JP2000516083A - マラリア原虫ｍｓｐ―１のｃ末端断片を含む組換えタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、バキュロウイルス系において産生される組換えタンパク質に関し、その必須の構成ポリペプチド配列は、ヒトに対して感染性であるマラリア原虫属、特にPlasmodium falciparumのメロゾイト寄生虫の表面タンパク質１（タンパク質ＭＳＰ−１）の１９キロダルトン（ｐ１９）のＣ末端断片の配列であって、該Ｃ末端断片は、感染サイクルにおけるヒトの赤血球中への侵入段階の終わりに、通常寄生虫表面に固定されて残存する。前記組換えタンパク質はマラリアに対するワクチンの産生に適用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 マラリア原虫ＭＳＰ−１のＣ末端断片を含む組換えタンパク質 本発明は、哺乳動物、特にヒトに感染するマラリア原虫(プラスモディウム属) のメロゾイト形態の主な表面タンパク質、より一般的にはＭＳＰ−１と称されて いるものから得られるワクチン用の新規活性成分に関する。 ＭＳＰ−１は既に多くの研究の対象となっている。ＭＳＰ−１は、プラスモデ ィウム属寄生虫、特に熱帯熱マラリア原虫Plasmodium falciparumのシゾント(sc hizont)段階で合成され、マラリアの肝臓段階と赤血球段階の双方でメロゾイト の主要表面構成成分の一つである（１、２、３、４）。このタンパク質は、その 主たる特性と全ての既知のマラリア原虫種間で保存性が高いことから、抗マラリ アワクチンを作る材料となり得ることが示唆されている（５、６）。 同なじことがそのタンパク質の断片についても言え、特に、例えば、感染宿主 の赤血球中へ寄生虫が侵入する際に形成されることが観察されている、天然切断 物についてもしかりである。このような切断物としては、分子量４２ｋＤａのＣ 末端断片（７、８）が挙げられる。これ自身は再度切断され、見かけの分子量３ ３ｋＤａのＮ末端断片と、グルコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）基 を介した（１０、１１）修飾で寄生虫膜に通常は固定されたままである、見かけ の分子量１９ｋＤａのＣ末端断片（９）とになる。 また、赤血球内発育サイクルの初期環状体段階において（１５、１６）、まだ 知られてはいないが、再侵入プロセスで、１９ｋＤａの断片が、本質的な役割を 担っているにちがいないことが観察されている。これが、このタンパク質が、出 来得るワクチンの、特に効果的な標的と成り得るという従来の仮説の基礎をなし ている。 以下に頻繁に言及するある型のマラリア原虫からのｐ４２およびｐ１９タンパ ク質とは、そのマラリア原虫のＭＳＰ−１タンパク質の対応するＣ末端切断物、 または拡大して、遺伝子組換えによって、または従来の技法、例えば「アプライ ド・システム」シンセサイザーを用いた化学合成法、もしくは「メリフィールド 」 型固相合成法によって得られる実質的に同一のアミノ酸配列を含む合成物を指す ものとする。便宜上、「組換えｐ４２」および「組換えｐ１９」は、少なくとも 一つの遺伝子工学的工程を含んだ技術により得られた「ｐ４２」および「ｐ１９ 」を指す。 熱帯熱マラリア原虫P．falciparumを大量に得ることは困難で、三日熱マラリ ア原虫P．vivaxの試験管内(in vitro)での培養が不可能なため、抗マラリアワク チンを製造するには、組換えタンパク質またはペプチドを使用する技術に依存す るのが唯一の手段であることが明らかになった。しかし、ＭＳＰ−１は、約２０ ０ｋＤａと大きいため、その全体を製造するのは非常に困難である。そのため、 研究者は、まだ機能はわかっていないが、おそらくはより重要なＣ末端部分を研 究するようになった。 P．falciparumのＭＳＰ−１のＣ末端部分を組換えタンパク質（１２、４０， ４１）として、以下の系で産生しサルで試験した： ・E．coli中で産生されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合したｐ １９（４０）； ・E．coli中で産生されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合したｐ ４０（１２）； ・S．cerevisiae中で産生されたヘルパーＴ細胞エピトープを保有する、破傷風 アナトキシン由来のポリペプチドと融合したｐ１９（１２）： ・バキュロウイルス系中で産生されたｐ４２（４１）； である。 E．coli中で産生されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合したｐ １９タンパク質をミョウバンまたはリポソームに取り込ませたものを、６匹のAo tus nancymaiサルにワクチン接種したが、いずれも保護効果を示さなかった（４ ０）。 E．coli中で産生されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合したｐ ４２タンパク質を完全フロイントアジュバントと混合したものを、２種のAotus 種（A．nancymaiおよびA．vociferans）のサルに投与したが保護効果を示さなか った。S．cerevisiae中で産生されたｐ１９タンパク質は、２匹のA．nancymai種 Aotusサルで保護効果を示した（１２）。これに対して、２匹のA．vociferans種 Aotusザルには保護効果がなかった。 また、Changらは、P．falciparumと共通するあるアミノ酸配列を含む組換えｐ ４２タンパク質をバキュロウイルス系中で産生し、これを使用してウサギで実施 された免疫試験を報告している（１８）。彼らは、ウサギでは、組換えｐ４２が 組換えＭＳＰ−１タンパク質全体（ｇｐ１９５）と実質的に同様の挙動をとるこ と明らかにしている。完全フロイントアジュバントとこのｐ４２タンパク質との 混合物は、P．falciparumに感染可能なヒト以外の霊長類、Aotus,lemurinus gri semebraのワクチン接種試験に用いられた（４０）。その結果、３匹の動物のう ち２匹は完全に保護され、３匹目は、対照体のものに似た寄生虫血症を示したが 、潜伏期間は長かった。しかし、寄生虫自体で誘導されるヒトの抗体のような保 護特性があると結論するのは危険である。P．falciparumおよびP．vivaxに対す る霊長類の実験モデルはあまり満足のいくものはないことを思い起こすべきであ る。P．falciparumおよびP．vivaxに対して開発されたSaimiriモデル、およびP ．falciparumに対するAotusモデルは、寄生虫株を適応させることを必要とし、 有意な寄生虫血症とするために動物の牌臓摘出をしばしば必要とする人工系であ る。そのため、このようなモデルから得られたワクチン接種では、ヒトに対して 、ある限られた的中率を持つに過ぎない。 いずれにせよ、そのような組換えタンパク質で得られうる実際のワクチン化率 がどうなるかがまた疑問であり、多くの場合、あるマラリア原虫株由来のｐ４２ をワクチン接種した個体で誘導される抗体が、同一種でも他の株による感染に対 して免疫予防効果があるかどうかはわからない−以下に報告する−同一種のマラ リア原虫由来のｐ４２、特にｐ３３上にある高頻度可変領域に留意すべきである （１３）。 ｐ４２のＮ末端部分の多型性は、その種の寄生虫にしばしば観察される免疫逃 避において重要な役割を担っていると考えられる。 本発明の目的は、これらの困難を回避し、真に有効な実験モデルにおいて、ま たは直接ヒトにおいてもその保護効果を証明できるワクチン用組換えタンパク質 を産生することにある。 より詳細には、本発明は、ヒトに対して感染性であるマラリア原虫に対するワ クチンの組成がグリコシル化に関係なく活性のある組換えタンパク質であって、 その必須ポリペプチド配列が： ・ヒトに対して感染性であるマラリア原虫型寄生虫のメロゾイト形態の表面タン パク質１（ＭＳＰ−１タンパク質）の１９kDa（ｐ１９）Ｃ末端断片で、感染サ イクルにおけるヒトの赤血球中への侵入段階の終わりに寄生虫表面に通常固定さ れて残存するＣ末端側の配列、 ・対応する寄生虫による寄生虫血症を生体内(in vivo)で阻害可能な免疫応答を 誘導しうる断片の一部の配列、 ・上記ｐ１９断片もしくはその断片の一部と免疫学的に等価なペプチドの配列を 組換えタンパク質の活性成分として含み、 その組換えタンパク質が還元培地中で不安定で、対応するマラリア原虫に対して 形成されるヒト抗血清によって認識されるエピトープの大部分を好ましくは作り 上げているエピトープの高次構造をさらに含む、ヒトに対して感染性であるマラ リア原虫型寄生虫に対するワクチン組成物を提供する。 このようなエピトープの高次構造の存在は、ワクチンの活性成分の保護効果に おいて重要な役割を果たしている。それらは、特に、バキュロウイルス系で産生 された場合、上で規定した他の特徴を示す、特別な活性成分は全て他の部位に見 出される。必要ならば、「バキュロウイルスベクター系」という表現は、バキュ ロウイルス型ベクター自身と株化細胞、特にこれらの細胞系に導入された導入配 列が発現するように修飾されたバキュロウイルスとこれに感染可能な昆虫の細胞 により構成される集合体を意味する。バキュロウイルス系におけるこれら２つの パートナーの好ましい例は、Longacreらの論文（１９）に記載されている。同じ 系を以下の実施例において使用した。もちろん、バキュロウイルスとバキュロウ ィルスが感染する細胞の変異体を、選択したものに代えて使用することができる ことは言うまでもない。 特に、組換えタンパク質は、それが不可逆的非還元状態または非還元状態であ る場合に対応マラリア原虫または相同マラリア原虫に対して形成されるヒト抗血 清により認識されるが、不可逆的還元状態では、同様の抗血清で認識されない か、またされたとしてもわずかである。 還元培地中でのエピトープの高次構造の不安定性は以下の実施例に記載されて いる試験、特にβ−メルカプトエタノールの存在下の試験により証明することが できる。