JP2000515768A

JP2000515768A - Ｎｏｎ−ｍｎｏｎ−ｏｈｉｖ−１株、フラグメントおよび使用

Info

Publication number: JP2000515768A
Application number: JP10526284A
Authority: JP
Inventors: フィリペモークレール; イブティサムルセール−アジャカ; フランソワシモン; セントサラゴスチ; フランソワバレ−シヌシ
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1996-12-09
Filing date: 1997-12-08
Publication date: 2000-11-28
Also published as: US6509018B1; US20070190524A1; BRPI9713891B8; WO1998026075A1; DE69739251D1; US7534877B2; ATE422544T1; CN1244896B; US20100184014A1; CA2274490C; EP0946731B1; US20030157660A1; DK0946731T3; US7030234B2; PT946731E; US8227185B2; FR2756843A1; BRPI9713891A; BRPI9713891B1; CN1244896A

Abstract

(57)【要約】 non-M、non-0 HIV-1グループのレトロウイルス株、特にYBF30と称される株、そのフラグメント、さらに診断用試薬として及び免疫原性剤としてのその使用。Mグループおよび0グループの両方とも異なるHIV-1ウイルスは、下記の特徴を示す： ^*Mおよび0グループのタンパク質に関して血清学的反応を殆どか又は全く有さず、本発明によるYBF30株またはCPZGAB SIV株に由来するタンパク質に関しては強い血清学的反応性；^*Mおよび0グループHIV-1グループのenvおよびgag領域からのプライマーを用いるとき、ゲノム増幅が不存在； ^*本発明によるYBF30株に由来するプライマー存在下でのゲノム増幅；および^*YBF30株に関して＞70%であるエンベロープ遺伝子の産物のホモロジー。

Description

【発明の詳細な説明】ＮＯＮ−ＭＮＯＮ−ＯＨＩＶ−１株、フラグメントおよび使用本発明は、non-M、non-O HIV-1グループのレトロウイルス株、特にYBF30と称される株、そのフラグメント、並びに診断試薬として及び免疫原性剤としてのその使用に関する。ヒト後天性免疫不全ウイルスHIV-1およびHIV-2は、レトロレンチウイルスであり、それはアフリカの多数の霊長類動物に見られるウイルスである。全てのこれらのウイルスは、共通の祖先を有するように見える；しかしながら、これらの異なるウイルスが、この祖先から分離することになった期間を判断するのは非常に難しい。より遠いが、にもかかわらず同じグループに属する他のウイルスは、他の哺乳動物(有蹄類動物およびネコ科動物)に見い出される。全てのこれらのウイルスは、長期感染と関連する；症状の不存在は、自然感染したサルの通例である。HIV-2の起源はSooty Mangabey(西アフリカ)ウイルスとのその強いホモロジーのために明確であるように見えるが、HIV-1に近縁のいかなるウイルスもサルでは見い出されていない。最も近縁のウイルスは、２種のチンバンジーで見い出されるウイルス(CPZGAB SIV、ANT SIV)である。全てのレンチウイルスは、実質的な遺伝子的変異性を発揮することが見い出され、多数の異なる地理的位置から得られるこれらの変種の系統学的研究は、８種のサブタイプ（クレード）のHIV-1が区別されることを可能にし、それら全ては互いに等距離にある。クレードは、変異性の発現の数学上の表現にすぎない：核酸に基づくよりもアミノ酸に基づく表現型分析は、異なる結果をもたらす(Korbe rら、1994)。サブタイプの表示は、系統学的分析に一致し、該分析は、今日までいかなる病理生理学的関連も有しないが、その代わり、地理的関連性は有する。これは、それぞれのサブタイプが、主として特定の地理的領域で見られることによる。Bサブタイプは、ヨーロッパおよび米国で優勢であるが、２つのサブタイプ、即ち、 EおよびBはタイで見られ、伝染様式に強い関連性があり、それは実際的事実では見い出された特定のポピュレーションおよびサブタイプに対応する。全てのクレードは、アフリカで見出され、世界の残りの部分でのそれらの分布は、ハイリスク行為にふける人間間の遭遇の可能性を反映している。主たるクレードは、それがアフリカでは重要な割合で存在しているので主要なものであり、クレードAである。非常に大きい度合いの変異は、幾つかのアフリカ諸国で見い出されている(G．Myer s、1994；P.M．Sharpら、1994)。幾つかのサブタイプが、中央アフリカ共和国(M urphyら、1993)およびカメルーン(Nkengasongら、1994)のような西部中央アフリカ諸国で特徴付けられている。最後に、HIV-1のウイルス変異種のキャリアである患者が特徴付けられており、それらの血清は、フランス市場で販売されていて確定型ウェスタンブロットが非定型である特定のキットに関する検出問題を提起している(Loussert-Ajakaら、1994；Simonら、1994；PCT国際出願WO96/27013)。