ES2572628T3 - Método in vitro para desmontaje/remontaje de partículas análogas al virus del papiloma humano (VLP) - Google Patents

Abstract

Un método para producir partículas análogas a virus (VLP) del virus del papiloma humano (VPH), que comprende: (i) purificar una proteína L1 del VPH expresada de forma recombinante desmontada en presencia de al menos un agente reductor de sulfhidrilo que mantiene dicha proteína L1 del VPH expresada de forma recombinante en una forma desmontada; y (ii) montar dicha proteína L1 del VPH expresada de forma recombinante en partículas análogas a virus (VLP) del virus del papiloma humano mediante la eliminación u oxidación de dicho al menos un agente reductor.

Description

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DESCRIPCION

Metodo in vitro para desmontaje/remontaje de partmulas analogas al virus del papiloma humano (VLP)

Campo de la invencion

La presente invencion proporciona un medio muy eficaz para desmontar partmulas analogas al virus del papiloma (VLPs) en capsomeros y/o subunidades inferiores, y volver a montarles en VLP. Estas composiciones que contienen VLP nuevamente montadas producidas por la invencion expresan epftopos conformacionales neutralizantes y tienen elevada homogeneidad y comprenden por tanto agentes eficaces profilacticos y diagnosticos para el diagnostico o la prevencion de la infeccion por el virus del papiloma. Tambien, la presente invencion se refiere a uso de dichas VLP para la encapsulacion de restos deseados, por ejemplo, agentes terapeuticos o diagnosticos, y el uso de los mismos como pseudoviriones para evaluar la eficacia de posibles vacunas o compuestos terapeuticos.

Antecedentes de la invencion

El virus del papiloma infecta una amplia variedad de diferentes especies de animales, entre las que se incluyen los seres humanos. La infeccion se suele caracterizar por la induccion de tumores benignos epiteliales y fibroepiteliales, o verrugas, en el sitio de la infeccion. Cada especie de vertebrado se infecta por un conjunto de viris del papilo espedfico de la especie, que comprende diferentes tipos del virus del papiloma. Por ejemplo, se han aislado mas de sesenta tipos diferentes de genotipos del virus del papiloma humano (VPH). Los virus del papiloma son agentes infectivos fuertemente dependientes de la especie. Por ejemplo, los virus del papiloma de canidos y conejos no pueden inducir papilomas en especies heterologas como seres humanos. La inmunidad neutralizante de la infeccion contra un tipo del virus del papiloma no confiere inmunidad contra otro tipo, incluso aunque ambos tipos infecten una especie homologa.

En los seres humanos, los virus del papiloma ocasionan verrugas genitales, una enfermedad de transmision sexual frecuente. Los tipos 6 y 11 del VPH se asocian con mucha frecuencia condilomas acuminados benignos del tipo condilomata acuminata. Las verrugas genitales son muy comunes, y las formas subclmicas o no evidentes de la infeccion por VHC son incluso mas habituales que la infeccion clmica. Aunque la mayona de las lesiones inducidas por el VPH son benignas, las sesiones que ocasionan algunos tipos de virus del papiloma, por ejemplo, VPH-16 y VPH-18, pueden experimentar una evolucion maligna. Ademas, la infeccion por uno de los tipos de virus del papiloma asociados a malignidad se considera un factor de riesgo significativo para el desarrollo de cancer de cuello de utero, el segundo tipo de cancer mas comun en las mujeres de todo el planeta. Entre los tipos del VPH implicados en el cancer de cuello de utero, el VPH-16 es el mas habitual, y se encuentra en aproximadamente el 50 % de los canceres de cuello de utero.

A la vista de los riesgos para la salud significativos que plantea la infeccion por el virus del papiloma de una forma gen eral, y de la infeccion por el virus del papiloma humano en particular, varios grupos han notificado el desarrollo de antfgenos recombinantes del virus del papiloma y su uso como agentes diagnosticos y como vacunas profilacticas. En general, dichas investigaciones se han centrado en la produccion de vacunas profilacticas que contienen la protema principal de la capsida (L1) en solitario o combinada con la protema secundaria de la capsida (L2). Por ejemplo, Ghim et al, Virology, 190:548-552 (1992), notificaron la expresion de la protema L1 del VPH-1 usando una expresion de vaccinia en celulas Cos, que muestra epftopos conformacionales y el uso de la misma como vacuna o para la tipificacion o deteccion serologica. Este trabajo es tambien es la base de una solicitud de patente, la que tiene como numero de serie 07/903.109, presentada el 25 de junio de 1992 (abandonada en favor del documento con numero de serie 08/216.506, presentada el 22 de marzo de 1994), de la que se ha otorgado una licencia al cesionario de la presente solicitud. Tambien, Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 92:11553-11557 (1995), notificaron que la inmunizacion de canidos con un virus del papiloma canino oral (VPCO) recombinante expresado en un sistema de baculovirus/celula de insecto previno en su totalidad el desarrollo de papilomas vmcos mucosales. Estos resultados son importantes dadas las similitudes significativas entre muchos VPH y VPCO. Por ejemplo, muchos VPCO esten asociados al cancer anogenital y genital, infecta e induce lesiones en un sitio de mucosa, analogamente al VPH. Tambien las secuencias L1 del VPCO comparten similitudes estructurales con las secuencias de L1 del VPH. Dadas estas similitudes, el modelo del VPCO/beagle es util para la investigacion de vacunas que contienen la protema L1, por ejemplo, en la investigacion de la respuesta inmunitaria protectora, la proteccion frente a la infeccion natural y la optimizacion de los protocolos de vacunacion. (Id.)

Tambien, un grupo de investigacion de la Universidad de Rochester notifico la produccion de la protema principal de la capsida (L1) del virus del papiloma humano y de partmulas analogas a virus usando un sistema de expresion en baculovirus/celula de insecto (Rose et al, Universidad de Rochester, documento WO 94/20137, publicado el 15 de septiembre de 1994). En particular, notificaron la expresion de la protema principal de la capsida L1 de VPH-6 y VPH-11 y la produccion de partmulas analogas a VPH-6, VPH-11, VPH-16 y VpH-18.

Ademas, un grupo de investigacion de la Universidad de Queensland tambien divulgo intencionadamente la fabricacion recombinante de las protemas L1 y/o L2 del virus del papiloma, asf como su uso potencial como vacunas (Frazer et al, documento WO 93/02189, publicado el 4 de febrero de 1993).

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Aun mas, un grupo de investigacion del gobierno de los Estados Unidos notifico protemas de la capsida del virus del papiloma supuestamente capaces de autoensamblarse en estructuras de capsomeros y capsidas vmcas que comprenden epttopos antigenicos conformacionales (patente de Estados Unidos n. ° 5.437.951, Lowy et al, concedida el 1 de agosto de 1995). Las reivindicaciones de dicha patente se dirigen a una secuencia espedfica de ADN del VPH-16 que codifica una protema L1 capaz de autoensamblarse, y al uso de la misma para expresar capsidas recombinantes del VPH-16 que contienen dicha protema L1 del VPH-16.

Con respecto de las vacunas que contienen la protema de la capsida del VPH, los expertos en la materia aceptan ampliamente que un prerrequsito fundamental de una vacuna basada en la protema principal de la capsida L1 del VPH es que esten presentes los epttopos conformacionales presentes en la protema L1 expresados por las protemas principales de la capsida del virus del papiloma humano (vease, Hines et al, Gynecologic Oncology, 53:1320 (1994); Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 92:11553-11557 (1995)).

Se han notificado en la bibliograffa las protemas L1 del VPH tanto no particuladas como particuladas recombinantes que presentan los epftopos conformacionales de L1 de VPH. Se sabe que L1 es estable en varias configuraciones oligomericas, por ejemplo (i) capsomeros que comprenden pentameros de la protema L1 y (ii) capsidas que estan compuestas por setenta y dos capsomeros en una estructura icosahedrica T=7. Tambien, se sabe que la protema L1, cuando se expresa en celulas eucariotas por sf misma, o junto con L2, es capaz de un autoensamblaje eficaz en estructuras de tipo capsida que se denominan de manera general partmulas analogas a virus (VLP).

Se ha demostrado que las VLP son morfologica y antigenicamente similares a los viriones autenticos. Ademas, se ha notificado que la inmunizacion con VLP desencadena la produccion de anticuerpos neutralizantes del virus. Mas espedficamente, los resultados con una variedad del virus del papiloma de animales (virus del papiloma oral de canidos y virus del papiloma bovino 4) han sugerido que la inmunizacion con VLP da como resultado proteccion contra posteriores infecciones por el virus del papiloma. En consecuencia, las VLP compuestas por protemas L1 del HPH se han propuesto como vacunas para prevenir enfermedades asociadas con las infecciones por el virus del papiloma humano.

Por ejemplo, se ha nori que la protema L1 se puede ensamblar en VLP cuando se expresa usando vectores vmicos recombinantes de baculovirus y vaccinia y en levadura recombinante (Hagensee et al, J. Virol., 68:4503-4505 (1994); Hofmann et al, Virology, 209:506-518 (1995); Kirnbauer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:12180-12184 (1992); Kirnbauer et al, J. Virol., 67:6929-6936 (1993); Rose et al, J. Virol., 67:1936-1944 (1993); Sasagawa et al, Virology, 206:126-135 (1995); Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11553-11557 (1995); Volpers et al, Virology, 200:504-512 (1994); Zhou et al, J. Virol., 68:619-625 (1994)).

La mayona de las preparaciones de L1 recombinante anteriores aisladas de celulas eucariotas han dado como resultado una poblacion variable de VLP con un diametro aproximado de 55 nm, que tienen un aspecto similar a los viriones intactos. Sin embargo, el montaje de VLP es ligeramente sensible para el tipo de celula. Por ejemplo, la L1 expresada en Escherichia coli se expresa en gran medida en forma de capsomeros o mas pequenas, con pocas o ninguna capsida efidente ni en la celula ni despues de la purificacion (Rose et al, J. Virol., 67:1936-1944 (1993); Li et al, J. Virol., 71:2988-2995 (1997)). Se observaron resultados similares con la protema VP1 del virus del polioma expresado en E. coli (Salunke et al, Biophys. J., 56:887-900 (1989)).

Hasta la fecha, no se ha informado de un metodo eficaz in vitro para el desmontaje y posterior montaje cuantitativo de las VPL del virus del papiloma. Dicho metodo sena muy ventajoso si permitiera ventajosamente la preparacion de VLP mas estables y/u homogenas del virus del papiloma. Esto sena beneficioso, ya que tanto la homogeneidad como la estabilidad son preocupaciones significativas en la preparacion de las vacunas, y en su caracterizacion durante la fabricacion. Ademas, la capacidad de desmontar y volver a montar las VLP tiene aplicaciones importantes en la purificacion de VLP. Las protemas L1 del VPH expresadas en celulas eucariotas se ensamblan espontaneamente para formar VLP, como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, la mayona de procedimientos para purificar las protemas se han disenado para purificar protemas mas pequenas que las VLP de 55 nm y 20 millones de dalton. El potencial para desmontar las VLP eextrafdas de celulas eucariotas hasta el nivel de capsomeros L1 o inferior, purificar los componentes mas pequenos usando tecnicas convencionales y, a continuacion, volver a montarlos para formar los VLP en el estado del proceso de purificacion deseado es algo muy potente, y en la actualidad se utiliza para la purificacion de las VLP del VPH-16jr , como se describe a continuacion (compuestas de una forma mutada de la protema VPH-16 L1 de la que se han borrado 34 aminoacidos del extremo C). Finalmente, la capacidad para desmontar y volver a montar las VLP in vitro permite empaquetar los compuestos exogenos deseados dentro de la VLP montada de nuevo.

Los intentos anteriores para desmontar las VLP del papiloma incluyeron experimentos basados en un trabajo anterior realizado sobre el virus del papiloma, un papovirus relacionado, donde se mostro que tanto la reduccion de disulfuros como la quelacion de cationes eran esenciales para el desmontaje del virion (Brady et al, J. Virol., 23:717724 (1977)). Sin embargo, en el caso de las VLP del VPH, se demostro que niveles bajos de agente reductor (DTT 1-10 mM) que proporciona el desmontaje optimo del virus del polioma en presencia de bajos niveles de agentes quelantes (por ejemplo, EGTA 0,5-10 mM) solo fueron ligeramente eficaces para el desmontaje de la VLP del virus del papiloma (vease la Tabla 1, Li et al, J. Virol., 71:2988-2995 (1997)). Por el contrario, se ha demostrado que VLP

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de L1 del HPH-11 parcialmente tripsinizadas se desmontan de una forma eficaz en dichas condiciones (Li et al, J. Virol., 71:2988-2995 (1997)). Sin embargo, esto tiene desventajas, ya que el uso de proteasa puede dar como resultado efectos adversos, por ejemplo, la eliminacion de epftopos neutralizantes.

Tambien, Sapp y colaboradores demostraron que se podna conseguir el "desmontaje parcial" de las VLP del VPH- 33 mediante un tratamiento con el agente reductor en solitario (DTT 20 mM). Sin embargo, no se determino la descomposicion de la VLP (Sapp et al, J. Gen. Virol., 76:2407-2412 (1995)).

Como se ha descrito anteriormente, el montaje de la capsida del VPH requiere el plegado correcto de la protema L1. Sin embargo, los factores adicionales significativos para la formulacion y la estabilidad de las VLP no se han elucidado todavfa. Con respecto a lo anterior, se sabe de forma general que el montaje de VLP se puede ver afectado por numerosos factores. Por ejemplo, los factores y las condiciones conocidas por afectar el montaje de otros virus incluyen, a modo de ejemplo: pH, fuerza ionica, modificaciones posteriores a la traduccion de las protemas de la capsida, enlaces disulfuro, y enlaces de cationes divalentes, entre otros. Por ejemplo, la importancia de los enlaces de cationes, espedficamente calcio, en el mantenimiento de la integridad del virion, se ha desmostrado para el virus del polioma (Brady et al, J. Virol., 23:717-724 (1977)), y para el rotaovirus (Gajardo et al, J. Virol., 71:2211-2216 (1997)). Analogamente, los enlaces disulfuro parecen ser significativos para estabilizar el virus del polioma (Walter et al, Cold Spring Har. Symp. Quant. Biol., 39:255-257 (1975); Brady et al, J. Virol., 23:717724 (1977)); y los virus SV40 (Christansen et al, J. Virol., 21:1079-1084 (1977)). Tambien, se sabe que factores como el pH y la fuerza inonican afectan la estabilidad de la capsida del virus del polioma, afectando supuestamente a las interacciones electroestaticas (Brady et al, J. Virol., 23:717-724 (1977); Salunke et al, Cell, 46:895-904 (1986); Salunke et al, Biophys. J., 56:887-900 (1980)). Analogamente, tambien se sabe que las modificaciones posteriores a la traduccion de algundas protemas de la capsida vftica pueden afectar a la estabilidad y al montaje; por ejemplo, glicosilacion, fosforilacion y acetilacion (Garcea et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3613-3617 (1983); Xi et al, J. Gen. Virol., 72:2981-2988 (1991)). De esta forma, existen numerosos factores interrelacionados que pueden afectar a la estabilidad de la capsida, el desmontaje y el remontaje, que vanan ampliamente incluso para virus relacionados.

Por tanto, existe una necesidad en la tecnica de elucidar los factores que afectan al desmontaje y remontaje de las VLP del virus del papiloma. Ademas, basado en lo anterior, existe una necesidad en la tecnica de un metodo eficaz in vitro para desmontar y volver a montar VLP del virus del papiloma que de como resultado VLP que tengan buena homogeneidad, estabilidad y propiedades inmunogenas, por ejemplo, las que esten presente en los epftopos conformacionales y, mas especialmente, en los epftopos neutralizantes expresadas en la superficie de viriones del virus del papiloma natural intacto. Ademas, existe una necesidad significativa de metodos para desmontar y montar las VLP del virus del papiloma que eviten los problemas del despontaje parcial de la VLP y que eviten el uso de la proteasa utilizada en los metodos de la tecnica anterior para generar VLP del virus del papiloma.

Objetos de la invencion

De esta forma, es un objeto de la invencion resolver los problemas de la tecnica anterior.

Mas espedficamente, es un objeto de la invencion proporcionar un metodo novedoso para desmontar y volver a montar las VLP del virus del papiloma.

Aun mas espedficamente, es un objeto de la invencion proporcionar un metodo novedoso para desmontar y volver a montar las VLP del virus del papiloma humano.

Es tambien un objeto de la invencion proporcionar un metodo que permita el desmontaje y remontaje cuantitativo de las VLP del virus del papiloma en grandes cantidades.

