JP2000515755A

JP2000515755A - インベルターゼ阻害剤

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Publication number: JP2000515755A
Application number: JP10508521A
Authority: JP
Inventors: トーマスラウシュ; シルケクラウスグリル; ステフェングレイナー
Original assignee: ウニベルシテートハイデルベルグ
Priority date: 1996-07-30
Filing date: 1997-07-30
Publication date: 2000-11-28
Also published as: CA2261999A1; DE59712469D1; EP0956357A1; ES2251738T3; WO1998004722A1; EP0956357B1; CA2261999C; ATE308620T1; US6384300B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、インベルターゼの酵素活性を減少させ得るポリペプチドをコードする少なくとも１種の核酸配列、ポリペプチドそれ自身、並びにこの核酸配列を含むトランスジェニック植物に関する。さらに、本発明は、貯蔵に関連するスクロース損失を減少させた、そのようなトランスジェニック植物を作成する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】インベルターゼ阻害剤本発明は、インベルターゼの酵素活性を下げることができるポリペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸配列を含む核酸、ポリペプチドそれ自体、並びに、この核酸配列を含むトランスジェニック植物に関するものである。本発明は、さらに、貯蔵スクロースの損失の低下したトランスジェニック植物の調製方法に関する。テンサイ(Beta vulgaris)を貯蔵している間、収穫から処理の間の期間に、呼吸又はスクロースの代謝が、一日あたり、約0.02％のスクロースの損失を導く。さらにこの損失は、還元糖の増加、とりわけフルクトース及びグルコースの増加 (Burba,M.(1976),"Respiration and Sucrose Metabolism of Sugar Beets in St orage,"Zeitschri な品質の劣化を伴う。貯蔵の間、スクロースの分解の最初の代謝段階は、液胞のインベルターゼによる酵素的な加水分解である。この酵素は、傷害の後、テンサイ組織において新しく(de novo)合成される（Milling,R.J.,Leigh,R.A.,and Hal l,J.L.(1993),"Synthesis of a Vacuolar Acid Invertase in Washed Discs of Storage Root Tissue of Red Beet(Beta vulgaris L.)",J.Exp.Bot.4 4:1687-1694)。テンサイのスクロースのバルクは、細胞の液胞に局在するため、（傷害に）誘導された液胞のインベルターゼは、貯蔵スクロースの損失に中心的な役割を果たす。現在、貯蔵スクロースの損失の問題に対する、満足のいく解決策はない(Burba ,1976)。従来技術の技術における、最も重要な実施策は、低温(12℃以下)に及びよく限定された大気湿度(90-96％の間)を維持することにある。しかし、貯蔵損失を減らするため、これまで採られた全ての対策は、満足のいくものではない。貯蔵中のスクロースの、六炭糖のグルコースやフルクトースへの転換、およびこのようなスクロースの損失は、ジャガイモの”コールドスウィートニング(co ld sweetening)”の間にも起きる。低温処理の結果、液胞インベルターゼがジャガイモの塊茎で誘導され、六炭糖に対す K.,Sonnewald,U.(1996),"Soluble Acid Invertase Determines the Hexose-to-S ucrose Ratio in Cold-Stored Potato Tubers,"Planta 198:246-252）。コールドスウィートニングの結果としての六炭糖の形成は、例えばフレンチ−フライドポテトを作る際に、品質の低下を導く。トマト果実(Lycopersicon esculentum Mill.)