JP2000515854A

JP2000515854A - 脳タンパク質ｓ―１００の存在の測定方法

Info

Publication number: JP2000515854A
Application number: JP10505124A
Authority: JP
Inventors: ブルンデル，ヤン; ニベルグ，レナ
Original assignee: エービーサンテックメディカル
Priority date: 1996-07-05
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 2000-11-28
Also published as: CA2259413A1; DE69733957T2; NZ333408A; WO1998001471A1; NO986218D0; SE9602677D0; NO986218L; AU3563397A; ES2247633T3; IL127278A0; AU715797B2; BR9710175A; EP0931094A1; ATE301671T1; EP0931094B1; DE69733957D1

Abstract

(57)【要約】臨床サンプルにおいて脳タンパク質Ｓ−１００の存在を測定するアッセイ法であって、ヒトＳ１００βのβサブユニットのアミノ酸配列のセリン１からアスパラギン３８まで及びトレオニン８２からグルタミン酸９３までの領域中のエピトープに指向された抗体を用いる方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】脳タンパク質Ｓ−１００の存在の測定方法本発明は脳タンパク質Ｓ−１００の存在を測定することによる、脳の機能障害及び黒色腫癌を持つ患者の診断及びその後の治療のための方法に関する。本発明はＳ−１００からの有用な抗原決定基を含むペブチド、及びこれらのペプチドに結合するモノクローナル抗体にも関する。知られているとおり、神経系はその様々な細胞要素に特異的な多数のタンパク質を含む。いかなる病的過程、傷害、又は神経病による神経組織及び神経起源の細胞の細胞破壊は正常な可溶性内在性細胞質タンパク質の脳細胞外液、及び最終的には脳脊髄液（ＣＳＦ）及び血液（血清及び血漿）を含む他の体液への放出をもたらす。このタイプの可溶性低分子量タンパク質の代表例はＳ１００タンパク質族に見出すことができる。この族の総論はZimmer et al.,Brain Research Bul letin,vol.37,pp417-429,1995において見出すことができる。細胞膜の破壊後、これらのタンパク質は時間経過に応じて、及び病的過程の病因又は脳組織の障害の程度に比例した量で細胞外液へ放出される。タンパク質はＣＳＦへ拡散して次に血液へと、又は直接血液中へ拡散する。上述の細胞膜破壊はこれらの抗原及びマーカーの一つ以上の血漿又は血清レベルによって反映される。これらのタンパク質抗原は脳についてのみならず脳中の細胞成分についても安定でありかつ特異的であるという利点を有する。様々な神経系のタンパク質抗原の関連する放出を追跡することによって神経病の過程で生ずる破壊過程の種類、及び／又はあり得る脳組織の障害の程度を推論することが可能である。このタイプの情報は診断、上述の病気及び傷害の重大性及び進行度の評価を可能にする。臨床サンプル中のＳ−１００ポリペプチドの量を測定することは既に知られている。ＵＳ−Ａ−４６５４３１３はＳ−１００タンパク質のためのラジオイムノアッセイ法を開示する。この特許文献はＳ１００ポリペプチドの様々な種類についても、又はどのエピトープにアッセイ法が基づいているのかについても何も述べていない。検出限界は０．２０ｎｇ／ｍlであると述べられているが、１．５ −２．５ｎｇ／ｍｌの濃度が１０％未満の偽陽性を持つためには要求される。この濃度はかなり高い。更に、いくつかの国では臨床アッセイに放射線を用いる方法を用いることは許可されていない。ＥＬＩＳＡに関する方法を用いることによってＳ−１００ポリペプチドを測定することも知られている。ＧＢ−Ａ−２１０９９３１は酵素でラベルされた抗原及び抗原が結合されるプロテインＡでコーティングされた粒子の利用を含む固相免疫分析法を開示する。