末、リニメント剤、膏薬、エーロゾル剤等が挙げられる。局所適用に関しては、活性成分が、好ましくは固体又は液体不活性担体物質と組合せて、ボトル中に、あるいは加圧した揮発性物質、通常は気体の噴射剤、例えばフレオンと混和してパッケージされる噴霧性エーロゾル剤も適している。これらの組成物は、静脈内に、経口的に、あるいは鼻又は肺を通して投与することができる。それらはまた、非経口的に又は皮下に投与することができる。上皮又は表皮への投与は、ボンバードメント（例えば、遺伝子銃を用いて）又は局所適用（例えば、遺伝子クリームを用いて）により行うことができる（これには、テープの剥離による下層細胞の曝露、又は浸透増強剤の必要がある場合や、その必要がない場合もある）。具体的場合の活性化合物の実際に好ましい量は、用いられている特定化合物、処方される特定の組成物、適用方式、特定の位置および処置される生物によって変化する、と考えられる。既定宿主に対する用量は、従来の考え方を用いて、例えば被験化合物と公知の薬剤の示差的活性の通例の比較により、そして例えば適切な従来の薬理学的プロトコルを用いて、決定し得る。遺伝子導入におけるパピローマウイルスベクターの有用性を裏付ける論理は注意を引きつけるもので、遺伝子療法および遺伝子免疫感作に加えられ、革新的療法および予防に関するこの技術の衝撃は大きい。実施例本発明の特定の態様は、以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解し得るが、これらは本発明の例示を意図するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１試薬。ＢＰＨＥ−１細胞は、A．Lewis（NIH，Bethesda）（Zhang，Y.L．et al .，1987，J．Virol．61，2924-2928）より入手した。Ｃ１２７クローンＣ細胞は、W．Vass（NIH，Bethesda）から、ＢＨＫ−２１細胞はＡＴＣＣから入手した。ＶＬＰに対する抗血清（Roden，R.B.S.，et al.,1996，J．Virol．70，3298-33 01）およびモノクローナル抗体はすべて既に報告されている（Cowsert，L.M.，e t al.,1 988，Virology 165，613-15;Roden，R.B.S.，et al.，1994，J．Virol．68，757 0-74）。別記しない限り、ＳＦＶ発現ベクターを含むその他の試薬はすべて、Li fe Technologies Inc.，Gaithersburgから入手したものである。組換えｐＳＦＶ−１プラスミドの生成。内部ＳｐｅＩ部位を除去するために、ＢａｍＨＩ切断および再結合ＢＰＶｐＭＬＤＮＡからの２つの別々の反応でのＰＣＲにより、オリゴヌクレオチド、すなわち、第一の反応に関しては、CCGCTGGA TCCCACTATTATATAGCACCATGGCGTTGTGGCAACAAGGCCAG（配列番号１）およびCAGTTGAG ACTAGAGAGCCAC（配列番号２）、そして第二の反応に関してはGTGGCTCTCTAGTCTCA ACTG（配列番号３）およびGCGGTGGATCCTTATTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTTACTGGAAGTT TTTTGGC（配列番号４）を用いて、ＢＰＶＬ１を増幅した。生成物をゲル精製し、混合して、そして全長Ｌ１遺伝子を外部(outside)プライマーを用いて再増幅した。生成物（〜１．５ｋＢ）をゲル精製し、ＢａｍＨＩで消化して、ｐＳＦＶ −１のＢａｍＨＩ部位中にクローン化した（Lijestrom，P.，and Garoff，H.， 1991，BioTechnology 9，1356-1361）。クローンをシーケンシングして、方向およびＳｐｅＩ部位非存在、並びに増幅エラーを確認した。ＢＶＰＬ２をＰＣＲによりＢａｍＨＩ切断および再結合ＢＰＶｐＭＬＤＮＡから、プライマーとしてGCGGTAGATCTAATATGAGTGCACGAAAAAGAGTAAAACGTGCCAGT（配列番号５）およびC CGCTAGATCTAGGGAGATACAGCTTCTGGCCTTGTTGCCACAACGC（配列番号６）を用いて増幅した。生成物（〜１．５ｋＢ）をゲル精製し、ＢｇＩＩＩで消化し、ｐＳＦＶ− １のＢａｍＨＩ部位中にクローン化して、シーケンシングした。野生型（１１４／Ｋ）およびキャプシド集合欠損突然変異体（ｐＡＴ）ＨＰＶ１６Ｌ１をＢｇＩＩＩを用いてｐＥＶｍｏｄから切り取り、ｐＳＦＶ−１中にサブクローニングした。ＨＰＶ１６Ｌ２をｐＥＶｍｏｄベクターからｐＳＦＶ−１．ＮｒｕＩ（ＳｐｅＩではなくＮｒｕＩを用いて線状化した）のＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングした。プラスミドはすべて、アルカリ性溶解および塩化セシウム等密度遠心分離法により大腸菌ＨＢ１０１から精製された。組換えＳＦＶストックの生成。組換えｐＳＦＶ−１クローンおよびｐＨｅｌｐｅｒ−２（Berglund，P.，et al.,1993，Bio Technology 11,916-920）プラスミドを、ＳｐｅＩ（又は、ｐＳＦＶ−１．ＮｒｕＩベースクローンに関してはＮｒｕＩ）を用いて線状化した。ＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ＳＦＶＲＮＡを生成するために、１×ＳＰ６反応緩衝液中に１ｍＭＡＴＰ、１ｍＭＣＴＰ、１ｍＭＵＴＰ、０．５ｍＭＧＴＰ、１ｍＭＲＮＡキャッピング類似体ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、５ｍＭＤＴＴ、１００Ｕヒト胎盤ＲＮａｓｅ阻害剤、７５ＵＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを含有する１００μｌ反応液中に、１μｇの各線状化ｐＳＦＶ−１クローンおよび１ μｇのｐＨｅｌｐｅｒ−２を再懸濁した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、２．５μｌを０．７％アガロースゲル上で分析して、ＳＦＶＲＮＡの完全性を評価した。