は、高い水分含量を示す。これは、浸透圧的に活性な内生糖(スクロースおよび六炭糖)に一部起因する。スクロースの、インベルターゼが介在する加水分解を阻害することにより、全糖含量を引き下げると、より低い水分含量の、より小さな果実を導く(Klann,E.M.,Hall,B .,Bennett,A.B.(1996),"Antisense Acid Invertase(TIV1)Gene Alters Soluble Sugar Composition and Size in Transgenic Tomato Fruit,"Plant Physiology 112:1321-1330)。トマト果実の水分含量の低下は、果実の濃縮液(例えば、ケチャップ)を生産する上で、エネルギーコストの節約を導く。インベルターゼのアンチセンス発現を介した液胞インベルターゼ活性の低下は、多様なイソ型の産生があるため完全ではない。そのため、インベルターゼ阻害剤の形質転換導入は、特に前記インベルターゼ阻害剤が、これら様々なイソ型に対して同等の阻害作用を有する場合、大きな利益に帰するかもしれない。そのため、植物において、本質的に、貯蔵と関するスクロースの損失がない、新しい系を創り出すことが、本発明の目的である。この目的は、請求の範囲に特徴付けられた、本発明の主題により達成される。本発明の最初の主題は、ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む核酸に関しており、このポリペプチドはインベルターゼの酵素活性を減少させるか若しくは低下させることができる。 ”核酸”及び”核酸配列”という用語は、デオキシリボヌクレオチド、および /またはリボヌクレオチド、および/または修飾されたヌクレオチド由来の、天然の、半合成の、合成の、若しくは修飾された核酸分子を意味する。 ”ポリペプチド”という用語は、天然に生じるポリペプチドおよび組換えポリペプチドを意味する。組換えポリペプチドは、元々のゲノムの天然のDNA、もしくは外来のDNA配列で修飾された天然のDNAを基にして、分子生物学的技術で調製された構造物を意味しており、該構造物は、例えばプラスミドで組換えたり、適当な宿主系において複製されたり、発現され得る。 ”インベルターゼの酵素活性を減少させることができるポリペプチド”という表現は、インベルターゼに結合する過程において、前記インベルターゼの酵素活性を低下させ、阻害タンパク質の十分な量がある場合に、完全な阻害が可能となるポリペプチドを意味している。液胞のインベルターゼの約90％の阻害は、好ましくはトランスジェニック植物において、阻害剤の発現により達成される。本発明の実施態様において、植物細胞のインベルターゼは液胞に局在している。別の実施態様では、インベルターゼは細胞壁に局在している。さらに別の実施態様では、インベルターゼは、細胞質に局在している。インベルターゼは、好ましくはテンサイ、ジャガイモ、又はトマトに由来する。本発明の好ましい実施態様において、核酸は、図1(配列番号1)、図3(配列番号 2)、図12(配列番号3)および図14(配列番号4)に示される核酸配列、もしくはそのセグメントもしくはそのフラグメント、並びに、図1,3,12、もしくは14に示される核酸配列の相補的な配列とハイブリッド形成できる核酸配列、もしくはそのセグメントもしくはそのフラグメントを含む。別の実施態様において、本発明による核酸は、さらに標的配列をコードする核酸配列を含む。”標的配列”という用語は、明確な細胞のコンパートメントへの細胞標的化を仲介する、例えば、液胞内への標的化を仲介するアミノ酸配列を意味する。本発明の好ましい実施態様において、標的配列は次に示すアミノ酸配列： LEGVFAEIAASNSTLVAE をもつ、大麦レクチンの液胞標的配列を含む。別の実施態様において、本発明による核酸は、さらにシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。”シグナルペプチド”という用語は、シグナル認識粒子（signal recognition particle:SRP）によって認識される疎水性のアミノ酸配列を意味する。SRPは、粗面の小胞体(ER)上で完全なポリペプチドの合成を仲介し、その結果ポリペプチドはER内腔(lumen)に放出される。さらなる実施態様では、本発明による核酸は、ER保持配列(retention sequenc e)をコードする核酸配列を含む。好ましい実施態様では、シグナルペプチドはインベルターゼ、好ましくは、タバコの細胞壁のインベルターゼに由来する。