同様に、以下の実施例には、本発明のタンパク質を不可逆的還元状態に するための実験条件が記載されている。 この観点から、Longacreらにより産生された組換えタンパク質（１４）を以下 のような組成で使用することができる。S.Longacreらは、特に、使用したバキュ ロウイルスの、ポリヘドリン（polyhedrin）プロモーターのコントロール下に、 Plasmodium vivaxのＭＳＰ−１のｐ１９をコードするヌクレオチド配列を組み込 み、これを昆虫細胞［Spodoptera frugiperda（Sf9）系］に感染させ、培養し、 組換えｐ１９を産生することに成功したことを思い起こすべきである。使用され たバキュロウイルスベクターのポリヘドリン（polyhedrin）プロモーターのコン トロール下に、以下に記載するペプチド配列をコードする配列を導入した： ・ポリヘドリンシグナル配列の５’末端３５塩基対の断片で、このタンパク質の 発現を開始するメチオニンコドンを（ＡＴＴに）変異されたもの； ・ＭＳＰ−１シグナルペプチドを含み、ＭＳＰ−１のＮ末端部位に対応する３２ アミノ酸残基から成るペプチドをコードする５’末端ヌクレオチド断片： ・ｐ１９をコードするヌクレオチド配列あるいはPlasmodium vivaxのＭＳＰ−１ タンパク質のｐ４２をコードするヌクレオチド配列の何れかで、場合に応じて、 ヌクレオチド配列の３’末端領域を備え（「固定」形態）または欠失し（可溶形 態）た配列。この発現産物のＣ末端側は、最終産物であるｐ１９タンパク質を寄 生虫膜へ固定する際に本質的役割を担うと考えられている； ・２つの終止コドンＴＡＡ。 ｐ４２の、ＭＳＰ−１のＣ末端領域に由来する配列は、Ａｓｐ１３２５からＬ ｅｕ１７２６（固定された形態）か、Ｓｅｒ１７０５（可溶性の形態）までで、 ｐ１９では、その配列はＩｌｅ１６０２からＬｅｕ１７２６（固定された形態） か、Ｓｅｒ１７０５（可溶性の形態）までで、上に示されたｐ４２またはｐ１９ の完全なアミノ酸配列は、開始から末端アミノ酸までP．vivaxのベレム (Belem) 単離体で配列決定された遺伝子であることがわかる（２０）。 同様の結果が、同じベクター系において、三日熱マラリア原虫Plasmodium cyn omolgiのｐ４２およびｐ１９をコードするヌクレオチド配列を使用して得られた 。P.cynomolgiにおける興味は２倍である：これはマカクに対して感染性であるP ．vivaxに非常に近い寄生虫種である。またこれはヒトにも感染可能である。さ らに、天然系におけるP.cynomolgi由来のＭＳＰ−１の保護効果を検証するため に、P.cynomolgiの自然宿主、アカゲザルおよびトクマカクへの感染も可能であ る。アカゲザルはヒトの免疫応答に対応する最も代表的な種の一つであると考え られる。 特に、２つの組換えポリペプチド：P.cynomolgi由来の可溶性ｐ４２と、可溶 性ｐ１９は、それぞれバキュロウイルス系で産生され、未変性のＭＳＰ−１タン パク質の対応領域を認識するモノクローナル抗体を使ったアフィニティカラム上 で精製され、トクマカクを用いて実施したワクチン接種試験により、特に可溶性 ｐ１９では優れた結果が得られた。次の観察がなされた：ｐ１９のみ（３匹のサ ル）とｐ１９とｐ４２の併用（３匹のサル）で免疫化された６匹のサルは、全て 、抗原投与感染後、現実的にはほとんど免疫性を示さなかった。ｐ４２で免疫化 された３匹のサルにおいて得られた結果にも有意の差はなかった。３匹のうち２ 匹は上述した通りであるが、３匹目は、免疫化されていないサル（３匹）または フロイントアジュバントの存在下でＰＢＳ緩衝液とともに免疫化された対照（３ 匹のサル）よりもより低い寄生虫血症を示したため、あまり明確ではなかった。 ２回目の抗原投与感染では、ｐ１９を単独で接種されたサルは、少なくとも６ ヶ月間保護されたことが示された。この系（トクマカク、P.cynomolgi）におい てミョウバンと組み合わせたｐ１９での二回目のワクチン接種試験では、３匹の サルの内２匹について有意な保護性が示された。ミョウバンの存在下でＭＳＰ− １または他の組換え抗原が保護効果を示したのはこれが最初である（４２）。 P.cynomolgi由来の組換えｐ１９を導入したバキュロウイルス系中で産生され た組換えポリペプチドを用いて、マカクで実施した特に効果的な試験結果から、 他のプラスモディウム属由来の組換えｐ１９をそれぞれ含む組換えポリペプチド が同様に挙動しなければならないことが示された。これらは、「人工宿主」に おいてP．vivaxまたはP．falciparumで行われた試験結果よりも、ヒトにおける マラリアに対して、より意味がある。 Ｃ末端ＭＳＰ−１タンパク質（ｐ１９）由来のバキュロウイルス組換えタンパ ク質は、ヒトに対するＭＳＰ−１の保護効果を評価する最も代表的なモデルを構 成する、天然系において非常に有意な抗マラリア保護効果を奏する。 ｐ１９の形態が、ｐ４２のＮ末端部位の高頻度可変領域、すなわちワクチン接 種された患者が多くの多型性に直面する自然の状況では有害となりうる効果を持 つ領域が除去されたものである場合は、得られる保護効果はさらに改善される。 さらにｐ１９はｐ４２に存在しない特異的エピトープを保有するように思われる 。 ワクチン活性成分の配列が存在する１９ｋＤａのＣ末端断片は、通常、対応Ｍ ＳＰ−１タンパク質のｐ１９配列の上流にある如何なるポリペプチド配列もない 場合には、ｐ１９それ自体の配列に限定されうる。しかし、活性成分の必須構成 ポリペプチド配列は、３３ｋＤａ（ｐ３３）Ｎ末端断片が存在してもワクチンの 活性成分の免疫学的特性を明らかに、変化させないならば、対応ｐ４２の自然の 切断前に、対応ｐ４２におけるｐ１９とまだ結合している該３３ｋＤａ（ｐ３３ ）Ｎ末端断片に属するＣ末端側ポリペプチド配列をさらに含みうる。また、以下 に、特に実施例の記載において示すように、同種のプラスモディウムの種々の株 におけるｐ３３のＣ末端配列（図４の「領域III」のペプチド配列のＣ末端部分 を参照）は、特にこの図から得られる仮説を用いて、それらが活性成分（図４の 領域ＩＶに相当する配列ｏｆｏ）のワクチン特性を基本的に変更せず；ｐ１９と ｐ３３の領域ＩＩＩとの間の椎定切断部位が、特によく保存された領域（ＬＮＶ ＱＴＱ）におけるロイシンとアスパラギン残基との間に位置し、ヒトに対して感 染性である異なる種類のマラリア原虫においては例えば少なくとも８０％のオー ダーの相同性または実質的に保持された配列を有している。 通常、ｐ３３のＣ末端ポリペプチド配列は、それが存在する場合、５０未満の アミノ酸残基、または３５未満、好ましくは１０未満のアミノ酸残基を含む。 これに対し、当然に寄生虫から保護する抗体を誘導する能力を保持しているな らば、ワクチンの活性成分の必須構成ポリペプチド配列は、ｐ１９をコードする 配列の全てを含む必要はない。特に、「断片部位」の分子量は１０から２５ｋＤ ａ、特に１０から１５ｋＤａである。好ましくはこのポリペプチド断片部位は２ つのＥＧＦ（表皮増殖因子）領域の少なくとも１つを含む。 明らかに、当業者であれば、活性断片ともはやそうではないものとを、ｐ１９ をコードする断片のエキソヌクレアーゼによる切断時間を変えるか、または適当 な制限酵素との反応により、ｐ１９をコードする配列から得られた断片からそれ ぞれ単離したｐ１９由来の長さの異なる挿入断片を含む修飾ベクターを産生する ことによって実験的に識別することができる：ついで対応の修飾ベクターにより 形質転換し、保護効果を呈する対応の真核細胞、特に昆虫細胞におけるこれら挿 入断片による発現物質の能力を、特に以下の実施例において記載される実験条件 下で試験することができる。特に、これら挿入断片の発現物質は、対応する寄生 虫全体によって生体内で誘導される寄生虫血症を阻害することができるものでな くてはならない。 しかして、本発明は、活性成分の必須構成ポリペプチ配列が、ｐ１９または、 他のものによる所定のアミノ酸配列の付加、欠失もしくは置換が、修飾ペプチド の寄生虫血症阻害能力に大きな変化をもたらさないことを前提として、上述した 断片により得られるものに等価な細胞および／または体液型免疫学的応答を誘導 しうるペプチド−以下「免疫学的等価ペプチド」と称する−により構成される全 てのワクチン用組成物を含む。 また、ｐ１９断片は、対応寄生虫により生体内で通常誘発される寄生虫血症を 阻害する能力を変化させないで増大させるならば、当然に、Ｎ末端側またはＣ末 端側で、またはペプチド結合を介して、ワクチン増強作用を持つ更なるマラリア 原虫のタンパク質断片（例えば、特にシステインに富んだある領域を持つP．fal ciparum（３０）および（３１）由来のＥＢＡ−１７５、あるいはP．vivax（２ ９）由来のダフィー（Duffy）結合タンパク質）に結合していてもよい。 また、ｐ１９またはその一部をコードする断片は、ｐ１９のＮ末端上流に、異 なるペプチド配列、例えばＭＳＰ−１タンパク質に対するもののような、使用シ グナルペプチドのＣ末端断片を含むことができる。この配列は、５０アミノ酸残 基未満が好ましい、例えば１０から４０のアミノ酸を含む。 これらの知見は、例えば他のマラリア原虫、特にマラリアの最も深刻な状態の 一つの原因であり、寄生虫の優性種であるP．falciparum由来のｐ１９にも同様 に当てはまる。 しかしながら、バキュロウイルス系においてP．vivaxまたはP.cynomolgi由来 の組換えｐ１９を産生するための上に要約した技術では、単に免疫保護試験の実 施を可能にする程のかなりの量を得ようとするのであっても、満足のいく収量で P．falciparumの組換えｐ１９の産生を変化させないように導入するのは困難で ある。 本発明は、この問題を大部分解決するための方法をまた提供する。さらにバキ ュロウイルス系の発現ベクターにおけるPlasmodium falciparumのｐ１９をコー ドする自然ヌクレオチド配列を合成ヌクレオチド配列を使用して置換し、非常に 高い収率でP．falciparum−および同様の困難性を有する他のマラリア原虫−の ｐ１９を得ることが可能になり、該合成ヌクレオチド配列は、同じｐ１９をコー ドするが、自然ヌクレオチド配列よりもヌクレオチドのＧおよびＣの割合が高い ことを特徴とする。 