Ｓ−１００タンパク質は請求の範囲８で言及されているにすぎず、この方法の感度については何も示されていない。ＪＰ−Ａ−６／１０９７３４は磁性粒子に固定された第１ポリクローナル抗体及び第２のラベルされたポリクローナル抗体を用いたＳ−１００ポリペプチドの分析に好適な方法を記載する。この方法は二つの異なる酵素、すなわち西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼを必要とし、少なくとも１０の連続手段を含む。最小検出限界は脳脊髄液については０．０２ｎｇ／ｍｌ、ウシの脳については０．０６ｎｇ／ｍｌであると述べられている。臨床サンプルの複雑さはしばしば深刻な問題である。あるアッセイ法は実験室での人為的サンプルを用いる場合には優れた結果を与えるかもしれないが、方法が臨床条件下でテストされる場合は極めて多数の信頼できない結果が得られるだろう。イムノアッセイに関していえば、問題は抗原決定基の不適切な選択によってしばしば生ずる。二つの異なる抗体の使用を含むアッセイ中の一方の抗体は測定されるべき抗原に他方の抗体が結合する場合の妨害となるかもしれない。検出過程に含まれる抗体に対するエピトープの不適切な選択は、検出基がタンパク質複合体中に完全に又は部分的に埋め込まれて検出に利用できないという結果をもたらすかもしれない。サンプル中に存在する様々なタンパク質が妨害するかもしれない。更に、多くの連続手順を含む方法は複雑な臨床サンプルに対しては不確かな結果を与えるかもしれない。何故なら、妨害の可能性は手順の数及び添加された余分の成分と共に増大するからである。臨床サンプル中の医学的に重要な物質の分析方法の改良に対する要求は常にある。理想的な臨床アッセイは迅速かつ正確であるべきであり、加えて特定のタイプの標本に関して正確さを損なうことなしにすべてのタイプの臨床サンプルを用いて行うことができなくてはならない。又、それは最小の余分な成分を要求するべきである。これはＳ−１００ポリペプチド及び医学的に重要な他の物質の測定に当てはまる。発明の概要ヒトＳ−１００βポリペプチドのアミノ酸配列のセリン（ｓｅｒ）１からアスパラギン（ａｓｎ）３８まで、及びトレオニン（ｔｈｒ）８２からグルタミン酸（ｇｌｕ）９３までの領域中のエピトープに指向された抗体を用いることによってＳ−１００ポリペプチド及び特にそのβサブユニツト又は同位型(isoform)の測定のための改良された臨床アッセイ法が得られることが今や明らかとなった。従って本発明の主目的はこれらのエピトープに指向されたモノクローナル抗体を用いたアッセイ法である。本発明の他の目的はセリン１からアスパラギン３８まで、及びトレオニン８２からグルタミン酸９３までのヒトＳ−１００βポリペプチドのアミノ酸配列の部分に相当する配列を持つ短いペプチドに関する。本目的の更に他の目的はアッセイ法を行うための分析キットに関する。発明の詳細な説明既述の通り、臨床サンプルを分析する方法の概要を述べることは極めて困難であることが多い。方法が高い感度を持ち、正確な結果を与えることが必要である。又、分析対象物(analyte)以外のサンプルの他の既知又は未知の成分が結果に影響を与えないことが極めて重要である。本発明は好適なＳ−１００エピトープ及び対応する抗体の選択に基づいたヒトＳ−１００ポリペプチドの存在及び／又は含有量を測定するイムノアッセイ法に関するものであり、上述の必要条件を満たしている。選択されたエピトープの組合せが以下のようなテスト及びテストキットを与えることが明らかになった： 1. 高感度が達成される； 2. キットの抗体は臨床サンプル中の分析対象物に対するのと同様に内部標準に対しても平等に強く結合する； 3. エピトープは異なる抗体が分析対象物に結合する場合、異なる抗体が相互に干渉しないように選択される。即ち、エピトープは相互から十分に離れて位置する。本発明のエピトープはすべてヒトＳ−１００βポリペプチドに含まれている。アミノ酸配列：及び中に存在するエピトープが好ましい。特に好ましいものはペプチド特にペプチド中に含まれるエピトープである。開示されたエピトープはすべて、請求の範囲のアッセイ方法が基づいている好適な抗体の形成を誘導するためのペプチドを構築するのに用いられる。これらのペプチドは大部分が３８個までのアミノ酸からなる。