Es objeto de la invencion de la invencion proporcionar composiciones que comprenden VLP del virus del papiloma, preferentemente composiciones que comprenden VLP del virus del papiloma humano de calidad mejorada, por ejemplo, de homogeneidad, inmunogenicidad y/o estabilidad mejoradas.

Es objeto de la invencion proporcionar un medio mejorado para purificar VLP mediante la incorporacion del desmontaje/remontaje de VLP al proceso de purificacion.

Es un objeto adicional de la memoria descriptiva proporcionar un metodo para encapsular restos deseados en VLP del virus del papiloma, por ejemplo, agentes terapeuticos o diagnosticos.

Es otro objeto de la memoria descriptiva proporcionar VLP del virus del papiloma, preferentemente VLP del virus del papiloma humano, que contienen agentes diagnosticos o terapeuticos deseados, por ejemplo, agentes antineoplasicos o agentes antivirales.

Es otro objeto adicional de la memoria descriptiva generar "pseudoviriones" de tipos del virus VPH donde no estan disponibles cantidades de viriones del VPH no estan actualmente disponibles mediante la encapsulacion de los componentes exogenos en las VLP del VPH construidas con las protemas L1 y L1/L2 de dicho VPH del virus del

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papiloma, en particular el ADN correspondiente al genoma de dicho VPH o fragmento del mismo, o un ADN que codifica un marcador seleccionable tal como la p-galactosidasa.

Es otro objeto adicionalm de la memoria descriptiva proporcionar un novedoso metodo para suministrar un resto deseado, por ejemplo, un ADN, a las celulas deseada donde el vehmulo de administracion de dicho resto, por ejemplo, ADN de sentido directo o de sentido contrario, comprende una VLP del virus del papiloma.

Sigue siendo otro objeto de la presente memoria descriptiva utilizar pseudoviriones basados en VLP del HPH en un ensayo in vitro para analizar la eficacia de potenciales vacunas del VPH que analizan la capacidad de los anticuerpos neutralizantes para inhibir la insercion de un ADN encapsulado en el mismo en celulas normalmente infectadas por dicho VPH.

Breve descripcion de la invencion

Por tanto, la invencion se refiere en general a un metodo novedoso para desmontar y volver a montar las VLP del virus del papiloma, preferentemente las VLP del virus del papiloma humano in vitro.

Mas espedficamente, la presente invencion proporciona un metodo para producir partmulas analogas a virus (VLP) del virus del papiloma humano (VPH), que comprende:

(i) purificar una protema L1 del VPH expresada de forma recombinante desmontada en presencia de al menos un agente reductor de sulfhidrilo que mantiene dicha protema L1 del VPH expresada de forma recombinante en una forma desmontada; y

(ii) montar dicha protema L1 del VPH expresada de forma recombinante en partmulas analogas a virus (VLP) del virus del papiloma humano mediante la eliminacion u oxidacion de dicho al menos un agente reductor.

Como se ha descrito anteriormente, las VLP del virus del papiloma estan constituidas principalmente de una protema estructural L1, que es estable en forma de capsomeros pentamericos o capsidas compuestas por 72 capsomeros. Dichas VLP pueden tambien comprender la protema L2. En particular, mediante la seleccion cuidadosa de las condiciones experimentales, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que el desmontaje cuantitativos de las VLP del virus del papiloma (casi en su totalidad hasta el nivel de los capsomeros o inferior) y el posterior remontaje, se pueden conseguir de forma consistente mediante la exposicion prolongada de las VLP a una solucion que comprende una concentracion elevada de al menos un agente reductor de sulfhidrilo, preferentemente contenido en tampones de fuerza ionica de moderada a baja. Espedficamente, el metodo sujeto da como resultado composiciones que contienen VLP remontadas de muy alta homogeneidad, que predominantemente contienen partmulas en el intervalo de VLP de tamano completo, con un promedio de 56,5 ± 7.0 nm (n=15) con muy poca cantidad de VLP ensambladas parcialmente o complejos de tamano inferior. Los rendimientos son tambien muy altos, es decir, cuantitativos, con un promedio de 80-90 % en terminos de la protema L1 total desde el material de partida a las VLP remontadas en condiciones de desmontaje optimas. Ademas, esencialmente, todos los capsomeros anteriormente disociados se vuelven a montar para producir VLP solubles y filtrables de tamano completo.

Se ha descubierto inesperadamente que el uso de tales condiciones da como resultado composiciones de VLP del virus del papiloma de homogeneidad potenciada (con respecto al material de partida de VLP y a las composiciones de VLP disponibles), es decir, composiciones homogeneas constituidas casi completamente por VLP del virus del papiloma que tienen 55 nm, 150 S. Ademas, se ha demostrado que estas vLp homogeneas tienen epftopos conformacionales neutralizantes del VPH, un requisito previo de una vacuna profilactica eficaz basada en VLP del VPH. Tambien, los inventores han descubierto sorprendentemente que los quelantes no potencian el desmontaje de las VLP, y ademas pueden inhibir el desmontaje de capsomeros en VLP. Como se describe con mas detalle infra, estos hallazgos fueron sorprendentes porque un papovirus relacionado, un poliomavirus, ha demostrado que la exposicion a bajos niveles de agente reductor de sulfhidrilo y quelacion de los iones calcio fueron esenciales para el desmontaje del virion. Por el contrario, dichas condiciones solamente son ligeramente eficaces para el desmontaje de las VLP del papiloma.

Como se indica, se ha descubierto que el capsomero del virus del papiloma y las composiciones de VLP, producidas de acuerdo con la invencion, presentan epftopos espedficos de la estructura (conformacionales), en particular epftopos neutralizantes, que aparecen sobre la superficie de los viriones intactos del virus del papiloma. Se ha demostrado tanto mediante su reactividad con anticuerpos neutralizantes y anticuerpos dirigidos contra L1 del virus del papiloma espedficos de estructura en un ensayo ELISA, y por su capacidad de inducir la smtesis de anticuerpos que neutralizan la infeccion por el virus del papiloma en un ensayo de infeccion RT-PCT. Por tanto, son muy adecuados para su uso como agentes profilacticos para prevenir la infeccion por el VP y con fines diagnosticos. Ademas, los metodos sujetos para el desmontaje y remontaje de VLP se pueden aplicar para diferentes grados de pureza de VLP. Esto permite el desmontaje de mezclas brutas de VLP, la purificacion de los componentes solubles mas pequenos de VLP (que es mas sencillo gracias a su tamano mucho menor), seguido por el remontaje en la etapa deseada del proceso de purificacion.

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Tambien, como se describe con mas detalle infra, los metodos sujeto proporcionan adicionalmente la introduccion de restos deseados, por ejemplo, ADN, protemas, peptidos, hormonas, radionucleidos, farmacos antineoplasicos y agentes antivmcos en las VLP durante el remontaje. Esto es ventajoso ya que dichas VLP se pueden utilizar como vehmulos de suministro (para la insercion de restos deseados en las celulas) y como "pseudoviriones" para evaluar la eficacia profilactica de las vacunas del virus del papiloma.

Los presentes inventores teorizan que el desmontaje de la VLP del virus del papiloma requiere una exposicion prolongada hasta niveles muy elevados de agentes reductores debido a la presencia de enlaces disulfuro estabilizantes, que probablemente estan muy profundos y son inaccesibles, y dicha exposicion de estos enlaces a los disolventes debido a las fluctuaciones estructural locales son muy infrecuentes. (Este fenomeno se describe con mayor detalle en la solicitud con n. ° de serie 08/888.050, presentada el 3 de julio de 1997). Aparentemente, tras una exposicion prolongada a concentraciones elevadas de agente reductor y a una fuerza ionica de moderada a baja, estos enlaces quedan accesibles con el tiempo.

Definiciones:

Protema principal de la capsida, o protema L1

Esto se refiere a la proteina estructural del virus del papiloma (VP) que constituye la parte principal de la estructura de la capsida del VP. Esta proteina se ha notificado en la preparacion de vacunas del VpH y como agente diagnostico.

Proteina secundaria de la capsida, o proteina L2

Esto se refiere a la proteina estructural del virus del papiloma que constituye una parte menor de la estructura de la capsida vmca del VP.

Particulas analogas a virus o VLP

Esto se refiere a las estructuras analogas a capsidas que son el resultado de la expresion y el montaje de una secuencia de ADN de la L1 del virus del papiloma, sola o combinada con una secuencia de ADN de la L2. Las VLP son morfologica y antigenicamente similares a los viriones autenticos. Las VLP se pueden producir in vivo, en celulas hospedadoras adecuadas, por ejemplo, celulas hospedadoras de mairnfero y de insecto, o se pueden formar espontaneamente tras la purificacion de protemas L1 recombinantes.

Pseudovirion

Esto se refiere a las VLP que contienen compuestos marcadores exogenos, compuestos de protemas L1 o L1 y L2 de un tipo de VP espedfico. Los pseudoviriones se pueden utilizar para someter a ensayo la eficacia de las sustancias, como los anticuerpos, para bloquear la union espedfica al virus y/o la recaptacion en celulas diana, en los casos donde no esta disponible un virus autentico.

Proteina L1 correctamente plegada

Esto se refire a la proteina L1 (tanto monomerica, en la forma de oligomeros pequenos (dfmeros-tetrameros) o capsomeros) que esta en una conformacion adecuada para su remontaje en VLP y que retiene epttopos presentes en capsidas vmcas o VLP.

Capsomeros

Esto se refiere a una configuracion oligomerica de la proteina L1 que esta constituido por pentameros de L1. Capsidas

Esto se refiere a la parte estructural del virus del papiloma que esta compuesto de capsomeros. Mas espedficamente, esta constituido por setenta y dos capsomeros en una estructura de icosahedro T=7.

Epitopo conformacional L1 del VPH

Esto se refiere a un epttopo expresado sobre la superficie de la proteina L1 correctamente plegada, que tambien se expresa por una proteina L1 de un tipo natural correspondiente del VPH. Los expertos en la materia aceptan normalmente que la presentacion de epitopos conformacionales es fundamental para la eficacia (como agentes profilacticos y diagnosticos) de inmunogenos de la proteina L1 de VPH.

Epitopo conformacional L1 del VPH neutralizante

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Esto se refiere a un epttopo expresado sobre la superficie de la protema L1 plegada correctamente, que tambien se expresa por una protema L1 de un correspondiente VPH infeccioso no natural, y que desencadena anticuerpos neutralizantes. Los expertos en la materia aceptan bien que la presentacion de epttopos conformacionales neutralizantes es fundamental para la eficacia (como agentes tanto como profilacticos como diagnosticos) de los inmunogenos de la protema L1 del VPH.

Anticuerpo conformacional

Esto se refiere a un anticuerpo que se une espedficamente a un epftopo expresado en la protema L1 plegada correctamente pero no en la protema L1 desnaturalizada.

Solucion de agente reductor de alta concentracion

Esto se refiere a una solucion que contiene una cantidad de al menos un agente reductor de sulfhidrilo, por ejemplo, glutation, p-mercaptoetanol o ditiotreitol que proporciona al menos un 70 % de desmontaje de las VLP del virus del papiloma, cuando las VLP se ponen en contacto entre ellas durante periodos de tiempo prolongados, al menos 2 horas, y mas preferentemente al menos 16 horas. La concentracion del agente reductor puede variar dependiendo del agente reductor concreto. En el caso del p-mercaptoetanol, esta cantidad sera preferentemente al menos 1 % por peso, mas preferentemente al menos 3-5 % en peso. En el caso del ditiotreitol, la cantidad sera preferentemente al menos aproximadamente 100 mM.

Exposicion prolongada o puesta en contacto de las VLP con la solucion de agente reductor de alta concentracion

Esto se refiere al tiempo en que las VLP estan en contacto con la solucion de agente reductor de alta concentracion que es suficiente para proporcionar al menos un 70 % del desmontaje de las VLP en capsomeros. Preferentemente, dicha exposicion prolongada dara como resultado 70-90 % de desmontaje y, optimamente, practicamente el desmontaje total de VLP. Este tiempo variara para los diferentes tipos de VP, y tambien puede depender de las celulas que expresan las VLP (material de partida), grado de pureza (presencia o ausencia de agregados), pH, y fuerza ionica. Adicionalmente, las VLP formadas a partir de protema L1 alterada o qmmicamente mutada, por ejemplo, una protema L1 truncada en su extremo C, puede desmontarse en condiciones mas suaves. En general, esta exposicion sera de al mentos 2 horas (en el caso de las VLP de VPH-16Tr), y mas tfpicamente mas prolongada, es decir, al menos de 12 horas, mas preferentemente al menos 16 horas (en el caso de las VLP de VPH-1l).

Descripcion detallada de las figuras

Figura 1: Analisis SDS/PAGE de la protema L1 de VPH-11 purificada. La protema se mezclo con tampon de preparacion de muestra en ausencia (hilera 1) o presencia (hilera 2) de DTT 2 mM t se sometio a ebullicion durante 2 minutos antes de la electroforesis en gel. A la izquierda se muestran las posiciones a las que migraron los patrones de peso (en Da x 10-3).

Figura 2: Analisis de cojines de sacarosa al 30% del desmontaje de VLP de VPH-11. Las preparaciones de VPH-11 se trataron a 4°C como se describe en el texto, y se tomaron las muestras en la parte superior (T) o inferior (B) del cojm de sacarosa antes de la electroforesis en gel. Grupo 1, material de partida purificado sin tratar de VLP de VPH-11 en PBS. Grupo 2, VLP incubadas con un 5 % de PME durante 16 horas. Grupo 3, VLP incubadas con un 5 % de PME durante 1 hora. Grupo 4, VLP incubadas con un 2 % de PME durante 16 horas. Grupo 5, VLP incubadas con un 0,5% de PME durante 16 horas. Grupo 6, VLP incubadas con DTT 10 mM, EDTA 5 mM durante 16 horas.

Figura 3: Analisis en gradiente lineal de sacarosa 5-20 % de VLP de VPH-11 desmontadas. Las VLP en PBS se incubaron con un 5 % de PME (a), o NaHCO3 200 mM, pH 9,6(b) durante 16 horas at 4°C y a continuacion se centrifugaron en un gradiente lineal de sacarosa 5-20 % como se describe en el texto. El gradiente se recogio en 25 fracciones (0,5 ml), y el aglomerado (P) se resuspendio en 0,5 ml de PBS. Se muestra una inmunotransferencia que demuestra la posicion de la protema L1 a traves del gradiente. Tambien se indican las posiciones de los picos a las que migran las posiciones de los patrones de sedimentacion cuando se analizan con gradientes diferenciados.

Figura 4: Analisis en gradiente lineal de sacarosa 10-65% de las VLP de VPH-11 en diversos estados de montaje. Una almuota de material de partida de VLP purificado (a) se incubo con un 5 % de PME durante 16 hras a 4°C (b). Una parte de las VLP tratadas con PME se volvieron a montar mediante dialisis en PBS-0,5 NaCl para eliminar el agente reductor (c). A continuacion, las muestras se centrifugaron en gradientes de sacarosa 10-65 % lineales como se describe en el texto. Cada gradiente se recogio en 12 fracciones (1 ml), y el aglomerado (P) se resuspendio en 1 ml de PBS. Se muestran las inmunotransferencias que demuestran las posiciones a las que migra la protema L1 en los diferentes gradientes. Tambien se indican las posiciones de los picos a las que migran las posiciones de los patrones de sedimentacion, como en la Fig. 3.

Figura 5: Micrograffas electronicas de las VLP de VPH-11 en diversos estados de montaje. Las VLP, tratadas como se ha descrito, se tineron con acido fosfotungstico al 2 %, se aplicaron a rejillas, y se fotografiaron con aumentos de 15-25,000 veces. a, material de partida de VLP purificado, b, VLP desmontadas hasta el nivel de capsomeros por incubacion con un 5 % de PME durante 16 horas t 4°C. c, VLP remontadas a partir de las VLP

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desmontadas mediante dialisis en PBS-0,5 NaCI, d, la region central de la imagen c a mayor ampliacion. Barra de escala a,c = 200 nm; b,d, = 100 nm.