残りのＲＮＡを１ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地中に希釈し、１ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ中に１００μｌのリポフェクチンと混合し、周囲温度で１５分間インキュベートした。Ｔ−７５組織培養フラスコ中のＢＨＫ−２１細胞を洗浄し、２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭで覆った。ＲＮＡ／リポフェクチンミックスを添加し、細胞を３７℃で４時間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、１３ｍｌの完全培地（グラスゴーＭＥＭ中に５％ウシ胎仔血清、１０％トリプトーゼホスフェートブロス、１０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．４、１×非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中に２４時間保持した。培地を回収し、遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）により清澄化して、アリコート化し、−８０℃で保存した。ＢＰＨＥ−１細胞中でのパピローマウイルスの生成。０．５ｍｇ／ｍｌキモトリプシンＡ４（Boehringer Mannheim）を用いて氷上で３０分間インキュベートし、０．５ｍｇ／ｍｌのアプロチニン（Sigma）で処理することにより、組換えＳＦＶストックを感染性にした。１００ｍｍ組織培養プレート中の１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中に１２〜２０時間保持した４ｘ１０⁶個のＢＰＨＥ−１細胞を、Ｄ−ＰＢＳ（０．９ｍＭカルシウムおよび０．５ｍＭマグネシウムを含有）で洗浄した。細胞を、Ｄ−ＰＢＳ中に２５ｍｌに希釈された活性化組換え体ＳＦＶ（最高発現レベルを示すようにしたが、一般的には各高力価ストック０．５ｍｌ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。ウイルスを吸引し、完全培地に移し換えて、３０時間保持した。細胞を皿から培地中に掻き取り、これを回収して、遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）し、細胞ペレットを１ｍｌのＤ−ＰＢＳ中に再懸濁した。超音波処理（１０秒間、６０％パワー、Fisher１５０型超音波膜破砕機、マイクロチップ付）により、細胞を溶解させた。 in vitroフォーカス形質転換アッセイ。細胞溶解物を、６０ｍｍ組織培養プレート中の単層のＣ１２７クローンＣ細胞の培地（１０％ウシ胎仔血清および１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）に添加した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、洗浄し、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ中で３週間保持した。細胞をメタノール中の０．５％（ｗ／ｖ）メチレンブルー、０．２５％（ｗ／ｖ）カルボールフクシンで染色し、フォーカスの数を調べた（Dvoretzky，I.，et al.，1980，Virology 10 3，369-375）。哺乳類細胞からの粒子の精製。ＶＬＰの調製のために、ＢＨＫ−２１細胞を、組換えＳＦＶに感染後、３日間保持した。完全ビリオンを生成するために、組換えＳＦＶに感染させた後、３０時間だけ、ＢＰＨＥ−１細胞を保持した。１０個の５００ｃｍ²培養皿の細胞をプレートから培地中に掻き取って、これを遠心分離（１０００×ｇ、４℃で１０分間）し、細胞ペレットを５ｍｌの氷冷ＰＢＳ中に再懸濁した。超音波処理（１分間、６０％パワー）により細胞を溶解し、０．５％ＮＰ−４０で処理した。抽出物をＰＢＳクッション中の４０％（ｗ／ｖ）スクロース３０ｍｌ上に積層し、８０，０００×ｇで、４℃で１５０分間、遠心分離した。ペレットをＰＢＳ中の２７％（ｗ／ｗ）塩化セシウム１２ｍｌに再懸濁して、２７５，０００×ｇで２０時間、遠心分離した。等密度勾配を分画し、Ａｂｂｅ３Ｌ屈折計（Milton Roy，Rochester，N.Y.）を用いて、各分画の密度を測定した（Kimbauer,R.，et al.，1993，J．Virol．67，6929-36）。サザーンブロット分析。塩化セシウム勾配試料を２．５容量のエタノールと混合し、−２０℃で一夜保存した。試料を遠心分離（１６，０００×ｇ、４℃で１０分間）し、７０％エタノールでペレットを洗浄して、１０ｍＭＴｒｉｓ）１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８（ＴＥ）中に再懸濁した。各試料をプロテイナーゼＫで処理し、フェノール／クロロホルム抽出して、エタノール沈殿させ、ＴＥ中に再懸濁した。試料を０．８％アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜（Hybond N， Amersham）に移して、ＵＶ架橋処理（１２μＪ、ＵＶ Autocrosslink 1800，S tratagene）した。高ストリンジェント条件下でＢＰＶｐＭＬの［³²Ｐ］標識ランダムプライムドＳｐｅＩ−ＫｐｎＩ断片を用いて、ＢＰＶＤＮＡを検出した（Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.，1989，Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spling Harbor Laboratory Press，Col d Spring Harbor，NY）。電子顕微鏡法。５μｌ試料を炭素被覆銅グリッドに結合させて、１％（ｗ／ｖ）酢酸ウランで染色して、フィリップスＥＭ４００ＲＴ電子顕微鏡を用いて１００ｋＶで観察することにより、透過型電子顕微鏡法を実施した。