本発明によるペプチドの全アミノ酸配列はヒトＳ−１００βから由来している。これらのペプチドは変異体を含んでいてもよく、そこでは元来のアミノ酸配列が改変されているか、又は挿入、付加、置換、逆位、又は欠失によって変更されており、それは好ましくは配列番号２及び配列番号３の配列と少なくとも９０％の相同性を示し、かつ本質的に同一の免疫特性を保持している。又、ペプチドは多数の特定のエピトープを含んでもよく、この場合、それらの配列長は３８アミノ酸を越えてもよい。「サブフラグメント（sub-fragment）」という表現は少なくとも６アミノ酸の長さを持つポリペプチド配列を意味する。エピトープは少なくとも二つの別個のエピトープを含む融合ペプチドの構築に用いることができ、それらはすべてイムノアッセイにおいて内部標準として用いることができる。略語以下の略語が用いられる：Ｓ１００ −Ｓ１００β ＲＴ −室温ＢＳＡ −ウシ血清アルブミンＭａｂ（ｓ）−モノクローナル抗体ｋＤ −キロダルトンＥＣＬ −増強された化学発光アッセイＣＢＢ −クーマシーブリリアントブルーＬＩＡ −発光測定イムノアッセイＩＲＭＡ −イムノラジオメトリックアッセイ(Immuno Radio Metric Assay) ＥＬＩＳＡ −酵素結合免疫溶媒アッセイ(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assa y) ＳＤＳ−ＰＡＧＥ −ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＰＢＳ −リン酸緩衝溶液ＲＬＵ −相対光単位（Relative Light Units）ＮＨＳ −Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドＥＤＣ −Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドＲＡＭＦｃ −ウサギ抗マウスＦｃ抗体ＥＤＴＡ −エチレンジアミン四酢酸ＮａＣｌ −塩化ナトリウムＮａＮ₃ −アジ化ナトリウムｉｖ． −静脈（的）ａａ −アミノ酸ｎｇ −ナノグラムｍｌ −ミリリットルｍｇ −ミリグラムＨＲＰ −西洋ワサビペルオキシダーゼｈ −時間ｍｉｎ −分ｓｅｃ −秒すべてのテスト手順に共通する実験の詳細ペプチドはMerrifield(1963).J.Am.Chem.Soc.,vol.85,p2149:Gutte et al.(19 71),J.Biol Chem vol.246,p.1922;及びCarpino et al．(1970),J Am Chem Soc v ol.92,p.5748に開示される方法によって調製された。 ow et al.(1988).Antibodies.A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,p.139 による方法によって調製された。抗原及び標準の調製 Balb/cマウスの免疫化に先立つＳ１００抗原の調製及び精製手順はHaglid＆St avrou(J.Neurochem.1973,20:1523-1532)に従って微細な改変を加えたHoore(Bioc him.Biophys.Res.Comm.1965,19:739-744)に従った。手短に述べると、ウシの脳はｐＨ７．２のトリス緩衝液中でホモジナイズされた。ホモジナイズされたものは１００００r.p.m.で遠心分離され、澄明な上澄みが硫安沈殿による更なる精製に用いられた。硫酸アンモニウムによる飽和後もなお可溶である画分は透析され、Sephadex G150 Sepharose(Pharmacia Biotech AB,Uppsala Sweden)クロマトグラフカラムでの分離、及びそれに続くＤＥＡＥ−セファデックス（イオン交換）カラム(Pharmacia Biotech AB,Uppsala Sweden)での分離によって精製された。０．３−０．４ＭＮａＣｌで抽出される画分が採集され、脱塩され、凍結乾燥され、更なる実験に用いられた。ハイブリドーマの構築 Balb/cマウスはフロイントの完全アジュバント(Freund's complete adjuvant) で腹腔内注射で精製されたＳ１００ββを用いて免疫化され、６週間後に３日間連続して補助静脈（ｉｖ．）