換言すれば、本発明は、バキュロウイルス系においてｐ１９をコードするヌク レオチド配列の発現が、これらバキュロウイルス中に通常含まれ感染宿主細胞で 発現する自然ヌクレオチド配列に対して観察されるように、バキュロウイルスに より形質転換可能な宿主細胞の「細胞機構」で発現するヌクレオチド配列の連続 したコドンの適合性の改善と明らかに関連しており；よって、本来のP．falcipa rumのヌクレオチド配列は全く発現しないか、ほとんど発現せず；falciparumの ｐ１９をコードするのヌクレオチド配列のものよりもＧおよびＣの量が比較的よ り高いため、Longacreら（１４）により観察されたバキュロウイルス系のP．viv axのｐ１９、および発明者がまた示したように、本来のｐ１９ヌクレオチド配列 から改変したP.cynomolgi配列のｐ１９に対する効果的な発現の説明が可能とな る。 しかして、本発明は、より一般的には、バキュロウイルス系に摂取されうるシ グナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を、ベクターに含有され、 ベクターにより移入可能な細胞により認識されうるプロモータのコントロール 下で、含む組換えバキュロウイルス型修飾ベクターであって、第１のものの下流 にあって、またプロモーターのコントロール下で： ・ヒトに対して感染性であるPlasmodium vivax以外のマラリア原虫型寄生虫のメ ロゾイト形態の表層タンパク質１（ＭＳＰ−１タンパク質）の１９kDa（ｐ１９ ）Ｃ末端断片で、感染サイクルにおけるヒトの赤血球中への侵入段階の終わりに 寄生虫表面に通常固定されて残存するＣ末端断片； ・バキュロウイルス系における第２配列由来の発現物質が、対応寄生虫による寄 生虫血症を生体内で阻害しうる免疫応答を誘導しうる場合には、該ペプチド断片 の一部； ・上記断片の上記一部または上記ｐ１９ペプチド断片により得られるものと同様 の細胞および／または体液型免疫学的応答を誘導する上記免疫学的に等価なペプ チドの能力に大きな変更を生じないアミノ酸の付加、欠失もしくは置換した上記 Ｃ末端ペプチド断片（ｐ１９）もしくは前記断片の一部と免疫学的に等価なペプ チド； のペプチド配列をコードし、 前記ヌクレオチド配列が、必要に応じて、それを構成しているヌクレオチドの全 体の４０％から６０％の範囲、好ましくは少なくとも５０％ＧおよびＣのヌクレ オチド含有量を有することを特徴とする。この配列は、本来のコドンに対応する 翻訳を変えることなく（ペプチド配列を維持して）Ｇ／Ｃに富んだコドンに変化 している合成遺伝子を作ることによって得ることができる。 合成ＤＮＡにより与えられるヌクレオチド配列は、本来の翻訳配列の特徴を保 持しながら、すなわちアミノ酸配列を維持しながら、ｃＤＮＡまたは本来の遺伝 子配列に対し少なくとも１０％の修飾コドンを有しうる。 産生された組換えペプチド−あるいは免疫学的に等価なペプチド−のアミノ酸 配列が修飾されても、特に以下に記載する試験において、形成された組換えタン パク質の免疫学的特性または保護特性の消失にならない場合には、ＧおよびＣヌ クレオチド含有量がさらに増大されうることを排除するものではない。 これらの知見は、ヒトに感染性である他のマラリア原虫、特に、本来のヌクレ オチド配列がバキュロウイルス系における有効な発現とあまり適合性のないＴ およびＡのヌクレオチド含有量を持つ対応ｐ１９をコードするものにも当然適用 される。 使用されるシグナルをコードする配列は、関連したマラリア原虫の本来の配列 と通常結合したものでありうる。しかし、それは、他のマラリア原虫、例えばP. vivaxまたはP.cynomolgiまたはそれがバキュロウイルス系におけるシグナルとし て認識されうるならば他の生物体からでも得ることができる。 考慮中のベクターにおいてその断片またはｐ１９をコードする配列は、ある場 合は、由来している寄生虫への未変性タンパク質の固定配列が剥奪されており、 その場合、発現したタンパク質は一般的に培地中に排出される（可溶性の形態） 。またこの点に関し、本発明の条件下で、特にそれらがP．falciparumまたはP.c ynomolgiまたはP．vivax由来のものである場合、可溶性または固定した形態の産 生された組換えタンパク質がオリゴマーを形成する傾向にあり、この特性は形成 された組換えタンパク質の免疫性を増加させる原因となりうる。 また本発明は、コードする配列が、通常、それが発現する宿主の細胞膜への未 変性タンパク質の固定を引き起こすｐ１９の疎水性Ｃ末端配列をコードする３’ 末端配列を含むベクターに関する。さらに、この３’末端領域は、使用したバキ ュロウイルス系の宿主の細胞膜に産生した組換えタンパク質の全体を固定する配 列をそれがコードする場合に他の生物体由来の、あるいはP．vivaxからの３’末 端配列に例えば対応する、可溶性のｐ１９部分をコードする配列に対して異種性 でありうる。このような固定配列の例としては、Spodoptera fruglperda（３２ ）型昆虫の細胞で発現可能なＣＤ５９抗原のＧＰＩ（３２）またはＣＤ１４ヒト タンパク質のＧＰＩ（３３）がある。 またさらに本発明は、当然組換えタンパク質にも関連しており、これらタンパ ク質は対応マラリア原虫に対して形成されるヒト血清が認識するエピトープの高 次構造を含む。 一般には、本発明は、それがエピトープの高次構造、例えばバキュロウイルス 系で産生されたもの、特に還元培地中で不安定なものを含む場合には、上述した 型の任意の組換えタンパク質に関する。 また本発明は、もちろん、特にバキュロウイルス系で使用される細胞宿主への 、 固定領域を持つ形態であるか、可溶性の形態であるかにかかわらず、前記組換え タンパク質にも関する。 さらに本発明は、従来のタンパク質オリゴマー化技術を使用し、後天的に産生 するか、または使用したバキュロウイルス系中で自発的に産生されたオリゴマー をも包含する。最も一般的に使用される技術は、グルタルアルデヒドを含む。し かしながら、タンパク質中のそれぞれのアミノ基およびカルボキシル基との間を 架橋する如何なる従来の系でも使用することができる。例えば、欧州特許出願公 開第０６０２０７９号に記載された何れの技術でも使用することができる。 「オリゴマー」なる用語は、２〜５０のモノマー単位を含む分子であって、モ ノマー単位の各々が、ｐ１９または凝集体を形成可能な、上述したようなその断 片を含む分子を意味する。また本発明は、共有結合または他の結合を介して、ワ クチン製造に使用するキャリア分子−例えばポリリジン−アラニン−と上述した ようなｐ１９断片またはｐ１９との間にできる任意の抱合物質を包含する。これ らを使用するワクチン用組成物も本発明の一部を形成する。 またさらに、本発明は、Plasmodium vivax由来のタンパク質を含む、これらの オリコマー様、または抱合した組換えタンパク質を使用するワクチン用組成物に も関しており、これらの知見はこれら組換えタンパク質のオリゴマーにも拡張で きる。 また本発明は、上述した組換えタンパク質がアジュバント、例えばミョウバン と混合した組成物を包含する。それらが産生された細胞膜への固定を許容するＣ 末端領域を含む組換えタンパク質は、有利には、ワクチン産生に適切なリポソー ムを形成しうる脂質と組合わせて使用される。限定するものではないが、例えば J．Delattreらによる「リポソーム：技術的、生物学的および薬理学的アスペク ト(Les liposomes aspects technologique，biologique et pharmacologiqus)」 （INSERM社、1993年）と題された刊行物に記載されている脂質を用いることがで きる。 適切にワクチン接種をすれば、相同の固定領域であろうと異種の固定領域であ ろうと、組換えタンパク質に固定部位が存在すると、特に高い保護活性を有しう る細胞親和性抗体、特にＩｇＧ_2aおよびＩｇＧ_2bの産生がマウスにおいて促進さ れ、このように構成されたワクチンの活性成分を脂質以外のアジュバントと会合 させて、リポソーム形態にすることは不要になる。リポソームは、冷貯蔵せずに 貯蔵および移送することができ、ある条件下で凍結乾燥も可能なので、これは大 きな利点である。 本発明の他の特徴は、以下に記載する本発明の組換えタンパク質の実施例およ びそれらを産生可能な条件から明らかになるであろう。これらの実施例は、本発 明の範囲を限定することを意図はしていない。 ＰｆＭＳＰ１_p19Ｓ（可溶性）（P．falciparum由来の可溶性ｐ１９）の構造の記 載 組換え構成体ＰｆＭＳＰ１_p19Ｓは、８塩基対のリーダー配列と、Ｍｅｔ₁から Ａｓｐ₃₂までのPlasmodium vivax由来のＭＳＰ−１の最初の３２アミノ酸残基［ ベレム単離体：Del Portilloら、1991、P.N.A.S、88、4030］に対応し、Ｅｃｏ ＲＩ切断部位により２つの断片が連結しているＧｌｕＰｈｅが続くＤＮＡを含む 。これに、図１に記載され、Ａｓｎ₁₆₁₃からＳｅｒ₁₇₀₅までのPlasmodium falci parumのＭＳＰ１_p19をコードする合成遺伝子が続く［Uganda-Palo Alto単離体： Changら、1988、Exp.Parasitol、67、１］。構造体は２つのＴＡＡ終止コドンで 終了する。この構造により、感染した細胞からの培養上清に分泌された組換えタ ンパク質が生じる。 同じ方法で比較するために、ChangらによりExp.Parasit．(67、１；1989)に記 載されたP．falciparum株（ＦＰＵ）の対応ＤＮＡを直接コピーしたものからな るコード配列を使った以外は、上述したｐ１９を産生させたのと同様の条件下で 組換え構造体を産生した。遺伝子のコピー（アスパラギン１６１３からセリン１ ７０５）は、ＰＣＲに本来の遺伝子から合成した。 図１Ａは合成遺伝子（Ｂａｃ１９）と「本来の遺伝子」（ＰＦ１９）の両方の 配列を示している。 これから、P．