低温電子顕微鏡用の試料は、炭素被覆銅グリッド上のエアフージで１５分間回転させて、液体エタン中で凍結させ、さらにフィリップスＥＭ４００ＲＴ電子顕微鏡を用いて１００ｋＶで観察した（Booy，F.P.，et al.，1991，Cell 64，1007-1015）。実施例２抗体。ＢＰＶＥ２タンパク質に対するモノクローナル抗体Ｂ２０１およびＢＰＶＥＩタンパク質を認識するポリクローナル抗血清１５０−１は、Dr．Ellio t Androphy（New England Medical Center，Tufts University School of Medic ine）により提供されたものである。ＢＰＶＬ１キャプシドタンパク質を認識するモノクローナル抗体５Ｂ６、および全長ＢＰＶＬ２キャプシドタンパク質に対して生成したウサギポリクローナル抗血清１７／２８は、既に報告されている（Roden，R.B.S.，et al.,1994，J．Virol．68，7570-74）。ＢＰＶＬ２タンパク質に対するモノクローナル抗体６Ａ８は、A．Bennett Jenson（Georgetown Un iversity）により提供されたものである（Jin，X.W.，et al.,1989，J．Gen．Vi rol．70，1133-40）。ＳＣ３５に対する抗体は、Sigma Immunochemicals（St．L ouis，MO）から購入した。抗ＰＭＬ抗体５Ｅ１０は、R．van Driel（University of Amsterdam）により生成されたもので、Dr．Louis Staudt（NCI，NIH）のご厚意によりいただいたものである（Stuurman，N.，1992，J．Cell．Science 101 ，773-84）。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）およびテキサスレッド結合ヤギ抗ウサギＩｇＧは、Jackson Immunoresearch（West Grove，PA）から購入した。細胞系。A．Lewis（NIH，Bethesda）から入手したＢＰＨＥ−１細胞を、抗生物質および１０％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ中で増殖させた（Zhang，Y.L.，et al.，1987，J．Virol．61，2924-2928）。ＡＴＣＣから入手したＢＨＫ−２１細胞を、１０％トリプトーセホスフェートブロス、抗生物質、非必須アミノ酸、ＨＥＰＥＳおよび５％ＦＣＳを補足したグラスゴー培地中で増殖させた。顕微鏡分析用に、２４ウエルプレート中の酸洗浄済＃０１カバーグラス上に、細胞を１× １０⁵個／ウエルの密度で植え付けて、一夜培養した。組換えセムリキ森林熱ウイルス発現系。組換えＳＦＶＲＮＡおよびＢＰＶＬ１又はＬ２キャプシドタンパク質を発現する複製欠損ウイルス、並びにＳＦＶ感染プロトコルは、本明細書中にすでに記載されている。ＢＰＶＥ１およびＥ２を、ＢＰＶゲノムから増幅されたＰＣＲ生成物と同様に、ｐＳＦＶ−１のＢａｍＨ１部位中にクローン化した。Ｅ１のためのプライマーは、5'CCGCTGGATCCGCACC ATGGCAAACGATAAAGGTAGC（配列番号７）および3'GCGGTGGATCCGATCTTGCAACTTATCAC TAC（配列番号８）、並びにＥ２のためのプライマーは、5'CCGCTGGATCCGCACCATG GAGACAGCATGCGAACG（配列番号９）および3'GCGGTGGATCCGAAGAAAAGGCAATGGCAGTG （配列番号１０）である。各遺伝子を発現する組換えウイルスは、Ｌ１およびＬ２に関して記載したのと同様に生成される。細胞の感染のためには、高力価組換えＳＦＶストックを、氷上で３０分間、５００μｇ／ｍｌのキモトリプシンＡ４で処理し、次にアプロチニンを５００μｇ／ｍｌに添加して、さらに１０分間処理した。活性化ウイルスを、カルシウムおよびマグネシウムを含有するダルベッコのＰＢＳで１／１００に希釈して、２４ウエルプレート中の細胞に添加した。３７℃で６０分後、ウイルス含有培地を除去して、感染用の残りに１００ｍＭＫＣｌを補足した普通成長培地と置き換えて、細胞タンパク質発現を保持した。感染を５〜６時間継続させた後、細胞を固定し、免疫位置決定した。ＳＦＶ感染は４８時間で細胞死を誘発するが、感染細胞の形態にはこの初期時点では目に見える変化は認められなかった。免疫蛍光染色。細胞を冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、ＰＢＳで希釈した１．０％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間インキュベートして固定し、ＰＢＳ／２００ｍＭグリシンで３回洗浄した。次に細胞を、ＰＢＳ／０．１％ポリオキシエチレン２０セチルエーテル（Ｂｒｉｊ）（Sigma Chemicals，S t．Louis，MO）で希釈した一次抗体とともにインキュベートし、４℃でインキュベートした。ポリクローナル抗血清は、１／１０００希釈液で用いた。ハイブリドーマ上清として用いたモノクローナル抗体を、１／１００希釈した。精製抗体は、５μｇ／ｍｌの濃度で用いた。二重免疫蛍光染色のために、一次抗体は、同時にインキュベートされた。インキュベーション後、カバーガラスをＰＢＳ／０．１％Ｂｒｉｊで３回洗浄した。二次抗体をＰＢＳ／０．１％Ｂｒｉｊで５μｇ／ｍｌに希釈し、４℃でインキュベートした。このインキュベーション後、細胞をＰＢＳ／０．１％Ｂｒｉｊで十分に洗浄して、ガラススライド上のFluoromoun t-G封入溶液（Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL）上に逆向きにした。Zeiss Axioplan顕微鏡に取り付けられたBioRadＭＲＣ１０２４レーザー走査共焦点システムを用いて、蛍光を調べた。画像はすべて、光子計数モードを用いてZeiss６３×Ｎ．Ａ．１．４ planapo対物レンズで得られた。緑色および赤色チャンネルの蛍光は重複せず、そして抗体結合は意図された抗原に特異的であるということを、対照カバーガラスにより確認した。Adobe Photoshopプログラムを用いて、画像をコラージュ処理し、スケール調整した。蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）。ＢＰＶゲノムの上流調節領域（７１７３〜２８）に対するプローブを、５’オリゴCGGCAAGCTTGCAATGTGCT GTGTCAGTTG（配列番号１１）および３’オリゴCGCGAAGCTTAACGGTGATGGTGTGATTAT （配列番号１２）を用いてＰＣＲ増幅した。ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位は太字で、ＢＰＶ配列重複は下線で示した。フルオレセインラベリングミックス（ Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）を用いてＰＣＲ反応を実施し、フルオレセイン標識化ｄＵＴＰはＰＣＲ生成物中に組み入れられる。細胞を、２％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ＋５ｍＭＭｇＣｌ₂中で、室温で１０分間、固定した。ＰＢＳ／２００ｍＭグリシンで３回洗浄後、ＰＢＳ中の０．２％トリトンＸ −１００（ｖ／ｖ）を用いて、細胞を５分間、透過性化して、ＰＢＳで再洗浄した。ハイブリダイゼーション直前に、細胞を２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭＮａＣｌ＋１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用いて室温で洗浄した。標識化プローブ（１５０ｎｇ／カバーガラス）を、１×ＳＳＣを用いて最終容量１０μｌとして、真空乾燥した。プローブを１００％脱イオン化ホルムアミド７μｌ中に再懸濁し、９０℃で５分間加熱した。７μｌのハイブリダイゼーション緩衝液をプローブに添加して、最終濃度を５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、１×Denhardt溶液、１０％硫酸デキストランおよび５０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．５とした。迅速に連続して、この混合物をカバーガラスに適用し、ガラススライド上に逆向きに置いて、１ｍｍのスペーサーにより間隔をあけて第二ガラススライドで覆い、パラフィルム（American National Can，Greenwich，CT）で密封して、９０℃で１０分間インキュベートした。次にスライドを３７℃の湿潤室に移して、一夜置いた。一夜インキュベーション後、カバーガラスを５０％ホルムアルデヒド／２×ＳＳＣで３７℃で６０分間、２×ＳＳＣで３７℃で３０分間、そして２×ＳＳＣで室温で３０分間を数回繰り返して洗浄した。タンパク質位置決定がさらに望ましい実験のために、最終ハイブリダイゼーション後洗浄の後に、前記と同様に抗体染色を実施したが、但し、インキュベーション又は洗浄には、デタージェントは含まれていなかった。実施例３ＢＰＶゲノムの生成。環状ＢＰＶＤＮＡを生成するために、そのユニークなＢａｍＨＩ部位を介してクローン化されたＢＰＶゲノムを含有する塩化セシウム精製ＢＰＶｐＭＬプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、フェノール／クロロホルム抽出して、沈殿させた。ＤＮＡを５００μｇ／ｍｌで、０．０５Weiss単位／μｇのＴ４ＤＮＡリガーゼを含有するライゲーション緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．６、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＡＴＰ、１ｍＭＤＴＴ）中に再懸濁し、１６℃で一夜インキュベートして、ＢＰＶゲノムのセルフライゲーションを促進した。再結合ＤＮＡをエタノールで沈殿させて、洗浄し、ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ)中に１μｇ／μｌで一夜再懸濁した。ＢＰＶ後期および／または初期遺伝子を発現するバキュロウイルスの生成。ＢＰＶＬ１単独、Ｌ２単独、又はＬ１＋Ｌ２を一緒に発現したバキュロウイルス（Summers，M.D.，and Smith，G.E.，1987，A manual of methods for baculovi rus vectors and insect cell culture procedures．Bulletin No．1555，Texas Agricultural Experiment Station，College Station，Tcxas）が、記載されている（Kimbauer，R.，et al.，1993，J．Virol．67，6929-36）。ＢＰＶＥ１（ Blitz，I.L．and Laimins，L.A.，1991，J．Virol．65，649-656）又はＥ２（Mo nini，P.，et al.，1993，J．Virol．67，5668-5676）を発現する同様のバキュロウイルスを、Elliot Androphy，New England Medical Center，Boston，MAから入手した。昆虫細胞でのパピローマウイルスの生成。感染前に、Ｓｆ９細胞を、１０％ウシ胎仔血清および０．０１％（ｖ／ｖ）pluronicＦ−６８を含有したグレイス培地とともに攪拌フラスコ中で２７℃で保持した。遠心分離（３００×ｇ、５分間）により細胞を回収し、血清を含有しないグレイスの培地中に、１０⁶／ｍｌで再懸濁した。６０ｍｍ組織培養皿当たり３×１０⁶個のＳｆ９細胞をプレートし、３０分間付着させた。各プレートに関して、血清無含有グレイス培地１ｍｌ中の１５μｇの結合ＢＰＶＤＮＡを、ポリスチレン試験管中の１ｍｌの血清無含有グレイス培地中の３５μｌのリポフェクチン（Life Technologies）と静かに混合し、室温で３０分間インキュベートした。培養皿中の培地を吸引し、２ｍｌの血清無含有グレイス培地中のＤＮＡ／リポフェクチン複合体と置き換えた。細胞を２７℃で４時間インキュベートし、培地を吸引し、種々の組合せのＬ１、Ｌ２、Ｅ１およびＥ２発現組換えバキュロウイルス（Ｍ０１〜１０）３３μｌを含有する２ｍｌの血清無含有グレイス培地と置き換えた。