本発明の別の実施態様では、核酸は、さらに植物での発現に適したプロモーターを含む核酸配列を含む。このプロモーター、もしくはプロモーター配列は、好ましくは、インベルターゼと同じ植物に由来する。本発明の特に好ましい実施態様では、プロモーターはジャガイモもしくはテンサイに特異的なプロモーターである。要約すると、本発明による核酸は、ポリペプチドをコードする、先に定義した核酸配列を含むことができ、およびもし適当であれば、標的配列および/または先に定義したプロモーターをコードする、先に定義した核酸配列を含むことができ、そこではアミノ酸配列をコードする全ての核酸配列は、好ましくはリーディングフレームに配置され、遺伝コードにより縮重され得る。本発明のさらなる主題は、原核もしくは真核の宿主細胞において、組換えポリペプチドの発現のための、本発明により先に定義された核酸を含むベクターである。本発明によるベクターは、好ましくはプロモーター、エンハンサー、終末配列のような適切な調節エレメントを含むことができる。本発明によるベクターは、例えば、発現ベクター、もしくは、好ましくは宿主細胞の遺伝物質に、本発明による核酸を安定して組込むベクターであり得る。適切な発現系は、例えばTiプラスミド、もしくは植物の遺伝物質に、本発明による核酸を安定して組込むためのベクターとして、アグロバクテリウムチュメファシエンス(Agrobacterium tu mefaciens)におけるバイナリープラスミド系(binary plasmid system)を含む。さらに、本発明による核酸は、例えば、アグロバクテリウムリゾジェネス(Agr obacterium rhizogenes)のRiプラスミドにより、ポリエチレングリコールを介する直接の遺伝子転移により、電気穿孔法により、若しくは粒子衝撃法により、植物の遺伝物質に挿入され得る。本発明のさらなる主題は、本発明による核酸、若しくは本発明によるベクターを含む宿主細胞である。適切な宿主細胞は、例えば、大腸菌(E.coli)のような原核生物、若しくはサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、スキゾサッカロマイセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ハンセヌラポリモルハ（Hansenula polymorha)、ピヒアパストリス(Pichia pastoris)ような真核生物の宿主細胞、およびバキュロウイルス(baculovirus)に感染した昆虫の細胞である。本発明のさらなる主題は、先に定義した核酸配列にコードされたポリペプチドそれ自体であり、核酸配列は遺伝コードに従い縮重され得る。本発明によるポリペプチドは、インベルターゼの酵素活性を低下させることのできる、少なくとも１つのアミノ酸配列セグメントを含む。特に好ましい実施態様では、ポリペプチドは図1(配列番号5),3(配列番号6),12(配列番号7)および14(配列番号8)に示されるアミノ酸配列、もしくはそのセグメントもしくはそのフラグメントを含む。” ポリペプチド”という用語は、さらに、例えば、同じ植物由来のイソ型、およびタンパク質レベルでの相同性が、好ましくは70％を超える、他の植物種の相同な阻害剤の配列を含む。本発明の実施態様において、ポリペプチドは、さらにポリペプチドのC-末端に配置されたアミノ酸配列、即ち先に定義した標的配列、および/または、例えば”KDEL”のようなER保持配列を含んだアミノ酸配列を含み、および/またはポリペプチドのN-末端に配置されたアミノ酸配列、即ち先に定義したシグナルペブチドを含むアミノ酸配列を含む。本発明による核酸配列、本発明によるベクター、および本発明によるポリペプチドは、先行技術の方法により調整され得る。本発明のさらなる主題は、少なくとも先に定義した本発明の核酸を含むトランスジェニック植物である。 ”トランスジェニック植物”もしくは”植物”という用語は、植物全体のみならず、根、茎、葉、器官特異的な組織もしくは細胞、その再生物質、とりわけ種、およびその胚といった植物の部分を含む。この用語は、さらに、トマトやトウモロコシばかりでなく、例えばジャガイモ、サツマイモ、キャッサバのようなでんぷん質の塊茎およびでんぷん質の根、および例えばさとうきび、テンサイのような砂糖植物(sugar plants)を含む。本発明の好ましい実施態様において、トランスジェニック植物の野生型はテンサイ、トマト若しくはジャガイモである。