Figura 6: Reaccion de las VLP intactas y desmontada con anticuerpos monoclonales espedficos de la estructura de VPH-11. Material de partida de VLP de L1 de VPH11 (A), VLP desmontadas mediante tratamiento con un 5 % de PME tanto sin (B) como con (C) dialisis posterior en PBS-0,5 M NaCl para eliminar el agente reductor, y las VLP desmontadas en presencia de carbonato 200 mM, pH 9,6 y a continuacion se dializaron en PBS-0,5 M NaCl (D) donde se unieron a los pocillos de las placas de microvaloracion. Los anticuerpos monoclonales espedficos de la estructura de VPH-11, H11.F1 (neutralizante de VPH-11; □) y H11.A3 (no neutralizante de VPH-11; •) se analizaron para determinar la inmunoreactividad respecto a los antigenos unidos en un ELISA como se describe en la seccion Materiales y metodos. La reactividad con el anticuerpo monoclonal AU1 (■), que reconoce un epftopo lineal encontrado en L1 de VPH-11, se utilizo como control para demostrar la union del antigeno a los pocillos de microvaloracion.

Figura 7: Comparacion de la capacidad del antisuero sensibilizados contra las VLP de VPH-11 iniciales purificadas, y las VLP remontadas, para neutralizar el virus VPH-11. El suero anti-VPH-11 se incubo con viriones de VPH-11 durante 60 min a 37°C antes de anadir las celulas HaCaT. Alternativamente, los viriones se anadieron a las celulas sin preincubacion con el suero. Seis dfas despues de la infeccion, las celulas se recogieron, y se extrajo el ARN total. Se utilizo un diez por ciento del ARN total para la transcripcion inversa, y un diez por ciento del ADNc resultante se utilizo seguidamente como molde de la PCR anidada usando cebadores espedficos del mensaje E1AE4 de VPH-11 tras corte y empalme. Los productos de la PCR se separaron en geles de agarosa al 2 %. Los geles se tineron con bromuro de etidio y se examinaron con luz UV para determinar la presencia de la banda de E1AE4 a -0,6 kb (a). La amplificacion mediante PCR de la p-actina se realizo para todas las muestras de ADNc como control interno (b). El tamano esperado de la banda de la p-actina es -0,6 kb. La hilera S contiene marcadores del tamano molecular. La hilera C representa las reacciones realizadas con ARN de celulas incubadas sin virus, y la hilera V representa las celulas incubadas con virus que no se preincubaron con suero. Como se esperaba, la banda E1AE4 se detecto en las celulas infectadas por virus, pero no en las celulas no infectadas. Las siguientes hileras conteman productos de la PCR procedentes de celulas infectadas con el virus que se habfan incubados con diluciones en serie log-10 de antisuero anti-VPH-11 (10'3-10'7) sensibilizado contra las VLP iniciales purificadas VPH-11 y las VLP remontadas, como se indica.

Figura 8: Comparacion SDS/Page de las VLP de VPH-16jr en estados montado (-PME) y desmontado (+PME, Ciclo 2), lo que indica la mayor pureza de las VLP purificadas en estado desmontado. La posicion a la que migra la protema L1 de VPH-16jr se indica mediante la flecha.

Figura 9: Analisis en gradiente lineal de sacarosa 5-20 % de las VLP de VPH-16jr desmontadas. Las VLP+PME del ciclo 2 finales purificadas (vease la Tabla 3) en PBS se incubaron con un 4 % de PME durante 16 horas a 4°C y a continuacion se centrifugaron en un gradiente lineal de sacarosa 5-20 % como se describe en la seccion de Metodos. El gradiente se recogio en 25 fracciones (0,5 ml), y el aglomerado (P) se resuspendio en 0,5 ml de PBS. Se muestra una inmunotransferencia, sondeada con el anticuerpo monoclonal espedfico de VPH-16, 16-E, que demuestra la posicion de la protema L1 a traves del gradiente. Tambien se indican las posiciones de los picos a las que migran las posiciones de los patrones de sedimentacion cuando se analizan con gradientes diferenciados.

Figura 10: Analisis en gradiente lineal de sacarosa 10-65% de las VLP de VPH-16jr en diversos estados de montaje. Una almuota de (a) material de partida de VLP purificado (+PME Ciclo 2; vease la Tabla 3) se incubo con un 4 % de PME durante 16 horas a 4°C (b). Una parte de las VLP tratadas con PME se volvieron a montar mediante dialisis en PBS-0,5 NaCl para eliminar el agente reductor (c). A continuacion, las muestras se centrifugaron en gradientes de sacarosa 10-65% lineales como se describe en el texto. Cada gradiente se recogio en 12 fracciones (1 ml), y el aglomerado (P) se resuspendio en 1 ml de PBS. Se muestran las inmunotransferencias, sondeadas con el anticuerpo monoclonal espedfico de VPH-16, 16-E, que demuestra las posiciones a las que migra la protema L1 en los diferentes gradientes. Tambien se indican las posiciones de los picos a las que migran las posiciones de los patrones de sedimentacion, como en la Fig. 9.

Descripcion detallada de la invencion

Como se ha descrito, la presente invencion se refiere de forma general a un metodo novedoso que proporciona un desmontaje muy eficaz de las VLP del virus del papiloma, es decir, un desmontaje de al menos un 70 %, mas preferentemente un desmontaje del 70-90 %, y lo mas preferiblemente, un desmontaje total de las VLP, que comprende una exposicion prolongada de las VLP del virus del papiloma que comprenden L1 o una combinacion de las protemas L1 y L2 a una solucion de agente reductor de sulfhidrilo de alta concentracion. En general, la concentracion del agente reductor sera de al menos un 1 % en peso, y mas preferentemente de aproximadamente un 3-5 % en peso, donde la solucion que contiene agente reductor tiene preferentemente una fuerza ionica que es como maximo de aproximadamente 0,5 y preferentemente menor.

Sin embargo, las concentraciones del agente reductor y la fuerza ionica pueden variar para los diferentes tipos del virus del papiloma, las celulas hospedadoras de las que se obtienen, las formas mutadas y/o qmmicamente alteradas de la protema L1, y la pureza. Mas espedficamente, los presentes inventores han elucidado las condiciones para el desmontaje maximo de las VLP purificadas in vitro, que proporciona un remontaje posterior eficaz. Se ha descubierto que una incubacion prolongada de las VLP del virus del papiloma con concentraciones

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relativamente elevadas de agentes reductores con fuerzas ionicas que son como maximo de 0,5 M, y mas preferentemente cercanas a una fuerza ionica fisiologica o inferiores, es a la vez necesaria y suficiente para generar capsomeros homogeneos solubles a partir de las VLP purificadas. Ademas, se ha descubierto que tras la eliminacion o, alternativamente, mediante oxidacion del agente reductor, se obtiene una poblacion definida de las VLP intactas adecuadamente dimensionadas.

Esto se ha demostrado de manera particular usando VLP de VPH-11 producidas en un sistema de baculovirus/celula de insecto, es decir, en celulas deTrichoplasia ni (High Five®) infectadas con un baculovirus recombinante que contiene la totalidad de la secuencia del ADN de la L1 de VPH-11. Sin embargo, basandose en estos resultados, es razonable concluir que se lograran resultados similares con las VLP de virus del papiloma producidas a partir de otros tipos y especies, en particular otros tipos de virus del papiloma humano. Esto es algo razonable, ya que numerosas protemas L1 del virus del papiloma han demostrado producir VLP cuando se expresan en sistemas de vectores de expresion recombinante.

Analogamente, es razonable esperar que se logren resultados similares usando las VLP del virus del papiloma comprendidas por una combinacion de las protemas L1 y L2, ya que parecen ser virtualmente identicas a las VLP fabricadas solamente con protemas L1.

[Sin embargo, suponiendo que la L2 tiene un papel estabilizante significativo, los presentes inventores reconocen que es posible que el desmontaje necesite el uso de mayores concentraciones de agente reductor, una exposicion mas prolongada al mismo, pH elevado y/o reducida fuerza ionica durante el desmontaje.] Ademas, se espera que los metodos sujeto sean adecuados para el desmontaje/montaje de las VLP obtenidas a partir de cualquier sistema de celulas hospedadoras que den como resultado la produccion de las VLP del virus del papiloma. Aunque los solicitantes reconocen que existen algunas diferencias entre las celulas hospedadoras, como se ha descrito supra, se ha notificado que muchas celulas hospedadoras expresan las VLP del las VLP en forma de las VLP.

En general, el material de partida de VLP deseado se producira en un sistema de celula hospedadora adecuado, por ejemplo, un sistema de baculovirus/celula de insecto, del que se extraera por metodos conocidos. La tecnica de extraccion dependera de factores tales como las celulas hospedadoras espedficas utilizadas, la concentracion, si permanece intracelular o se secreta al medio, entre otros factores.

El desmontaje de las VLP se puede realizar a diferentes niveles de pureza de las VLP. Cuando se realiza junto con la purificacion, las VLP se extraen de las celulas, se desmontan, se purifican con tecnicas convencionales, y se vuelven a montar con el grado deseado de pureza. En los casos en que las VLP se utilizan para empaquetar componentes exogenos, o cuando el desmontaje/remontaje se realiza para mejorar la homogeneidad del producto final, las VLP utilizadas seran de una pureza bastante elevada. En estos casos, las VLP utilizadas en el desmontaje seran preferentemente al menos un 10-30% en peso, mas preferentemente un 50% en peso, y lo mas preferentemente al menos un 70-90 % en peso. Los metodos para determinar la pureza de las VLP son bien conocidos, e incluyen metodos desitometricos SDS-PAGE.

Como se describe detalladamente infra en la seccion de materiales y metodos, la presente invencion desarrolla un ensayo de cribado rapido para el estudio del desmontaje de las VLP que utiliza un sistema en gradiente de sacarosa. En este sistema, el aglomerado con las VLP intactas pasa por un cojm de sacarosa al 30 %, mientras que los capsomeros no agregados, los oligomeros de L1 mas pequenos, o los monomeros de L1, se quedan en la parte superior del cojm. De esta forma, este metodo de ensayo es beneficioso ya que facilita la identificacion precisa de las condiciones que dan como resultado el maximo desmontaje de las VLP.

En general, se ha descubierto que el desmontaje maximo de las VLP requiere una exposicion prolongada de las VLP no agregadas a una solucion que contiene una concentracion elevada de un agente reductor de sulfhidrilo. Como se ha expolicado anteriormente, una exposicion prolongada es la duracion suficiente para dar como resultado al menos un 70 % de desmontaje de las VLP, mas preferentemente un 70-90 % de desmontaje de las VLP, y de forma virtualmente ideal, el desmontaje completo de las VLP. En el caso de las VLP de Li de VPH-11 recombinante producidas en el sistema de celulas de insecto ilustrado, el desmontaje maximo se produjo transcurridas aproximadamente 16 horas a 4°C (usando una solucion que contema un 5 % en peso de p-mercaptoetanol). Sin embargo, dichos tiempos de exposicion se pueden reducir usando otros materiales de partida de las VLP, diferentes condiciones de pH, mayores concentraciones del agente reductor, y menores fuerzas ionicas. Por ejemplo, se ha descubierto [no se muestran los resultados] que se puede realizar un desmontaje sustancial de las VLP formadas mediante una forma truncada en el extremo C de la protema L1 de VPH-16 mediante la exposicion de dichas VLP a una solucion de p-mercaptoetanol (4 %) tras aproximadamente 2 horas a 4°C.

El metodo de desmontaje de las VLP sujeto ha demostrado ser eficaz usando p-mercaptoetanol y ditiotreitol como agentes reductores. Sin embargo, se espera que otros agentes reductores conocidos proporcionen resultados similares. Los ejemplos de agentes reductores adecuados utiles en la invencion incluyen glutation, p- mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritritol, cistema, sulfuro de hidrogeno, y mezclas de los mismos.

Como se indica, el presente metodo pone en contacto las VLP con una solucion que tiene una concentracion

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elevada de un agente reductor de sulfhidrilo. En el presente documento, esto se define como una concentracion de agente reductor que da como resultado un desmontaje sustancial de las VLP, es decir, al menos un 70 %, preferentemente al menos un 70-90 %, y mas preferentemente un desmontaje virtualmente total de las VLP, tras una exposicion prolongada.

Estas concentraciones elevadas del agente reductor variaran dependiendo de los agentes reductores adecuados, o combinacion de los mismos. En el caso del p-mercaptoetanol, se ha descubierto que una concentracion de al menos aproximadamente un 5 % en peso (713 mM) da como resultado un desmontaje optimo de las VLP de la L1 del VPH- 11 a una fuerza ionica fisiologica. Concentraciones inferiores de agente reductor y periodos de exposicion reducidos dan como resultado un desmontaje de VLP menos eficaz. Por ejemplo, se ha descubierto que soluciones de p- mercaptoetanol al 4 % tambien proporcionan un desmontaje eficaz (al menos un 70 %).

Se ha descubierto tambien que la fuerza ionica es un parametro importante en el metodo de desmontaje. Preferentemente, el desmontaje se realizara con una solucion que tenga una fuerza ionica que sea como maximo de 0,5, y preferentemente menor, mas preferentemente el desmontaje se realizara a una fuerza ionica aproximadamente "fisiologica" (es decir, 0,15 NaCl) o inferior. Se ha descubierto que fuerzas ionicas mayores vuelven menos eficaz el metodo de desmontaje de las VLP. En general, la fuerza ionica sera como maximo de aproximadamente 0,5, mas preferentemente de como maximo aproximadamente 0,25, y lo mas preferible como maximo de aproximadamente 0,15.

Tambien se ha descubierto que la presencia de agregacion de las VLP tiene efectos negativos sobre el desmontaje. Este efecto se puede evitar por la eliminacion del material agregado, o potencialmente se puede obviar mediante una exposicion mas prolongada de las VLP a la solucion de agente reductor de concentracion elevada. Esto ocurre probablemente debido a que los enlaces disulfuro estan muy profundos y por tanto son inaccesibles para el agente reductor cuando hay agregados, evitando de esta forma el desmontaje.

Analogamente, como se ha comentado, se ha descubierto sorprendentemente que los quelantes, incluso en altas concentraciones, no tienen un efecto significativo sobre el desmontaje de las VLP del VPH-11. Esto se demostro usando EGTA y EDTA, ambos quelantes bien conocidos, solos y en combinacion con ditiotreitol. Como se ha descrito anteriormente, esto es sorprendente, ya que se habfa notificado que los agentes quelantes eran necesarios en el desmontaje de las VLP de un papovirus.

Adicionalmente, se ha descubierto que el tampon carbonato (NaHCO3 0,2 M pH 9,6) produce un desmontaje significativo de las VLP de VPH-11. Sin embargo, a diferencia del desmontaje inducido por una exposicion prolongada a agentes reductores de sulfhidrilo, no fue posible volver a montar las VLP tratadas con carbonato. Se teoriza que el tratamiento con carbonato desnaturaliza parcialmente la protema L1. Esto demuestra que solamente aquellos metodos (tales como la exposicion prolongada a concentraciones eficaces de agentes reductores de sulfhidrilo) que desmontan las VLP manteniendo al mismo tiempo la estructura de la protema L1 plegada correctamente producira material que sea adecuado para olver a montarse en VLP solubles de tamano completo.

Como se indica el desmontaje sujeto de las VLP de VPH-11 da como resultado capsomeros de gran homogeneidad que presentan epftopos conformacionales neutralizantes, como se demuestra por su reactividad con anticuerpos monoclonales conformacionales y neutralizantes producidos contra el virus del papiloma particular (se ha ilustrado el VPH-11). Ademas, en condiciones optimas, el metodo sujeto da como resultado una composicion donde las VLP parecen estar completamente descompuestas en capsomeros. Inversamente, el desmontaje sujeto de las VLP de VPH-16-rr parece dar como resultado una mezcla de capsomeros, oligomeros mas pequenos de L1 y monomeros de L1. Sin embargo, esta mezcla de oligomeros de L1 es tambien capaz de volverse a montar de forma cuantitativa. Esto indica que el metodo sujeto proporciona la protema L1 plegada correctamente, en la forma de capsomeros, oligomeros mas pequenos de L1 o monomeros de L1, que es adecuado para volver a montar las VLP.

Como se ha descrito, una ventaja particular de la invencion es que estos capsomeros se pueden volver a montar cuantitativamente en las VLP simplemente por eliminacion de la solucion del agente reductor. La eliminacion del agente reductor se puede realizar por diferentes metodos, por ejemplo, dialisis o cromatograffa en columna. Alternativamente, la adicion de un exceso de oxidantes puede promover potencialmente la formacion posterior de los enlaces disulfuro adecuados, conduciendo al remontaje de las VLP. Como se ha descrito anteriormente, el remontaje se ve afectado por la integridad estructural del material de partida de la protema L1 plegada correctamente. Tambien, la solubilidad del material de partida afecta el remontaje, ya que el material agregado no se vuelve a montar cuantitativamente.