１時間感染後、培地を除去し、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するグレイス培地５ｍｌと置き換えた。加湿雰囲気中で２７℃で７２時間、細胞を保持し、プレートから掻き取って回収した。プレートをＰＢＳで１回洗浄して、残りの細胞をすべて取り出し、次に細胞を遠心分離（３００×ｇ、５分間）により収集した。培地を吸引して、細胞ペレットを− ８０℃で保存した。 in vitroフォーカス形質転換アッセイ。感染性ＢＰＶの産生に関して試験するために、Ｃ１２７細胞における標準フォーカス形質転換アッセイを実行した（Dv oretzky，I.，et al.，1980，Virology 103，369-375）。１ｍｌのＤ−ＰＢＳ（０．９ｍＭカルシウムおよび０．５ｍＭマグネシウムを含有する）を各細胞ペレットに添加し、細胞を氷上で１５秒間超音波処理（マイクロチップ、６０％パワー、Fisher１５０型音波膜破砕機）して溶解した。中和試験のために、抗体をこの段階で添加し、氷上で１時間インキュベートした。細胞溶解物を、６０ｍｍ培養皿中の低継代数マウスＣ１２７クローンＣ細胞の集密的細胞単層上の５ｍｌの培地（１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ。加湿５％ＣＯ₂／９５％空気の雰囲気中で３７℃で保持）に混合した。３７℃で１時間インキュベート後、細胞を１回洗浄し、次に５ｍｌの新鮮な培地を添加した。翌日、培地を、２〜３週間細胞を保持するために用いる１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭと置き換えて、週２回、再補充した。フォーカスをメタノール中のメチレンブルー（Sigm a，Ｍ９１４０）およびカルボールフクシン（Sigma,Ｃ−４１６５）で染色して、計数した。実施例４ＨＰＶ１６に関してここで報告したものと同様の手法を用いて、他のパピローマウイルスに関する感染性偽型を生成した。ＨＰＶ１１ゲノムは、ＨＰＶ１１ＤＮＡクローンを単離して生成する。ＨＰＶ１８のＥ２、Ｌ１およびＬ２遺伝子を発現するバキュロウイルスを調製する。Ｓｆ９昆虫細胞をＨＰＶ１１ゲノムでトランスフェクトして、Ｅ２、Ｌ１およびＬ２発現バキュロウイルスに感染させる。ＨＰＶ１８｛ＨＰＶ１１｝偽型の生成のための条件を提供し、粒子を回収する。感染性偽型の産生を試験するために、培養哺乳類細胞がＨＰＶ１８ビリオンに感染し得ることを確認する。次に、これらの細胞を用いて、in vitro感染性アッセイを実行する。フォーカス形質転換は終点ではないけれども、感染は、パピローマウイルスゲノム中に、迅速且つ容易に検出可能なマーカーを組み入れることにより確認される。形質転換がトランスフェクションによるものか、感染によるものかを確定するために、中和試験を実行する。中和抗体は、ＨＰＶ１８ビリオンに対して生成させる。ＨＰＶ１８｛ＨＰＶ１１｝偽型をこれらの抗体とともに前インキュベートし、次に細胞に投与する。中和工程が感染性を遮断した場合には、ＨＰＶ１８｛ＨＰＶ１１｝ビリオンによる感染が生じて、トランスフェクションは起きない。実施例５パピローマウイルスＶＬＰは、立体配座ビリオン表面エピトープを呈するがしかし癌遺伝子のおそれがあるウイルスゲノムを欠くために、パピローマウイルス感染に対するワクチンとして魅力のある候補である。それらが、感染性パピローマウイルスに対する高力価の明らかに型特異的中和抗体を誘導するという知見が、ＶＬＰのワクチンの能力を支持する。さらに、ＶＬＰによるワクチン接種は、パピローマウイルスによる高用量実験的感染に対する型特異的抗体媒介性in viv o防御を刺激した。本明細書中に記載したように、危険性の高いＨＰＶ、例えばＨＰＶ１６に対する中和抗体を直接測定するin vitroアッセイが現在開発されている。これは、ＨＰＶ１６のin vitro生成と、感染性に関する定量的in vitroアッセイの開発を必要とする。このアッセイは、例えば、パピローマウイルスＶＬＰを用いたパピローマウイルス感染に対する免疫予防ワクチンの開発に際して中和抗体の生成をモニタリングするためのこのプロトコルに、あるいは中和抗体の力価が防御と最もよく相関するものであるために、過去に開発された免疫予防ワクチンに関する防御をモニタリングする場合に、用いられる。フォーカス形質転換アッセイには２〜３週間を要するが、しかしこの問題は、パピローマウイルスゲノム中に迅速且つ容易に検出可能なマーカーを組み入れることにより、回避される。したがって、β−ガラクトシダーゼ発現カセットを、ほとんどのウイルスゲノム、例えばＢＰＶゲノムの代わりに置き換えて、有効な包膜に必要なそのｃｉｓ−エレメント、例えばＥ２結合部位のみを残す。この実施例では、ＢＰＶゲノムをＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２構造タンパク質で包膜して、ＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１／β−ガラクトシダーゼ｝偽型化ビリオンを生成する。ＨＰＶ１６ＶＬＰを用いたＨＰＶ１６感染に対する免疫予防ワクチンに関する防御は、ＨＰＶ１６に対する中和抗体を試験することによりモニタリングする。試料をワクチンから得て、ＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１／β−ガラクトシダーゼ｝偽型化ビリオンと混合する。感染が色の変化により確認されるＨＰＶ１６｛ＢＰＶＩ／β−ガラクトシダーゼ｝によるＣ１２７細胞の感染は、３〜４日で実行可能な定量的in vitro中和アッセイの代表的なものである。中和抗体は、感染性を遮断する。中和抗体の存在は、測定された感染性の量を、中和抗体が含まれていないことが知られている対照試料に関して測定された感染性の量と関連づけることにより、決定し得る。中和抗体の濃度は、測定された感染性の量を、既知量の中和抗体を含有する試料で測定された感染性の量と関連づけることにより決定し得る。ワクチンが中和抗体を欠くことは、ＨＶＰ１６ＶＬＰワクチンによる追加免疫接種が保証されるということの指標として用い得る。実施例６非哺乳類細胞における感染性ヘルペスウイルス偽ウイルスビリオンを調製するための実験室プロトコルを以下に示す。