これらの変異種の分析は、Charneauら、1994が提案したように、タイプ１ HIV ウイルスが、２つのグループ、即ち、M(主要)グループおよび、O(アウトライアー)グループに亜分類されるべきであり、これらの単離物を含むという事実を確認した。公知のOグループウイルスの配列について実施された同義性変異/非同義性変異の比率の分析は、この新しいグループが、たとえMグループよりも古くないとしても、やはり古いことを示す(Loussert-Ajakaら、1995)。今日までのその低い有病率、即ち、カメルーンでHIV-1に感染した8%の患者およびフランスで特徴付けられた18症例は、純粋な疫学的な要因によるものと考えられている。これら２グループのHIV-1は、二重星の形をしている樹の形態である(図9〜19) 。２つの単離物、即ち、ガボンからのチンパンジーから特徴付けられたCPZGAB S IV(Huetら、1990)およびアントワープ動物園のチンパンジーから特徴付けられた CPZANT SIVは、HIV-1に非常に近縁であるが、これら２グループのいずれの範疇にも属さず、系統樹の２つの新しい枝を形成する配列および遺伝子的構成を有する。新しい変異種の提示は、HIV感染を検出するための十分に鋭敏で特異的な試薬、即ち、偽陰性または偽陽性の結果をもたらさない試薬を開発するために、また、MグループもしくはOグループのいずれにも属さないサブタイプに関して保護的である組成物を開発するために重要である。結果として、出願人は、non-M、non-O株、並びにこの株由来の配列を提供する目的を自らに設定し、それらは、non-Mおよびnon-OのHIV-1変異種を検出するのに好適であり、偽陰性の結果や偽陽性の結果ももたらさない。これをするために、本発明者は特に、グループMおよびグループOのHIV-1感染を区別し確認するアルゴリズムを確立し、それによってnon-M、non-O変異種を選択可能にした。本発明は、1996年7月2日にコレクシオン・ナシオナル・ド・クルチュール・ド・ミクロオルガニスム(Collection Nationale de Cultu res de Microorganismes)に番号I-1753で寄託され(YBF30と名付けらた)、パストゥール研究所に維持されているレトロウイルスの形態学的および免疫学的特徴を有するnon-M、non-O HIV-1株に関する。 non-M、non-O変異種は、タイプ１ HIVを意味するが、血清学的および分子的にこれらのグループのいずれにも属するとは認められ得ない、として理解される。本発明は、上記の株の完全なヌクレオチド配列(配列番号1)ならびに、少なくとも10ヌクレオチドのサイズであり、前記株に由来する核酸フラグメントにも関する。言及され得るこのタイプのフラグメントは：も称される、並びに、上記のヌクレオチド配列の１つと同一でなく、これらの配列の１つに相補性ではないが、にもかかわらずnon-M、non-O HIV-1ウイルス由来の核酸配列と特異的にハイブリダイズし得る任意の配列である。そのような配列は、non-M、non-O HIV-1の特異的同定において、および任意の HIV-1の区別的同定のために、単独で又は他の試薬とプールされて、診断試薬として使用され得る。これらの配列は、特に、検出されるウイルス配列との直接的ハイブリダイゼーションまたは前記ウイルス配列の増幅のいずれかを含む診断テストで使用され得、これらのテストは、プライマーまたはプローブとして、少なくとも10ヌクレオチドを含み、上記配列のいずれか１つ、特に上記配列である配列番号21-57の１つに含まれるオリゴヌクレオチドを使用する。本発明は、MグループともOグループとも異なり、下記の特徴を示すことを特徴とするHIV-1ウイルスにも関する； ^*MおよびOグループのタンパク質に関して血清学的反応性を殆どか又は全く有さず、YBF30株またはCPZGAB SIV株に由来するタンパク質に関する強い血清学的反応性； ^*MおよびOグループのHIV-1ウイルスのenvおよびgag領域からのプライマーを用いるとき、ゲノム増幅が不存在； ^*上述のように、YBF30株に由来するプライマー存在下でのゲノム増幅；および ^*YBF30株に関して＞70%である、エンベロープ遺伝子の産物のホモロジー。本発明は、HIV-1タイプの核酸配列のハイブリダイゼーションおよび／または遺伝子増幅の方法を実行するための上記配列の使用にも関し、これらの方法は、 non-M、non-O HIV-1タイプのウイルスによる個体の潜在的感染のインビトロ診断に適用可能である。このインビトロ診断方法は、生物学的サンプル(血清または循環リンパ球)を用いて行なわれるもので、下記を包含する：．検出されるべき核酸を抽出する工程であって、該核酸はウイルスのゲノムに属し、該ウイルスは生物学的サンプル中に恐らく存在し得、および好適な場合にはこの核酸がRNA形態であるなら逆転写酵素を使用し核酸を用いて処理する工程、．核酸を変性させる工程、本発明に従い少なくとも１種の配列とハイブリダイズする工程、および好適な場合には、好適な試薬(DNAポリメラーゼおよびdNTP のような重合化試薬)の存在下に形成されたハイブリッドを伸張させる工程を包含する、少なくとも１サイクル、および．