本発明のさらなる主題は、本発明によるトランスジェニック植物の調製方法であり、そこで、植物細胞は、遺伝物質に、先に定義した核酸の、安定な組込みにより形質転換され、さらに形質転換された植物細胞は、トランスジェニック植物に再生される。トランスジェニック植物の調製法は、先行技術において公知である。本発明のさらなる主題は、貯蔵スクロース損失の低下したトランスジェニック植物の調製のための、先に定義した核酸の使用に関する。トランスジェニック植物において、”インベルターゼ阻害タンパク質”として先に定義したポリペプチドの発現による貯蔵スクロース損失の低下は、意外にも、例えばテンサイもしくはジャガイモの塊茎の質を向上させるための、高い特異性をもった、環境的に安全な方法であることが、本発明により言及され得る。テンサイにとって、必要とされる生産能力の低下は、所与の生産性レベルに対する、糖回復の効率の後押しにより可能となる。ジャガイモの場合、ジャガイモの生産物の質は、とりわけフレンチ−フライドポテトを作るためには、冷蔵に誘導される六炭糖形成の減少により高められる。トマトの場合には、トマト果実の水分含量は、浸透圧的に活性な六炭糖の減少により低められる。インベルターゼ阻害剤をコードする核酸配列と、好適な標的配列をコードする核酸配列の組み合わせにより、発現したインベルターゼ阻害剤の、液胞内への正確な液胞標的化が、例えば、達成され得るし、さらにこのようなインベルターゼ阻害剤の発現が、空間中に制限され得る。さらに、インベルターゼ阻害剤の発現は、例えば、ビートや塊茎に特異的なプロモーターの利用により、時間内に制限され得る。図は以下を示す：図１は、ニコチアナタバカム(Nicotiana tabacum)由来の、インベルターゼ阻害剤をコードする、1701塩基対の長さで、オープンリーディングフレーム(ORF) が、開始ヌクレオチド1をもつ、477塩基対からなる、cDNAを示す。この核酸配列にコードされたインベルターゼ阻害剤は、計算上の分子量Mr18915、計算上の等電点10.13の159アミノ酸を示す。図2 は、植物の形質転換のため、本発明の好ましい実施態様の阻害剤構築の、概要的な調製を示す。図3 は、タバコ細胞の細胞壁に局在する、631塩基対(ポリ(A)を除く)の長さのインベルターゼ阻害剤をコードするさらなるcDNAを示す。細胞壁への分泌に用いられるシグナル配列は、イタリック体で示す。切断の部位は、成熟したタンパク質の部分的に配列決定されたN-末端配列と同じであり、矢印で示す。図4 は、大腸菌(E.coli)において、組換えタバコインベルターゼ阻害剤の発現を示す。図3に示したcDNAは、pQEベクター(Qiagen,Hilden,Germany)にクローン化した。組換えタンパク質は、His-tag化された融合タンパク質として発現された。A:M,分子量マーカー；1：誘導されていないバクテリア；2:IPTGで誘導されたバクテリア；3：アフィニティークロマトグラフィー(Ni-NTA)で精製された、組換えタバコインベルターゼ阻害剤。B：A由来の画分1〜 3の、阻害剤に対するポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロット分析。図5 は、組換え阻害タンパク質による、タバコの細胞壁インベルターゼの用量依存的な阻害を示す。●はスクロースの非存在下で、両方のタンパク質のプレインキュベーション後の阻害を示し、■はプレインキュベーションしないときの阻害を示す。図6 は、傷害の後、テンサイにおける、酸性インベルターゼ活性の誘導を示す。図7 は、傷害を受けたテンサイの全インベルターゼ活性の、タバコの細胞培養物に由来するインベルターゼ阻害剤による、阻害を示す。図8 は、組換えタバコインベルターゼ阻害剤による、テンサイの細胞壁のインベルターゼの阻害を示す（図3-5参照）。●はスクロースの非存在下で、両方のタンパク質をプレインキュベーションした後の阻害を示し、■はプレインキュベーションしないときの阻害を示す。図9 は、傷害を受けたテンサイの全インベルターゼ活性(液胞のインベルターゼ＋細胞壁のインベルターゼ)の、組換えタバコインベルターゼ阻害剤による阻害を示す(図3〜5参照)。●はスクロースの非存在下で、両方のタンパク質をプレインキュベーションした後の阻害を示し、■はプレインキュベーションのないときの阻害を示す。図10 は、トマト果実からの液胞インベルターゼ(VI)の免疫学的な同定、及びタバコのインベルターゼ阻害剤と相同なトマトの阻害剤(INH)の検出、を示す。両方のタンパク質は、ポリクローナルの単一特異性抗血清(monospecific antisera) で検出した。