ヘルペスウイルスＤＮＡクローンを単離して、ヘルペスウイルスケノムを生成する。クローン化ＤＮＡを機能的にコードする発現カセットを調製する。発現カセットを、パッケージングシグナルを保持しながら、ウイルス遺伝子と置き換えて、ヘルペスウイルスベクターＤＮＡを得る。空キャプシド中にウイルスゲノムをパッケージングするための非構造タンパク質（単数又は複数）を発現する、そしてヘルペスウイルスキャプシドの構造タンパク質を発現するバキュロウイルスを調製する。Ｓｆ９昆虫細胞をヘルペスウイルスベクターＤＮＡでトランスフェクトし、非構造性および構造性タンパク質発現バキュロウイルスに感染させる。ヘルペスウイルス偽型の生成のための条件を提供し、ビリオンを回収する。感染性ビリオンの産生を試験するために、培養哺乳類細胞が野生型ビリオンに感染し得ることを確認する。次に、これらの細胞を用いて、in vitro感染性アッセイを実行する。クローン化ＤＮＡによりコードされたタンパク質の産生に関して試験することにより、感染が確認される。形質転換がトランスフェクションによるものか、感染によるものかを決定するために、中和試験を実行する。中和抗体は、野生型ビリオンに対して生成させる。ヘルペスウイルス偽型をこれらの抗体とともに前インキュベートし、次に細胞に投与する。中和工程が感染性を遮断した場合には、偽型化ビリオンによる感染が生じており、トランスフェクションは起きない。実施例７顔面のしわの治療のための臨床プロトコルを以下に示す。ＨＰＶ１ＤＮＡクローンを単離して、ＨＰＶ１ゲノムを産生する。皮膚の結合組織中に見出される分子であるエラスチンの前駆体であるプロエラスチンを機能的にコードする発現カセットを調製する。発現カセットを、Ｅ２ＢＳを保持しながら、ウイルス遺伝子と置き換えて、ＨＰＶ１ベクターＤＮＡを得る。ＨＰＶ１のＥ２、Ｌ１およびＬ２遺伝子を発現するバキュロウイルスを調製する。Ｓｆ９昆虫細胞をＨＰＶ１ベクターＤＮＡでトランスフェクトし、Ｅ２、Ｌ１およびＬ２発現バキュロウイルスに感染させる。ＨＰＶ１｛ＨＰＶ１／エラスチン｝偽型の生成のための条件を提供し、粒子を回収する。感染性粒子の産生を試験するために、培養哺乳類細胞がＨＰＶ１ビリオンに感染し得ることを確認する。次に、これらの細胞を用いて、in vitro感染性アッセイを実行する。エラスチンの産生に関して試験することにより、感染が確認される。形質転換がトランスフェクションによるものか、感染によるものかを決定するために、中和試験を実行する。中和抗体は、ＨＰＶ１ビリオンに対して生成させる。ＨＰＶ１偽型をこれらの抗体とともに前インキュベートし、次に細胞に投与する。中和工程が感染性を遮断した場合には、ＨＰＶ１｛ＨＰＶ１／エラスチン｝ビリオンによる感染が生じており、トランスフェクションは起きない。感染性ＨＰＶ１｛ＨＰＶ１／エラスチン｝粒子をクリームに製剤化した。クリームは、患者の顔面に局所的に適用される。濃度増大は遺伝子導入の効率を適切に増大せず、濃度低減は遺伝子導入の効率の有意な低減を引き起こすという臨床試験に基づいて、ウイルスの特定用量を選択する。ウイルス投与後約１０日目に、患者は顔面のしわの低減について評価され、クリームは、必要に基づいて、さらなる治療のために再適用される。本発明の特定の実施態様を詳細に説明したが、これらの実施態様は実例の説明のためのものであって、本発明がそれらに限定されないことは、当業者には明らかである。本発明の真の範囲は、添付の請求の範囲に記載されたものおよびそれと均等のものである。引用文献は、参照により本明細書中に含まれるものとする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年９月７日（１９９８．９．７）【補正内容】請求の範囲１．（ａ）Ｅ２結合部位と、遺伝子および前記遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットとを含むパピローマウイルスベクターＤＮＡと、（ｂ）Ｌ１およびＬ２構造タンパク質を含んで前記ベクターＤＮＡを包膜するパピローマウイルスキャプシドとを含む感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子。２．前記Ｌ１およびＬ２構造タンパク質の各々がヒトパピローマウイルスに由来する、請求の範囲第１項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子。３．前記遺伝子がヒト遺伝子である請求の範囲第１項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子。４．（ａ）パピローマウイルスＥ２ＤＮＡ結合タンパク質並びにＬ１およびＬ２構造タンパク質を発現する細胞系を提供し、（ｂ）Ｅ２結合部位と、遺伝子および前記遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットとを含むパピローマウイルスベクターＤＮＡであって、前記パピローマウイルスＥ２結合部位が前記Ｅ２ＤＮＡ結合タンパク質のコグネイト結合部位であるパピローマウイルスベクターＤＮＡで細胞系を形質転換し、（ｃ）前記Ｌ１およびＬ２構造タンパク質を含むキャプシドによる前記ベクターＤＮＡの包膜のための条件を提供して前記粒子を生成し、（ｄ）前記粒子を回収することを含む、感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子の製造方法。５．前記細胞系が、哺乳類細胞系、昆虫細胞系又は酵母細胞系である、請求の範囲第４項に記載の方法。６．請求の範囲第４項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を含む細胞系。７．請求の範囲第４項に記載の方法により製造される感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子。８．（ａ）請求の範囲第１項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を提供し、（ｂ）培養哺乳類細胞に前記粒子を感染させ前記培養哺乳類細胞を前記遺伝子で形質転換することを含む、培養哺乳類細胞中への遺伝子の導入方法。