non-M、non-O HIV-1グループタイプのウイルスのゲノムに属する核酸の潜在的な存在を検出する工程。下記の条件は、YBF30株に由来するプライマーを用いてPCRのために使用される： −フェノール/クロロホルム技術によりリンパ球DNAを抽出し、それを波長26 0nmでの分光分析によって定量すること。全ての増幅は、Perkin Elmer 2400サーモサイクラーを用いて行なわれる。 −長い(9 kb)PCRは、XL PCRキット(Perkin Elmer)を製造業者の条件に従って、dNTP、提供された緩衝液およびPerkin Elmerの”hot start”を用いて行ない、この長いPCR増幅サイクルは次の通りである：．2分間94℃で１サイクルの変性、．続いて16サイクル：94℃で15秒間、55℃で15秒間、68℃で8分間、．続いて24サイクル：94℃で15秒間、55℃で15秒間、68℃で8分間、さらに1 5秒間(増分)をそれぞれのサイクルに加える。 −組み重ね式PCR(nested PCR)を、長いPCRの増幅産物に対して行なう。組み重ね式PCRを行なう条件は、次の通りである：．緩衝液および製造業者の使用説明書に従うBoehringer MannheimからのTaq ポリメラーゼ酵素《Expand High Fidelity PCR System》、dNTPおよびPerkin El merからの”hot start”、．200μmolの各dNTP、本発明による20pmolの各プライマー、５μｌのDNA、1 0μｌの10xPCR緩衝液、2.6単位のTaqポリメラーゼを100μｌの容積で、．増幅：2分間94℃で１サイクル、その後38サイクル：94℃で15秒間、55℃ で15秒間、72℃での伸長時間は、増幅されるPCR産物のサイズに従い変化する(30 秒から2分まで)、および最終伸長サイクルは72℃で10分間。増幅された産物は、好ましくは、直接的な配列決定によって検出される。本発明は、non-M、non-O HIV-1株により又は上述のヌクレオチド配列を用いて発現され得ることを特徴とする、および(1)上述のnon-M 、non-O HIV-1ウイルス、特にYBF30株またはこの株の変異種によって誘発され、 non-M、non-O HIV-1株による感染の後に得られる生物学的サンプル中に存在する抗体によって認識され得ること、および／または(2)抗non-M、non-O HIV-抗体の産生を誘導し得ることを特徴とする、ペプチドまたはペプチドフラグメントにも関する。言及され得るこのタイプのペプチドは、特に、YBF30株に由来するもの、特に：gag遺伝子によって発現されるもの(配列番号4)、pol遺伝子によって発現されるもの(配列番号6)、vlf遺伝子によって発現されるもの(配列番号8)、vpr遺伝子によって発現されるもの(配列番号10)、vpu遺伝子によって発現されるもの(配列番号12)、tat遺伝子によって発現されるもの(配列番号14)、rev遺伝子によって発現されるもの(配列番号16)、env遺伝子によって発現されるもの(配列番号18) 、またはV3ループ領域フラグメントのようなそのフラグメントの１つ、即ち、CT RPGNNTGGQVQIGPAMTFYNIEKIVGDIRQAYC(配列番号58)、およびnef遺伝子によって発現されるもの(配列番号20)、または上述のnon-M、non-O HIV-1による感染の間に産生される抗体を認識し得るこれらのペプチドのフラグメント、である。本発明は、本発明によるヌクレオチド配列の１種以上の翻訳産物、および／または特に合成手段によって得られる上述のペプチドの１種を含む免疫原性組成物にも関する。本発明は、１種以上の上記ペプチドに対する抗体、および特に、インビトロでのHIV-1タイプのウイルスによる個体の感染の区別的診断を、当業者に公知の方法を用いて実行するための、それらの使用にも関する。本発明は、non-M、non-O HIV-1株による感染後に得られる感染血清から単離される抗体によって認識され得る全てのペプチド、および本発明による抗体によって認識され得るペプチドを包含する。本発明はさらに、non-M、non-O HIV-1ウイルスのインビトロ診断のための方法に関し、該方法は、患者から採取された生物学的サンプルを請求項１０に記載の抗体に接触させること、ここで該抗体は抗CPZGAB SIV抗体と組合せることが可能でもあり得る、および生物学的サンプル中に存在することが可能でもあり得るHI V-1抗原と前記抗体との間で形成される免疫学的複合体を検出することを包含することを特徴とする。本発明は、HIV-1診断用キットにも関し、該キットは、本発明による少なくとも１種の試薬を含むことを特徴とする。上述の規定とは別に、本発明はまた、この後に続く本発明の主題である方法を実行する実施例および添付の図面を参照した説明から明らかになる他の規定を包含し、図面については： −図1〜7は、YBF30株のゲノム上の、異なるプライマーの位置を示す； −図８は、YBF30株のゲノム構成を示す； −図9〜16は、グループM HIV-1およびグループO HIV-1と比較した、YBF30株の異なる遺伝子の系統学的分析を示す(図9：ltr遺伝子、図10：gag遺伝子、図11 ：tat遺伝子、図12：rev遺伝子、図13：vlf遺伝子、図14：envgp120遺伝子、図1 5：env gp41遺伝子、図16：nef遺伝子、図17：pol遺伝子、図18：vpr遺伝子、図 19：vpu遺伝子)； −図20は、YBF30とHIV-1/CPZGAB SIVとの遺伝子的距離をパーセンテージで示す。