En general, el remontaje se llevara a cabo por eliminacion del agente reductor de sulfhidrilo o por adicion de oxidantes y exposicion del material de partida de protema L1 plegada correctamente a condiciones de fuerza ionica mayor, por ejemplo, al menos 0,5 o mayor. Mayores concentraciones de sal actuan estabilizando las VLP. Sin embargo, la adicion de agentes quelantes tiene el efecto contrario, es decir, inhibe moderadamente el remontaje.

Sorprendentemente, dicho remontaje da como resultado VLP que son mucho mas homogeneas en lo que respecta al tamano de partmula que el material de partida de VLP. Esto se ha demostrado por comparacion con el material de

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partida de VLP y el producto de VLP vuelto a montar en gradientes de sacarosa 10-65 % lineales, y mediante el examen con el microscopio electronico. Predominantemente, se detectaron partmulas en el intervalo de las VLP de tamano completo, con un promedio de 56,5 ± 7,0 nm, con muy pocas VLP parcialmente montadas, o complejos de tamano inferior. Tambien, los rendimientos son muy altos, con un promedio de aproximadamente 80-90 % en terminos de la relacion de protema L1 total desde el material de partida a las VLP remontadas usando condiciones de remontaje optimas. Esencialmente, todo el material de partida desmontado parece reformularse en VLP solubles y filtrables de tamano completo. Igualmente, estas VLP muestran epftopos conformacionales neutralizantes que aparecen en la superficie de los viriones autenticos del virus del papiloma y desencadenan anticuerpos neutralizantes potencialmente como el material de partida de VLP.

Aunque estos resultados son novedosos e inesperados, lo que no se esperaba, basandose en las ensenanzas de la solicitud, que un experto en la materia pudiera conseguir rendimientos de VLP incluso mayores variando la concentracion de protemas, la fuerza ionica y/o la cinetica.

Como se ha descrito, la presente memoria descriptiva proporciona ademas metodos para producir las VLP del virus del papiloma en cuyo interior se ha encapsulado un resto o restos deseados. Esto se llevara a cabo generalmente mediante las siguientes etapas:

(i) obtener las VLP de un virus del papiloma deseado, que estan constituidas por la protema L1 o una combinacion de las protemas L1 y L2;

(ii) desmontar dichas VLP poniendo en contacto dichas VLP con una solucion que contiene una alta concentracion de un agente reductor de sulfhidrilo que tiene una fueraza ionica que es como maximo 0,5;

(iii) poner en contacto las VLP desmontadas con una solucion que contiene un resto a encapsular en su interior, y que opcionalmente tambien contiene la protema L2 purificada (por ejemplo, si las VLP desmontadas no comprenden la protema L2); y

(iv) volver a montar dichas VLP desmontadas por eliminacion del agente reductor de sulfhidrilo o por adicion de un exceso de oxidante, produciendo de esta forma las VLP que contienen el resto o restos deseados.

Las etapas de desmontaje y montaje se llevan a cabo como se ha descrito anteriormente, es decir el desmontaje se realiza mediante el uso de altas concentraciones agentes reductores de sulfhidrilo, tfpicamente al menos 1 % en peso, o mayores, y durante periodos prolongados, es decir, al menos 2 horas, y tfpicamente mas tiempo, por ejemplo, al menos 16 horas. Como se ha descrito, el tiempo de exposicion y la concentracion del agente reductor se ven afectados por el tipo de VLP del virus del papiloma, el sistema de celula hospedadora donde se producen, las mutaciones en la protema L1 (por ejemplo, truncamientos en el extremo C), nivel de pureza, si hay agregados presentes, y potencialmente si las VLP comprenden L1 o una combinacion de L1 y L2. El remontaje se produce tras la eliminacion o la oxidacion del agente reductor de sulfhidrilo.

Como se ha descrito anteriormente, aunque es razonable suponer que las VLP que comprenden L1 y L2 se desmontaran en condiciones similares a las VLP basadas en L1, la protema L2 puede tener una funcion de estabilizacion. De esta forma, el desmontaje de las VLP que comprenden L1 y L2 puede requerir potencialmente mayores concentraciones de agente reductor, tiempos de exposicion mas prolongados, una fuerza ionica reducida, un pH elevado, o una combinacion de los mismos. Alternativamente, las VLP constituidas completamente por protemas L1 del VP se pueden desmontar como se ensena en el presente documento, y la protema L2 purificada (producida por metodos recombinantes) se puede anadir durante la etapa de remontado.

Los restos que se pueden encapsular en las VLP incluyen restos terapeuticos y diagnosticos, por ejemplo, secuencias de acidos nucleicos, radionucleidos, hormonas, peptidos, agentes antivmicos, agentes antitumorales, agentes moduladores del crecimiento celular, inhibidores del crecimiento celular, citoquinas, antfgenos, toxinas, etc.

Las VLP sujeto, que contienen un resto deseado encapsulado en su interior, tras su administracion a un hospedador deseado, preferiblemente humano, deberan capturarse por celulas normalmente infectadas por el virus del papiloma concreto, por ejemplo, celulas epiteliales, queratinocitos, etc., proporcionando de esta forma la internalizacion potencial de dicho resto encapsulado en el interior de dichas celulas. Esto puede facilitar el uso de las VLP sujeto para terapia (en contraposicion a su uso profilactico) porque posibilita la administracion de un agente terapeutico a un sitio celular deseado, por ejemplo, un sitio de cancer de cuello de utero. Dado el fastidio que suponen los VP en general, esto puede proporcionar un medio muy selectivo para administrar restos deseados a celulas diana. Por ejemplo, puede proporcionar un medio de administracion de secuencias de acidos nucleicos, por ejemplo, un ADN que codifica un polipeptido terapeutico, o una secuencia de sentido contrario.

El resto o restos encapsulados, por supuesto, no deben afectar negativamente el montaje o la estabilidad de las VLP. Esto se puede determinar produciendo VLP que contienen el resto deseado y evaluando sus efectos, de existir, sobre el montaje y/o la estabilidad de las VLP.

En el caso de los ADN o ARN, la secuencia de acido nucleico encapsulada puede tener hasta 8 kilobases, el tamano del genoma del VP. Sin embargo, tfpicamente, las secuencias encapsuladas seran mas pequenas, por ejemplo, de aproximadamente1-2 kilobases. Tfpicamente, estos ADN codificaran un polipeptido deseado, por ejemplo, un

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polipeptido terapeutico, tal como una enzima, hormona, factor de crecimiento de tipo insulina, etc. Esta secuencia posteriormente estara unida operativamente a secuencias que faciliten la expresion de la misma en las celulas hospedadoras diana.

Otra aplicacion de las VLP que contienen ADN encapsulados es como "pseudoviriones". A este respecto, numerosos virus del papiloma, incluyendo los implicados en enfermedades humanas, son raros, no se pueden propagar facilmente vitro y no se pueden purificar facilmente a partir de una fuente de celulas humanas en cantidades que permitan su uso en ensayos de neutralizacion de anticuerpos. Esto es un problema, ya que evita o dificulta evaluar la factibilidad de las vacunas o los compuestos terapeuticos para la proteccion contra estos virus VPH espedficos. Los ejemplos de tipos de VPH para los que no hay existencias disponibles incluyen VPH31, 33, 35, y 45.

Los metodos de la presente memoria descriptiva debenan eliminar, o al menos reducir, estos problemas. Esencialmente, los "pseudoviriones" estaran construidos de auerdo con aquellos virus que comprenden las VLP que estan constituidas por la protema L1 o una combinacion de protemas L1 y L2 del VP concreto, y posteriormente se ha encapsulado en su interior una parte del genoma de dicho virus del papiloma o un ADN que codifica un marcador seleccionable.

Este pseudovirion se puede utilizar en un ensayo in vitro de "infectividad" en celulas para evaluar la eficacia de las correspondientes vacunas contra el VLP. Esencialmente, esto se realizara poniendo en contacto las celulas con dichos pseudoviriones. Estos pseudoviriones se deberan unidr a dichas celulas y permitir la insercion de dicho ADN. Posteriormente, la insercion de dicho ADN se puede evaluar por metodos conocidos, por ejemplo, metodos de hibridacion con la PCR, o basarse en la expresion del marcador seleccionable, por ejemplo, la p-galactosidasa.

Esto se realizara tanto en presencia como en ausencia de anticuerpos generados contra las protemas L1 o L2 espedficas del VPH concreto. Si la insercion se inhibe, como se determina por ejemplo basandose en la expresion reducida del marcador seleccionable, esto es una indicacion de que la protema L1 o la protema L2 actican la produccion de anticuerpos neutralizantes del virus.

La presente invencion es aplicable para producir las VLP de cualquier virus del papiloma y, en particular, cualquier virus del papiloma humano. Se han notificado muchos ADN de L1 y L2 del vPh en la bibliograffa, y estan a disposicion del publico (vease, por ejemplo, Baker, Sequence Analysis of Papillomavirus, Genomes, pp. 321-384; Long et al, patente de Estados Unidos n.° 5.437.931, Cole et al, J. Mol Biol., 193:599-608 (1987); Danos et al, EMBO J., 1:231-236 (1982); Cole et al J. Virol., 38(3):991-995 (1986)). Tambien, es bien sabido que los ADN de la L1 del VPH muestran una homologfa significativa. De esta forma, un ADN de la L1 del VPH deseado se puede obtener facilmente, por ejemplo, mediante la utilizacion de un ADN de la L1 del VPH o fragmento del mismo anteriormente notificado como sonda de hibridacion o como cebador durante la amplificacion mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). De hecho, se han clonado y expresado numerosos ADN de la L1 del VPH.

Preferentemente, el ADN de la L1 del VPH indicado en la presente invencion se derivara de un VPH que este implicado en cancer o condilomata acuminata, por ejemplo, VpH-16, VPH-18, VPH-31, VPH-33, VPH-35, VPH-39, VPH-45, VPH-51, VPH52, y VPH-56 que estan implicados en el cancer, y VPH-6, VPH-11, VPH-30, VPH-42, VPH- 43, VPH-44, VPH-54, VPH-55 y VPH-70, que estan implicados en las verrugas. Sin embargo, las VLP homogeneas sujeto se pueden producir a partir de cualquier ADN de la L1 del VPH deseado.

En general las secuencias seleccionadas de L1 y opcionalmente de L2 del VPH se expresaran en un sistema de celula hospedadora recombinante deseada, y se utilizara para producir las VLP del VPH para su desmontaje.

El hospedador y el vector de expresion seleccionados se cultivaran en condiciones que favorecen la produccion de las VLP. Esto dependera en gran medida del sistema hospedador seleccionado y de las secuencias reguladoras incluidas en el vector, pro ejemplo, si la expresion requiere induccion. Tras la expresion, las VLP del VPH se extraeran de las celulas hospedadoras. El medio de extraccion tambien dependera, en cierta medida, del sistema hospedador/vector.

Por ejemplo, si se selecciona un vector de expresion intracelular, las celulas hospedadoras deberan lisarse, y las VLP del VPH deberan recuperarse del lisado. Por el contrario, si el vector de expresion contiene secuencias que facilitan la secrecion, las vLp del VPH se pueden recuperar directamente del medio de cultivo. Los metodos para recuperar protemas homologas a partir de celulas hospedadoras recombinantes y medio de cultivo son bien conocidos en la tecnica.

Las secuencias de L1 del VPH se pueden expresar en cualquier celula hospedadora que proporcione la expresion de rendimientos recuperables de las VLP del VPH. Los sistemas hospedadores adecuados para la expresion de protemas recombinantes son bien conocidos e incluyen, a modo de ejemplo, bacterias, celulas de mairnfero, levaduras, y celulas de insecto. Un sistema de expresion preferido comprende el sistema de baculovirus/celula de insecto utilizado en los ejemplos, ya que este sistema proporciona altos rendimientos de protema. Sin embargo, las protemas L1 y L2 del VPH se pueden producir en otros sistemas, en particular bacterias y levaduras.

Los vectores adecuados para clonar la expresion de las secuencias de ADN que codifican la L1 del VPH sujeto son

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bien conocidos en la tecnica, y estan comercialmente disponibles. Ademas, tambien son bien conocidas las secuencias reguladoras para conseguir la clonacion y la expresion, por ejemplo, promotores, secuencias de poliadenilacion, potenciadores y marcadores seleccionables. La seleccion de las secuencias adecuadas para obtener rendimientos de protema recuperables es algo rutinario para el experto en la materia.

Se ha notificado la aplicacion de las VLP en vacunas profilacticas y productos de diagnostico para el VPH. Los capsomeros producidos por el desmontaje tambien pueden ser utiles, ya que se ha descubierto que tienen epttopos conformacionales neutralizante, e inducen anticuerpos neutralizantes. Las VLP sujeto pueden ser una ventaja para esto debido a su mayor homogeneidad y potencialmente, estabilidad.

Como se ha descrito, la presente invencion debera ser ampliamente aplicable a cualquier secuencia de L1 del VPH. Existe una variedad de tipos de VPH conocidos en la tecnica. Ademas, tipos concretos de VPH estan asociados con infecciones concretas tales como, verrugas planas, verrugas cutaneas, epidermodisplasia verruciformis, lesiones y cancer de cuello de utero. Se han identificado mas de 60 tipos distintos del VPH en lesiones clmicas mediante estudios de homologfa de secuencia de nucleotidos vmcos. Vease, por ejemplo, Jenson et al, En: Belshe, R. ed., Textbook of human virology, Second Edition, MASS:PSG, 1989:951 y Kremsdorf et al, J. Virol., 52:1013-1018 (1984). El tipo de VPH determina, en parte, el sitio de la infeccion, las caractensticas patologicas y el aspecto clmico, asf como la evolucion clmica de la correspondiente lesion.

Como se cree que hay poca o ninguna inmunidad cruzada para los tipos del VPH y la inmunidad para la infeccion es espedfica del tipo de VPH, sera necesario producir las VLP del VPH para cada tipo espedfico del VPH para el que se requiera proteccion o tratamiento. Sin embargo, debido a la homologfa entre las protemas y los genes de L1, se pueden utilizar tecnicas de hibridacion para aislar el gen L1 particular de interes. Las sondas de nucleotidos seleccionadas de las regiones de la protema L1 que se han demostrado que muestran homologfa de secuencia se pueden utilizar para aislar otros genes L1. Los metodos de hibridacion son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985); Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis et al, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); y Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, segunda edicion, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Alternativamente, se pueden utilizar metodos de PCR para amplificar los genes L1 o los fragmentos genicos (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos numeros 4.683.195; 4.683.202; y 4.800.159).

Las partmulas de virus tambien se pueden aislar para un tipo particular de virus del papiloma, clonarse el ADN, y aislarse las secuencias de acido nucleico que codifican las protemas L1. Se han notificado los metodos para aislar partmulas vmcas y clonar los ADN del virus (vease, por ejemplo, Heilman et al, J. Virology, 36:395-407 (1980); Beaudenon et al, Nature, 321:246-249 (1986); Georges et al, J. Virology, 51:530-538 (1984); Kremsdorf et al, J. Virology, 52:1013-1018 (1984); Clad et al, Virology, 118:254-259 (1982); DeVilliers et al, J. Virology, 40:932-935 (1981); y la solicitud de patente europea 0.133.123).

Alternativamente, se puede aislar la protema L1 de un virus del papiloma humano concreto, determinarse la secuencia de aminoacidos, y construirse las sondas de acido nucleico basandose en la secuencia de ADN prevista. Dichas sondas se pueden utilizar para aislar el gen L1 a partir de una biblioteca de ADN del virus del papiloma (veanse, por ejemplo, Suggs et al, PnAS, 78(11):6613-6617 (1981) y Young and Davis, PNAS, 80:1194 (1983)).

Como se descrito, la formacion de las VLP es algo sensible al tipo de celula donde se realiza la expresion. Por tanto, es ventajoso seleccionar sistemas que producen grandes cantidades de VLP como material de partida para el desmontaje de VLP. En genral, el sistema de expresion comprendera un vector que tenga la protema L1 de interes y las regiones reguladoras adecuadas, asf como una celula hospedadora adecuada.

Como se ha descrito, se utilizan preferentemente un vector baculovirus. Un sistema baculovirus tiene la ventaja de que un gran porcentaje de las celulas se puede inducir para expresar la protema debido al uso de la infeccion en lugar de tecnicas de transfeccion. Aunque el baculovirus es un virus de insecto y crece en celulas de insecto (Sf9), estas celulas conservan muchos de los mecanismos eucariotas para procesar protemas, incluyendo la glicosilacion y la fosforilacion, que pueden ser importantes para generar las protemas con la conformacion adecuada. Los sistemas de vector baculovirus son conocidos en la materia (vease, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experimental Bulletin, N.° 1555 (1987); Smith et al, Mol. Cell Biol., 3:2156-2165 (1985); Posse, Virus Research, 5:4359 (1986); y Matsuura, J. Gen. Virol., 68:1233-1250 (1987)). Tambien, se ha notificado que las celulas infectadas por baculovirus expresan protemas L1 del VPH que muestran la conformacion adecuada.