falciparum由来のｐ１９をコードする本来の配列９３コドンの うち５７コドンが修飾された（５５はコドンの３番目のヌクレオチド、他の２つ のコドンは１番目および３番目のヌクレオチド）ことが分かる。上述した条件下 でシグナルペプチドを導入し、クローニングのためのＥｃｏＲＩ切断部位を導入 するために５’末端に新規のコドンが加えられ、また同様に発現終止信号を入れ るために、P．falciparumｐ１９に存在しなかった２つの終止コドンが加えられ た。連続するコドンの上部に付けた個々の文字は、連続する各アミノ酸に対応す る。星印（＊）は終止コドンを示している。２つの配列が同一の場合はヌクレオ チドを垂直線で示している。 ＰｆＭＳＰ１_p19Ａ（固定ＧＰＩ）（P．falciparumの固定ｐ１９）構造の記載 ＰｆＭＳＰ１_p19Ａ構造は、合成配列（図１Ｂ）が、２つの終止コドンＴＡＡ が続くＡｓｎ₁₆₁₃からＩlｅ₁₇₂₆までのPlasmodium falciparumのＭＳＰ１_p19（U ganda−Palo Alto単離体）をコードすることを除けば、上述の特徴を有していた 。この構造により、感染した細胞の原形質膜に、グルコシルホスファチジルイノ シトール（ＧＰＩ）型構造体によって固定された組換えタンパク質が生じる。 図１Ｃは、シグナル配列を切断する前のＰｆＭＳＰ１_p19Ｓ組換えタンパク質 の配列を表す。 図１Ｄは、シグナル配列を切断した後のＰｆＭＳＰ１_p19Ｓ組換えタンパク質 の配列を表す。 図１Ｃおよび１Ｄにおいて下線が付されたアミノ酸残基は、（シグナル配列を 有する）P．vivaxのＭＳＰ−１のＮ−末端部とP．falciparumのＭｓｐ−１_p19由 来のヌクレオチド配列を連結するためのＥｃｏＲＩ部位をもつ。 図２−免疫親和性により精製された可溶性の組換えＰｆＭＳＰ１_p19抗原を、 β−メルカプトエタノールの存在（還元）下または非存在（非還元）下でＳＤＳ −ＰＡＧＥし、免疫ブロット法により分析した。２％のＳＤＳの存在下でサンプ ルを９５℃まで加熱した後ゲル上に添加した。これらの条件下では、共有結合( ジスルフィド架橋)のみが非凝集化に抗しうる。左手のブロットは未変性ｐ１９ の直線状エピトープと反応したモノクローナル抗体で染色した。右手のブロット はPlasmodium falciparumによるマラリアに対して獲得した免疫性を有する患者 か ら生じた１３のヒト抗血清の混合物で染色した。これらの結果は、組換えバキュ ロウイルス分子の大半が、ヒトの抗血清により認識されるポリマーの形態でエピ トープの高次構造を再生しうることを示している。 図２Ｂ：非還元（ＮＲ）、帯電培地における還元のみ（Ｒ）、および 不可逆的還元（ＩＲ）状態にあるP．vivaxおよびP.cynomolgi由来の 精製された組換えＭＳＰ−１ｐ１９のヒトの抗血清を用いた 免疫ブロット分析： この研究は、バキュロウイルスの発現系が、生体内においてＭＳＰ−１のＣ末 端部位に大量に存在するエピトープの高次構造を正確に再生したという考えに基 づいていた。この特性を測定する最良の手段（ｐ１９に対応する精製された未変 性のタンパク質が存在しない現在おける、唯一可能な手段かもしれない）は、マ ラリアにさらされた個体の抗血清との組換えタンパク質の反応性を調査すること であり、これはヒトの免疫系により「可視化できる」未変性のタンパク質を反映 する。 このように免疫親和性により精製された可溶性の組換えＰｖＭＳＰ−１ｐ１９ およびＰｃＭＳＰ−１ｐ１９抗原を、ＤＴＴの存在（還元）下または非存在（非 還元）下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）後、免疫ブロット法により分析した。２ ％のＳＤＳの存在下でサンプルを９５℃まで加熱した後ゲル上に添加した。不可 逆的還元は、次のようにして行った：タンパク質をｐＨ８．４で０．２Ｍのトリ ス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＤＴＴ、１．０％のＳＤＳに再懸濁させ、７０℃で３ ０分間加熱した。水で希釈した後、最終濃度が２Ｍになるようにアクリルアミド を添加し、混合物を窒素雰囲気下３７℃に保った暗所で１時間インキュベートし た。Plasmodium vivaxによるマラリアに対して獲得した免疫性を有する患者から 得た２５のヒト抗血清の混合物で免疫ブロットした。ＶとＣは、それぞれ、P．v ivaxおよびP.cynomolgiのＭＳＰ−１由来のタンパク質を表す。不可逆的に還元 された組換えタンパク質はヒトの抗血清とまったく反応しないが、非不可逆的に 還元されたタンパク質または還元されていないタンパク質が良好な反応性を示し たことは注目すべきことである。（還元されていないＰｖＭＳＰ−１ｐ１９は、 そのグルコシル化状態によりニトローセルロース膜に十分に結合しないため、少 し弱かった）。これらの結果は、ヒトの抗血清によるバキュロウイルスＭＳＰ− １ｐ１９分子の認識性が、完全でないにしろ、この系で再生され、還元に対して 敏感なエピトープの高次構造に大きく依存していることを示している。 図３−可溶性のＰｖＭＳＰ１_p42組換え抗原（Longacreら、1994、前掲）をP． falciparumのメロゾイト由来のタンパク質画分と共存させ、で３７℃で５時間イ ンキュベートし、等電点電気泳動により分離した。ついでサンプルを、β−メル カプトエタノールの存在（還元）下または非存在（非還元）下で免疫ブロット法 により分析した。等電点電気泳動画分５ないし１２および界面活性剤の存在下（ Ｔｅｘ）または非存在下（Ｔ）で得られた２つの全メロゾイト抽出物が分析され た。免疫ブロットはP．vivaxのＭＳＰ１_p42および_p19に特異的なモノクローナル 抗体で明らかになった。この結果は、界面活性剤で抽出されうるP．falciparum のメロゾイトにタンパク質分解活性があることを示唆している。ある画分による ｐ４２の消化は、消化物質（ｐ１９）の重合を引き起こすようである：β−メル カプトエタノールが存在すると、約１９ｋＤａの分子（Ｔｅｘ−Ｒ）が優位にな って、高分子量の形態のものが消失するため、この重合は、おそらくジスルフィ ド架橋の形成に関連している。よって、これらの実験で観察されたｐ１９の重合 が、生体内でのこの分子固有の性質であると思われる。 図３Ｂ：P．vivaxの抗ＭＳＰ−１抗体のヒトの応答に対する ｐ４２およびｐ１９抗原の差次的寄与 P．vivaxに対して獲得した免疫性を有する個体の抗血清によるP．vivaxのＭＳ Ｐ−１ｐ４２およびｐ１９の認識度を、次のようにＥＬＩＳＡ阻害法を使用して 比較した：P．vivaxによるマラリアに対して獲得した免疫性を有する患者から生 じた２５ヒト抗血清の混合物を１：５０００に希釈し、これを単独で、または１ ｍＭの精製されたP．vivaxの組換えｐ４２またはｐ１９の存在下において、室温 で４時間インキュベートした。この混合物を、４℃で１８時間、５００ｎｇ ｍｌ^-1の精製された組換えｐ４２またはｐ１９を吸着コーディングしたマイクロ タイターウェルに移し、室温で３０分間インキュベートした。０．１％のトゥイ ーン（Tween）２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼで標識し たヤギの抗マウスＩｇＧを添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベートした 。酵素活性を４９２ｎｍでの光学密度を読むことにより明らかにした。阻害度の パーセンテージを、競合抗原の不在下においてマイクロタイタープレート上にコ ーティングした抗血清を用いた抗血清活性度１００％の値に基づいて算出した。 統計データはスタットビュー（Statview）プログラムを使用して算出した。各々 の帯は、４ないし１２の測定に基づいて、一組の競合／吸着抗原の阻害度の平均 パーセンテージを表し；垂直線は９５％信頼区間に相当する。星印（＊）はツニ カマイシンの存在下で産生されたＮ−グリコシル化されていない抗原を示す。こ れらの測定の重要なパラメータは、ＥＬＩＳＡ曲線に対して敏感である領域にあ る抗血清の１：５０００という希釈度と、親和性の低いエピトープによる競合を 含む１ｍＭの競合抗原濃度である。よってこれらのデータは、２つの比較抗原間 の最大類似度を反映している。この結果は、ｐ１９の存在下ではｐ４２に対する ヒト抗血清の反応性がｐ４２抗原自身によるのと同程度に大きく阻害されるため 、主として、全部ではないがヒトの抗血清により認識されるｐ４２エピトープが ｐ１９上に存在することを示している。しかしながらこれに対し、ｐ１９に対す るヒトの抗血清の反応性が、ｐ１９自身によるものよりもｐ４２によって阻害さ れる方が少ないので、ヒトの抗血清で認識されるｐ１９エピトープの約２０％は 、ｐ４２上にないか、アクセスできない。このようなｐ１９の特異的なエピトー プはｐ４２のｐ１９およびｐ３３への切断後にだけ構築されるか現れるうる。こ れらの結果は、効果が、グルコシル化の差異ではなく、ｐ４２とｐ１９とのペプ チド成分間の差異に実際にはよることを示し、グリコシル化による影響は受けな かった。これらの結果により、ｐ１９がｐ４２に対し、明確な免疫学的同一性を 有するという事実が裏付けられる。 ＰｃＭＳＰ１_p19Ｓ（可溶性）構造（P.cynomolgiの可溶性ｐ１９）の記載 上述した構造体で使用されたＤＮＡは、Plasmodium cynomolgi ceylonesi株の クローンから得られた（２２−２３）。この株はその自然宿主［マカカ シニカ (Macaca sinica)］を連続して通過し、蚊を介して循環伝染することにより保持 された（２７）。 成熟したシゾント段階における血液寄生虫を、寄生虫血症が５％のレベルに達 成したときに、感染したサルから得た。ついでそれらを（２５）に記載された方 法を使用して精製した。ついでＤＮＡを（２６）で記載されているようにして抽 出した。 １２００の塩基対の断片を、P．vivax由来の図４で下線が施されているオリゴ ヌクレオチドを使用するＰＣＲ反応を使用して産生した。５’末端オリゴヌクレ オチドはＥｃｏＲＩ切断部位を含み、３’オリゴヌクレオチドはＢｇｌＩＩ切断 部位に続く２つの合成終止コドンＴＡＡを含有する。