SDS-PAGEとウエスタンブロットの後、VIは52および20kDaの２つの分解産物を示す。VIはコンカナバリンA(concanavalin A)セファロースに完全に結合するのに対し、トマトのインベルターゼ阻害剤は、con-A結合、con-A非結合の画分に、ほぼ等量で存在することを示す。図11 は、トマトのVIの、組換えタバコインベルターゼ阻害剤による阻害を示す( 図3-5参照)。●はスクロースの非存在下で、両方のタンパク質をプレインキュベーションした後の阻害を示し、■はプレインキュベーションしないときの阻害を示す。図12 は、トマトのインベルターゼ阻害剤の部分的なcDNA配列を示し、それはトマトの花のcDNAからRT-PCRにより増幅された。図13 は、２つの(同じ)部分的なトマトのインベルターゼ阻害剤のクローンと、タバコのインベルターゼ阻害剤の比較を示す(図３参照)。図14 は、図3のインベルターゼ阻害剤のクローンの、細胞質の相同物のcDNA配列を示す。このクローンにコードされたタンパク質は、細胞質ゾルのインベルターゼを阻害できる。本発明は、以下に示す実施例により、より詳細に説明される。実施例必要な遺伝子構成を調製するため、以下の実施例で用いたすべての方法は、分子生物学の操作にとって、標準的な方法に相当する(Ausubel,F.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Seidmann,J .G.(1987-1996),Smith,J.A.,and Struhl,K.,Current Protocols in Molecular B iology,Greene Publishing)。その方法は、本質的に次の段階に細分化される： (1)阻害タンパク質は、細胞壁タンパク質の選択的な塩溶離、２つのイオン交換クロマトグラフィー、およびそのあとにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことにより、等質に精製する。 (2)相同な阻害タンパク質をトリプシンで消化し、その結果生じた阻害タンパク質のペプチドを、エドマン分解法で配列決定する。 (3)得られたペプチド配列を基に、同義のプライマーを合成する；その助けを借り、阻害剤のcDNAのDNA断片を、全cDNAからPCR反応により増幅する。 (4)cDNAライブラリーは、タバコ細胞培養物から調製する (5)阻害剤cDNAの得られた部分的な配列(段階(2)参照)は、cDNAライブラリーのスクリーニングに用いられる。 (6)大腸菌に発現後(Qiagen pQEべクターにクローニング)、得られた全長のクローンは、その機能(インベルターゼ阻害)について確かめられる。 (7)阻害タンパク質をコードするcDNAクローンのセグメント(図１)は、PCRにより増幅される。シグナル配列と標的配列との次のライゲーションを許す制限切断部位を有するプライマーが、この目的に使われる。シグナル配列は5'末端に連結され、液胞に対する標的配列は3'末端に連結される。シグナル配列の回復：シグナル配列は、タバコ細胞壁インベルターゼのcDNAから(Greiner,S.,Weil,M.,Krausgri ll,S.,and Rausch,T.(1995),Plant Physiolog y 108:825-826)PCRにより(領域Met¹-Val²³)増幅される。阻害剤cDNAへの次のライゲーションを許す制限切断部位をもつプライマーが、この目的のために使われる。標的配列の回復：標的配列は、大麦レクチン(Bednarek,S.Y.,and Taikhel,N.V .(1991),Plant Cell 3:1195-1206)のためのcDNAから増幅される。再び、阻害剤のcDNAへの結合を許す制限切断部位をもつプライマーが、この目的のために使われる。図3(配列番号2)に示した核酸のセンス鎖のクローニングのため、完全な核酸が、pBK-CMVベクター(Stratagene ZAP発現ファージから、in vivoで切断され生じる)から、制限エンドヌクレアーゼBamHIとXbaIの助けを借り切り出される。得られたDNAフラグメントは、BamHI/XbaIで切断されたバイナリー形質転換ベクターに連結され、バクテリアに形質転換する。図3(配列番号2)に示した核酸のアンチセンス鎖のクローニングのため、制限エンドヌクレアーゼBamHIとKpnIが用いられる。それ以外の手続は、センス鎖のクローニングと同じである。