Para su expresion en un sistema de expresion adecuado, un gen L1 o un gen L1 modificado se une operativamente en un vector de expresion y se introduce en una celula hospedadora para permitir la expresion de la protema L1 por dicha celula. El gen con las regiones reguladoras apropiadas se proporcionara en la orientacion y marco de lectura correctos para permitir su expresion. Los metodos para la construccion de genes son conocidos en la materia (vease, en particular, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Ssegunda edicion, Cold Spring Harbor, NY (1989)), y las referencias citadas en el mismo.

Se puede emplear una amplia variedad de secuencias de transcripcion y de regulacion. Las senales se pueden

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derivar de fuentes vmcas, donde las senales reguladoras estan asociadas con un gen particular que tiene un alto nivel de expresion. Esto es, se utilizan promotores fuertes, por ejemplo, de origen vmco o de mairnfero. De esta forma, las condiciones optimas para llevar a cabo la invencion incluyen la clonacion del gen L1 en un vector de expresion que exprese un exceso de epttopos neutralizantes del virus dependientes de la conformacion de la protema L1 en celulas transfectadas o celulas diana infectadas.

La adecuabilidad de las VLP del VPH producidas de acuerdo con la invencion como vacunas o como agentes de diagnostico se confirma por la reaccion con anticuerpos o con anticuerpos monoclonales que reaccionan o reconocen epftopos conformacionales presentes en el virion intacto y en funcion de su capacidad para activar la produccion de un antisuero neutralizante. Los expertos en la tecnica conocen los ensayos adecuados para determinar si se producen anticuerpos neutralizantes. Esta es una caractenstica esencial de las VLP del VPH que se van a utilizar en las vacunas contra VPH. De esta forma, se puede verificar si las VLP del VPH desencadenaran la produccion de anticuerpos neutralizantes contra el VPH. De esta forma, se pueden probar otros vectores de expresion y sistemas de expresion para su uso en la invencion.

Como se ha descrito, las VLP producidas de acuerdo con los metodos de la presente invencion se pueden utilizar para detectar, diagnosticar, serotipado, y tratar la infeccion por el virus del papiloma. Cuando se usa para el diagnostico o el serotipado, las VLP de acuerdo con la invencion se pueden etiquetar usando una varidad de etiquetas y metodos de etiquetado. Los ejemplos de etiquetas que se pueden utilizar en la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, etiquetas enzimaticas, etiquetas radioisotopicas, etiquetas isotopicas no radiactivas, etiquetas fluorescentes, etiquetas de toxinas, y etiquietas quimioluminiscentes.

Los ejemplos de etiquetas enzimaticas adecuadas incluyen malato hidrogenasa, nucleasa de estafilococo, delta-5- esteroide isomerasa, levadura-alcohol deshidrogenasa, alfa-glicerol fosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa, acetilcolinesterasa, etc.

Los ejemplos de etiquetas radioisotopicas adecuadas incluyen 3H, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 211At, 212Pb, 47SC, y 109Pd.

Los ejemplos de etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen una etiqueta 152Eu, una etiqueta de fluorescema, una etiqueta de isotiocianato, una etiqueta de rodamina, una etiqueta de ficoeritrina, una etiqueta de ficocianina, una etiqueta de aloficocianina, una etiqueta de o-ftaldehndo, una etiqueta de fluorescamina, etc.

Los ejemplos de etiquetas de toxina adecuadas incluyen la toxina difterica, ricino, y toxina del colera. Los ejemplos de etiquetas quimioluminiscentes incluyen una etiqueta luminal, una etiqueta isoluminal, una etiqueta de ester de acridinio aromatico, una etiqueta de imidazol, una etiqueta de sal de acridinio, una etiqueta de ester de oxalato, una etiqueta de luciferina, una etiqueta de luciferasa, una etiqueta de Aequorina, etc.

Los expertos en la tecnica conoceran otras etiquetas adecuadas que se pueden utilziar de acuerdo con la presente invencion. La union de estas etiquetas a las VLP se puede llevar a cabo usando tecnicas convencionales normalmente conocidas del experto en la materia. Las tecnicas tfpicas se describen en Kennedy et all Clin. Chim. Acta, 70:1-31 (1976), y Schurs et al, Clin. Chim. Acta, 81:1-40 (1977). Las tecnicas de acoplamiento mencionadas en esta ultima son el metodo del glutaraldehndo, el metodo del peryodato, el metodo de la dimaleimida, el metodo del ester de m-maleimidobencil-N-hidroxi-succinimida, todos estos metodos se incorporan por referencia al presente documento.

La deteccion de los anticuerpos dirigidos contra el VPH usando las VLP sujeto se puede mejorar mediante el uso de transportadores. Los transportadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nilon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del transportador puede ser tanto soluble en determinada extension o insoluble para los fines de la presente invencion. El experto en la materia detectara otros muchos transportadores adecuados para su union a las protemas, o podra dilucidarlos mediante el uso de experimentacion rutinaria.

En un aspecto, la presente memoria descriptiva proporciona el desarrollo de vacunas VP. Las vacunas de la invencion incluiran una cantidad de las VLP del VPH sujeto suficiente para inducir la formacion de anticuerpos neutralizantes en el hospedador incluido en un transportador farmaceuticamente aceptable.

La administracion de las vacunas que contienen las VLP sujeto de acuerdo con la memoria descriptiva se puede llevar a cabo por cualquier medio farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, por via parenteral, local o sistemica, incluyendo a modo de ejemplo, la administracion oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, y topica. La forma de administracion depende de factores entre los que se incluyen la ruta natural de la infeccion. La dosis administrada dependera de factores entre los que se incluyen la edad, estado de salud, peso, tipo de tratamiento concurrente, de existir, y naturaleza y tipo del virus del papiloma humano particular. La vacuna se puede utilizar en una forma farmaceutica tal como capsulas, soluciones lfquidas, suspensiones o elixires, para administracion oral, o en formulaciones lfquidas esteriles tales como soluciones o suspensiones para uso parenteral o intranasal. Se utiliza

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preferentemente un transportador inerte inmunologicamente aceptable, tal como suero salino o una solucion salina tamponada con fosfato.

Las vacunas se administraran en cantidades terapeuticamente eficaces. Esto es, en cantidades suficientes para producir una respuesta inmunologica protectora. En general, las vacunas se administraran en dosis comprendidas entre aproximadamente 0,1 mg de protema hasta aproximadamente 20 mg de protema, mas generalmente de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 100 mg de protema. Se pueden administrar dosis simples o multiples.

El metodo de la presente invencion se puede utilizar en la preparacion de las VLP del VPH que contienen vacunas para prevenir la infeccion el virus del papiloma. Ademas, siguiendo los metodos de la invencion, se pueden fabricar vacunas de cualquier virus del papiloma espedfico del ser humano.

Puesto que mas de un tipo de VP puede estar asociado con las infecciones de VP, las vacunas pueden comprender las VLP del VPH estables derivadas de mas de un tipo de VP. Por ejemplo, como el VPH 16 y 18 estan asociados con carcinomas de cuello de utero, por tanto, una vacuna para la neoplasia de cuello de utero puede comprender las VLP del VPH 16; del VPH 18; o de ambos VPH 16 y 18.

De hecho, se sabe que una variedad de neoplasias estan asociadas con infecciones de VP. Por ejemplo, los VPH 3a y 10 se han asociado a verrugas planas. Se han notificado numerosos tipos del VPH asociados a la epidermodisplasia verruciformis (EV) incluyendo los VPH 3a, 5, 8, 9, 10, y 12. Se ha notificado que los VPH 1, 2, 4, y 7 estan asociados con verrugas cutaneas, y los VPH 6b, 11a, 13, y 16 estan asociados con lesiones de las membranas mucosas (vease, por ejemplo, Kremsdorf et al, J. Virol., 52:1013-1018 (1984); Beaudenon et al, Nature, 321:246-249 (1986); Heilman et al, J. Virol., 36:395-407 (1980); y DeVilliers et al, J. Virol., 40:932-935 (1981)). Asf, las formulaciones de vacuna sujeto pueden comprender una mezcla de las VLP montadas de nuevo derivadas de diferentes tipos de VPH dependiendo de la proteccion deseada.

Como se indica, las VLP del VPH de la invencion tambien se pueden utilizar para el serotipado y la incorporacion a kits de serotipado.

Para los ensayos serologicos, los kits comprenderan las VLP del VPH sujeto, y medios para la deteccion, tales como sustratos enzimaticos, anticuerpos marcados, y similares.

Habiendo descrito la invencion de una forma general, los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion y no se pretende que sean limitantes, salvo que se especifique de otra forma.

Ejemplos

Se usaron en los Ejemplos los siguientes materiales y metodos.

Materiales y metodos VLP del VPH-11

Para uso en los estudios del desmontaje de las VLP y del montaje posterior utilizando la protema pura, las protemas L1 del VPH-11 se expresaron heterologamente en celulas de Trichoplusia ni (High Five®) infectadas con baculovirus recombinantes que codifican el marco de lectura abierto de las L1 completas en la direccion 3' del promotor de la polihedrina como se ha descrito en (Ghim et al, In M.A. Stanley (ed.) Immunology of human papillomaviruses, Plenum, Nueva York, p. 147-153 (1993)). Se recogieron las celulas aproximadamente 72 horas despues de la infeccion, se aglomeraron mediante centrifugacion, y se congelaron. Para la preparacion de las VLP, la pasta celular se volvio a suspender en tampon de homogeneizacion (NaH2PO4 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, que contiene 10 |jg/ml de leupeptina, 1 jg/ml de aprotinina, and 1 |jg /ml de pepstatina A) y se liso en un microfluidizador (Microfluidics modelo HC8000/3A). A continuacion, el lisado homogeneizado se centrifugo a 100.000 x g durante 90 minutos y el aglomerado que contema las VLP del VPH-11 se volvio a suspender en PBS que contema CsCl (405 g/l). A continuacion, el lisado clarificado se centrifugo durante la noche a 83.000 x g y se recogio la banda de VLP. Las VLP se diluyeron en PBS-NaCl 0,5 M, y se distribuyeron en capas en un gradiente en etapas de dos componentes compuesto por un 30 % y un 63 % de sacarosa. Se centrifugaron los gradientes a 167.000 x g durante 3 horas, y la banda de VLP purificada se recogio en la interfase entre las soluciones del 30 % y el 63 % de sacarosa. A continuacion, se dializaron las VLP en los tampones seleccionados (tanto PBS, como PBS con NaCl anadido hasta una concentracion final de 0,3 M o 0,5 M), y se almacenaron a 4 °C. Se determino la concentracion de protema mediante el ensayo de Bradford (Bradford et al, Anal. Biochem., 72: 248-254 (1976)) utilizando albumina de suero bovino como protema de referencia, y se determino el contenido de L1 como se ha descrito (Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11553-11557 (1995)]. Partiendo de 25-30 g de pasta celular humeda, el protocolo anterior dio como resultado 15-25 mg de las VLP de VPH-11

VLP de VPH-16Tr

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Para uso en los estudios del desmontaje de las VLP y el montaje posterior durante la purificacion, las protemas L1 de HPV-16t (compuestas por una forma mutada de la protema Li del VPH-16 de la cual se han eliminado los 34 aminoacidos del extremo C) se expresaron en celulas High Five® como se ha descrito anteriormente. La pasta celular se volvio a suspender en tampon de extraccion (Tris 10 mM, Triton X-100 al 1,0%, pH 6,0), se mezclo mediante agitacion, y se centrifugo un tiempo corto a 1.000 x g. El aglomerado que contema las VLP del VPH-16t se volvio a suspender en Tris 20 mM, NaCl 0,1 M, tampon a pH 8,0, se sometio a vortizacion un tiempo corto, y se centrifugo a 3.000 x g durante 30 min. El sobrenadante se recogio, se filtro a traves de filtros de jeringa de 0,45 p de acetato de celulosa, y a continuacion se incubaron en presencia o ausencia de 4 % de pME durante >2 horas a 4°C antes de su uso en ensayos de purificacion en columna. Se aplico el sobrenadante filtrado clarificado (+/-PME) a diferentes resinas de intercambio ionico a valores de conductividad bajos (5-15 miliohms), se lavo con varios volumenes de columna de tampon de equilibrio y se eluyo con un gradiente creciente de NaCl. Para ensayar la utilidad de HIC para eliminar el ADN residual y los contaminantes de la protema, las fracciones que conteman el pico de la protema L1 elrnda de IEC se combinaron, se ajustaron a 0,7 M en sulfato de amonio y se aplicaron a una columna HIC equilibrada en el mismo tampon. La columna se lavo con varios volumenes de columna del tampon de equilibrio, y a continuacion se eluyo la protema L1 a partir de la columna HIC a una concentracion menor de sulfato de amonio. Los productos finales de los procesos de purificacion (+/-pME) se dializaron extensamente frente a PBS (NaCl 0,5 M) y se compararon en terminos de pureza, rendimiento, y ADN residual. La aparicion de las VLP se caracterizo mediante el microscopio de electrones y el analisis lineal en gradiente de sacarosa (vease a continuacion).

Centrifugacion en gradiente de sacarosa

Se utilizaron tres tipos de gradientes de sacarosa en estos experimentos. En primer lugar, se uso la centrifugacion en cojines de sacarosa al 30 % para identificar condiciones que favorecieran el desmontaje de las VLP en componentes solubles. 100-200 pl de mezclas de reaccion que conteman las VLP (50-100 pg de protema total) mas o menos agentes perturbadores potenciales se distribuyeron en capas en la parte superior de tubos de centnfuga de 5 ml con 4,8 ml de sacarosa al 30 % (p/p en PBS-NaCl 0,5 M) y se centrifugaron a 197.000 x g durante 2 horas a 40 °C en un rotor basculante. Se tomo una almuota de 50 pl de la parte muy superior del tubo, y se mezclo con un tampon de preparacion de muestras 2X Laemmli (Laemmli, U.K., Nature, 227:680-685 (1970)). El resto del cojm de sacarosa al 30 % se retiro mediante una pipeta, y el "aglomerado" (normalmente ninguno era visible) se volvio a suspender en 100 pl de tampon de preparacion de muestras 1X Laemmli. A continuacion, se determino la presencia de protema L1 del VPH-11 en la parte superior o la parte inferior del cojm de sacarosa al 30 % mediante sDs/PAGE y se cuantifico la cantidad relativa de L1 mediante el analisis de los geles digitalizados. En segundo lugar, se determino el estado de las VLP desmontadas mediante centrifugacion de tasa zonal a traves de gradientes de sacarosa al 5-20% lineales. Las VLP desmontadas (100-200 pg de protema total en 400 pl) se distribuyeron en capas en la parte superior de gradientes de 11,6 ml preformados compuestos por sacarosa al 5-20% (p/v en PBS.NaCl 0,5 M), y se centrifugaron a 111.000 x g durante 24 horas a 4,4 °C en un rotor basculante. Las fracciones (0,5 ml) se recogieron a traves del gradiente, y el "aglomerado" (normalmente ninguno era visible) se volvio a suspender en 0,5 ml de PBS mediante homogeneizacion Dounce. Se determino la posicion de la protema L1 del VPH-11 a traves del gradiente mediante inmunotransferencia. Se calibraron los gradientes utilizando protemas patron con coeficientes de sedimentacion establecidos (E. coli p-galactosidasa, 19 S; catalasa de hugado de bovino, 11,3 S; albumina de suero de bovino, 4,3 S) y el porcentaje en las fracciones se determino mediante refractometna.

En tercer lugar, se determino el estado de las VLP iniciales desmontadas y montadas posteriormente mediante centrifugacion de tasa zonal a traves de gradientes lineales de sacarosa al 10-65%. La protema L1 del VHP-11 (100-200 pg de protema total en 400 pl) en diferentes estados de montaje se distribuyeron en capas en la parte superior de gradientes de 11,6 ml preformados compuestos por sacarosa al 10-65 % (p/v en PBS.NaCl 0,5 M), y se centrifugaron a 188.000 x g durante 2,5 horas a 40 °C en un rotor basculante. Se recogieron los gradientes (en fracciones de 1,0 ml), se analizaron, y se calibraron como anteriormente, con el parvovirus B19 (70 S) y se usaron las VLP de L1 del VPH-18 (160 S) como patrones de calibracion adicionales.