しかしながら、勿論、これらの実施例は、本発明の主題を例示するためのみに示され、いかなる制限も構成しないことが理解されるべきである。実施例：本発明によるnon-M、non-O変異種(YBF30)を得ること及びその使用これは、特にカメルーンにおけるヒト後天性免疫不全ウイルス(HIV)による感染の疫学を研究することと関連して可能であったが、その疫学は特に逆説的である。この国では、株の多様性は、今日までに報告された公知のM(主要)グループのHIV-1ウイルスの殆どのサブタイプとして顕著である。Oグループ(アウトライアーとしてのO)の高度に多様性のHIV-1ウイルスで感染した症例が報告され、殆どもっぱらカメルーン起源の患者中にあった。HIV-2、HTLV-1およびHTLV-2のサブタイプAおよびBによる感染の症例も、報告された。以前の血清学的および遺伝子型評価の結果を基礎に考慮して、本発明者は、M およびOグループのHIV-1ウイルスによる感染を区別し確認するためのアルゴリズムを確立し、non-M、non-O変異種を選択した。これらの方法をサンプルに適用し、該サンプルはヤオウンド(Yaound)でのHIV 感染のためにラボラトワレ・ナシオナル・ド・リファレンス(Laboratoire Natio nal de R 徴付け、このヒトYBF30とサル株CPZGAB SIVとの間で観察されたホモロジーを考慮しながら、新しいHIV-1グループを特徴付ける手段を確立することを可能にした。Ｉ-疫学的研究の際にYBF30変異種を血清学的に特徴付ける方法 1)サンプルの採集： HIV感染を検出し確認するために、1994年および1995年にヤオウンド・ラボラトワレ・ド・リファレンスに送られた全ての成人患者の血清が研究された(n=883 1)。 2)グループMおよびグループOのHIV-1の間での血清学的区別、および変異種の選択： IV-1およびHIV-2 EIA、Sanofi-Pasteur、パリ、フランス)があった場合、これは次に、Mグループの特異的抗原との競合の原理に基づいてEIAテスト(Wellcozyme Rec HIV-1、Murex、ダートフォード、英国)と組合わされた。競合的Wellcozyme Rec HIV-1テストが陽性であり、閾値またはcut-off(CO)値と比較して光学密度(OD)における反応性の比率が５より大きい場合(CO/OD＞5)、血清はHIV-1陽性であると見なされ、その結果は新しいサンプルで確認されなければならない。競合テストをHIV-1による感染を確認するテストとしてみなすための５より大きい反応性比率の選択は、Bichat病院のウイルス研究室によって得られた経験に基づいている：＞５の比率で反応した7200サンプルの全ては、強く陽性のHIV-1ウェスタンブロット(WB、New Lav Blot 1、SDP、マルヌ・ラ・コケ)を示した。HIV-1セロコンバージョンの症例とは別に、HIV-1陽性であると確認し、Wellcozyme比率＜５を示すサンプルは、HIV-2による感染またはOグループ HIV-1もしくは他のHIV-1変異種による感染のいずれかに対応する。混合EIA検出を行なうとき偽陽性反応を排除するために、＜５のCO/OD比率を示すサンプルは、第３世代の混合HIV-1/HIV-2 EIA(Enzygnost Plus)マーブルグ、ドイツ)を用いて体系的にテストされ、該EIAはMおよびO HIV-1グループの抗原を含む(MVP5180株の組換えgp41)。このテストが陽性である場合、HIV-1とHIV-2とを判別する迅速なテスト(Multispot、SDP、マルヌ・ラ・コケ)およびウェスタンブロット(WB、New Lav Blot 1または2、SDP)を次に行なう。 3)ＯグループHIV-1およびHIV-1変異種による感染を血清学的に確認する＜５のCO/OD比率を示し、WB(陽性基準：2 ENV+/-POL+/-GAGまたは１ ENV+POL+ /-GAG)およびHIV-1によって陽性であると判別された全てのサンプルを、V3のペプチド抗原および貫膜領域(InnoLia、Innogenetics、ゲント、ベルギー)を用いて、ドットブロットテストで試験する。 4)グループOおよび変異株のレトロウイルス単離血清陽性の患者からの末梢血単核細胞(PBMC)を、カメルーンでFicoll-Hypaque 勾配によって単離し、その後保存し、液体窒素中でパリに輸送した。解凍した後、患者からのPBMCを、血清陰性のコーカサス人ドナーからのリンパ球とともに共同培養した。培養上清中のウイルス複製を、逆転写酵素活性を検出し、p24抗原(Elavia p24ポリクローナル、SDP)を検出するテストを１ヶ月間行なうことによって明示した。 5）配列： PCR産物を、フラグメントのサイズに依存して1−1.4％濃度のアガロースゲル上で可視化し、3M酢酸ナトリウム(1:10)および3容量の無水エタノール中で沈殿させ、-80℃で30分間インキュベートし、続いて、13,000rpmで20分間遠心分離した。