注射を与えられた。脾臓は最後の注射の４日後に除去され、融合のために調製された。ミエローマ細胞系Sp2/0-Ag14がBalb/c脾臓細胞の融合に用いられた。抗体の精製及びサブクラスの決定モノクローナル抗体はHarlow & Lane Eds.in ANTIBODIES A LABORATORY MANUA L,Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York 298-299 & 311に従ってハイブリドーマの上澄みから同定、抽出され、精製された。手短に述べると、特異的抗体を持つ上澄みを担持する陽性のハイブリドーマクローンがＳ１００ββでコーティングされたマイクロタイタープレートウェルを用いるＥＬＩＳＡを用いて同定された。イムノグロブリンは飽和硫酸アンモニウムを用いて沈殿され、１．５Ｍグリシン、３ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．９に対して透析された。透析された材料はプロテイン−Ａ Sepharose(Pharmacia Biotech AB,Uppsala Sweden)カラム上でアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。画分は１ＭトリスｐＨ８．０の少容量の添加によって中和された。エピトープマッピングそれぞれの抗体のためのＳ１００β（モノマー）エピトープは合成ペプチドライブラリーの使用によって調査された。ペプチドはタンパク質中の９１アミノ酸（ａａ）のすべてをカバーする、マニュファクチュラー(manufacturer)(Researc h Genetics，USA)に従ったアミドリンク(amide link)を介してニトロセルロースフィルターメンブレンに結合された。合計でライブラリーは１０アミノ酸残基の長さの合成ペプチドである一つを除いてすべて３１からなっていた。各々のペプチドはタンパク質の−ＣＯＯＨ未端の方へ３アミノ酸だけ連続的にシフトされた。陽性の抗体結合はＨＲＰと結合した第２の抗マウス抗体の使用によって示され、ＥＣＬアッセイ(Amersham,UK)を用いて検出された。結果：以下の二つの結合配列が見出された。エピトープ１及び、エピトープ２抗体の反応性エピトープと反応する精製された抗体はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）システム(Pha rmacia Biosensor AB,Uppsala Sweden)を用いて反応性及び親和性についてチェックされた。手短に述べると、抗体の特異性をテストするため、ＲＡＭＦｃが標準手順に従って、約６００ＲＬＵを与えるセンサーチップＣＭ５ＮＨＳ−エステル活性化表面に固定された。次に個々のＭａｂは約３００ＲＬＵを与えるＲＡＭＦｃ表面へ結合され、続いて個々の実験においてＳ１００αα及びＳ１００標準（５０％Ｓ１００αβ及び５０％Ｓ１００ββからなる）が添加された。すべての反応はリン酸緩衝液の連続流中で行われた。抗体と抗原の間のカイネティクス(kinetics)は同様になされた。Ｓ１００抗原は固相として意図される抗体の反応性測定については２００−４５０ｎＭで、トレーサーとして意図される抗体の測定については１０００−１５００ｎＭでチップに添加された。カイネティクスはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）カイネティクエヴァリュエーション（Kinetic evalua tion）2.1.ソフトウエア(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala Sweden)を用いて測定された。反応性プロフィールからエピトープと反応する抗体はＳ１００のβ− 含有型に特異的であり、α−含有型には特異的でないことが推論できる。実施例１免疫発光測定手順の開発トレーサー抗体がルミノールと結合された。手短に述べると、ＡＢＥＩ(Sigma ,St Louis,Ms)が２ケ所で活性化された(diactivated)エステル（エチレングリコールビス−スクシミジルスクシネート、ＥＧＳ）と結合された。