Electroforesis en gel

SDS/PAGE

Se llevo a cabo la SDS/PAGE en gran medida de acuerdo con el metodo de Laemmli (Laemmli, U.K., Nature, 227: 680-685 (1970)]. Las muestras se mezclaron con un tampon de preparacion de muestras, se llevaron a ebullicion durante 2 minutos, se centrifugaron brevemente en una minicentnfuga y se cargaron sobre minigeles al 7,5 % (Fig. 1) o al 10 % (Figs. 2-4) con un gel de apilado al 4 %. Los geles se analizaron durante aproximadamente 1 hora a una corriente constante de 20 mA a temperatura ambiente, y se visualizo la protema mediante tincion con azul brillante de Coomassie R250.

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Inmunotransferencia

Se prepararon las electrotransferencias de L1 del VPH-11 a partir de geles de SDS/PAGE en gran medida de acuerdo con el metodo de Towbin et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354 (1979)]. Las transferencias se bloquearon con protema de leche desnatada al 1 % en PBS durante la noche a 4 °C. Las transferencias se sondearon con AU1 (Berkely Antibody Co.), un anticuerpo monoclonal de raton dirigido contra un epttopo lineal en protemas L1 del virus del papiloma humano (25) durante 90 minutos, se lavaron con PBS al 0,1 %, Triton X-100 y a continuacion se volvieron a bloquear durante 30 minutos. A continuacion, se incubaron las transferencias con IgG de cabra dirigida contra IgG de raton marcada con HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.) durante 40 minutos y se lavaron como anteriormente. A continuacion, se revelaron las transferencias con el reactivo de transferencia Western ECL (Amersham), y se expusieron a una pelmula de rayos X.

Analisis de geles

Se determinaron la Mr de la L1 monomerica y oligomerica a partir de sus valores de Rf en SDS/PAGE al 7,5 % en comparacion con las protemas normalizadas (Vease, Jackowski et al, In T. E. Creighton (ed.), Protein structure: a practical approach, IRL Press, Nueva York, p 1-21 (1989)) Cuando estaba indicado, los geles se digitalizaron sobre un densitometro de lecho uniforme Hewlett Packard Scanjet Plus, y se determino la intensidad de las bandas utilizando el software Scan Analysis (version 2.2; Specom Research).

Microscopio electronico

Las muestras de protemas se dejaron sedimentar sobre rejillas de cobre revestidas con formvar y carbono (Electron Microscopy Sciences), se transfirieron por via seca, y se tineron con acido fosfotungstico al 2 % filtrado recientemente (pH 6,8). Las rejillas se examinaron en un microscopio electronico de transmision JEOL modelo 1005 a una tension de aceleracion de 100 KV y se fotografiaron a aumentos nominales de 15-25.000x.

Enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA)

Las VLP de L1 del VPH-11 (0,5-1,0 mg/ml de L1) en PBS-NaCl 0,3 M se almacenaron sin tratamiento a 4°C, o se incubaron durante la noche a 4°C tras la adicion de PME (a una concentracion final del 5 %) o tampon carbonato 2,0 M, pH 9,6 (a una concentracion final de carbonato 200 mM). A continuacion, se dializo una porcion de las muestras tratadas frente a 4 x IL PBS-NaCl 0,5 M a 4°C durante > 24 h. Todas las muestras se diluyeron a una concentracion de 0,8 |jg de L1/ml y se distribuyeron en los pocillos de placas de microvaloracion (80 ng de L1 por pocillo). Las VLP sin tratar y el material dializado se diluyeron en PBS. La muestra tratada con PME se diluyo sin dialisis posterior en PBS que contema pME al 5 %, y una muestra incubada sin dializar en carbonato 200 mM se diluyo en carbonato 200 mM, pH 9,6. Tras la incubacion a 37 °C durante 1 h, se lavaron las placas con PBS, Tween-20 al 0,1 % (PBS- Tw) y se bloquearon con protema de leche desnatada al 5 % en PBS. Anticuerpos monoclonales (AU1, o H11.F1 y H11.A3 purificados de ascites, adquiridos de la Pennsylvania State University (Christensen et al, J. Virol., 64:56785681 (1990)), se diluyeron en leche desnatada al 1 % en PBS y se anadieron a los pocillos. Tras una incubacion de 2 h a temperatura ambiente, se lavaron las placas con PBS-TW y se anadio IgG de cabra contra IgG de raton marcada con HRP. Despues de 1 h a temperatura ambiente, las placas se lavaron como anteriormente y se revelaron con sustrato HRP (Kirkegaard and Perry Laboratories). Se realizaron medidas de densidad optica a 405 nm en el punto final de 15 min. Se calcularon los promedios de los pocillos por duplicado como los valores de densidades opticas finales.

Ensayo de neutralizacion del VPH 11

Los antisueros contra las VPL del VPH-11 purificado original y las VLP del VPH-11, que se desmontaron mediante exposicion prolongada al agente reductor de sulfhidrilo y a continuacion se montaron posteriormente tras la eliminacion del agente reductor mediante dialisis, se generaron en ratones BALB/c (grupos de 5). Se inyectaron los ratones por via s.c con 1 jg de VLP absorbida en 1 mg/ml de adyuvante de alhidrogel en las semanas 0, 4 y 9 con extracciones de sangre terminales llevadas a cabo en la semana 13. Para determinar si el aumento de antisueros en ratones era capaz de neutralizar el virus VPH-11, se ensayo la capacidad de los antisueros de bloquear la expresion en un ARNm tras corte y empalme de un VPH-11 espedfico en una lmea celular humana (HaCaT).

El Dr. Norbert Fusening proporciono HaCaT, una lmea celular de queratinocitos humanos inmortalizada (Boukamp et al, J. Cell Biol., 106: 761-771 (1988)). Se hicieron crecer las celulas hasta confluencia en 154/HKGS (Cascade Biologics, Inc.) suplementado con penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 jg/ml) en placas de 24 pocillos. Virus madre VPH-11Hershey, adquirido del Dr. John Kreider (Kreider et al, J. Virol., 61:590-593 (1987)), se sonico durante 25 s en hielo, se diluyo en medio 154/HKGS, y se incubo durante una hora a 37°C. se aspiro el medio de las celulas HaCaT y se anadieron 0,5 ml de virus diluido por pocillo. Como un control, un pocillo de celulas en cada placa recibio 0,5 ml de medio sin virus. Para la neutralizacion mediada por anticuerpos, se diluyeron los antisueros en 154/HKGS y se incubaron con una cantidad fija del virus madre VPH-11 en un volumen final de 0,5 ml durante una hora a 37 °C tras la adicion a las celulas HaCaT. Se anadio medio reciente a cada pocillo de celulas cuatro dfas

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despues de la infeccion y en el dfa seis se recogieron las celulas y se preparo el ARN celular total utilizando Tri Reagent (Molecular Research Center, Inc.). Los aglomerados de ARN finales se volvieron a suspender en 20 jl de agua tratada con DEPC y se cuantificaron mediante espectrofotometna.

Se determino la capacidad de los antisueros para bloquear la expresion del ARNm tras corte y empalme espedfico del VPH-11 mediante la transcriptasa inversa (RT)-PCR. Se llevaron a cabo las reacciones de la Rt usando un kit First Strand cDNA (Boehringer Mannheim) con 2 jg del ARN total como el molde y un oligonucleotido dT como el cebador. Se necesitaron PCR anidadas para detectar el ADNc del VPH-11 E1AE4. Se llevo a cabo el primer ciclo de amplificacion con 25 % del ADNc de cada reaccion RT y 5'-TACAAGACCTTTTGCTGGGCACA-3" (localizado en las bases 765-787 en la secuencia genomica del VPH-11) con el cebador directo exterior y 5'AAAGGCAGGAAAATAGCACAC-3' (localizado en las bases 4088-4110 en la secuencia genomica del VPH-11) como el cebador inverso exterior durante 30 ciclos de la PCR. Se uso un diez por ciento de la mezcla de la PCR del primer ciclo para las reacciones anidadas con 5'ATATTGTGTGTCCCATCTGCG-3" (localizado en las bases 792-812 como cebador directo anidado y 5'-CAGCAATTTGTACAGGCACTAC-3' (localizado en las bases 3877-3898 en la secuencia genomica del VPH -11) como el cebador inverso anidado durante 30 ciclos de la PCR. Se configuraron las reacciones de la PCR del primer ciclo y de la PCR anidada con perlas Hot Wax (1,5 mM) y tampon a pH 9,5 (InVitrogen), con 200 jM de dNTP, 125 ng de cada cebador directo e inverso, y 2,5 unidades de la polimerasa Taq (Perkin-Elmer) en un volumen final de 50 jl. El perfil de temperatura para la pCr del primer ciclo y la PCR anidada era de 80 °C/5 min, 95° C/30 s, 72°C/30 s, con una extension final a 72 °C durante 10 min.

Como control para demostrar que el ensayo podfa detectar el ARNm extrafdo de las celulas HaCaT, se usaron todas las muestras de ADNc en reacciones de la PCR separadas con cebadores espedficos para el corte y empalme de la p-accion celular del ARNm como se ha descrito y se amplificaron como anteriormente (Smith et al, J. Invest. Dermatol., 105: 1-7 (1995)).

Todos los productos de la PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 % y se visualizaron mediante fluorescencia con bromuro de etidio.

Ejemplo 1

Desmontaje cuantitativo de las VLP del VPH-11

Se prepararon cantidades relativamente grandes de las VLP de L1 del VPH-11 como material de partida para el estudio del desmontaje y montaje posterior de la VLP. Se aislaron las VLP de L1 del VPH-11 a partir de celulas High Five® infectadas con baculovirus recombinante mediante centrifugacion en gradiente de CsCl y sacarosa. La pureza calculada de estas preparaciones de L1, basada en el analisis densitometrico de SDS/PAGE, vario entre un 70-90 % (vease la Fig. 1, banda 2). Ademas, en los gradientes lineales de sacarosa, la mayona de la protema migro como se esperaba para una mezcla de VLP individuales y agrupadas (Fig. 4a), y se observo en el microscopio electronico una mezcla de partmulas de tamanol intermedio y de tamano completo (50-55 nm) (Fig. 5a).

Las interacciones covalentes y no covalentes que estabilizan las VLP de L1 montadas no se conocen completamente, pero un trabajo anterior sobre las VLP del virus del papiloma humano y los viriones del virus del polioma relacionados y las VLP sugiere la importancia de la fuerza ionica, cationes divalentes (Brady et al, J. Virol., 23:717-724 (1977); Salunke et al, Biophys. J., 56:887-900 (1987), y enlaces disulfuro (Sapp et al, J. Gen. Virol., 76:2407-2512 (1995); Volpers et al, Virology, 200:504-512 (1994)). En particular, Sapp y colaboradores habfan demostrado mediante inmunotransferencia que el 50 por ciento de la protema L1 de las VLP de VPH-33 se urna mediante enlaces disulfuro en un intervalo de oligomeros mas grandes con una Mr aparente, consistente con los tnmeros de L1, y que las condiciones de reduccion suaves descomponen las VLP del VPH-33 al nivel hasta los capsomeros (Sapp et al, J. Gen. Virol., 76:2407-2412 (1995); Volpers et al, Virol., 200:504-512 (1994)). En los estudios de los inventores, en ausencia de agentes reductores, solo una parte de la protema L1 del VPH-11 migro en la SDS/PAGE con una Mr evidente de 55.000 Da (Fig. 1, Banda 1). Aproximadamente el 40 % (el porcentaje vario entre diferentes preparaciones de VLP) de la protema L1 de VPH-11, las VLP estaba unida mediante enlaces disulfuro en oligomeros mas grandes (Fig. 1, Banda 1), con valores de Mr previstos de aproximadamente 144.000 Da (posiblemente, el tnmero de L1) y 210.000 Da (posiblemente, el tetramero de L1). Los oligomeros de L1 no migran como una unica banda, y pareda que eran heterogeneos en tamano. Sapp y colaboradores observaron tambien el oligomero de 200.000 Da en inmunotransferencias (Sapp et al, J. Gen. Virol., 76:2407-2412 (1995); Volpers et al, Virol., 200:504-512 (1994)), como parte de una banda amplia de mayor peso molecular. Estos resultados indican que una parte de las VLP de las protemas L1 del VPH-11 estan unidas mediante enlaces disulfuro en oligomeros mayores. Para estudiar el papel de los enlaces disulfuro y otras interacciones en la estabilidad de la VLP, se desarrollo un ensayo de cribado rapido para el desmontaje de la VLP. Las VLP de L1 del VPH-11 purificadas, antes y despues de varios tratamientos, se distribuyeron en capas en la parte superior de los cojines de sacarosa al 30 %, se centrifugaron, y la distribucion de la protema L1 en la parte superior y en la parte inferior del cojm de sacarosa al 30 % se visualizo mediante SDS/PAGE. Se esperaba que las VLP intactas se agruparan a traves del cojm de sacarosa al 30 %; se esperaba que los capsomeros no agregados y el monomero de L1 permanecieran en la parte superior del cojm. En la Fig. 2 se muestra un ejemplo de este ensayo. Para cuantificar la disposicion relativa de la protema L1, se digitalizaron los geles, se determino la intensidad total de las bandas L1 en la parte superior y en la

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parte inferior del cojm, y a continuacion se calculo el porcentaje de intensidad de la tincion de L1 en cualquier posicion. Los resultados de varias de las mencionadas determinaciones se tabularon en las Tablas 1 y 2. Como se ha demostrado en la Fig. 2, el material de partida de VLP purificada sedimento a traves de la sacarosa al 30 %, como se habfa previsto, sin que fuera evidente la L1 en la parte superior. Sin embargo, tras la incubacion con una elevada concentracion del agente reductor p-mercaptoetanol (pME), la protema L1 se encontraba en gran medida en la parte superior del cojm de sacarosa al 30 %, indicando que el agente reductor habfa desmontado las VLP del VPH-11 en componente mas pequenos, no agregados. De forma interesante, el desmontaje maximo de las VLP requirio normalmente la exposicion a una concentracion muy alta de agente reductor (en este caso un 5 % o pME 713 mM) durante un periodo relativamente largo (-16 horas a 4 °C). Concentraciones menores del agente reductor o duraciones mas cortas de reduccion no eran tan fiables y eficaces en el desmontaje de la VLP. La adicion de una concentracion baja de un agente quelante no potencia el desmontaje (Fig. 2 y Tabla 1).

Ademas de los reductores, se ha descubierto que las otras variables importantes para el desmontaje cuantitativo de las VLP eran la fuerza ionica durante la reaccion de desmontaje y la solubilidad del material de partida de la VLP. Como se observo anteriormente para los viriones del virus del polioma, las condiciones de menor fuerza ionica desestabilizan las VLP (Brady et al, J. Virol., 23:717-724 (1977)), aunque Sapp et al (J. Gen. Virol., 76:2407-2412 (1996)) notificaron que la generacion de capsomeros de VPH-33 a partir de las VLP era insensible a la concentracion salina entre NaCl 0,15 M y NaCl 0,6 M. Para las VLP del vPh-11, el maximo desmontaje (-90 %) de las VLP expuestas a pME al 5 % durante 16 horas se observo a fuerza ionica "fisiologica" (es decir, NaCl 0,15 M) pero se volvio correspondientemente menos eficaz a medida que la fuerza ionica aumentaba (Tabla 1). El efecto estabilizante de la fuerza ionica aumentada se podna superar parcialmente incubando las VLP con agentes reductores en plazos mas largos o a temperaturas elevadas. Sin embargo, aunque la incubacion de las VLP con pME al 5 % durante 120 horas a 4 °C, o durante 24 horas a 24 °C aumento la extension del desmontaje en un 6070 % a NaCl 0,5 M, el desmontaje distaba de estar completo (no se muestran los datos). Ademas, para el desmontaje cuantitativo, el grado de agregacion del material de partida de VLP era tambien importante. En los experimentos notificados aqrn, las soluciones de VLP se dializaron en tampones de fuerza ionica diferentes y se almacenaron a 4 °C hasta el uso en ensayos de desmontaje. Tras varios dfas, particularmente a NaCl 0,15 M, las soluciones se volvieron ligeramente turbias, indicando algun grado de agregacion (aunque se observo poca o ninguna precipitacion). El tratamiento de las soluciones de VLP turbias con agentes reductores no da como resultado el mismo grado de desmontaje que el observado con la solucion de VLP soluble inicial, indicando que las VLP agregadas eran resistentes al desmontaje. Sin embargo, tras la eliminacion del material agregado (que vario entre 10-50% de las VLP totales dependiendo de la edad de la preparacion) mediante filtracion, las VLP solubles restantes se pudieron desmontar de nuevo en la misma extension que el material de partida de la VLP soluble inicial.