この断片をP．vivaxのＭＳ Ｐ−１タンパク質に対するシグナル配列を既に含むｐＶＬＳＶ₂₀₀プラスミドに 、これらＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ切断部位を介し、連結反応させて導入した （１９）。新規のプラスミド（ｐＶＬＳＶ₂₀₀Ｃ₄₂）はＤＮＡの塩基配列を分析 するために使用した。 P.cynomolgiおよび対応P．vivax配列を並べた。黒い矢印は推定される第１お よび第２切断部位を示している。それらはP．falciparumの既知の部位との相似 性によって決定した（２７、２８）。垂直線および水平矢印は研究された４つの 領域の境界に配されている。領域４はP.cynomolgiのｐ１９をコードする配列に 相当する。グリコシル化部位を箱で囲み、保護されたシステインに下線を付した 。図４の下部はP．vivaxとP.cynomolgiの２つの単離体間での相同性の割合を示 している。 組換え構造体ＰｃＭＳＰ１_p19Ｓは、８塩基対のリーダー配列と２つの断片を 連結しているＥｃｏＲＩのためにＧｌｕＰｈｅが続くＭｅｔ₁からＡｓｐ₃₂まで のPlasmodium vivax由来ＭＳＰ−１の最初のアミノ酸３２個［ベレム単離体：De l Portilloら、1991、P.N.A.S、88、4030］に相当するＤＮＡを含有する。これ にはＬｙｓ₂₇₆からＳｅｒ₃₈₀までのPlasmodium cynomolgiのＭＳＰ１ｐ１９をコ ードする配列が続く［セイロン（Ceylon）株］。構造体は２つのＴＡＡ終止コ ドンで終了する。この構造体により、感染した細胞からの培養上清に分泌された 組換えタンパク質が生じる。 Plasmodium falciparumのｐ１９を特異的に認識するモノクローナル抗体 での免疫アフィニティークロマトグラフィーによる組換えＰｆＭＳＰ１ｐ１９ の精製 ファルマシア社（Pharmacia）で使用されている手順を詳述した標準的な方法 に従い、３ｇの活性化ＣＮＢｒ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社）に、７０ ｍｇのモノクローナル抗体（１９９７年２月１４日にＣＮＣＭ［国立微生物培養 菌株保存機関］（フランス，パリ）に登録番号１−１８４６で寄託されたＧ１７ ．１２ハイブリドーマから得られたもの、；このＧ１７．１２ハイブリドーマは P．falciparumのｐ１９を認識するＩｇＧ２ａ／ｋを産生するＸ６３Ａｇ８ ６５ ３ミエローマから構成された）を結合させてクロマトグラフィー用の樹脂を調製 した。可溶性のＰｆＭＳＰ１ｐ１９を含有する培養上清を４℃で１６時間、クロ マトグラフィー樹脂とともにバッチでインキュベートした。カラムを２０倍量の ＰＢＳ（0.05% NP40を含む0.5M NaCl）で一度、５倍量のＰＢＳで一度、さらに ２倍量の10mMリン酸ナトリウムpH6.8で一度洗浄した。溶離は0.2MのグリシンpH2 .2 30mlで行った。溶出液は１Mリン酸ナトリウムpH7.7で中和し限外濾過により 濃縮し、ＰＢＳで透析した。吸着したＰｆＭＳＰ１ｐ１９を精製するために洗浄 液および溶出液の全てに、0.1％の３−（ジメチル−ドデシルアンモニオ）−プ ロパンスルホネート［フルカ（Fluka）社］を補足的に加えた。 リスザルSaimiri sciureusにおけるP．vivaxの 組換え（ｐ４２およびｐ１９）ＭＳＰＩのワクチン接種試験 このワクチン接種試験は、雄で牌臓摘出されていない２から３才のSaimiri sc iureus boliviensisモンキーについて行った。３匹のサルに、免疫アフィニティ ーで精製した、それぞれ約５０から１００μｇの可溶性の組換えＰｖＭＳＰ１_{p4 2} および_p19（１９）の混合物を、３週間の間隔で３回筋肉注射して感染させた。 完全（ＦＣＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）を次のように使 用した：第１回目の注射：ＦＣＡ／ＦＩＡを１：１；第２回目の注射：ＦＣＡ／ ＦＩＡを１：４；第３回目の注射：ＦＩＡ。ついでこれらのアジュバント組成物 をＰＢＳ中で抗原と１：１で混合した。５匹の対照サルは、同様のプロトコール を用いてE．coliで産生されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ ）を抗原として投与した。抗原投与後の感染は、最終の注射後２．５週間適応さ せたPlasmodium vivax株（ベルム）に感染した２×１０⁶の赤血球細胞を注射す ることにより行った。なすりつけ標本をギムザ染色ご検査することにより全ての 動物における寄生虫血症を毎日測定することで保護度を評価した。 図５の曲線は、測定された寄生虫血症発症率の変動を、感染後の経過時間（日 数）の関数としての血液１マイクロリットル毎の寄生された赤血球の数（縦座標 は対数尺）として示している。曲線Ａは３匹のワクチン接種されたサルにおいて 観察された平均値に相当し；曲線Ｂは５匹の対照サルにおける平均値に相当する 。 図は、ワクチン接種により、寄生虫血症を大きく減少させる効果があることを 示している。 トクマカクMacaca sinicaにおけるPlasmodium cynomolgiの 組換え（ｐ４２およびｐ１９）ＭＳＰ１のワクチン接種試験 １５匹の捕獲したサルを次のように使用した：（１）３匹に１００μｇの可溶 性のＰｃＭＳＰ１_p42を注射した；（２）３匹に３５μｇ（第１回目の注射）ま たは５０μｇ（第２回目および第３回目の注射）のＰｃＭＳＰ１_p42を注射した ；（３）３匹にＰｃＭＳＰ１_p42および_p19の混合物を注射した；（４）３匹にア ジュバントとＰＢＳを注射した：（５）３匹には何も注射しなかった。上述の実 験手順では、完全および不完全フロイントアジュバントを使用した。注射は筋内 注射で４週間の間隔をおいた。抗原投与後の感染は、最終の注射後４週間適応さ せたPlasmodium cynomolgiに感染した２×１０⁵の赤血球細胞を注射することに よりなされた。ギムザ染色で寄生虫血症を検査することにより全ての動物におけ る 寄生虫血症を毎日測定することで保護度を評価した。４００のなすりつけ標本を 計数しても寄生された赤血球数細胞がなければ陰性に分類した。寄生虫血症は寄 生された赤血球数細胞のパーセンテージとして表した。 図６Ａ−６Ｇに得られた結果を示す。それら各々には感染後の時間（横座標に 日数）の関数として、抗原投与動物において観察された寄生虫血症発症率（縦座 標の対数尺に沿って寄生された赤血球細胞のパーセンテージとして表す）を示す 。 結果は次のものに関する： ・図６Ａ：ワクチン接種されていない対照動物； ・図６Ｂはフロイントアジュバントを含有する塩類溶液を投与した動物に関する ； ・図６Ｃは、動物にフロイントアジュバントを投与した結果の相対結果を強調す る目的で、図６Ａおよび６Ｂを重ね合わせたもの（変動は明らかに重要ではない ）； ・図６Ｄはｐ４２でのワクチン接種の終わりに得られた結果を示す； ・図６Ｅはｐ１９を単独でワクチン接種された動物に関する； ・最後に、図６Ｆはｐ１９とｐ４２の混合物をワクチン接種された動物に関する 。 ｐ４２は確かにあるレベルの保護度を誘発した。しかしながら、図６Ｅおよび ６Ｆに示されるように、本発明の組換えｐ１９により付与される保護度は一層良 好であった。 遊離のシステインの出現に伴うｐ４２の２つ目の切断により保護度が改善され 、試験された３つの種の組換えタンパク質において、この形態の大きな特徴であ るｐ１９多重結合体を生じるジスルフィド分子間架橋が形成されるという仮説を 述べることができる。 グラフ（６Ａ−６Ｆ）を作成するために使用された数を図６Ｇに示す。 P.cynomolgiトクマカクでのワクチン接種試験；対照体およびｐ１９ を単独でワクチン接種したサルの二回目の抗原投与後の感染（図８） 他のワクチンを接種しないで６ヶ月後、ＦＣＡ／ＦＩＡとともに、ｐ１９ＭＳ Ｐ−１を単独で投与した３匹のマカク（図６Ｅ）、フロイントアジュバントを含 む塩類溶液を投与した３匹のマカク（図６Ｂ）、および２匹の新たな感染をして おらず、ワクチン接種もされていないサルに、Plasmodium cynomolgiに感染させ た１×１０⁶の赤血球細胞を注射することにより新規の抗原投与感染をさせた。 ギムザ染色によるなすりつけ標本の検査により全ての動物における寄生虫血症を 毎日測定することで保護度を評価した。４００のなすりつけ標本を計数しても寄 生された赤血球数細胞がなければ陰性に分類した。寄生虫血症を寄生された赤血 球細胞のパーセンテージとして表した（グラフ８Ａ−Ｃを作成するために使用し た図は図８Ｄである）。６ヶ月前に抗原投与した６匹の免疫化された動物からは 、１日で０．００８％の寄生虫血症発症率を示した各グループ１検体を除き、検 出可能な寄生虫血症はみられなかった（図８Ａおよび８Ｂ）。影響を受けていな い２匹の対照体は２１日で最大０．８％の通常の寄生虫血症を示した(図８Ｃ)。 よって、最初の抗原投与による免疫後、寄生虫血症がないかまたは非常にわずか であるにもかかわらず、１回目の抗原投与後の感染で、完全に通常の感染を示す ３匹の対照体より、ＭＳＰ−１ｐ１９をワクチン接種された３匹の動物は、６ヶ 月間以上保護されていた。これらの結果は、ｐ１９の保護期間は少なくとも６ヶ 月であることを示唆している。 P.cynomolgiトクマカク系におけるミョウバンと混合した ｐ１９でのワクチン接種試験（図９） 先の正の保護結果は完全（ＦＣＡ）または不完全フロイントアジュバント（Ｆ ＩＡ）を使用することにより得られた。しかしながら、現在ヒトにおいて許容さ れている唯一のアジュバントはミョウバンである。このため、アジュバントとし てのミョウバンの存在下で、トクマカクにP.cynomolgiのＭＳＰ−１ｐ１９のワ クチン接種試験を行った。６匹の捕獲したマカクを次のように使用した：（１） ３匹の動物には２０ｍｇのミョウバンと５０ｍｇのP.cynomolgiの組換えＭＳＰ −１ｐ１９を４量注射した；（２）３匹の動物には１０ｍｇのミョウバンと生理 水を４回注射した。