ペレットを乾燥させ、その後10μｌの蒸留水(Sigma)に取る。精製を、"Qiaq uick Gel Extraction kit"(Qiagen)上で製造業者の使用説明書に従って行なう：産物を、自動DNAシークエンサー（Applied Biosystems，Inc.、フォスターシティ、カリフォルニア州)上で前記(Loussert-Ajakaら、1995)のようにApplied Bio system Dye Terminatorキットを用いて配列決定する；ヌクレオチド配列を、Sequence Navigatorソフトウエア(Applied Biosystems)上で分析し、GeneWorksソフトウェア(Intelligenetics Inc.)を用いて整列させる。 6)系統学的分析：配列は、複数の整列に関してはCLUSTALソフトウェアを用いて、また参照マトリックスとしてLaboratory of Biology and Theoretical Biophysics、ロスアラモス、ニューメキシコ、87545米国に所有されるHIV配列のコンパイルの整列として採用して、整列させた。系統学的分析を、PHYLIPソフトウェアを用いて行なった；距離を先ずDNADIST を用いて計算し、その後で系統学的分析をNEIGBOR JOININGまたはFITCHを用いて行なった；最後に、樹を、DRAWTREEを用いて描いた(図9〜19)。遺伝的距離のパーセンテージも、図20に示す。 SEQBOOTを、何よりも先ず、「ブートストラッピング(bootstrapping)」分析のために使用し、その後DNADISTおよびNEIGHBOR JOININGまたはFITCHを使用した。最後に、ブートストラッピング値を、CONSENSを用いて得た。 II‐グループOおよび変異HIVウイルスを検出するための調査の結果：スクリーニングで陽性であると判明した3193サンプルのうち174サンプルが、異常な血清反応によりグループO またはグループMとして、または変種であると見なされた。 III‐異常な血汗反応性を示す非グループOおよび非グループMサンプルの検出 WB(ウェスタンブロット)によりHIV-1陽性であったが、競合EIAにおいて＜５の CO/OD比率で反応した174個の血清を、グループM、グループOおよびCPZGAB SIVからのV3ペプチド上で判別性LIAドットブロットによりテストした： −７個は、提示されたペプチドのいずれにも反応しない(M、OまたはCPZGAB SIV)。いかなる細胞収集も無いことは、いかなる結論も引き出させない。 −82個は、Oグループ株のV3ループに対応するペプチドの少なくとも１種に関して反応性を示す。交叉反応の頻度は低く、エピトープに限定され、該エピトープはコンセンサスV3領域(11%)およびCPZGAB SIV V3領域(43%)に対応する。 −84個の血清は、Oグループ・エピトープとは反応しない。これらのサンプルの殆どは、AIDS症状を示す患者から得られた(75/84)。 −カメルーン人患者(NJ)から採取した１つの血清は、CPZGAB SIVペプチドと排他的に反応する。CPZGAB SIV抗原に関する、この孤立した反応性は、これまで記載されなかった。リンパ球は、患者から採取されたので、この株のウイルス学的特徴付けを続けることは可能であったし、それはYBF30と名付けられた。 IV‐この患者から採取(1995年5月)した最初のサンプルに対して為された血清学的およびウイルス学的検査の結果 (血清番号：95-6295)： 1)市販のELISAテスト(光学密度/閾値) 陽性の基準：OD/CO＞1 Wellcozyme CO/OD=1.55 Abbott Plus=＞15 Behring Plus=4.2 2)ウェスタンブロット New Lav 1 Pasteur WB： 160++、120++、68++、55+、41+、40+/-、34++、24++、1８+ 3)Innogenetics LIAドットブロットグループOおよびグループMのバンド全てに対する陰性なCPZGAB SIV V3 とは別である 4)M およびOグループに関して特異的であるペプチドに対して為された詳細な血清学的検査の結果 ^*Tours CHUのウイルス研究室のFrancis Barin教授によって開発された技術を改変した(Barin F.ら、1996)；MおよびOグループを区別するテストを開発するために、合成術は、OおよびMグループの貫膜gp41ペプチド間の抗体結合競合に基づくもので、それらを固相上に置き、OまたはMグループのいずれかのgp4l貫膜ペプチドは、高浸透圧液体反応相中でより高い濃度である。結果を下記の表Iに示すが、ここで、CPウェルは100%阻害コントロールに対応し、CSPウェルは0%阻害コントロールに対応する。表Ｉ 6295個の血清に関するグループO-グループM間での区別の結果これらの結果は、固相のペプチド(CSP)に関して強い結合があり、MおよびOペプチド(CP)の混合添加により顕著な阻害があるが、MペプチドによってもOペプチドによっても明確な区別がないことを明示している。これは、従って、感染株が、Mグループにも０グループのいずれにも属さないという血清学的証拠である。 ^*ペプチド間の競合の同じ根拠に基づき、CPZGAB SIV V3抗原に関してInnoLiaドットブロット中での孤立した反応性に鑑みて、gp41 M 、gp41,Oおよびgp41CPZGAB SIVペプチドを競合させることによって、この血清を研究した。 Amandineという名前のチンパンジーからの血清(CPZGAB SIV株を単離したM．Pe etersによって供与、AIDS 1992)の使用は、この技術を初めて有効なものにし得た。表IIで、最低値(OD)は、抗原結合の最高の度合いを示す。表ＩＩ Amandineチンパンジー血清および6295血清を用いたグループO-グループM-CPZGAB SIVの間での区別の結果 Amandine血清の反応性は、本発明によるテストを確認し有効にし、患者の血清はMおよびCPZGAB SIVペプチドに関して同一に反応するが、Oペプチドとの交叉反応は示さないことを示す。これらの結果は、グループM gp41およびCPZGAB SIVgp41ペプチドが、患者の血清に対して同様の阻害を示すことを明示する。感染株の抗原は、従って、グループMおよびCPZGAB SIV gp41ペプチドを同様に認識する抗体を生じる。 4)リンパ球単離から得られる結果(1995年5月に採取) 1995年5月22日に採取されたリンパ球から、標準的技術を用いて、レトロウイルスを単離した。MT2細胞系を用いた培養は、YBF30株がいかなるシンシチウム(N SI)も形成しないことを示す。 V‐２回目の血液サンプルに対して為された血汗清学的検査の結果(1995年11月)( 血清番号95-3371) 1)Innogenetics LIA ドットブロット CPZGAB SIV V3を別にして、全てのバンドに関して陰性である。 2)M およびOグループに関して特異的であるペプチドに対して為された詳細な血清学的検査の結果表IIIは、3371個の血清を用いた、グループO-グループM-CPZGAB SIV gp41間の区別の結果を示す。表 III 3371個の血清を用いたグループO-グループM-CPZGAB SIV gp41間での区別の結果これらの結果は、この新しい血液サンプル(疾病の最終段階にある同じ患者から採取)について、CPZGAB SIV gp41ペプチドが患者の血清を顕著に阻害することを確認する。感染株の抗原は、従って、CPZGAB SIV gp41ペプチドを優先的に認識する抗体を誘発した。 3)リンパ球単離からの結果(1995年11月の血液採取(95-3371-YBF31)) 1995年11月に採取されたリンパ球から、標準的技術を用いてレトロウイルスを単離し、YBF31と名付けた；配列エレメントは、YBF30のものと同一である。 VI‐YBF30 のゲノム増幅および配列全てのPCR操作ためのDNAを、陽性培養の終わりに得られた細胞から抽出する。 OグループHIV-1プライマーを用いて為されたPCRは、テストされた異なる領域( gag、pol、env)において陰性である。同様に、MグループHIV-1に特異的であるプライマーを用いて為されたものも、陰性である。 OグループPCRに関する増幅およびハイブリダイゼーション条件は、Loussert-A jaka、1995に記載されるものである。MグループPCRに関する増幅およびハイブリダイゼーション条件は、下記の著者に記載されるものである。これらMグループ・プライマーは、下記のように、HIV-1 HXB2配列に従って位置する： −envgp120において：ED3/ED12(位置5956-5985;7822-7792）；ED5/ED14(655 6-6581;7960-7931)；ED5/ED12；ED3/ED14；ES7/ES8(7001-7020;7667-7647)(Dela warｔらScience 1993;262:1257-1261)。 −env gp41において：最初のPCR、ED3/M29、続いて、組み重ね式PCR、M28/M 29(7785-7808;8099-8124)；M28/M29は、下記の配列を有する：SK68/SK69(Ouら、Science，1988;239:295-297)。 −gagにおいて：Amplicor Roche Diagnosticsシステムズ；組み重ねられたg agプライマー(Loussert-Ajakaら、Lancet 1995;346:912-913);SK38/SK39(Ouら、 Science，1988;239:295-297) −polにおいて：A/NE1(Boucherら、Lancet，1990；336:585-590);Pol3/Pol4 (Laurら、Lancet，1988，ii，538-541)。 H Polプライマー(4235/4538)を用いて為されたPCRのみが陽性であり、これはその後に、プライマー4327/4481 (Fransenら、Molecular and Cellular Probes 1994;8:317-322)を用いて組み重ね式PCRが行なわれた。このHPolフラグメントは、インテグラーゼ(260 bp)に位置しており、配列決定された。HP0Lプラィマーを用いた増幅は、過剰のウイルスにより可能となる。これは、使用されるDNAが、強度に陽性の培養の終わりに細胞から抽出されるからである(逆転写酵素＞100,000cpm)。