De forma interesante, incluso a elevadas concentraciones de quelantes, la quelacion de cationes no afecta significativamente el desmontaje de VLP. La dialisis de las VLP en EDTA 200 o tampones EGTA (PBS-NaCl 0,3 M, pH 7,4) conduce a un desmontaje no evidente, y la adicion de ditiotreitol 10 mM (DTT) a los tampones de dialisis tuvo poco efecto (Tabla 2). Se confirmo la incapacidad de altas concentraciones de quelantes de desmontar las VLP mediante el analisis con microscopio electronico, aunque EDTA (pero no EGTA) parecio que hinchaba las VLP ligeramente (no se muestran los datos). Cualquiera de estas concentraciones de quelantes son insuficientes para extraer iones estructuralmente importantes fuertemente unidos, o cationes que no son esenciales para mantener la integridad estructural de la VLP. De forma inversa, la adicion de una almuota concentrada de tampon NaHCO3 (pH 9,6) a una solucion de las VLP, hasta una concentracion final de carbonato 200 mM (en PBS-NaCl 0,3 M), produjo una rotura significativa de las VLP (Tabla 2). La adicion de DTT (hasta una concentracion final de 10 mM), no potencia adicionalmente la rotura inducida por carbonato. La incubacion de las VLP con carbonato 200 mM/ DTT 10 mM se usa comunmente para desnaturalizar los viriones de VPH o las VLP en ELISA (Favre et al, J. Virol., 15:12391237 (1975); Christensen et al, J. Virol., 64:3151-3156 (1990); Christensen et al, J. Gen. Virol., 75:2271-2276 (1994)). El efecto del carbonato parece ser espedfico del tampon, y no meramente una funcion del pH, ya que la incubacion de las VLP del VPH-11 con tampon glicina a pH 9,6 (concentracion final 200 mM) produjo muy poca rotura de la VLP, como se midio mediante el ensayo del cojm de sacarosa al 30 % (Tabla 2). De forma similar, Brady et al (J. Virol., 23:717-724 (1977)), observaron que el tampon carbonato a pH alcalino, pero no solo a pH alcalino, disocio los viriones del virus del polioma. Sin embargo, el efecto espedfico del carbonato a pH 9,6 no parece ser debido a la capacidad quelante potencial del carbonato, como sugirieron Brady et al (J. Virol., 23:717-724 (1977)), debido a que EDTA 200 mM a pH 9,6 (+/- DTT 10 mM) era completamente ineficaz en el desmontaje de la VLP (no se muestran los datos).

Ejemplo 2

Caracterizacidn de las VLP del VPH-11 desmontadas

Tras la exposicion a largo plazo a altas concentraciones del agente reductor, las VLP purificadas parecen romperse hasta los capsomeros. Como se muestra en la Fig. 3a, las VLP desmontadas generadas mediante incubacion con pME al 5 % durante 16 horas a 4 °C migraron en gradientes lineales de sacarosa al 5-20 % con un coeficiente de sedimentacion promedio de 11,3 ± 1,5 S (n = 5) determinado con respecto a los patrones de sedimentacion. Se observaron ocasionalmente especies mas grandes, con un coeficiente de sedimentacion calculado de 16-18 S (quiza los capsomeros dimericos), e incluso materiales aglomerados. Sin embargo, se detecto menos de un 10 % de

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L1 en la parte superior del gradiente (posicion esperada para el monomero de L1) o en el aglomerado (posicion esperada para las VLP intactas o los capsomeros agregados), sugiriendo que el material de partida de la VLP purificada se desmonto en gran medida hasta los capsomeros individuales tras la reduccion prolongada. Esta conclusion esta respaldada por el analisis con microscopio electronico de las VLP tras la incubacion prolongada con pME al 5 %, que representa graficamente un campo de capsomeros homogeneos (Fig. 5b) con un diametro promedio de 9,7±1,2 nm (n = 15), ocasionalmente con unas pocas estructuras mas grandes agregadas aparentes (la L1 monomerica no se detectana con esta tecnica). El diametro estimado del capsomero es ligeramente mas pequeno que el observado mediante crioelectromicroscopfa (11-12 nm) (Baker et al, Biophys. J., 60:1445-1456 (1991); Hagensee et al, J. Virol., 68:4503-4505, (1994); Belnap et al, J. Mol. Biol., 259:249-263 (1996)), debido quiza al acortamiento durante la preparacion de la rejilla del microscopio electronico. Los datos demostrados en las Figs. 3a y 5b indican que la exposicion prolongada a altas concentraciones de reductores desmonta cuantitativamente las VLP solubles purificadas para una poblacion homogenea de capsomeros.

Los capsomeros generados a partir de las VLP del VPH-11 tras la exposicion a largo plazo a altas concentraciones de agente reductor contienen epftopos estructurales que se encuentras en las VLP intactas. Se ha descrito un panel de anticuerpos monoclonales espedficos del VPH-11 que reaccionan con las VLP de L1 del VPH-11 pero no con la L1 "desnaturalizada". Estos anticuerpos monoclonales incluyen H11.F1, que se ha demostrado que reconocen un epftopo neutralizante dominante en viriones del VPH-11, y H11.A3, un anticuerpo distinto dependiente de estructura no neutralizante (Christensen and Kreider, J. Virol., 64:3151-3156 (1990); Christensen et al, J. Virol., 64:5678-5681 (1990)). Como se ha anticipado, H11.F1 y H11.A3 reaccionaron intensamente con el material de partida de la VLP del VPH-11 purificado cuando se analizo mediante ELISA (Fig. 6a). Sin embargo, estos anticuerpos reaccionaron tambien con los capsomeros generados a partir del material de partida de la VLP mediante exposicion al agente reductor (Fig. 6b). De esta manera, los capsomeros poseen al menos algunos epftopos dependientes de la estructura que se encuentran sobre la superficie de las VLP intactas y viriones autenticos, de acuerdo con los estudios llevados a cabo por Li et al, (J. Virol., 71:2988-2995 (1997)) sobre capsomeros de VPH-11 expresados en E. coli. Estos resultados demuestran ademas que los anticuerpos monoclonales H11.F1 y H11.A3, aunque requieren una conformacion "similar a la natural" para la union, no son dependiente de VLP como se ha descrito previamente (Ludmerer et al, J. Virol., 71:3834-3839 (1997)).

En contraste, los anticuerpos monoclonales H11.F1 y H11.A3 no reconocen las VLP de VPH-11 disociadas por tratamiento con tampon carbonato a pH 9,6 (no se muestran los datos; Christensen et al, J. Gen. Virol., 75:22712275 (1994)). El tratamiento con carbonato no conduce a una solucion homogenea de capsomeros, que a su vez apareda como una mezcla indistinta de objetos pequenos, parcialmente agregados, cuando se examino mediante el microscopio electronico (no se muestran los datos). Esta vision se confirmo parcialmente mediante el analisis de las VLP tratadas con carbonato en gradientes lineales de sacarosa al 5-20 %, donde la protema L1 migro en gran medida a -4S, aunque se observo una poequena poblacion a 9-11 S (Fig. 3B) de acuerdo con los efectos del tampon carbonato (a pH 10,6 con DTT 10 mM) sobre viriones del VPB (Favre et al, J. Virol., 15:1239-1247 (1975)). Finalmente, aunque el tratamiento con tampon glicina a pH 9,6 no disocia las VLP en partmulas individuales mas pequenas (Tabla 2), tiene algun efecto. Las VLP tratadas con glicina a pH 9,6 aparecieron en el microscopio electronico como una mezcla mal definida de VLP intactas, y parcialmente rotas y agregadas (no se muestran los datos).

Ejemplo 3

Montaje posterior cuantitativo de las VLP del VPH-11

El montaje posterior de la VLP de los capsomeros del VPH-11 se produjo tras la eliminacion del agente reductor tanto mediante dialisis como mediante cromatograffa en columna. Partiendo de una preparacion homogenea de capsomeros solubles, la dialisis prolongada en ausencia de agentes reductores dio como resultado una poblacion definida de VLP montadas posteriormente (Figs. 4c y 5c, d). Las VLP montadas posteriormente retuvieron los epftopos estructurales reconocidos por los anticuerpos monoclonales H11.F1 y H11.A3 (Fig. 6c).

Para el montaje posterior, los capsomeros (1-5 ml a 0,5-1,0 mg/ml de protema total) se dializaron frente a 4 x 1 l de PBS- NaCl 0,5 M a 4°C durante 24 h; la concentracion salina elevada se diseno para estabilizar las VLP. Aunque la adicion de agentes quelantes no potencia apreciablemente la capacidad de los agentes reductores para desmontar las VLP (Tabla 1), la presencia de EDTA 2 mM interfirio moderadamente sobre el montaje posterior, dando como resultado VLP que migraron en un gradiente lineal de sacarosa del 10-65 % como una poblacion bastante discreta de partroulas 150 S pero que parecio uniformizarse y extenderse al microscopio electronico (no se muestran los datos). Por el contrario, la adicion de Ca2+ 2 mM durante la reaccion de montaje posterior dio lugar a que las VLP se adhirieran entre sf, como se muestra por el analisis del gradiente lineal de sacarosa al 10-65 %, donde las VLP se montaron posteriormente en presencia de calcio migrado completamente en el aglomerado. Sin embargo, la presencia de Ca2+ no parecio afectar de otra manera la morfologfa basica de la VLP cuando se examino al microscopio electronico (no se muestran los datos). Finalmente, la dialisis de las VLP tratadas con carbonato en PBS NaCl 0,5 M no conduce al montaje posterior de las VLP. En vez de esto, la protema L1 permanecio tanto como componentes pequenos solubles o amorfos, precipitados agregados, como se evidencio tanto por el microscopio de electrones como el analisis del gradiente lineal de sacarosa al 10-65 % (no se muestran los datos). La dialisis de las

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VLP tratadas con carbonato no consiguio restaurar la reactividad con los anticuerpos monoclonales espedficos de estructura H11.F1 y H11.A3 (Fig. 6d). Caracterizacion de las VLP del VPH-11 montadas posteriormente.

Tras la eliminacion del agente reductor, los capsomeros se volvieron a montar cuantitativamente posteriormente en VLP. De forma sorprendente, las VLP remontadas son mucho mas homogeneas respecto al tamano de partmula que el material de partida de la VPL purificado en con cesio y gradiente de sacarosa. Cuando se compararon las tres etapas de la reaccion de desmontaje/montaje posterior mediante gradientes lineales de sacarosa al 10-65%, el material de partida de VLP purificado se distribuyo a traves del gradiente, con muchas partmulas migrando a la posicion esperada para las VLP intactas (150-160 S), pero con la mayona de la protema mas abajo del gradiente en el aglomerado (Fig. 4a). De forma similar, cuando se examino al microscopio electronico (Fig. 5a), se observo que el material de partida de VLP era una mezcla de partmulas de diferente tamano, incluyendo VLP de tamano completo, de 50-55 nm de diametro. Es posible que se produzca alguna perturbacion de las VLP durante la extraccion y la purificacion, dado que el analisis del gradiente lineal de sacarosa de las etapas iniciales del proceso de purificacion indico una distribucion mas homogenea de los tamanos de partmulas (no se muestran los datos).

Tras la exposicion a largo plazo a altas concentraciones de los agentes reductores, las VLP se desmontaron en capsomeros, como se ha descrito anteriormente. En comparacion con el material de partida de la VLP, los capsomeros migraron a la parte superior de los gradientes lineales de sacarosa al 10-65 % (con poco o ningun L1 detectado en el aglomerado; Fig. 4b), y en el microscopio electronico aparecieron como un campo de capsomeros sin romper (Fig. 5b).

El remontaje de los capsomeros dio como resultado una poblacion homogenea de VLP de tamano completo esfericas. Las VPL montadas posteriormente se distribuyeron en bandas en la parte intermedia de los gradientes lineales de sacarosa al 10-65 %, con un coeficiente de sedimentacion previsto de 150,4 ± 4,6 S (n = 7), con mucha menos L1 detectada tanto en el aglomerado como en la parte inferior del gradiente que la observada con el material de partida de la VLP purificada (Fig. 4c). La homogeneidad de las VLP remontadas fue incluso mas sorprendente cuando se examino al microscopio electronico, como se ha demostrado en la Fig. 5c, d. Predominantemente, se detectaron partmulas en el intervalo de las VLP de tamano completo, promediando 56,5 ± 7,0 nm (n = 15), con muy pocas VLP parcialmente montadas o complejos mas pequenos aparentes. Los rendimientos del proceso de remontaje fueron tambien muy elevados (promediando 83 % en terminos de protema L1 total procedente del material de partida para las VLP montadas posteriormente en condiciones optimas de desmontaje), debido esencialmente a que todos los capsomeros parecieron a formar las VLP solubles, filtrables, de tamano completo.

Ejemplo 4

Comparacion de la capacidad de las VLP de VPH-11 purificadas iniciales y de las VLP de VPH-11 remontadas para generar anticuerpos neutralizantes de virus

para que las VLP montadas posteriormente funcionen satisfactoriamente como candidatos de vacunas, es esencial que retengan la capacidad de estimular anticuerpos neutralizantes de virus cuando se inyectan en animales experimentales. Para ensayar esto, se generaron antisueros policlonales tanto de las VLP de VPH-11 purificadas iniciales, como de las VLP de VPH-11 desmontadas/montadas posteriormente en ratones BALB/c como se describe en la seccion de Metodos. Cada uno de los antisueros fue igualmente reactivo frente al inmunogeno correspondiente cuando se evaluo en un formato ELISA (no se muestran los datos). De forma mas importante, cuando se sometieron al ensayo de neutralizacion de la RT-PCR que implicaba viriones de VPH-11 infecciosos (Smith et al, J. Invest. Dermatol., 105:1-7 (1995)), los antisueros policlonales espedficos de las VLP del VPH-11 remontadas tras la reaccion inmunitaria presentaron un tftulo de neutralizacion de 10-5 - 10-6, igual al obtenido con los antisueros generados contra las VLP del VPH-11 iniciales purificadas (Fig. 7). Esto demuestra que las VLP del VPH11 remontadas retienen el dominio antigenico inmunogeno neutralizante de la capsida de los viriones del VPH-11, y tienen el potencial de servir como vacunas para la prevencion de la enfermedad del VPH genital. Ademas, dado que las VLP remontadas representan una preparacion homogenea de las VLP de tamano completo (es decir, el tamano del virus infeccioso), es posible que las VLP remontadas sean inmunogenos mas potentes que las VLP purificadas iniciales, que son heterogeneas en tamano, una posibilidad que se esta sometiendo a ensayo actualmente mediante la dosificacion de ratones con cantidades decrecientes de VLP iniciales y montadas posteriormente.

Ejemplo 5

Aplicacion del desmontaje y montaje posterior de la VLP durante la purificacion de las VLP del VPH

Como se ha descrito anteriormente, los metodos de purificacion de protemas convencionales no estan optimizados para utilizar con complejos de protemas el tamano de las VLP (partmulas de 20.000.000 Da, de 55 nm de diametro). En particular, el tamano absoluto de las VLP disminuye drasticamente la capacidad y la utilidad de la mayona de resinas cromatograficas, ya que la qrnmica reactiva en la resina es estericamente inaccesible a la VLP. Sin embargo, esta dificultad puede potencialmente evitarse desmontando las VLP brutas extrafdas de las celulas, purificando las VLP desmontadas utilizando metodos normalizados, y montando posteriormente las VLP en la etapa deseada de pureza. Un segundo riesgo de la purificacion de la VLP es la contaminacion con ADN residual. En un trabajo anterior

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llevado a cabo con las VLP del VPH-11 purificadas, persiste un determinado nivel de ADN de fondo que no se elimina mediante el tratamiento con ADNasa, sugiriendo que el ADN esta tanto encapsulado en las VLP como muy mtimamente asociado con ellas. El desmontaje de las VLP permitina una mayor eliminacion del ADN contaminante, una importante consideracion para cualquier compuesto biologico previsto para uso clmico.