注射は筋内注射を４週間の間隔でおこなった。最後の注射の ４週間後、P.cynomolgiに感染した２×１０⁵の赤血球細胞を注射することにより 感染させた。ギムザ染色によるなすりつけ標本を検査することにより全ての動物 における寄生虫血症を毎日測定することで保護度を評価した。４００のなすりつ け標本を計数しても寄生された赤血球数細胞がなければ陰性に分類した。。寄生 虫血症発症率を寄生された赤血球数のパーセンテージとして表した。この実験の 結果は次の通りであった。抗原投与後の感染は、ミョウバンと組換えｐ１９とで 免疫化された３匹のマカクのうち２匹は、ミョウバンと生理水とで免疫化された ３匹の対照マカク（図９Ｄ）よりも、感染期間中、全寄生虫血症発症率が約３０ 倍少なかった（図９Ａおよび９Ｂ）。ｐ１９で免疫化された３匹目のマカク（図 ９Ｃ）は対照とあまり違わなかった。図９に記載されている、トクマカクMacaca sinicaにおけるPlasmodium cynomolgiのｐ１９を使用するワクチン接種試験に ついては、グラフ（９Ａ−９Ｄ）を作成するために使用したデータを（図９Ｅ） に与える。結果は、先の結果（図６、８）よりもあまり著しいものではないが、 かなりの保護度がミョウバンと組換えＭＳＰ−１について観察されるのはこれが 初めてである。 図１０：リスザルにおけるPlasmodium falciparumの組換えｐ１９ を用いたワクチン接種試験 捕獲状態で飼育された約３才のSaimiri sciureus guyanensis（リスザル）２ ０匹を次のように使用した：（１）４匹の動物に、次のようにフロイントアジュ バントの存在下で５０ｍｇの可溶性ＰｆＭＳＰ−１ｐ１９を注射した：第１回目 の注射：ＦＣＡ／ＦＩＡを１：１；第２回目の注射：ＦＣＡ／ＦＩＡを１：４； 第３回目の注射：ＦＩＡ。ついでこれらのアジュバント組成物をＰＢＳ中で抗原 と１：１で混合した；（２）２匹の対照動物には、ＰＢＳのみを（１）に記載さ れたようにしてフロイントアジュバントと接種した；（３）４匹の動物に１０ｍ ｇのミョウバン［Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ、セルバ社（Serva）］の存在下で５０ｍ ｇの可溶性ＰｆＭＳＰ−１ｐ１９を注射した；（４）２匹の対照動物にＰＢＳの みを１０ｍｇのミョウバンと注射した；（５）４匹の動物に、次のようにしてリ ポソーム中で再生された約５０−１００ｍｇのＧＰＩ固定化ＰｆＭＳＰ−１ｐ１ ９を注射した：３００ｍｍｏｌのコレステロールと３００ｍｍｏ１のホスファチ ジルコリンを真空乾燥させ、１．４ｍｇのＰｆＭＳＰ−１ｐ１９、ＧＰＩを有す るＰＢＳにおいて３３０ｍＭのＮ−オクチルグルコシドに再懸濁させた。この溶 液を吸着性のバイオビーズ・ＳＭ−２［バイオ・ラッド社（Bio-Rad）］を用い 、ＰＢＳに対して透析し、形成されたリポソームを遠心分離して濃縮し、ＰＢＳ に再懸濁させた。第１回目の注射は４℃に保たれた新鮮なリポソームで行ない、 第２回目および第３回目の注射は保存のために凍結されたリポソームで行った； （６）２匹の動物に、（５）に記載されたようにｐ１９，ＧＰＩ抗原の不在下で 、同様の方法で作製された対照リポソームを注射した；（７）２匹の動物に、生 理水を注射した。４週間の間隔で３回の筋内注射を行った。Plasmodium falcipa rumに感染した１×１０⁶の赤血球細胞を注射することにより抗原投与後感染させ た。ギームザ染色によるなすりつけ標本を検査することにより全ての動物におけ る寄生虫血症発症率を毎日測定することで保護度を評価した。寄生虫血症発症率 は寄生赤血球数のパーセンテージとして表した。このワクチン接種試験の結果を 図１０，Ａ−Ｇに示す。 抗原投与による感染後、リポソームまたはフロイントアジュバントとｐ１９で 免疫化されたグループは対照グループと同様の寄生虫血症を示した（フロイント アジュバントとｐ１９でワクチン接種した１匹の動物（２９番）はワクチン接種 と関連のない理由（心臓停止）で抗原投与後数日で死亡した）。これら２つのグ ループ（貧フロイントエマルション、凝結リポソーム）における抗原投与は不規 則で、これらの結果の有意性を完全に評価することはできなかった。ミョウバン グループでは、感染期間中、２匹の動物は対照の約４倍少ない全寄生虫血症発症 率を示し、１匹の動物は約３倍未満、および１匹の動物は対照と同様であった。 対照における変異性、おそらく抗原投与感染に使用された寄生虫株がカイエンヌ （Cayenne）でごく最近開発された牌臓未摘出Saimiriモデルに十分適合していな かったために、この実験を説明することは少し困難である。しかしながらミョウ バンとの実際の効果は、不十分ではあるか、現在のところ我々の抗原はミョウバ ンと組み合わせときに効果を示しす唯一のP．falciparumの組換えＭＳＰ−１で あると思われる。 リスザルにおけるPlasmodium falciparumの組換えｐ１９を用いた ワクチン接種試験（図１０と同じ試験） 捕獲状態で飼育されたサルに、次のようにして、４週間の間隔で２回、１ｍｌ の接種物を筋内注射した：（１）４匹の動物に、以下のようなフロイントアジュ バントの存在下で５０μｇの可溶性ＰｆＭＳＰ１ｐ１９を注射した：第１回目の 注射：ＦＣＡ／ＦＩＡを１：１；第２回目の注射：ＦＣＡ／ＦＩＡを１：４；つ いでＰＢＳ中で抗原と１：１で混合した；（２）４匹の動物に、１０ｍｇのミョ ウバンの存在下で５０μｇの可溶性ＰｆＭＳＰ１ｐ１９を注射した；（３）４匹 の動物に、１：１モルのコレステロールとホスファチジルコリンからなるリポソ ーム中で再構成された約５０μｇのＧＰＩ固定化ＰｆＭＳＰ１ｐ１９を注射した 。動物は第２回目の注射後１７日間飼育した。 P．falciparumによる寄生虫血症発症率３０％のリスザルからの赤血球（多く は成熟した形態）をＰＢＳで洗浄し、残査を２％ＳＤＳおよび２％ジチオスレイ トールの存在下で８倍に希釈し、９５℃で加熱後、７．５％（分離ゲル）および ４％（濃縮ゲル）のポリアクリルアミドゲル上に添加した。ニトロセルロース膜 に移した後、免疫ブロット分析を次のようにして抗血清で行った：（１）フロイ ントアジュバントと可溶性のＰｆＭＳＰ１ｐ１９をワクチン接種した、４匹のサ ルの抗血清プールを２０倍希釈；（２）ミョウバンアジュバントと可溶性のＰｆ ＭＳＰ１ｐ１９をワクチン接種した、４匹のサルの抗血清プールの２０倍希釈； （３）リポソームと固定化ＰｆＭＳＰ１ｐ１９をワクチン接種した、４匹のサル の抗血清プールの２０倍希釈；（４）５０ｍｇ／５０ｍｌの、ＰｆＭＳＰ１ｐ１ ９の直線状エピトープと反応するモノクローナル抗体；（５）P．falciparumを 繰り返し感染させた約２０匹のサル由来のＳＨＩ９０抗血清プール。これはP．f alciparumでの続く感染により影響を受けなくなった。５００の希釈、（６）影 響を受けていない（P．falciparumにさらされたことがない）抗血清プール、２ ０希釈。 結果は、ＰｆＭＳＰ１ｐ１９をワクチン接種されたサルの３つの抗血清プール がより成熟した形態のものを含む寄生抽出物中に存在する、非常に高分子量の複 合体（堆積ゲルに拡散）と強く特異的に反応したことを示した。これらの結果は 、ＰｆＭＳＰ１ｐ１９の特定の凝集体が、特にオリゴマーの形態で、バキュロウ イルス系中で合成される組換えＰｆＭＳＰ１ｐ１９分子に再生産されるエピトー プを含んで生体内で存在するという仮説を支持している。 図７もまたこれらの結果を示している。図７は、ゲル上にできた免疫ブロット を示している。初めの３レーンは、ｐ１９を［（１）フロイントアジュバントと の、（２）ミョウバンとの、（３）リポソームの形態での］注射したサルの生体 内での応答、特に、成熟段階（ｐ４２がｐ１９とｐ３３に切断される時）に特有 の、オリゴマーの形態で生体内のｐ１９が凝集するという仮説を支持する高分子 複合体の存在を示している。 またこのワクチン接種試験は先の注射と同一の３回目の注射を含む。フロイン トアジュバントでの注射はＦＩＡのみを含む。 各々のグループには２匹の対照動物：すなわち、ＰＢＳとフロイントアジュバ ントとを注射した２匹の対照動物；ＰＢＳとミョウバンとを注射した２匹の対照 動物；タンパク質を含有しないリポソームを注射した２匹の対照動物；およびア ジュバントを含有しないＰＢＳを注射した２匹の対照動物；がいる。保護度は上 述したようにして評価した。 図７Ｂ：この図のデータは、リスザルP．falciparum／ワクチン接種試験（図 １０下）から得られた。番号は図１０に記載されている個々のサルに対応する。 この図の技術と方法は、各々のサルの抗血清が、試験注射の日に３回注射した後 に試験されたこと、およびＳＨＩ抗血清が１：２５０まで希釈されたことを除け ば、図７と同様である。ｐ１９とミョウバンをワクチン接種した４匹のサルの抗 血清はかなりの高分子量複合体と強く特異的に反応するが、ｐ１９およびフロイ ントアジュバントまたはリポソームをワクチン接種した他のグループのサルは、 これらの複合体と少ししか反応性を示さなかった。また、ｐ１９とミョウバンを ワクチン接種されたサルが最も保護されていたため、この高分子量複合体との反 応性は、グループの１匹のサルは対照体に対して保護されておらず、他のものが 部分的にのみ保護されているにもかかわらず、保護効果を示すものであると思わ れた。 本発明は、限定する性格のものではないが、もちろん、他の応用、例えばある 実施例に関連して以下に記載されるものにも関している。 治療 組換え分子ＰｖＭＳＰ１ｐ１９は、死の危険性があるP．falciparumによる深 刻なマラリア感染を治療するための受動的な転移に使用可能な特異的抗体を産生 するのに使用することができる。 診断 バキュロウイルス由来の組換え分子ＰｖＭＳＰ１ｐ４２、ＰｖＭＳＰ１ｐ１９ およびＰｆＭＳＰｐ１９は、特異的なネズミ科のモノクローナル抗体を産生させ るために使用することができ、使用された。これらの抗体は、他の種、例えばウ サギまたはヤギ由来のポリクローナル抗ＭＳＰ１ｐ１９抗血清と組合せて、一般 的に致命的とはならないP．vivaxによるマラリアと、致命的となりうるP．