次にＡＢＥＩ− ＥＧＳ結合物は１５％アセトニトリルを含むｐＨ７．４のＰＢＳ１００μｌ中でモノクローナル抗Ｓ１００抗体と約５０：５のモル比で混合され、室温で１時間（ｈ）インキュベートされた。ＡＢＥＩ結合抗体はSephacryl（登録商標）Ｓ３００ＨＲ(Pharmacia Biotech AB,Uppsala Sweden)ゲルろ過カラムで精製され、適切な画分が集められ、リン酸緩衝液で希釈された。抗体でコーティングされたＬＩＡ用のチューブの製造ポリスチレンチューブ(Greiner，ドイツ)は３μｇのＳ１００−抗体を含むｐＨ７．５のＰＢＳ３００μｌと共に室温で一晩インキュベートされた。チューブは０．１％Tween ２０（登録商標）を含むＰＢＳで洗浄された。次にチューブは０．９％ＢＳＡ及び４％サッカロースを含む溶液でブロックされ、２４時間インキュベートされた。溶液は吸引され、チューブは乾燥された。ＬＩＡテスト手順テストは抗体をコーティングされたチューブ中で患者の体液１００μｌをインキュベートすること、又は１００μｌの希釈物（ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ）と共にＳ１００標準を室温でインキュベートすることによって２段階の手順で行われた。洗浄後、ルミノールでラベルされた抗体２００μｌが添加され、測定前に更に２時間インキュベートされた。もう一度洗浄した後、発光はＬＩＡ−マットスターターサービスキット（Byk-Sangtec,Diezenbach Germany）を用いて発現され、すぐに発光測定装置（Berthold,Germany）で５秒（ｓｅｃ）間にわたる積分として測定された。得られた光シグナルをＳ１００の濃度へと変換するため、患者サンプルでの測定はＳ１００（標準）の既知濃度の溶液での測定と比較された。検出限界（０標準＋３標準偏差）は約０．０１μｇ／ｌであった。標準曲線の調製Ｓ１００Ｂタンパク質はMedisera,Lund.Swedenから入手され、ＰＢＳ＋５％ＢＳＡで希釈された。希釈度はββ型５０％とαβ型５０％からなるＳ１００調製品の０．１０，０．４０，２．００，８．００及び２０．００μｇ／ｌを含んでいた。ＰＢＳ＋５％ＢＳＡが標準０として用いられた。各希釈度につき３回の測定が行われた。測定結果及び統計計算は以下の表１に示されている：下方検出限界は３回の標準０測定プラス標準偏差値の３倍として規定された。この測定についてはそれは０．００６μｇ／ｌと計算された。血清中のＳ１００の臨床測定Ｓ１００濃度は心臓バイパス手術を受けて心肺装置につながれている患者からの血清で測定された。結果は以下の表２に示されている：実施例２ＥＬＩＳＡテスト手順の開発トレーサー抗体として、Harlow & Lane Eds．in ANTIBODIES A LABORATORY MA NUAL.Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York page 351に従ってβ− ガラクトシダーゼと結合されたモノクローナル抗Ｓ１００抗体が用いられた。抗体でコーティングされたＥＬＩＳＡ用のマイクロタイターウェルの準備マイクロタイターウェル（Corning,Denmark）は２．５μｇの抗体と共に＋４ ℃で一晩インキュベートされた。最後にマイクロタイターウェルは０．０５％Tw een２０（登録商標）で３回洗浄され、使用前にエアドライされた。ＥＬＩＳＡテスト手順ＥＬＩＳＡは複数段階のインキュベーション手順で行われた。１：１希釈された患者サンプル１００μｌ、又はＳ１００標準（０−２０μｇ／ｍｌ）１００μｌがウェルに添加された。プレートは振盪下、室温（ＲＴ）で１．５時間インキュベートされた。プレートは０．０５％のTween ２０（登録商標）を含むＰＢＳ３００μｌで３回洗浄された。アルカリホスファターゼが結合されたトレーサー抗体１００μｌが添加され、更に振盪器での１．５時間のインキュベートが行われた。次にウェルは０．０５％Tween ２０（登録商標）を含むＰＢＳで３回洗浄された。５％ｏ−ニトロ−フェニル−β−ガラクトシダーゼ基質溶液１００μｌが添加され、プレートは基質と共に更に４５分（ｍｉｎ）間インキュベートされ、色が発現された。