JP2915530B2

JP2915530B2 - ラミニンフラグメント

Info

Publication number: JP2915530B2
Application number: JP25004390A
Authority: JP
Inventors: 政彦片山; 京子上萩; 文嗣日野; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1990-09-21
Filing date: 1990-09-21
Publication date: 1999-07-05
Anticipated expiration: 2014-07-05
Also published as: JPH04134097A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規なヒトラミニンフラグメント、該
フラグメント量を指標とする疾病の検出方法、及び該フ
ラグメントの免疫学的測定キットに関する。

〔従来の技術〕

基底膜はコラーゲンと非コラーゲンの各成分より成
り、生体内に普遍的に存在する細胞外マトリックスであ
る。近年、肝疾患、腎疾患、ガンなど不可逆的に進行す
る諸疾患と基底膜との関連が注目されてきた。ラミニン
（以下、LNと略記する）は基底膜に特異的に存在する高
分子タンパク質であり、基底膜が分解作用を受けた時に
非フラグメント化ラミニン（以下、nLNと略記する）又
はフラグメント化ラミニン（以下、fLNと略記する）と
して体液中に遊離してくると考えられ、これら体液中の
nLN又はfLNを測定することは、疾患による基底膜分解の
進展を診断する上で臨床検査上重要であり、その簡便で
迅速な測定法の確立が望まれている。

〔発明が解決しようとする課題〕

最近、ペプシン分解によるfLNに対するウナギ抗血清
を用いたラジオイムノアッセイ法が開発された〔D.G.ブ
ロックス（D.G.Brocks）、クリニカルケミストリー
（Clinical Chemistry）第32巻、第787〜791頁（198
6）〕。

この測定法は、あらかじめ放射能で標識されたペプシ
ン分解fLNと試料を競合的に抗ペプシン分解fLN抗体に作
用させ、約１日反応後、抗ウサギIgG抗体と反応させて
免疫沈降物の放射能活性を測ることにより、試料中のLN
量を測定するものである。該ラジオイムノアッセイ法は
ペプシン分解によるfLNに対するウサギ抗血清を用い、
体液中のfLNを抗原としていないことで特異性の点で問
題があり、また目的抗原に対する抗体として抗血清を使
用する場合、このようにフラグメント化された抗原に対
する抗体の結合力が低下するため、正確な測定が不可能
であると考えられており、この点でも大きな問題を含ん
でいた。

また、尿中LNの測定は、糖尿病性腎症などの病態解析
といった点で重要な臨床的意義を有しているにもかかわ
らず、血中LNの約1/10以下という低い濃度で存在してい
るなどの理由で、従来の測定法では十分感度よく定量す
ることは不可能であった。

抗血清の代りに、体液中のfLNをも認識しうるモノク
ローナル抗体を使用することにより上記の問題は解決さ
れうるが、対象抗原となりうる体液中のfLN分子の構造
は特定されておらず、体液中のfLNを測定するために、
該fLNの特定が必要であった。

本発明の目的は、ヒト体液中のfLNを特定し、このfLN
を特異的に、高感度に測定する方法、測定用キット、及
びfLN量の測定による疾病の検出方法を提供することに
ある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明はヒトfLNに関し、ヒト
体液より得られる、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法による分子量が約4.2万であり、下記式I: （式中、Ｘは未同定アミノ酸残基を示す）で表されるＮ
末端アミノ酸配列を有していることを特徴とする。

本発明のヒトfLNは、例えば、健常人尿中より、例え
ば抗ヒトnLNポリクローナル抗体カラム、イオン交換樹
脂カラム等を用い、精製することができる。精製ヒトfL
Nは、例えば10％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、分子量約4.2万のバンドとして検出され、ヒトn
LN（分子量約80万）と比較し、極めて低分子化されてい
る。該ヒトfLNはそのＮ末端に前記式（Ｉ）のアミノ酸
配列を有し、この配列はヒトnLNのアミノ酸配列〔T.ピ
ッカライネン（T.Pikkarainen）ら、ジャーナルオブ
バイオロジカルケミストリー（J.Biol.Chem.）、第
263巻、第6751頁（1988）〕の、B2鎖のＮ末端部から３
〜18番目のアミノ酸配列と一致する。すなわち、該fLN
はヒトnLNのB2鎖のドメインＶ及びVIより構成されると
同定され、ヒト体液中より初めて単離・同定されたヒト
fLNである。