falci parumによるマラリアとを識別することができるマラリアの半定量診断試験の基 礎を形成しうる。この試験の原則は、血中のｐ１９タンパク質を含む全てのＭＳ Ｐ−１分子を捕捉し、定量することである。 この点において、ＭＳＰ１ｐ１９分子の利点は、次の通りである： （ｉ）同じ種および十分に分かれた異種間の双方において極めて良好に保存され 、特異的種反応体を産生することができる。ＰｆＭＳＰ１ｐ１９とＰｖＭＳＰ１ ｐ１９由来の抗体間で交差反応が見られない； （ｉｉ）正確には知られてはいないが、寄生虫による致死効果なしに、この分子 が大きく変化しないし欠失がないというＭＳＰ１ｐ１９の機能は、十分に重要で あると思われる； （ｉｉｉ）全てのメロゾイトに見られる主な抗原であり、よって、寄生虫血症発 症率が低い場合でさえ、寄生虫血症発症率に比例して原理的に検出可能でなくて はならない； （ｉｖ）バキュロウイルス由来の組換えＭＳＰ１ｐ１９分子は、末変性構造のＭ ＳＰ１ｐ１９の多くを再生するようであるので、これらのタンパク質に対して産 生される抗体は診断用途によく適している。 以下に同定されている微生物は、次の登録番号で、１９９６年２月１日にブタ ペスト条約の規則６．１に従って寄託された： 同定参照符号 登録番号 ＰｖＭＳＰ１ｐ１９Ａ １−１６５９ ＰｖＭＳＰ１ｐ１９Ｓ １−１６６０ ＰｆＭＳＰ１ｐ１９Ａ １−１６６１ ＰｆＭＳＰ１ｐ１９Ｓ １−１６６２ ＰｃＭＳＰ１ｐ１９Ｓ １−１６６３ また本発明は、好ましくは混合物中に当初から含有されるｐ１９型ペプチドを 精製するための、（例えばアフィニティークロマトグラフィー用の）固体状の支 持体に固定されたこれらの抗体の用途に関する。 精製とは、この混合物を抗体と接触させ、抗原−抗体複合体を解離させ、精製 されたｐ１９型ペプチドを回収することを意味する。 さらに本発明は、タンパク質または断片の混合物、特に次のタイプ： ・P．falciparumのｐ１９とP．vivaxのｐ１９； ・P．falciparumのｐ１９とP．falciparumのｐ４２で、後者は必要ならばそのほ とんどの高頻度可変領域が除去されている； ・P．vivaxのｐ１９とP．vivaxのｐ４２で、後者は必要ならばそのほとんどの高 頻度可変領域が除去されている； ・P．falciparumのｐ１９とP．falciparumのｐ４２で、後者は必要ならばそのほ とんどの高頻度可変領域が除去されていもの、およびP．vivaxのｐ４２とP．viv axのｐ１９で、後者は必要ならばそのほとんどの高頻度可変領域が除去されてい るもの； の混合物をさらに含有するワクチン用組成物に関する。 本願の場合、ほとんどの高頻度可変領域は、領域Ｉまたは領域ＩＩおよび領域 ＩＩＩの全てまたは一部として定義されており、好ましくは欠失している領域Ｉ ＩＩの一部は、領域ＩＩに並列しているもの（保存部位は、ｐ１９近傍で、ｐ３ ３のＣ末端側に位置している）。領域ＩＩおよび領域ＩＩＩは図４に示されてい る。 本発明はヒトのワクチンの製造に限定されるものではない。本発明は哺乳動物 に感染性である寄生虫由来の抗原または対応タンパク質を用いる家畜用ワクチン 組成物の製造および同様の条件下での製品にも適用することができる。さらに、 同様のタイプの感染であるバベシア病がウシ、イヌ、およびウマにも現れること が知られている。バベシア種の抗原の一つは、ＭＳＰ−１のタンパク質の一部と 高い高次構造的相同性（特に、２つのＥＦＧ様体とシステインに富んだドメイン において）と機能的相同性を有する［（３６）、（３７）および（３８）］。 このような寄生虫に対して可溶性の抗原を使用する家畜用ワクチンの例は開示 されている（３９）。 これらの混合物に使用されるｐ１９が、単離で検討される場合に、上述したよ うに修飾されうることは言うまでもない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/569 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/02 // Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ロス，チャールズ フランス国 Ｆ―92500 リュイユ・マル メゾン，リュ・ジュヌビエーブ・クチュリ エ，18，Ｃ／Ｏ アニエ リモン (72)発明者 ナト，ファリダバノ フランス国 Ｆ―92160 アントニー，リ ュ・ミラボー，65 (72)発明者 バーンウェル，ジョン，ダブリュ アメリカ合衆国 ニューヨーク 10012, ニューヨーク，ワシントン スクウェア ビレッジ ３，アパートメント 10Ｄ (72)発明者 メンディス，カミニ スリランカ国 コロンボ ８，ピー・オ ー・ボックス 271，キンゼイ ロード

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 必須構成ポリペプチド配列が： ・哺咄乳動物、特にヒトに対して感染性であるPlamodium vivax以外のマラリア 原虫型寄生虫のメロゾイト形態の表面タンパク質１（ＭＳＰ−１タンパク質）の １９キロダルトン（ｐ１９）Ｃ末端断片で、感染サイクルにおけるヒトの赤血球 中への侵入段階の終わりに寄生虫表面に通常固定されて残存するＣ末端断片の配 列、 ・または、対応寄生虫による寄生虫血症を生体内で阻害しうる免疫応答をさらに 誘導しうる断片の一部の配列、 ・または前記ｐ１９断片もしくは前記断片の前記一部によって産生されたものと 等価な細胞および／または体液型の免疫学的応答を誘導しうるペプチドの配列、 である組換えタンパク質であって、 還元培地中で不安定で、対応するマラリア原虫に対して形成されたヒト抗血清に より認識されるエピトープの大半を構成するエピトープの高次構造をさらに含み うる組換えタンパク質。 ２． 非不可逆的還元状態または非還元状態である場合に対応マラリア原虫また は相同マラリア原虫に対して形成されるヒト抗血清により認識されるが、不可逆 的還元状態である場合は、これら同一の抗血清により認識されないか、またはわ ずかな程度しか認識されないことを特徴とする請求項１に記載の組換えタンパク 質。 ３． 同一の条件下で産生された対応ｐ４２またｐ４２自身による免疫性がヒト の抗血清の反応性を阻害し、ｐ４２がｐ１９に対する前記ヒトの抗血清の反応性 を部分的にのみ阻害しうることを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク 質。 ４． ｐ４２の自然切断の前に、通常対応ｐ４２においてｐ１９と結合している 側のｐ３３のＣ末端ポリペプチド配列の通常上流のポリペプチド配列（３３ｋＤ ａのＮ末端断片）が本質的に除去され、それが存在する場合、前記ｐ３３のＣ末 端ポリペプチド配列を５０未満のアミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請 求項１ないし３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。 ５． 自然切断の前に、対応ｐ４２においてｐ１９と通常結合しているｐ３３の Ｃ末端ポリペプチド配列の上流のポリペプチド配列（３３ｋＤａのＮ末端断片） が本質的に除去され、それが存在する場合、前記ｐ３３のＣ末端ポリペプチド配 列が１０未満のアミノ酸残基を含んでいることを特徴とする請求項１ないし３の いずれか１項に記載の組換えタンパク質。 ６． 自然切断の前に、対応ｐ４２においてｐ１９と通常結合しているｐ３３の Ｃ末端ポリペプチド配列の上流のポリペプチド配列（３３ｋＤａのＮ末端断片） が本質的に除去され、それが存在する場合、前記最後のｐ３３のＣ末端ポリペプ チド配列が、ヒトに対して感染性であるP．falciparumまたはP．vivaxのような マラリア原虫に実質的な保存率を保持するものに限定されていることを特徴とす る請求項１ないし３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。 ７． ｐ１９断片の一部が、該ｐ１９に通常含有される２つのＥＧＦ領域の少な くとも１つを含むことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の組 換えタンパク質。 ８． 前記ｐ１９断片またはｐ１９断片の前記一部の分子量が１０から２５ｋＤ ａ、特に１０から１５ｋＤａの範囲内にあることを特徴とする請求項１ないし７ のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。 ９． 宿主細胞、特に前記組換えタンパク質が発現され、バキュロウイルスによ り感染可能な昆虫細胞のような真核細胞にｐ１９断片を固定する型のグリコシ ルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）基をさらに含有することを特徴とする 請求項１ないし８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。 １０． 組換えタンパク質が発現する宿主、特にバキュロウイルスにより感染可 能な昆虫細胞のような真核細胞の細胞膜への該組換えタンパク質の固定のための 導入に介在する、極度に疎水性のＣ末端部位が除去されたことを特徴とする請求 項１ないし８のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。 １１． 水溶性であることを特徴とする請求項１０に記載の組換えタンパク質。 １２． Plasmodium falciparumのＭＳＰ−１タンパク質のｐ１９配列または対 応断片の前記一部を含むことを特徴とする請求項１ないし１１のいずれか１項に 記載の組換えタンパク質。 １３． Plasmodium cynomolgiのＭＳＰ−１タンパク質のｐ１９配列または対応 断片の前記一部を含むことを特徴とする請求項１ないし１２のいずれか１項に記 載の組換えタンパク質。 １４． 請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質のオリゴ マー。 １５． 