同様な方法が、図14(配列番号4)由来の核酸のセンス鎖、及びアンチセンス鎖のクローニングのために用いられる。このように得られた構築物が、アグロバクテリウムチュメファシエンス(Agrob acuterium tumefaciens)が仲介する、植物(例えば、テンサイ、ジャガイモおよびトマト)への遺伝子転移に用いられる。図3,4からの核酸に対する液胞標的配列の挿入は、図1からの核酸について記載されたように行われる。 (8)(7)に示した遺伝子構築物の5'末端は、テンサイに特異的なプロモーターに連結され、これによって得られた構築物は、バイナリー発現ベクターにクローニングされる。 (9)標的植物は、適切な、既存技術の、形質転換法により、形質転換される。形質転換に用いられた遺伝子構成物の構造は、図２に示される。タバコ細胞で発現したインベルターゼ阻害剤に対する抗血清が、cDNAライブラリーのスクリーニングのために開発された。相同なcDNAプローブも、部分的なアミノ酸配列に由来するオリゴヌクレオチドを用い、PCR反応により得られた。さらに、オリゴヌクレオチドを用いるスクリーニングが実施された。図1に示したクローンは、オリゴヌクレオチドスクリ−ニングで単離された。300塩基対のフラグメントは、RT-PCRにより増幅され、次いで、cDNAライブラリーのスクリーニングのためのプローブとして用いられた。図3に示したクローンは、この方法で単離された。後者は、大腸菌(E.coli)で、His-tag化した融合タンパク質として発現された(図4)。組換え阻害タンパク質は、タバコ由来の細胞壁インベルターゼを阻害し、このインベルターゼのイソ型に対しては、基質の部分的な保護が認められたが(図5) 、他の液胞のインベルターゼ、又は細胞壁に局在するインベルターゼには、前記の保護は起こらなかった(以下参照)。その上、細胞質ゾルに局在する、図3に示した阻害剤のクローンの相同体が単離された(図14)。このクローンにコードされたタンパク質は、細胞質ゾルのインベルターゼの阻害剤として作用できる。傷害を受けたテンサイのインベルターゼ活性(図6)は、タバコの細胞から分離された阻害タンパク質により、阻害され得る(図7)。組換えタバコ阻害タンパク質を用いた酵素の反応速度論は、傷害を受けたテンサイ中の全インベルターゼ活性(図9)と、テンサイの部分的に精製された細胞壁インベルターゼ(図8)の両方が、タバコ由来のインベルターゼ阻害剤により、阻害され得ることを確認する。トマト果実では、液胞のインベルターゼが最初に発現され、それは、SDS-PAGE による分離で２つの分解産物(52及び20kDa、図10参照)になる。液胞のインベルターゼに加え、約19kDaの、おそらく細胞壁の空間に局在するインベルターゼ阻害剤も発現する；それは、タバコのインベルターゼ阻害剤に対する抗血清と交差反応する(図10)。トマト果実から分離された液胞インベルターゼは、組換えタバコインベルターゼ阻害剤により、同様に阻害される(図11)。タバコのインベルターゼ阻害剤の配列と、RT-PCRにより得られたトマトcDNA部分配列の著しい配列の相同性は(図12,13 )、果実で発現されるトマトのインベルターゼ阻害剤は、液胞インベルターゼについて、(細胞壁空間に)区画されるかもしれないこと、および、このため、in v ivoでは液胞インベルターゼを阻害しないことを示唆する。要約すると、アポブラストのタバコインベルターゼ阻害剤(図3)は、特にテンサイとトマトにおいて、細胞壁のインベルターゼと液胞のインベルターゼの両方を、完全に阻害できることを実証した。正確な細胞標的化により、タバコのインベルターゼ阻害剤は、形質転換した植物(テンサイ、ジャガイモ、トマト)において、液胞のインベルターゼおよび/または細胞壁に局在するインベルターゼを減少させるために使われ得る。細胞質ゾルに局在するインベルターゼ阻害剤(図14) は、細胞質ゾルのインベルターゼを制御する。トランスジェニック植物において、その阻害はスクロース/六炭糖の比率について、有益な効果も持ち得る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年９月１４日（１９９８．９．１４）【補正内容】請求の範囲１．ポリペプチドをコードする図３(配列番号２)、１２(配列番号３)または１４(配列番号４)に示される少なくとも１種の核酸配列またはそのセグメントを含む核酸であって、該ポリペプチドはインベルターゼの酵素活性を減少させ得る。２．植物細胞中のインベルターゼが液胞に局在する、請求項１に記載の核酸。３．