本発明のヒトfLNの測定方法としては、例えばHPLCを
用いる方法、免疫学的方法等があるが、該ヒトfLNに対
する特異的抗体を用いる免疫学的方法により、容易か
つ、高感度に試料中のヒトfLNを測定することができ
る。なお、本発明において、試料とはヒト体液、例えば
血清や尿を指す。

本発明のヒトfLNに対する特異的抗体とは、該ヒトfLN
に対するポリクローナル抗体でも良いが、感度、操作性
等の点から、該ヒトfLNを認識し、かつ抗原認識部位を
異にする一対のモノクローナル抗体を用いるのが好まし
い。該モノクローナル抗体としては、例えば本発明者ら
が作成したモノクローナル抗体HLN5及びHLN82があり、
該一対の抗体を用い、例えばエンザイムイムノアッセ
イ法により、試料中のヒトfLNを感度よく測定すること
ができる。

例えば悪性腫瘍、肝臓疾患、腎臓疾患、動脈硬化など
の患者の尿中のfLNを測定すれば、その尿中fLN値は健常
人と比べ高値を示し、これらの疾患の診断が、尿試料を
用い簡便に行うことができる。

また血清試料を用いても、これらの疾患を感度よく検
出できる。

本発明のヒトfLNに対する特異抗体は、例えばヒトnLN
を抗原として調製でき、該抗体を得るためのヒトnLN
は、例えばヒト胎盤から、それ自体公知の方法により、
例えば塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー等の方法を単独で又は組合
せて用いて分離精製することにより取得することができ
る〔ジャーナルオブバイオロジカルケミストリ
ー、第258巻、第12654〜12660頁（1983）〕。また、ヒ
トfLNは例えば上記の方法によって取得したヒトnLNを、
それ自体公知の方法により、例えばペプシン、トリプシ
ン、スロンビン、プラスミン、キモトリプシン等のプロ
テアーゼを単独で又は組合せて用いて限定分解又は完全
分解し、種々の分離方法、例えばゲルろ過、イオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー等の方法を用いて分離精製することにより取得し、抗
体調製用の抗原として用いることもできる。

また本発明のヒトfLNは、例えば肺ガン、胃ガン、結
腸ガン、乳ガン、膵ガンなどの悪性腫瘍患者、腎疾患々
者、動脈硬化患者又は肝疾患々者の血清又は尿を原料と
して精製、回収することも可能である。更に、近年ヒト
LNの一部アミノ酸配列が決定されたことにより本発明の
ヒトfLNのアミノ酸配列を有する合成ペプチドも用いら
れる。

本発明のヒトfLNに対する特異抗体は、例えば、上記
の患者の尿中より精製した本発明のヒトfLNを抗原とし
て、ヒト以外のホ乳動物、例えば、モルモット、ウサ
ギ、ラット、マウス、ヤギなどの抗体産生能のある動物
を用い通常の方法に従って免疫した後、採血して抗血清
を得、更に抗体を分離する。抗体を得るに当っては例え
ば本発明のヒトfLN0.1〜1mgを生理食塩水0.1〜5mlに溶
解し、これに同量の完全フロイント・アジュバントを加
え、充分乳化した後、用いるホ乳動物、例えばウサギや
マウス等の皮下又は皮内に注射し、１〜３週間ごとに数
回注射して免疫させる。その後、最終免疫の日より一定
期間後、採血し本発明のヒトfLNに対する抗体を含有す
る抗血清を得る。