９．培養非感染哺乳類細胞に被験粒子として請求の範囲第７項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を投与し、感染性を評価することを含む、感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子のスクリーニング方法。１０．治療を必要とする宿主対象に治療的有効量で投与された場合に治療効果を有し得る物質を前記遺伝子がコードする、請求の範囲第１項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を含む組成物。１１．免疫原を必要とする宿主対象に免疫原的有効量で投与された場合に免疫原性効果を有し得る物質を前記遺伝子がコードする、請求の範囲第１項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を含む組成物。１２．ヒトの細胞にin vivoで感染させて薬剤として用いるための感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子であって、（ａ）Ｅ２結合部位と、遺伝子および前記遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットとを含み、前記遺伝子が治療性タンパク質をコードし、前記細胞が治療的有効量の前記治療性タンパク質を発現する、パピローマウイルスベクターＤＮＡと、（ｂ）Ｌ１およびＬ２構造タンパク質を含んで前記ベクターＤＮＡを包膜するパピローマウイルスキャプシドとを含む感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子。１３．前記細胞が上皮細胞であり、前記治療性タンパク質が全身性作用を有する、請求の範囲第１２項に記載の方法。１４．前記細胞が上皮細胞であり、前記治療性タンパク質が前記上皮細胞に対する局所性作用を有する、請求の範囲第１２項に記載の方法。１５．前記治療性タンパク質が第ＩＸ因子であり、前記治療性タンパク質の発現が血友病の治療をもたらす、請求の範囲第１３項に記載の方法。１６．前記治療性タンパク質が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであり、前記治療性タンパク質の発現は皮膚癌の治療をもたらす、請求の範囲第１４項に記載の方法。１７．ヒトの細胞にin vivoで感染させてワクチンとして用いるための感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子であって、（ａ）Ｅ２結合部位と、遺伝子および前記遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットとを含み、前記遺伝子は免疫原性タンパク質をコードし、前記細胞は免疫原的有効量のタンパク質を発現する、パピローマウイルスベクターＤＮＡと、（ｂ）Ｌ１およびＬ２構造タンパク質を含んで前記ベクターＤＮＡを包膜するパピローマウイルスキャプシドとを含む感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子。１８．第１感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子と異なる第２感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子であって、それぞれの粒子がヒトの細胞をin viv oで感染させてワクチンとして用いられ、（ａ）Ｅ２結合部位と、遺伝子および前記遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットとを含有し、前記遺伝子は免疫原性タンパク質をコードし、前記細胞は免疫原的有効量の前記免疫原性タンパク質を発現する、パピローマウイルスベクターＤＮＡと、（ｂ）Ｌ１およびＬ２構造タンパク質を含んで前記ベクターＤＮＡを包膜するパピローマウイルスキャプシドとを含み、前記第１感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子とは異なる血清型である点で、前記第１感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子と異なる、第２感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 17/00 Ａ６１Ｐ 7/04 35/00 17/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 35/00 7/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｑ 1/70 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 7/00 33/50 ＺＣ１２Ｑ 1/70 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/465 33/50 37/52 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ロダン，リチャード，ビー. アメリカ合衆国，20814 メリーランド, ベセスダ，ローカストアベニュー 5308

Claims