植物細胞中のインベルターゼが細胞壁中に局在する、請求項１に記載の核酸。４．植物細胞中のインベルターゼが細胞質ゾル中に局在する、請求項１に記載の核酸。５．インベルターゼがテンサイ、ジャガイモまたはトマトに由来する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の核酸。６．さらに標的配列をコードする少なくとも１種の核酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の核酸。７．標的配列がオオムギレクチンの液胞標的配列を含む、請求項６に記載の核酸。８．さらにシグナルペプチドをコードする少なくとも１種の核酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１つに記載の核酸。９．シグナルペプチドがインベルターゼに由来する、請求項８に記載の核酸。１０．シグナルペプチドがタバコからの細胞壁インベルターゼに由来する、請求項８または９に記載の核酸。１１．さらにＥＲ保持配列をコードする少なくとも１種の核酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の核酸。１２．さらに植物中での発現に好適なプロモーターを含む少なくとも１種の核酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の核酸。１３．プロモーターがインベルターゼと同じ植物に由来する、請求項１２に記載の核酸。１４．プロモーターがジャガイモ、トマトまたはテンサイに特異的なプロモーターである、請求項１２または１３に記載の核酸。１５．請求項１〜１４のいずれか１つに記載の核酸を含むブクター。１６．請求項１〜１４のいずれか１つに記載の核酸または請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。１７．図３(配列番号６)、１２(配列番号７)または１４(配列番号８)に示されるアミノ酸配列またはそのフラグメント、並びに他の植物種の相同性配列を含む、インベルターゼの酵素活性を減少させ得る少なくとも１種のアミノ酸配列セグメントを含むポリペプチドであって、タンパク質レベルでの相同性は＞７０％である。１８．さらにポリペプチドのC-末端で整列されたアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が標的配列および／またはER保持配列を含む、請求項１７に記載のポリペプチド。１９．標的配列がオオムギレクチンの液胞標的配列を含む、請求項１８に記載のポリペプチド。２０．さらにポリペプチドのN-末端で整列されたアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がシグナルペプチドを含む、請求項１７〜１９のいずれか１つに記載のポリペプチド。２１．シグナルペプチドがインベルターゼに由来する、請求項２０に記載のポリペプチド。２２．シグナルペプチドがタバコからの細胞壁インベルターゼに由来する、請求項２０または２１に記載のポリペプチド。２３．請求項１〜１４のいずれか１つに記載の少なくとも１種の核酸を遺伝物質中に安定に組込んで含むトランスジェニック植物。２４．その野生型がテンサイである、請求項２２に記載.のトランスジェニック植物。２５．その野生型がジャガイモである、請求項２３に記載のトランスジェニック植物。２６．その野生型がトマトである、請求項２３に記載のトランスジェニック植物。２７．その野生型がサトウキビである、請求項２３に記載のトランスジェニック植物。２８．植物細胞が請求項１〜１４のいずれか１つに記載の核酸の遺伝物質中への安定な組込みによって形質転換され、形質転換された植物細胞がトランスジェニック植物に再生される、請求項２３〜２７のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物を作製する方法。２９．貯蔵スクロース損失を減少させたトランスジェニック植物を作製するための請求項１〜１４のいずれか１つに記載の核酸の使用。３０．ジャガイモ中の冷却誘発ヘキソース形成を減少させるための請求項１〜１４のいずれか１つに記載の核酸の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者グレイナーステフェンドイツ国ディー―63071 オッフェンバッハライプニッツシュトラーセ 57