またこの場合に用いる動物としては、抗体生産能のあ
る動物であればいずれを用いてもよく、大量の抗体を得
るには大型動物を用いるのが好ましく、通常はウサギ、
ヤギを用いるが、何ら限定されるものではない。更にこ
れらの動物から得られた抗ヒトfLN抗体を含有する抗血
清から抗ヒトfLN抗体を得るには通常用いられる抗体の
精製手段の方法によって、行えるもので例えば、抗血清
を硫安分画し、次いでイオン交換クロマトグラフィー、
あるいはゲルろ過によって精製採取すれば良い。更に高
純度に精製するにはヒトfLNを固定化した不溶化担体を
基材として用いるアフィニティークロマトグラフィーに
て吸着し、次いで溶出を行って得ればよい。更に別法と
しては本発明のヒトfLNを抗原として免疫させたヒト以
外のホ乳動物の脾細胞とミエローマ細胞とを用いて融合
させ、この融合細胞から本発明のヒトfLNに対するモノ
クローナル抗体産生細胞を分離し、この融合細胞を用い
る抗ヒトfLNモノクローナル抗体を製造する方法があ
り、特にホ乳動物としてマウスを用いる方法がよく利用
されている〔ネーチャー（Nature）、第256巻、第495頁
（1975）〕。以上のようにしてヒトLNに対するドメイン
特異抗体が得られる。

一方上記のヒトnLNを抗原として本発明のヒトfLNに対
するモノクローナル抗体を得ることもできる。すなわち
ヒトnLNを抗原として免疫をしたヒト以外のホ乳動物の
脾細胞とミエローマ細胞とを用いて融合させ、この融合
細胞から本発明のヒトfLNに対するモノクローナル抗体
を生産するクローンを分離する。このようにして得られ
るモノクローナル抗体は本発明のヒトfLNと反応するモ
ノクローナル抗体である。動物としてはマウスがよく用
いられる。

以上のようにして得られた本発明のヒトfLNに対する
モノクローナル抗体は、抗原認識部位を異にする抗体を
組合せて用いることにより本発明のヒトfLNを効果的に
検出することができる。

なお、本発明のヒトfLNの測定に用いる該fLN特異的抗
体としては、前述のように抗血清のようなポリクローナ
ル抗体、あるいはモノクローナル抗体のいずれでも差支
えないが、その特異性及び親和性の高さという点におい
て、特にモノクローナル抗体を使用することが望まし
い。

本発明のヒトfLNに対するモノクローナル抗体を用い
た測定法としては、従来この分野でよく知られた免疫測
定法すなわち、酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ
免疫比濁法、ラテックス凝集法、赤血球凝集法、SRID法
（免疫拡散法）等が用いられる。中でも酵素免疫測定法
が、感度、簡便さ等において最も実用的である。すなわ
ち抗ヒトfLNモノクローナル抗体をポリスチレンビー
ズ、ガラスビーズ、ポリスチレンマイクロタイタープレ
ートなどの不溶性担体で処理して、これらの担体に共有
結合又は物理的に吸着させて抗ヒトfLNモノクローナル
抗体の結合した不溶性抗体を得る。一方で抗ヒトfLNモ
ノクローナル抗体に従来公知の方法を用いて酵素標識を
行う。例えば、使用する酵素に最適な化合物（例えばβ
−ガラクトシダーゼに対しｍ−マレイミドエステル、ペ
ルオキシダーゼに対し過ヨウ素酸）、次いで抗体をこの
反応物に結合させて酵素標識抗ヒトfLNモノクローナル
抗体を得る。

このようにして得られた、抗ヒトfLNモノクローナル
抗体結合担体（不溶性抗体）と酵素標識抗ヒトfLNモノ
クローナル抗体（標識抗体）を用い、血中及び尿中のヒ
トfLN量を測定したところ、健常人に比べ悪性腫瘍患
者、腎疾患々者、動脈硬化症患者、肝疾患々者の血中及
び尿中では、本発明のヒトfLNの濃度が上昇することが
判明し、該fLNの測定が、これらの疾患の診断に有用で
あることが示された。