色発現は０．６６ＭＮａ₂ＣＯ₃ １００μｌの添加によって停止された。プレートの各ウェルは標準マイクロタイタープレートリーダーで４０５ｎｍで読み取られた。得られた色シグナルをＳ１００の濃度へと変換するため、患者サンプルでの測定はＳ１００（標準）の既知濃度の溶液での測定と比較された。検出限界（０標準＋３標準偏差）は約０．２μｇ／ｌであった。結果：標準（μｇ／ｌ） 0 0.5 1.5 5 15 Ａ４０５ 0.088 0.147 0.244 0.675 1.196 実施例３イムノラジオメトリック（ＩＲＭＡ）テスト手順の開発ＩＲＭＡトレーサー抗体結合モノクローナル抗Ｓ１００抗体はGreen wood et al.(Biochem．J.1963,89:114 -123)に従ってクロラミンＴ法を用いて沃素と結合された。比活性は５２０±８０ＭＢｑ／ｍｇと測定された。ポリスチレンビーズにコーティングされる抗体の準備モノクローナル抗Ｓ１００抗体はHarlow & Lane Eds.in ANTIBODIES,ALABORA TORY MANUAL,Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York.533 & 536-537 に従ってグルタルアルデヒド結合法によってポリスチレンビーズに結合された。最終ブロッキングは１％ＢＳＡ，０．１％ＮａＮ₃を含むＰＢＳｐＨ７．５によって行われた。ＩＲＭＡテスト手順患者サンプル又は標準１００μｌは１００μｌＰＢＳ希釈物と共にポリスチレンチューブに添加された。ポリスチレンでコーティングされたビーズが一つずつ各チューブに添加され、続いて振盪器で室温で１時間インキュベートされた。次にビーズは脱イオン水２ｍｌで１回洗浄され、Ｉ−１２５でラベルされたトレーサー抗体２００μｌが添加され、そしてチューブは振盪器で更に２時間インキュベートされた。洗浄後、ビーズの放射性シグナルは標準γ計数器で測定された。得られた放射性シグナルをＳ１００の濃度へと変換するため、患者サンプルでの測定はＳ１００（標準）の既知濃度の溶液での測定と比較された。検出限界（０標準＋３標準偏差）は約０．１μｇ／ｌであった。実施例４黒色腫患者からの血清中のＳ１００のアッセイのためのＩＲＭＡテスト手順の使用Ｓ１００に基づくテスト手順は黒色腫に関する臨床問題に適用された。癌進行の様々な段階の黒色腫を持つ患者からの血液サンプルは血清採取チューブに採取された。次にサンプルは冷凍され、実施例３で上述したテスト手順に従って処理された。結果：段階との関係臨床段階Ｉ対臨床段階II。５７７人の患者の調査において段階Ｉの幾何平均は０．１２μｇ／ｌであり、段階IIについての幾何平均は０．３３μｇ／ｌであった。ｐ値＜０．００１。実施例５黒色腫患者からの血清中のＳ１００のアッセイのためのＩＲＭＡテスト手順の使用Ｓ１００に基づくテスト手順は黒色腫に関する臨床問題に適用された。癌進行の様々な段階の黒色腫を持つ患者からの血液サンプルは血清採取チューブに採取された。次にサンプルは冷凍され、実施例３で上述したテスト手順に従って処理された。結果：生存者との関係臨床段階I対臨床段階IIおよびIII。６４３人の患者で行われた生存者に関する調査では相対危険及び９５％信頼間隔が計算された。相対危険は１２．３であり、信頼間隔は０．００１未満のｐ値で５．６−２７．２であった。実施例６余分の肉体循環(extra corporal circulation)装置の脳への影響の評価についてのＳ１００ＬＩＡ法の使用実施例１におけるＳ１００に基づくテスト手順が脳の障害及びそれに続く余分の肉体循環（ＥＣＣ）の監視に適用された。余分の肉体循環を受けている患者からの血液サンプルは血清チューブに採取され、「テスト手順」に従って処理された。結果：このグループの患者においては血清中のＳ１００のレベルは手術後少なくとも２日間評価された。簡単な事例では最初の２４時間以内で正常レベルに戻るであろう(P.Johnson e t al.J.Cardiothor,Vasc.Anaesthesia,9:6(1995)694-99参照)。実施例７黒色腫患者からの血清中のＳ１００のアッセイのためのＬＩＡテスト手順の使用Ｓ１００に基づくテスト手順は黒色腫に関する臨床問題に適用された。