Para ensayar este potencial, se extrajeron las VLP del VPH-16t a partir de celulas de insecto infectadas con baculovirus, y purificadas mediante cromatograffa IEC e HIC convencional como se describe en la seccion de Metodos, tanto en ausencia del agente reductor sulfhidrilo (VLP intactas), como en presencia de pME al 4 % (VLP desmontadas). En el ultimo caso, las VLP extrafdas se incubaron con pME al 4 % durante >2 h a 4 °C antes de la cromatograffa en columnas IEC e HIC, que se equilibraron tambien en pME. Los productos purificados finales de ambos procedimientos de purificacion (es decir, en presencia o ausencia del agente reductor sulfhidrilo) se dializaron frente a 4x1 l de PBS (NaCl 0,5 M), y se determinaron la pureza, el rendimiento y los niveles del ADN residual. Como se muestra en la Tabla 3, una preparacion representativa purificada en ausencia de pME dio como resultado las VLP del VPH16t que tuvieron una pureza solo de aproximadamente un 60 % (en terminos de contaminacion de protemas) y conteman niveles de ADN mayores que los deseados para el uso humano. Por el contrario, tres preparaciones de VLP purificadas en el estado desmontado se caracterizaron por rendimientos mayores, una pureza de protemas significativamente mas elevada y unos niveles de ADN residual sustancialmente reducidos. La mayor pureza de la protema de las VLP purificadas en el estado desmontado es facilmente evidente cuando se analiza mediante SDS/PAGE como se muestra en la Fig. 8. El tamano y la homogeneidad de las VLP del VPH-16t montadas posteriormente tras la purificacion fueron mas heterogeneos que los observados para el remontaje de las VLP del VPH-11 purificadas, pero en promedio, fueron tan homogeneos como las VLP del VpH-16 Tr purificadas sin desmontaje y en algunos casos formaron VLP de tamano completo uniformemente homogeneas, algo que los inventores no han observado nunca con las VLP del VPH-16t purificadas sin desmontaje (no se muestran los datos).

Existen interesantes diferencias en los efectos del tratamiento prolongado con agentes reductores de sulfhidrilo entre VPH 16tp y las VLP del VPH-11. En primer lugar, las VLP del VPH-16t parecen desmontarse cuantitativamente a niveles menores del agente reductor y/o a duraciones mas cortas de la exposicion (no se muestran los datos). No es evidente que esto refleje una diferencia genuina entre las VLP de VPH-16 y VPH-11, o que esto se deba al truncamiento del extremo C de la protema L1 de VPH-16tp, ya que, en ensayos preliminares, los autores observaron que la rotura proteolttica del extremo C de la protema L1 del VPH-11 tambien acelera la descomposicion de las VLP en presencia del agente reductor de sulfhidrilo. Un rasgo mas interesante es que el tratamiento de VLP del VPH-16t purificadas con el agente reductor de sulfhidrilo parece generar una mezcla de capsomeros, oligomeros mas pequenos de la protema L1 y monomero de L1, sobre la base del analisis con gradiente lineal de sacarosa al 5-20 % sobre las VLP desmontadas del VPH-16t (Fig. 9). Sin embargo, tras la eliminacion del agente reductor mediante dialisis, esta mezcla de componentes solubles pequenos pudo volver a montarse para dar VLP intactas con un rendimiento de -90 %, como se demuestra mediante el analisis con gradiente lineal de sacarosa al 10-65 % (Fig. 10), y se confirmo por analisis al microscopio electronico (no se muestran los datos). Estos resultados demuestran que las VLP se pueden desmontar hasta el nivel de los capsomeros, o incluso de oligomeros de L1 mas pequenos, y seguir siendo adecuados para volver a montarse para obtener VLP intactas de tamano completo, siempre que las condiciones de desmontaje produzcan protemas L1 correctamente plegadas y solubles.

TABLA 1

Desmontaje de las VLP de la L1 del VPH-11; Efectos de los agentes reductores3

Condicion de desmontaje

0,15 M NaCl 0,3 M NaCl 0,5 M NaCl Superior Inferior Superior Inferior Superior Inferior

Material de partida

3,8±0,7 96,3±0,8 3,2±1,4 96,8±1,4 4,2±0,3 4 95,9±0,6

5 % pME, 16 h

87,7±3,2 12,4±3,1 70,9±12 29,1±12 53,2±6,8 46,8±6,8

5 PME, 1 h

68,1±11 31,9±11 68,0±10 32±10 - -

2 % pME, 16 h

72,1 ± 2,7 27,9±2,7 67,6±21 32,3 ± 612 - -

0,5 % pME, 16 h

45,8±18 54,2±16 28,8±16 71,2±16 - -

DIT 10 mM, 16 h

44,5±11 55,5±11 43,8±20 56,2±20 - -

DTT 10 mM, 1 h

9,5±6,4 90,5±6,4 - - - -

DTT 10 mM, EDTA 5 mM, 16 h

55,9±6,2 44,1±6,2 - - - -

aLas VLP (0,5-1,0 mg/ml de protema) se trataron como se ha indicado a 4°C, y la distribucion de L1 a traves de un cojm de sacarosa al 30 % se determino como se ha descrito en 'la seccion de Metodos. Se muestran los promedios de multiples determinaciones (n=3-7) ± la desviacion estandar.

TABLA 2

Desmontaje de las VLP de la L1 del VPH-11; Efectos de quelantes y tamponesa

Condicion de desmontaje

Superior Inferior

EDTA 200 mM, pH 7,4

4±3 96±3

EDTA 200 mM, DTT 10 mM

10±6 90±6

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Desmontaje de las VLP de la L1 del VPH-11;

zfectos de quelantes y tampones3

EGTA 200 mM, pH 7,4

13±11 87±11

EGTA 200 mM, DTT 10 mM

11±6 89±6

NaHCO3 200 mM, pH 9,6

81±2 19±2

NaHCO3 200 mM, DTT 10 mM

74±11 26±11

Glicina 200 mM, pH 9,6

11±1 89±1

Glicina 200 mM, DTT 10 mM

41±12 59±11

aLas VLP (0,5-1,0 mg/ml de protema) se trataron como se ha indicado durante 16 horas a 4°C, y la distribucion de L1 a traves de un cojm de sacarosa al 30 % se determino como se ha descrito en 'la seccion de Metodos. Se muestran los promedios de determinaciones por duplicado ± el intervalo.

TABLA 3

Comparacion de la punficacion de las VLP de VPH-16 desmontadas e intactas

Ensayo

Escala Pureza Rendimiento ADN

-PME

24 g 59 % 5,0 % 30 ng/100 jg de L1

+ PME, Ciclo 1

10 g 85 % 10,8 % 5,3 ng/100 jl de L1

+ PME, Ciclo 2

10 g 85 % 18,4 % 0,6 ng/100 jl de L1

+ PME, Ciclo 3

30 g 81 % 6,1 % --

aUna purificacion de las VLP intactas (-PME) y tres purificaciones de las VLP desmontadas (+PME, Ciclos 1-3) se compararon entre sf, y se prepararon tal como se ha descrito en la seccion de Metodos. La escala indica los gramos de pasta de celulas utilizaros, la pureza se determino mediante analisis densitometrico de SDS/PAGE del producto final, comparado con la cantidad presente en la pasta de celulas inicial, y el ADN se determino segun el metodo del umbral y se notifico por 100 |jg de protema L1, la dosis maxima esperada en seres humanos.

Conclusiones

De esta forma, la presente invencion proporciona condiciones precisas para el desmontaje cuantitativo, y el posterior montaje de las VLP del virus del papiloma in vitro. Como se ha descrito, los intentos anteriores para desmontar las VLP del papiloma estaban afectados, en cierta medida, por el trabajo realizado sobre el virus del papiloma, un papovirus relacionado, donde se mostro que tanto la reduccion de disulfuros como la quelacion del calcio eran esenciales para el desmontaje del virion (Brady et al, J. Virol., (1977)). Sin embargo, se ha descubierto sorprendentemente que los bajos niveles de agente reductor (DTT 1-10 mM) proporcionan el desmontaje optimo del virus del polioma en presencia de bajos niveles de agentes quelantes (por ejemplo, EDTA 0,5-10 mM) solo fueron ligeramente eficaces para el desmontaje de las VLP del papiloma (Tabla 1, Li et al, (Id.)) (1997)), aunque las VLP de la L1 del VPH-11 parcialmente tripsinizado se disociaron en las condiciones anteriores (Li et al, (id.) 1997)). Sin embargo, Sapp y colaboradores demostraron que se podfan generar capsomeros a partir de las VLP de VPH-33 por tratamiento con agente reductor solamente (DTT 20 mM), aunque no se determino la extension de la descomposicion de las VLP (Sapp et al, (Id.) 1995)). En los experimentos anteriormente descritos, se descubrio que, cuando se examinaba el desmontaje mediante analisis en gradiente, era necesario analizar la presencia de protema L1 en el "aglomerado". En muchos casos, el examen de las fracciones a traves del gradiente sugena que se habfa conseguido una buena descomposicion. Sin embargo, el examen del aglomerado, incluso cuando no era visible, indicana que un importante porcentaje de las protemas segrna en la forma de VLP de tamano variable, o agregadas de otra manera, tal como se confirma mediante analisis con el microscopio optico. El desarrollo del ensayo consiguio desmontar las VLP de forma consistente en componentes solubles mas pequenos. Se descubrio que el desmontaje cuantitativo hasta una solucion homogenea de capsomeros individuales (para las VLP de VPH-11) o una mezcla de capsomeros y oligomeros de L1 correctamente plegados mas pequenos y de monomeros de L1 (VLP de VPH-16Tr) pudo lograrse consistentemente mediante un tratamiento prolongado de las VLP no agregadas con altos niveles de agente reductor con tampones de fuerza ionica de moderados a bajos.

Como se ha descrito, la observacion de que la quelacion de cationes no afectaba practicamente al desmontaje de las VLP del VPH-11 VLP fue sorprendente, ya que se opoma a estudios anteriores con el virus del polioma que indicaban que la quelacion del calcio activaba el desmontaje del virion, y que la adicion de calcio superana el efecto de los quelantes (Brady et al, (Id.) (1977)). Analogamente, Montross et al, (Id.) (1991), observaron que las VLP del virus del polioma, que normalmente se reunen solamente en el nucleo, se podfan formar en el citoplasma tras la adicion de un ionoforo de calcio, que supuestamente aumentaba la concentracion de calcio citoplasmatico hasta el nivel necesario. Sin embargo, el calcio aparentemente no es importante para la estabilidad de capsidas de L1 de VPH-11. A la inversa, el tratamiento con tampon carbonato a pH alcalino produjo el "desmontaje" de las VLP de la L1 del VPH-11 de forma similar a los resultados observados con viriones del virus del polioma (Brady et al, (Id.) 1977)). Sin embargo, este tratamiento parece mas intenso, ya que las VLP no se pudieron regenerar mediante dialisis en PBS-0,5 M NaCl seguido por tratamiento con carbonato.

El desmontaje de las VLP del VPH-11 mediante el tratamiento con carbonato dio como resultado que la protema L1 no pudiera reaccionar con los anticuerpos monoclonales espedficos de VPH-11 dependientes de la estructura. Por

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el contrario, el desmontaje de las VLP de L1 del VPH-11 mediante la reduccion prolongada dio como resultado capsomeros que teman epftopos espedficos de estructura que aparecen sobre la superficie de las VLP de L1 del VPH-11 intactas y de los viriones de VPH-11. Estos resultados respaldan la idea de que solamente la protema L1 plegada correctamente retiene la capacidad de volver a ensamblarse para formar las VLP.

Para volver a ensamblar las VLP de tamano completo eficazmente in vitro, los resultados descritos en el presente documento indican que la integridad estructural, la solubilidad y la homogeneidad del material de partida son significativos. Tras la generacion de dicha poblacion de capsomeros (para las VLP de VPH-11) o una mezcla de capsomeros y oligomeros de L1 correctamente plegados mas pequenos y monomeros de L1 (VL de VPH-16jr) mediante reduccion con tiol, el remontaje se produjo espontaneamente tras la eliminacion del agente reductor. El remontaje se logro eliminando el agente reductor de sulfhidrilo, tanto por metodos de cromatograffa en columna o mediante dialisis contra un gran exceso de tampon, dando como resultado una poblacion de VLP remontadas de tamano completo, mas homogeneos en cuanto al tamano que el material de partida de VLP. En estudios anteriores con el virus del polioma, Salunke et al, (Id.) (1989) observaron que el montaje de las VLP a partir de los capsomeros produda multiples montajes polimorficos icosahedricos en funcion de las condiciones de montaje (pH, fuerza ionica y concentracion de calcio). De manera interesante, la estructura formada con mas consistencia fue un icosaedro de 24 capsomeros, asf como un icosaedro de 12 capsomeros, ademas del icosaedro de 72 capsomeros de la capsida del virus. Los autores indican que la formacion del enlace disulfuro debena ayudar al montaje de las VLP del polioma, aunque esto no es esencial, ya que a fuerza ionica elevada (sulfato de amonio 2 M) se forman capsidas de tamano variable, incluso en presencia de p-ME 15 mM. Analogamente, Li et al, (Id.) (1997), observaron que los capsomeros de VPH-11 purificados en columna expresados en E. coli teman la capacidad de formar estructuras de tipo capsida en NaCl 1 M, contra la presencia d PMEe 15 mM. Sin embargo, aunque las condiciones de fuerza ionica aparentemente favorecen cierto grado de formacion de la capsida, es evidente de los estudios de los autores que, a fuerza ionica fisiologica, el disulfuro se une lo necesario para mantener las VLP de L1 del VPH-11 y VPH-16jr unidas entre sf.

Incluso aunque las reacciones de desmontaje se realizaran tipicamente a 4°C sin agitacion, es interesante que el desmontaje maximo requiriera una exposicion prolongada a niveles muy elevados de agente reductor. Como se ha descrito anteriormente, la explicacion mas probable es que los enlaces de hidrogeno estabilizantes esten muy profundos e inaccesibles, y la exposicion de estos enlaces al disolvente debido a las fluctuaciones estructurales locales sea muy infrecuente.

La capacidad de volver a montar las VLP de tamano completo de forma masiva abre numerosas posibilidades. Como se muestra en la Fig. 7, a dosis elevadas, las VLP montadas de nuevo son capaces de suscitar anticuerpos neutralizantes del virus, tal como el material de partida de VLP purificadas. Los inventores han analizado varias veces la potencia de las VLP montadas de nuevo para determinar si eran inmunogenos tan potentes como el material de partida de la VLP, que es menos homogeneo en lo que respecta al tamano de paiimula. Aunque se observan numerosas partmulas de diferentes tamanos y formas en el nucleo de las celulas tras la infeccion in vivo (Kiselev et al, J. Mol. Biol., 40:155-171, (1969)), presuntamente solamente el virus de tamano completo es productor de la infeccion. Como se ha descrito, las VLP remontadas sujeto pueden mostrar potencialmente una mayor estabilidad debido al metodo sujeto que proporciona partmulas de VLP mas uniformes. Ademas, como se ha descrito anteriormente, la reaccion de remontaje puede potenciarse adicionalmente variando la concentracion de protema, el pH, la fuerza ionica y la cinetica, para optimizar el remontaje en una amplia gama de condiciones de partida. Finalmente, la invencion sujeto permite el empaquetamiento de compuestos exogenos dentro de las VLP realizando la reaccion de remontaje en presencia de una solucion concentrada del compuesto seleccionado. La invencion sujeto, como se ha descrito anteriormente, se puede utilizar para generar pseudoviriones para usar como sustituto de varios tipos de virus de VPH que no estan actualmente disponibles, o como sistema de administracion de farmacos u otros compuestos dirigidos.

Claims (7)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para producir partmulas analogas a virus (VLP) del virus del papiloma humano (VPH), que comprende:

   (i) purificar una protema L1 del VPH expresada de forma recombinante desmontada en presencia de al menos un agente reductor de sulfhidrilo que mantiene dicha protema L1 del VPH expresada de forma recombinante en una forma desmontada; y

   (ii) montar dicha protema L1 del VPH expresada de forma recombinante en partmulas analogas a virus (VLP) del virus del papiloma humano mediante la eliminacion u oxidacion de dicho al menos un agente reductor.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, donde dichas VLP del virus del papiloma humano se seleccionan entre el grupo que consiste de VPH-6, VPH-11, VPH-16, VPH-18, VPH-30, VPH-31, VPH-33, VPH-35, VPH-39, VPH-41, VPH-42, VPH-43, VPH-44, VPH-45, VPH-52, VPH-54, VPH-55, VPH-56, VPH-58, VPH-70, y mezclas de los mismos.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, donde dichas VLP del virus del papiloma humano son VLP del VPH-16.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 2, donde dichas VLP del virus del papiloma humano son VLP del VPH-16 y VLP del VPH-18.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 2, donde dichas VLP del virus del papiloma humano son VLP del VPH-11.
6. 6. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, donde dicho agente reductor de sulfhidrilo es p-mercaptoetanol.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, donde la protema L1 del VPH comprende la protema L1 del VPH-16Tr de la que se han eliminado 34 aminoacidos del extremo C.