本発明のヒトfLN量の測定に用いる抗ヒトfLN抗体をキ
ットとしておくことで、試料中の本発明のヒトfLN量を
簡便に測定することができる。キットに用いる試薬は溶
液状でも良いし、凍結乾燥品等でも良い。

〔実施例〕

以下に実施例を示し本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

参考例１（１）ヒトnLN抗原の単離ヒトnLN抗原の抽出のために、ヒト胎盤を0.5M NaCl
を含む0.05M トリス塩酸緩衝液（pH7.2）中でホモジナ
イズし、遠心分離により不溶化物を除いたのちに、終濃
度4MとなるようにNaClを添加して、その際に生じる沈殿
画分を集める。集めた沈殿を0.5M NaClを含む0.05M
トリス塩酸緩衝液（pH7.2）に可溶化したものを、同緩
衝液にて平衡化させたCL−6Bセファロースカラムにて分
画し、最初のピークに溶出されてくるフラクションをヒ
トnLN標品として集めた。

（２）ヒトnLN抗原に対するポリクローナル抗体の作
製上記（１）で得られた精製ヒトnLN抗原0.5mgを生理食
塩水0.5mlに溶解し、これに等量の完全フロイント・ア
ジュバントを加え、乳化させた後ウサギ皮下に注射し
た。２週間置きに、同量の抗原を不完全フロイント・ア
ジュバンドと乳化させたものを４回皮下注射し、最終免
疫より10日後にその全血を採取し、60分間室温で放置し
た後、遠心分離することにより抗ヒトnLN抗体を含有す
る抗血清を得た。本抗血清から常法によりプロティンＡ
カラムにより抗ヒトnLNポリクローナル抗体を精製し
た。

実施例１（１）尿中ヒトfLNの精製・同定上記参考例１−（２）にて得られた抗ヒトnLNポリク
ローナル抗体を常法によりCNBr活性化セファロース（フ
ァルマシア社製）に吸着させて、健常人尿５をそのカ
ラムに流し、吸着画分を8M尿素を含むPBSにて溶出し
た。カラムより溶出された粗ヒト尿fLN画分をMono−Ｑ
イオン交換カラム（ファルマシア社製）により分画し
て、精製ヒト尿fLNを得た。10％SDS−ポリアクリムアミ
ドゲル電気泳動により精製ヒト尿fLNを分離したとこ
ろ、分子量42,000付近に単一バンドとして観察され、目
的のヒト尿中fLNがヒトnLN（分子量800,000）と比較し
て、極めて低分子フラグメント化されていることが確認
された。

このヒト尿中fLNのＮ末端アミノ酸シークエンス解析
を行ったところ、前記式（Ｉ）の配列が検出され、ヒト
LNB2鎖のアミノ酸シークエンス〔T.ピッカライネンら、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第
263巻、第6751頁（1988）〕のうちＮ末端部より３−18
番目の配列と完全に合致したことから、ヒト尿中fLNが
ヒトLNB2鎖Ｎ末端由来の分子量42,000のポリペプチド
（ドメインＶ及びVI）により構成されていることが確認
された。