新鮮な細胞から抽出されるDNAを共同培養することなしに増幅することは、HPOLプライマー（特に3領域で）とYBF30単離物の配列との多数の誤対合のために、不可能である。この3末端の変換は、Taqポリメラーゼの伸長活性には非常に重要である。１−pol遺伝子の配列：陽性培養上清から抽出されたRNAを、RT-PCRにより、増幅するための非常に縮重したプライマーの使用は、陽性の増幅を与える。これらは、全てのレトロウイルス（Donehowerら、J．Virol．Methods 1990;28:33-46 ）に共通するプライマーであり、pol遺伝子の逆転写領域に位置する。配列決定後のフラグメントの分析は、特異的プライマーであるYRT2(配列番号32)をYBF30 単離物から生成し、アンチセンスプライマーとしてHpol 4481プライマー(Franse nら、1994、上記)を用いてpol遺伝子を増幅することが可能になる。フラグメントを、生成された各フラグメントに関して要請されるように、特異的プライマーを合成することによって配列決定した(図１)。２−env遺伝子の配列：２回目のアプローチは、長いPCR(XL-PCR、Perkin El mer)を行なうことであった、これによってLTRに位置するプライマー：LPBS1(配列番号22);LSiGiを用いて全てのウイルス(9000 bp)を増幅し、続いて、YRT2(配列番号32)/SK69を用いて6000 bpの組み重ね式PCRを行い、同じ手順に従って全てのエンベロープを配列決定する。gp41領域は、組み重ね式PCRを用い、プライマーSK68/LSiGiを使用して、配列決定された。３−gag遺伝子の配列：プライマーGag 5およびGag 11iを用い、要請されたようにこの特殊なプライマーから生成する、長いPCR(LPBS 1/LSiGi)によって達成された、組み重ね式PCRの使用は、ウイルスゲノムをウォーキングする。 VII‐配列決定の結果株YBF30は、完全に配列決定された(配列表を参照)。1995年11月のYBF31株は、部分的に配列決定され、重要な変異の不存在は、YBF30配列の有効性を確認する。 VIII‐YBF30 株のV3ループ領域のペプチドの合成 V3ループ領域の配列の研究は、対応するペプチドを合成し、YBF30株のこの領域のアミノ酸を、他のMサブタイプおよびO株のものと比較することを可能にする。前記ペプチドの配列は：ループの5領域の２つのアスパラギンから開始して、ペプチドを合成し、前記( IV4を参照)と同じ原理、即ち、Mグループ、OグループおよびCPZGAB SIVのペプチドに関連して競合に使用した。表IVに示される結果は、この株の当初の性質および、これらの株の可能性のある広がりを確認する。というのも、血清学的結果は、カメルーンのYBF30タイプの感染を裏付けるからである。さらに、カメルーンからの200個の選択されたHIV-1陽性血清の研究は、YBF30のものと類似するプロフィールを示す新しい症例の証拠を提供する。表 IV 200個の血清の反応性の研究 CPZ ANT SIVからの血清 YBF30株が単離された患者に対応する血清953371および956295のCPZ SIVペプチドとの反応性が、この新しいテストにおいて確認された。それ自身のV3抗原に関するより低い反応性は、疾病の後期段階の間に一般的である。にもかかわらず、この反応性は、Mペプチドに対して生じたものよりも高く維持される。別のカメルーン患者(血清967321)は、同じプロフィールのペプチド反応性を示す。以上のことから明らかなように、本発明は、正により明確に記載されたその実施態様には決して限定されず、反対に、それは、本発明の文脈または範囲から逸脱することなく当業者に思い浮かぶ全ての変異種を包含する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 21/08 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人アンスティテュパストゥールフランス国エフ―75724 パリセデックス 15 リュドュドクトゥールルー 28 (72)発明者モークレールフィリペフランス国エフ―33000 ボルドーリュブハン２ (72)発明者ルセール−アジャカイブティサムフランス国エフ―78500 サルトルーヴィルアヴェニュドラレパブリク 26 (72)発明者シモンフランソワフランス国エフ―75018 パリリュジェルマンピロ８ (72)発明者サラゴスチセントフランス国エフ―92100 ブローニュビランクールリュドゥビランクール 69 ビス (72)発明者バレ−シヌシフランソワフランス国エフ―92130 イスィ―レ― ムリノーリュデレヴァン 50 ルカプリコーン 104

Claims