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリペプチドをコードする少なくとも１種の核酸配列を含む核酸であって、該ポリペプチドはインベルターゼの酵素活性を減少させ得る。２．植物細胞中のインベルターゼが液胞に局在する、請求項１に記載の核酸。３．植物細胞中のインベルターゼが細胞壁中に局在する、請求項１に記載の核酸。４．植物細胞中のインベルターゼが細胞質ゾル中に局在する、請求項１に記載の核酸。５．インベルターゼがテンサイ、ジャガイモまたはトマトに由来する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の核酸。６．図１(配列番号１)、３(配列番号２)、１２(配列番号３)または１４(配列番号４)に示される核酸配列またはそのセグメントまたはその相補性配列にハイブリダイズする核酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の核酸。７．さらに標的配列をコードする少なくとも１種の核酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１つに記載の核酸。８．標的配列がオオムギレクチンの液胞標的配列を含む、請求項７に記載の核酸。９．さらにシグナルペプチドをコードする少なくとも１種の核酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか１つに記載の核酸。１０．シグナルペプチドがインベルターゼに由来する、請求項９に記載の核酸。１１．シグナルペプチドがタバコからの細胞壁インベルターゼに由来する、請求項９または１０に記載の核酸。１２．さらにＥＲ保持配列をコードする少なくとも１種の核酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の核酸。１３．さらに植物中での発現に好適なプロモーターを含む少なくとも１種の核酸配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の核酸。１４．プロモーターがインベルターゼと同じ植物に由来する、請求項１３に記載の核酸。１５．プロモーターがジャガイモ、トマトまたはテンサイに特異的なプロモーターである、請求項１３または１４に記載の核酸。１６．請求項１〜１５のいずれか１つに記載の核酸を含むベクター。１７．請求項１〜１５のいずれか１つに記載の核酸または請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。１８．インベルターゼの酵素活性を減少させ得る少なくとも１種のアミノ酸配列セグメントを含むポリペプチド。１９．図１(配列番号４)、３(配列番号６)、１２(配列番号７)または１４(配列番号８)に示されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む、請求項１８に記載のポリペプチド。２０．さらにポリペプチドのC-末端で整列されたアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が標的配列および／またはＥＲ保持配列を含む、請求項１８または１９に記載のポリペプチド。２１．標的配列がオオムギレクチンの液胞標的配列を含む、請求項２０に記載のポリペプチド。２２．さらにポリペプチドのN-末端で整列されたアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がシグナル配列を含む、請求項１８〜２１のいずれか１つに記載のポリペプチド。２３．シグナルペプチドがインベルターゼに由来する、請求項２２に記載のポリペプチド。２４．シグナルペプチドがタバコからの細胞壁インベルターゼに由来する、請求項２２または２３に記載のポリペプチド。２５．請求項１〜１５のいずれか１つに記載の少なくとも１種の核酸を含むトランスジェニック植物。２６．その野生型がテンサイである、請求項２５に記載のトランスジェニック植物。２７．その野生型がジャガイモである、請求項２５に記載のトランスジェニック植物。２８．その野生型がトマトである、請求項２５に記載のトランスジェニック植物。２９．植物細胞が請求項１〜１５のいずれか１つに記載の核酸の遺伝物質中への安定な組込みによって形質転換され、形質転換された植物細胞がトランスジェニック植物に再生される、請求項２５〜２８のいずれか１つに記載のトランスジェニック植物を作製する方法。３０．貯蔵スクロース損失を減少させたトランスジェニック植物を作製するための請求項１〜１５のいずれか１つに記載の核酸の使用。