実施例２（１）ヒトfLNに対するモノクローナル抗体の作製参考例１−（１）で得たヒトnLN 50μｇを生理食塩
水1.0mlに溶解し等量の完全フロイント・アジュバント
を加え乳化させ、Balb/cマウスの腹腔内に注射した。４
週間後に抗原50μｇのみを同マウスの腹腔内に注射し
た。その３日後にマウスより摘出した脾臓より、脾臓細
胞を得、マウスミエローマ細胞（P3−X63−Ag8−U1）と
細胞数10:1の比で混合し、50％ポリエチレングリコール
及び20％ジメチルスルホキシドの存在下で１分間放置
し、細胞融合を行った。無血清DMEM培地を加え希釈した
のち、遠心分離によりその上清を除き、10％牛胎児血清
含有DMEM培地にて細胞を懸濁し、96穴マイクロタイター
プレートに１穴当り２×10⁴細胞となるように分注し
た。その後１〜３日ごとに培地の半分量をHAT培地で交
換し、10〜20日後に融合細胞（ハイブリドーマ）の生育
してきたウエルの培養上清を採取し、抗体産生の有無を
ELISA法等により調べ、ヒトnLNに対する抗体を産生して
いるハイブリドーマを５株選択した。

以上５株のハイブリドーマのうち、実施例１−（１）
にて得られたヒト尿中fLNに反応性を有する抗体を産生
するものを３株選択した。

これらのハイブリドーマについて限界希釈法により２
回クローニングを行い、最も力価の高い抗体を産生する
ハイブリドーマのクローンとして、クローン株HLN5及び
HLN82の２株を取得した。

前記クローン株は、各々Hybridoma HLN5と表示し微工
研菌寄第11727号（FERMP−11727）、Hybridoma HLN82と
表示し微工研菌寄第10799号（FERM Ｐ−10799）とし
て、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。

この２株のハイブリドーマが産生するモノクローナル
抗体が同一フラグメント特異性を有することを確認する
ために、ウェスタンブロッティングにより、実施例１−
（１）にて得られたヒト尿中fLNに両者が反応し、かつ
抗原認識部位を異にすることを確めた。これらのモノク
ローナル抗体を大量に得るために、Balb/cマウス腹腔内
に約２×10⁷個のハイブリドーマを注射し、腹水腫瘍の
作らせ、10日後に腹水を採取し、抗ヒトfLNモノクロー
ナル抗体HLN5及びHLN82を取得した。

（２）抗ヒトfLNモノクローナル抗体結合ビーズの作
製上記（１）で得た抗ヒトfLNモノクローナル抗体HLN82
の1mgを含有する0.1M リン酸バッファー（pH8.0）20ml
にポリスチレンボール（積水化学社製、粒径6.35mm）10
0粒を加え、５℃で16時間、37℃で１時間反応させ、抗
体をビーズに固定化させた。ビーズは生理食塩水で充分
洗浄後、１％牛血清アルブミン（BSA）、0.05％アジ化
ナトリウム、0.9％NaClを含む10mM リン酸バッファー
（pH7.4）に浸漬し、５℃で一晩放置し、抗ヒトfLNモノ
クローナル抗体結合ビーズを得た。

（３）抗ヒトfLNモノクローナル抗体酵素標識物の作
成上記（１）で得られた抗ヒトfLNモノクローナル抗体H
LN5にペルオキシダーゼ（ベーリンガー−マンハイム社
製）をナカネ（Nakane）らの方法〔ジャーナルオブ
ヒストケミストリーアンドシトケミストリー（J.Hist
ochem.Cytochem.）第22巻、第1084頁（1974）〕によっ
て結合させ、標識抗体を得た。すなわち10mgのペルオキ
シダーゼを2mlの精製水に溶かし、0.1M 過ヨウ素酸カ
リウムを0.2ml加える。室温で20分反応させた後1mM 酢
酸バッファー（pH4.0）に対し４℃で一晩透析する。こ
れに0.2M 炭酸バッファー（pH9.5）を加えpHを９〜9.5
に調整する。一方、抗ヒトfLNモノクローナル抗体2mgを
1.5mlのリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）に溶かし、10mM
炭酸バッファー（pH9.5）に対し、一晩４℃で透析し
ておき、これを上記の過ヨウ素酸処理したペルオキシダ
ーゼと混合し、室温で２時間反応させた後、水素化ホウ
素ナトリウム（4mg/ml）を0.1ml添加し、４℃で２時間
反応後、リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）で平衡化した
ウルトロゲルAcA22（LKB社製）を用いゲルろ過により分
画した。ペルオキシダーゼ活性と抗体活性の一致する画
分を集め、メルチオレートナトリウムの終濃度0.01％と
なるように添加し、４℃で保存した。