【特許請求の範囲】１．感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子。２．ＨＰＶ１６｛ＢＰＶ１｝ビリオン。３．（ａ）Ｅ２結合部位と、遺伝子および前記遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットとを含むパピローマウイルスベクターＤＮＡと、（ｂ）Ｌ１およびＬ２構造タンパク質を含んで前記ベクターＤＮＡを包膜するパピローマウイルスキャプシドとを含み、前記遺伝子は第１生物種に由来し、前記Ｌ１構造タンパク質は第２生物種に由来し、前記第１生物種は前記第２生物種と異なる、感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子。４．前記第１生物種がＢＰＶ１であり、前記第２生物種がＨＰＶ１６である、請求の範囲第３項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子。５．（ａ）パピローマウイルスＥ２ＤＮＡ結合タンパク質並びにＬ１およびＬ２構造タンパク質を発現する細胞系を提供し、（ｂ）Ｅ２結合部位と、遺伝子および前記遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットとを含むパピローマウイルスベクターＤＮＡであって、前記パピローマウイルスＥ２結合部位は前記Ｅ２ＤＮＡ結合タンパク質のコグネイト結合部位であり、前記遺伝子は第１生物種に由来し、前記Ｌ１構造タンパク質は第２生物種に由来し、そして前記第１生物種は前記第２生物種と異なる、パピローマウイルスベクターＤＮＡで前記細胞系を形質転換し、（ｃ）前記Ｌ１およびＬ２構造タンパク質を含むキャプシドによる前記ベクターＤＮＡの包膜のための条件を提供して前記粒子を生成し、（ｄ）前記粒子を回収することを含む、感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子の製造方法。６．前記細胞系が哺乳類細胞系、昆虫細胞系又は酵母細胞系である、請求の範囲第５項に記載の方法。７．請求の範囲第３項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を含む細胞系。８．（ａ）請求の範囲第３項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を提供し、（ｂ）培養哺乳類細胞に前記粒子を感染させて前記培養哺乳類細胞を前記遺伝子で形質転換することを含む、培養哺乳類細胞中への遺伝子の導入方法。９．被験粒子をそれに感染可能な培養哺乳類細胞に投与し、その感染性を評価することを含む、感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子のスクリーニング方法。１０．治療を必要とする宿主対象に治療的有効量で投与された場合に治療効果を有し得る物質を前記遺伝子がコードする請求の範囲第３項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を含む組成物。１１．免疫原を必要とする宿主対象に免疫原的有効量で投与された場合に免疫原性効果を有し得る物質を前記遺伝子がコードする請求の範囲第３項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を含む組成物。１２．ヒトの細胞にin vivoで請求の範囲第３項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を感染させることを含み、前記遺伝子は治療性タンパク質をコードし、前記細胞は治療的有効量の前記治療性タンパク質を発現する、治療性タンパク質をヒトに提供する方法。１３．ヒトの細胞にin vivoで請求の範囲第３項に記載の感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を感染させることを含み、前記遺伝子は免疫原性タンパク質をコードし、前記細胞は免疫原的有効量の前記免疫原性タンパク質を発現する、免疫原性タンパク質をヒトに提供する方法。１４．前記細胞が上皮細胞であり、前記治療性タンパク質が全身性作用を有する請求の範囲第１２項に記載の方法。１５．前記細胞が上皮細胞であり、前記治療性タンパク質が前記上皮細胞に対する局所性作用を有する請求の範囲第１２項に記載の方法。１６．前記治療性タンパク質が第ＩＸ因子であり、前記治療性タンパク質の発現が血友病の治療をもたらす請求の範囲第１４項に記載の方法。１７．前記治療性タンパク質が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであり、前記治療性タンパク質の発現が皮膚癌の治療をもたらす請求の範囲第１５項に記載の方法。１８．前記ヒトの細胞にin vivoで第２感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子を感染させることをさらに含み、前記第２感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子は、前記第１感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子とは異なる血清型であるという点で前記第１感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子と異なる請求の範囲第１２項に記載の方法。１９．Ｅ２結合部位並びに遺伝子および前記遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットを含むパピローマウイルスゲノムと、Ｌ１およびＬ２構造タンパク質を含んで前記ゲノムを包膜するパピローマウイルスキャプシドとを含み、前記Ｅ２結合部位は第１パピローマウイルス血清型に由来し、前記Ｌ１構造タンパク質は第２パピローマウイルス血清型に由来し、前記第１パピローマウイルス血清型は前記第２パピローマウイルス血清型と異なる、感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子。２０．（ａ）ウイルスの空キャプシド中に前記ウイルスのウイルスゲノムをパッケージングするための前記ウイルスの非構造タンパク質を発現し、かつ前記ウイルスキャプシドの構造タンパク質を発現する非哺乳類細胞系を提供し、（ｂ）前記パッケージングのためのシグナルを含み、かつ遺伝子および前記遺伝子の発現を制御する配列を含む発現カセットをさらに含む前記ウイルスゲノムであって、前記遺伝子は第１生物種に由来し、前記ウイルスキャプシドは第２生物種に由来し、前記第１生物種は前記第２生物種と異なる、ゲノムで前記細胞系を形質転換し、（ｃ）前記ウイルスキャプシドによる前記ウイルスゲノムの包膜のための条件を提供して前記ビリオンを生成し、（ｄ）前記ビリオンを回収することを含む、非哺乳類細胞での感染性パピローマウイルス偽ウイルス粒子の製造方法。