【特許請求の範囲】１． 1996年7月2日にコレクシオン・ナシオナル・ド・クルチュール・ド・ミクロオルガニスム(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) に番号I-1753で寄託され(YBF30と名付けらた)、パストゥール研究所に維持されているレトロウイルスの形態学的および免疫学的特徴を有するnon-M、non-O HIV -1株。２．請求項１に記載の株に由来することを特徴とする、核酸配列。３．下記の配列：請求項１に記載の株の完全なヌクレオチド配列(配列番号1)、並びに前記株に由来する核酸フラグメント：(配列番号2)、(配列番号3)、 (配列番号5)、(配列番号7)、(配列番号9)、(配列番号11)、(配列番号13)、(配列番号15)、(配列番号17)、(配列番号19)および配列番号21〜57の配列、さらに上記のヌクレオチド配列の１つと同一でなく、またはこれらの配列の１つと相補性でないが、にもかかわらずnon-M、non-O HIV-1ウイルスに由来する核酸とハイブリダイズし得る任意の配列からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の核酸配列。４．配列番号21〜57の配列から選択されること、および請求項１または請求項５に記載のHIV-1を検出するためのプライマーとして又はプローブとして使用され得ることを特徴とする、オリゴヌクレオチド。５． MグループともOグループとも異なり、下記の特徴： ^*MおよびOグループのタンパク質に関して血清学的反応性を殆どか又は全く有さず、請求項１に記載のYBF30株またはCPZGAB SIV株に由来するタンパク質に関する強い血清学的反応性； ^*MおよびOグループのHIV-1ウイルスのenvおよびgag領域からのプライマーを用いるとき、ゲノム増幅が不存在； ^*請求項４に記載のYBF30株に由来するプライマー存在下でのゲノム増幅；および ^*YBF30株に関して70%より大きいエンベロープ遺伝子の産物のホモロジー、を示すことを特徴とするHIV-1ウイルス。６．ハイブリダイゼーションおよび／または遺伝子増幅によるnon-M、non -OグループのHIV-1ウイルスのインビトロ診断方法であって、生物学的サンプル( 血清または循環リンパ球)を用いて行なわれ、．検出されるべき核酸を抽出する工程であって、該核酸はウイルスのゲノムに属し、該ウイルスは生物学的サンプル中に潜在的に存在し得、および好適な場合にはこの核酸がRNA形態であるなら逆転写酵素を用いて核酸を処理する工程、．核酸を変性させる工程、請求項３または請求項４に記載の少なくとも１種の配列とハイブリダイズする工程、および好適な場合には、好適な試薬(DNAポリメラーゼおよびdNTPのような重合化試薬)の存在下に形成されたハイブリッドを伸張させる工程を包含する、少なくとも１サイクル、および．non-M、non-O HIV-1グループタイプのウイルスのゲノムに属する核酸の潜在的な存在を検出する工程、を包含することを特徴とする方法。７．請求項１または請求項５に記載のnon-M、non-O HIV-1株により或いは請求項３に記載のヌクレオチド配列を用いて発現され得ることを特徴とし、および(1)請求項１または請求項５に記載のnon-M、non-O HIV-1ウイルス若しくはこのウイルスの変異種によって誘発され、non-M、non-O HIV-1株による感染の後に得られる生物学的サンプル中に存在する抗体によって認識され得ること、および／または(2)抗non-M、non-O HIV-1抗体の産生を誘発し得ることを特徴とする、ペプチド。８． gag遺伝子によって発現されるもの(配列番号 4)、pol遺伝子によって発現されるもの(配列番号6)、vlf遺伝子によって発現されるもの(配列番号8)、vpr遺伝子によって発現されるもの(配列番号10)、vpu遺伝子によって発現されるもの(配列番号12)、tat遺伝子によって発現されるもの( 配列番号14)、rev遺伝子によって発現されるもの(配列番号16)、env遺伝子によって発現されるもの(配列番号18)、またはV3ループ領域フラグメント(配列番号5 8)のようなそのフラグメントの１つ、およびnef遺伝子によって発現されるもの( 配列番号20)、あるいは請求項１または請求項５に記載のHIV-1ウイルスによる感染の間に産生される抗体を認識し得るこれらのペプチドのフラグメントから選択されることを特徴とする、請求項７に記載のペプチド。９．請求項３に記載のヌクレオチド配列の１種以上の翻訳産物および／または請求項７もしくは請求項８に記載のペプチドを含む免疫原性組成物。１０．請求項７または請求項８に記載の１種以上のペプチドに対する抗体。１１． non-M、non-O HIV-1ウイルスのインビトロ診断のための方法であって、患者から採取された生物学的サンプルを請求項１０に記載の抗体に接触させること、ここで該抗体は抗CPZGAB SIV抗体と組合せることが可能である、および生物学的サンプル中に存在することが可能であるHIV-1抗原と前記抗体との間で形成される免疫学的複合体を検出することを包含することを特徴とする方法。１２．請求項３、４、７または８のいずれかに記載の配列を含むことを特徴とする、non-M、non-O HIV-1ウイルスを診断するための試薬。１３． non-M、non-O HIV-1ウイルスをスクリーニングおよびタイピングする方法であって、請求項３または請求項４に記載のヌクレオチド・フラグメントのいずれか１つを、タイピングされるべきウイルスの核酸と接触させ、形成されたハイブリッドを検出することを包含することを特徴とする方法。１４．請求項１２に記載の少なくとも１種の試薬を含むことを特徴とする、non-M、non-O HIV-1ウイルスの診断用キット。