癌進行の様々な段階の黒色腫を持つ患者、及び血液提供者からの血液サンプルは血清採取チューブに採取された。次にサンプルは冷凍され、実施例１で上述したテスト手順に従って処理された。結果：様々な段階の黒色腫を持つ１３６人の患者のうち、２５人は０．０８より下のＳ１００レベルを持ち、同じ機会にテストされた１００人の血液提供者のうち７人が０．０８μｇ／ｌ以上のレベルを持っていた。実施例８黒色腫の診断の際の両テスト及びＳ１００βポリペプチドマーカーの信頼性が調査された。黒色腫を持つ２５２人の患者について治療の開始前に血清が採取され、Ｓ１００βポリペプチドレベルの測定は実施例１に示されるアッセイ法によって行われた。０．１６μｇ／ｌのカットオフ値が用いられたとき、カットオフ値より大きいＳ１００β濃度を持つ患者の中間生存期間は７ヶ月であった。一方、カットオフ値より小さいＳ１００β濃度を持つ患者については中間生存期間は１２０ヶ月以上であった。悪性黒色腫を持つと診断され、病気の証拠を示さないとみなされ、実施例３に示すイムノラジオメトリックアッセイ法によって監視された患者においては、Ｓ１００βの増大したレベルが皮膚転移の出現の２ヶ月前に記録され、器官転移の６ヶ月前に発見された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08

Claims

【特許請求の範囲】 1．６−３８個のアミノ酸を含むヒトＳ−１００βポリペプチドの少なくとも一つのサブフラグメントからなるペプチド（ただし、前記サブフラグメントは配列及び／又はアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を示し、本質的に同一の免疫特性を保持している）。 2. サブフラグメントがアミノ酸配列：から由来することを特徴とする請求の範囲１のペプチド。である請求の範囲２のペプチド。 4. サブフラグメントがアミノ酸配列：から由来することを特徴とする請求の範囲１のペプチド。である請求の範囲４のペプチド。 6. 配列番号２の配列由来の少なくとも一つのサブフラグメント、及び配列番号３の配列由来の少なくとも一つのサブフラグメントからなることを特徴とする請求の範囲１のペプチド。 7. 請求の範囲１−６のいずれか一つのペプチドを特異的に結合するモノクローナル抗体又はかかる抗体のフラグメント。 8. 請求の範囲２のペプチドを特異的に結合する請求の範囲７のモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。 9. 請求の範囲４のペプチドを特異的に結合する請求の範囲７のモノクローナル抗体又は抗体フラグメント。 10. イムノアッセイ法における請求の範囲７−９のいずれか一つのモノクローナル抗体又は抗体フラグメントの使用。 11. 抗体を誘導するための請求の範囲１−６のいずれか一つのペプチドの使用。 12. イムノアッセイ法における請求の範囲１−６のいずれか一つのペプチドの使用。 13. 以下の手順を含む、サンプル中のヒトＳ−１００βポリペプチドの存在を測定する方法：分析するサンプルを請求の範囲８の第１モノクローナル抗体と免疫学的に反応させ（ただし前記第１抗体は担体と結合されている）；サンプルを請求の範囲９の第２モノクローナル抗体と免疫学的に反応させ（ただし前記第２モノクローナル抗体は検出手段を与えられている）；洗浄し；そして、サンプル中のＳ−１００βポリペプチドの量を検出する。 14. 検出手段が発光を放出する能力を持つ基である請求の範囲１３の方法。 15. 担体が磁性粒子である請求の範囲１４の方法。 16. 請求の範囲１−６のいずれか一つのペプチド、及び／又は請求の範囲７− ９のいずれか一つの抗体を含む、サンプル中のヒトＳ−１００βポリペプチドの存在を測定するためのキット。 17. 請求の範囲８の第１モノクローナル抗体及び請求の範囲９の第２モノクローナル抗体を含む請求の範囲１６のキットであって、前記第１モノクローナル抗体が担体に結合されており、かつ前記第２モノクローナル抗体が検出手段を与えられているキット。 18. 前記担体が磁性粒子であり、前記検出手段がルミノールの如き発光を放出する能力を持つ基である請求の範囲１７のキット。