請求項１ないし１３のいずれか１項に記載された組換えタンパク質の前 記ポリペプチド配列の２〜５０のモノマー単位を含むことを特徴とする請求項１ ４に記載のオリゴマー。 １６． ワクチン生産に使用するためのキャリア分子と抱合させられていること を特徴とする請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。 １７． 必須構成ポリペプチド配列が： ・ヒトに対して感染性であるマラリア原虫型寄生虫のメロゾイト形態の表面タン パク質１（ＭＳＰ−１タンパク質）の１９キロダルトン（ｐ１９）Ｃ末端断片で あって、感染サイクルにおけるヒトの赤血球中への侵入段階の終わりに、通常寄 生虫表面に固定されて残存するＣ末端断片の配列、 ・または、対応寄生虫による寄生虫血症を生体内で阻害可能な免疫応答をさらに 誘導しうる断片の一部の配列、 ・または前記ｐ１９断片もしくはその断片の前記一部によって産生されたものと 等価な細胞および／または体液型の免疫学的応答を誘導しうるペプチドの配列、 である組換えタンパク質であって、還元培地中で不安定で対応マラリア原虫に対 して形成されるヒトの抗血清により認識されるエピトープの大半を構成する、エ ピトープの高次構造をさらに含む組換えタンパク質を活性成分として含有する、 ヒトに対して感染性であるマラリア原虫型寄生虫に対するワクチン組成物。 １８． 活性成分が請求項２ないし１３または１６のいずれか１項に記載の組換 えタンパク質、もしくは請求項１４または請求項１５に記載のオリゴマーからな ることを特徴とする請求項１７に記載のワクチン組成物。 １９． 活性成分として、請求項１７または請求項１８に記載の組換えタンパク 質のオリゴマーを含む、ヒトに対して感染性であるマラリア原虫型寄生虫に対す るワクチン組成物。 ２０． Plamodium vivax以外のヒトに対して感染性であるマラリア原虫型寄生 虫のメロゾイト形態のＭＳＰ−１タンパク質のｐ１９を特異的に認識し、Plasmo dium vivaxを認識しない抗体。 ２１． モノクローナルであることを特徴とする請求項２０に記載の抗体。 ２２． モノクローナルであり、P．falciparumのｐ１９を特異的に認識するこ とを特徴とする請求項２０に記載の抗体。 ２３． P．vivaxのｐ１９を特異的に認識することを特徴とする請求項２０に記 載のモノクローナル抗体。 ２４． 生物学的サンプルを請求項２３の抗体と請求項２１または請求項２２の 抗体と接触させてマラリア原虫に感染させ、場合に応じて免疫学的反応の生起ま たは非生起を検出することを特徴とするP．vivaxによる寄生虫感染と他のマラリ ア原虫による寄生虫感染とを識別する差次的診断方法。 ２５． ベクターに含有され、該ベクターが移入可能な細胞により認識できるプ ロモータのコントロール下において、バキュロウイルス系の発現と融和性がある シグナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む組換えバキュロウ イルス型修飾ベクターであって、 さらに該プロモータのコントロール下で第１のものの下流にあり、 ・ヒトに対して感染性であるマラリア原虫型寄生虫のメロゾイト形態の表層タン パク質１（ＭＳＰ−１タンパク質）の１９キロダルトン（ｐ１９）Ｃ末端断片で あって、感染サイクルにおけるヒトの赤血球中への侵入段階の終わりに、通常寄 生虫表面に固定されて残存するＣ末端断片、 ・または、バキュロウイルス系における第２配列由来の発現物質が対応寄生虫に よる寄生虫血症を生体内で阻害可能な免疫応答をさらに誘導できる場合には該ペ プチド断片の一部； ・前記ｐ１９ペプチド断片または前記断片の一部により産生されるものと等価な 細胞および／または体液型免疫学的応答を誘導しうるペプチド； のペプチド配列をコードする配列を特徴とし、 該ヌクレオチド配列が、それが構成されているヌクレオチド全体に対し、４０ ％から６０％の範囲、好ましくは少なくとも５０％のＧおよびＣ量を含有してい ることを特徴とする修飾ベクター。 ２６． 前記第２のペプチド配列が請求項２ないし１３のいずれか１項に記載さ れているものに従うことを特徴とする請求項２５に記載の修飾ベクター。 ２７． 第２のヌクレオチド配列が合成配列であることを特徴とする請求項２５ に記載の修飾ベクター。 ２８． 第１のヌクレオチド配列がPlasmodium vivax由来のシグナルペプチドを コードし、通常マラリア原虫のＭＳＰ−１タンパク質と結合したことを特徴とす る修飾ベクター。 ２９． 第２のヌクレオチド配列において、それが発現される宿主、特にバキュ ロウイルスにより感染可能な昆虫細胞の細胞膜への組換えタンパク質の固定のた めの導入に関与する疎水性のＣ末端配列が３’末端で除去されていることを特徴 とする請求項２５ないし２８のいずれか１項に記載の修飾ベクター。 ３０． 修飾されたバキュロウイルスからなることを特徴とする請求項２５ない し２９のいずれか１項に記載の修飾ベクター。 ３１． 請求項２５ないし２９のいずれか１項に記載の修飾ベクターにより移入 されるか移入可能なＳｆ９型昆虫細胞のような微生物。 ３２． 少なくとも一部がポリペプチド配列： ・Plasmodium falciparumのメロゾイト形態の表面タンパク質１（ＭＳＰ−１タ ンパク質）の１９キロダルトン（ｐ１９）Ｃ末端断片で、感染サイクルにおける ヒトの赤血球中への侵入段階の終わりに、通常寄生虫表面に固定されて残存する Ｃ末端断片、 ・バキュロウイルス系におけるＤＮＡの発現物質が、対応寄生虫による寄生虫血 症を生体内で阻害可能な免疫応答をさらに誘導しうる場合には該ペプチド断片の 一部； ・または該ｐ１９ペプチド断片もしくは該断片の前記一部によって産生されるも のと等価な細胞および／または体液型の免疫学的応答を誘導しうるペプチド： をコードする第１のヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡであって、 前記ヌクレオチド配列が、該合成ＤＮＡが構成されているヌクレオチドの全体 の４０％〜６０％の範囲、好ましくは少なくとも５０％のＧおよびＣヌクレオチ ド量を含んでいることを特徴とする合成ＤＮＡ。 ３３． 第１のヌクレオチド配列において、それが発現する宿主、特にバキュロ ウイルスにより感染可能な昆虫細胞の細胞膜へのｐ１９タンパク質の固定のため の導入に関与する疎水性Ｃ末端配列をコードする配列の３’末端で除去されてい ることを特徴とする請求項３２に記載の合成ＤＮＡ配列。 ３４． 主配列に対して相同または異種のPlasmodiumのＭＳＰ−１と通常結合す るシグナルペプチドをコードするシグナルヌクレオチド配列が、第１のヌクレオ チド配列の前に存在していることを特徴とする請求項３２または３３に記載の合 成ＤＮＡ配列。 ３５． シグナル配列がP．vivax由来であることを特徴とする請求項３４に記載 のＤＮＡ配列。 ３６． 前記第１のヌクレオチド配列が細胞膜の結合領域のポリペプチドをコー ドする３’末端配列を含み、該固定領域が前記合成ＤＮＡを含むベクターで形質 転換された宿主細胞の膜表面に発現組換えタンパク質を固定し、該３’配列が主 ヌクレオチド配列に対して相同であり、または特にP．vivax由来のものと異種で あることを特徴とする請求項３２ないし３５のいずれか１項に記載の合成ＤＮＡ 。 ３７． ３’末端配列がP．vivaxから由来したものであることを特徴とする請求 項３６に記載の合成ＤＮＡ。 ３８． 前記３’末端配列が除去されていることを特徴とする請求項３２ないし ３６のいずれか１項に記載の合成ＤＮＡ配列。 ３９ ・ＣＮＣＭ［国立微生物培養菌株保存機関:Collection Nationale de Cul tures de Microorganismes］に登録番号１−１６５９で寄託されたウイルス； ・ＣＮＣＭに登録番号１−１６６０で寄託されたウイルス； ・ＣＮＣＭに登録番号１−１６６１で寄託されたウイルス； ・ＣＮＣＭに登録番号１−１６６２で寄託されたウイルス； ・ＣＮＣＭに登録番号１−１６６３で寄託されたウイルス； から選択されることを特徴とする請求項２５に記載のバキュロウイルス型ベクタ ー。 ４０． 請求項２１ないし２３のいずれか１項に記載の抗体と特異性を有するモ ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ。 ４１． ペプチド混合物から所定の特異性を持つｐ１９ペプチドを分離する方法 において、好ましくは不溶性の支持体に既に固定された請求項２０ないし２３の いずれか１項に記載の対応抗体にペプチド混合物を接触させ、ついで形成された 抗原−抗体複合体を分離し、精製されたｐ１９を回収することを特徴とする方法 。 ４２． マラリア原虫への感染に対する免疫応答を誘導可能な免疫原組成物を調 製するための、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載のタンパク質または請 求項１５または１６に記載のオリゴマーの使用。 ４３． 請求項１ないし１３のいずれか１項に記載のタンパク質と、必要ならば 最も少ない保存部位が欠失させられた対応ｐ４２か、上記タンパク質が由来する 寄生虫と相同の寄生虫から由来する他の組換えｐ１９またはｐ４２型タンパク 質の何れかとの混合物を活性成分として含むワクチン組成物。 ４４． 活性成分の混合物が次の混合物： ・P．falciparumのｐ１９とP．vivaxのｐ１９； ・P．falciparumのｐ１９とP．falciparumのｐ４２； ・必要に応じてそのほとんどの高頻度可変領域が除去されたP．vivaxのｐ１９と P．vivaxのｐ４２； ・必要に応じてそのほとんどの高頻度可変領域が除去されたP．falciparumpの１ ９とP．falciparumのｐ４２、および必要に応じてそのほとんどの高頻度可変領 域が除去されたP．vivaxのｐ１９とP．vivaxのｐ４２； から選択されることを特徴とする請求項２３に記載のワクチン組成物。 ４５． １９９７年２月１４日に登録番号１−１８４６でＣＮＣＭ（フランス， パリ）に寄託されたものであることを特徴とする請求項４０に記載のハイブリド ーマ。