実施例３（１）ヒトfLNの測定 EIA法は以下のようにして行った。試料200μをチュ
ーブに入れ、不溶化抗体ビーズをチューブの中に１つず
つ入れ37℃で１時間第１インキュベーションを行う。次
にビーズを、3mlの生理食塩水で３回洗い、標識抗体液
（300倍希釈）200μをビーズの入ったチューブに入
れ、37℃で１時間第２インキュベーションを行う。次に
ビーズを3mlの生理食塩水で３回洗い、ビーズを別のチ
ューブに移し、これに発色試薬300μ（ｏ−フェニレ
ンジアミン1mg/ml、H₂O₂の0.01％、0.1M クエン酸バッ
ファーpH5.0に溶解したもの）を加え、37℃で30分間反
応させ、1N H₂SO₄の1mlを加え反応を停止させた。波長4
92nmの吸光度を測定した。

このような手順で、悪性腫瘍19例、肝臓疾患27例、腎
臓疾患10例、動脈硬化症９例、及び健常人18例の血清
中、及び悪性腫瘍32例、肝臓疾患16例、腎臓疾患14例、
動脈硬化症13例、及び健常人21例の尿中のヒトfLN量を
測定した。尿は同時にクレアチニン量を市販のキット
（クレアチニンテストワコー：和光純薬工業社製）を用
いて測定して、尿量を補正するために、クレアチニン量
に対するfLNの量の比（fLNμg/g・Cr）で表した。

第１図は各種患者と健常人とで血清中ヒトfLNの分布
を比較したグラフであり、第２図は各種患者と健常人と
で尿中ヒトfLN量の分布を比較したグラフである。

この結果、モノクローナル抗体HLN5とHLN82の組合せ
において、尿、血清中のヒトfLNが測定でき各種患者の
血清中及び尿中ヒトfLN量は健常人に比べ明らかに高い
値を示し、疾患診断において本測定が有用であることが
示された。

実施例４（１）キットの作成 EIAキット（１回分）の組成を以下に示す。

1. 抗体固相化ビーズ１個〔工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されているハ
イブリドーマ微工研菌寄第10799号（FERM Ｐ−10799）
が産生するモノクローナル抗体HLN82が固相化されたビ
ーズ〕 2. ペルオキシダーゼ標識抗体 0.3ml 〔工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されているハ
イブリドーマ微工研菌寄第11727号（FERM Ｐ−11727）
が産生するモノクローナル抗体HLN5をペルオキシダーゼ
により標識した〕 3. 発色試薬 0.3ml （ｏ−フェニレンジアミンHClの10mg/ml、過酸化水素0.
01％を含むクエン酸緩衝液pH5.0） 4. 反応停止液（1N硫酸） 1.0ml 5. 標準品（本発明のヒトfLNを４、２、１、0.5μg/ml
含む１％BSA/TBS）〔発明の効果〕以上詳細に説明した通り、本発明により生体試料中の
LN測定試薬が提供された。本発明の測定試薬により新規
な悪性腫瘍、肝、腎、動脈硬化疾患の診断が可能となっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は血清中ヒトfLN量を、第２図は尿中ヒトfLN量を
それぞれ各種患者と健常人別に本測定試薬にて測定した
時の結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者加藤郁之進滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (56)参考文献特開平３−42572（ＪＰ，Ａ) 特開平３−27296（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 263，Ｎｏ．14（1988）ｐ．6751−８ (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/78 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト体液より得られる、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法による分子量が約4.2万であ
り、下記式I: （式中、Ｘは未同定アミノ酸残基を示す）で表されるＮ
末端アミノ酸配列を有していることを特徴とするヒトラ
ミニンフラグメント。