JP2000516201A

JP2000516201A - 血管形成阻害方法及び血管形成阻害に有用な組成物

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Publication number: JP2000516201A
Application number: JP09542941A
Authority: JP
Inventors: ピーターブルックス; ディヴィッドエイチェレッシュ
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2000-12-05
Also published as: AU3289397A; CN1226172A; US6500924B1; PT951295E; RU2194528C2; AU738782B2; AU733303C; SK163598A3; SK163298A3; RU2195312C2; AU3218397A; AU733303B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ビトロネクチンα_vβ₃アンタゴニストを使用した組織の血管形成の阻害方法、特にα_vβ₃アンタゴニストを含む治療用組成物を使用した炎症組織並びに腫瘍組織及び転移の血管形成の阻害方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】血管形成阻害方法及び血管形成阻害に有用な組成物発明の属する技術分野本発明は、一般的には医薬分野に関するものであり、特にビトロネクチン受容体α_vβ₃のアンタゴニストを使用した、組織の血管形成を阻害するための方法及び組成物に関する。従来技術インテグリンは、細胞外マトリックスタンパク質に結合し、一般的には細胞接着現象と呼ばれる細胞−細胞相互作用及び細胞−細胞外マトリックス相互作用を媒介するすることが知られている細胞受容体のクラスである。しかしながら、多数のインテグリン及びインテグリンに結合するリガンドが文献に記載されているにもかかわらず、多数のインテグリンの生物学的機能は十分に理解されていない。インテグリン受容体は、α及びβサブユニットから形成される非共有結合性ヘテロ二量体糖タンパク質複合体の共通した構造的特徴を有するタンパク質のファミリーを構成する。ビトロネクチンに対して優先的に結合するというオリジナルな特住にちなんで命名されたビトロネクチン受容体は、α_vβ₁、α_vβ₃及びα_vβ₅と命名された３つの異なるインテグリンに向けられていることが知られている(Horton,Int.J.Ex p Pathol.,71:741-759(1990))。α_vβ₁は、フィブロネクチン及びビトロネクチンに結合する。α_vβ₃は、フィブリン、フィブリノゲン、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、フォンビルブラント因子、オステオスポンチン(ost eospontin)及び骨シアロタンパク質Ｉを含む種々のリガンドに結合する。α_vβ₅ はビトロネクチンに結合する。これら３種のインテグリンが組織における多数の細胞相互作用おいて果たしている特定の細胞接着の役割は、研究中である。しかし、異なるインテグリンは異なる生物学的作用を有していることは明らかである。多数のインテグリンについてのリガンドにおける１つの重要な認識部位は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）トリペプチド配列である。ＲＧＤは、前記ビトロネクチン受容体インテグリンについて同定されたリガンドの全てにおいて見出されている。このＲＧＤ認識部位は、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド（「ペプチド」）により模倣され、そのようなＲＧＤペプチドはインテグリン機能の阻害剤として知られている。しかしながら、ＲＧＤペプチドの配列及び構造に依存して、阻害の特異性を変化させ、特定のインテグリンを標的とすることができることに注意することは重要である。ＲＧＤ認識部位について検討するためには、Pierschbacher et al.，Nature， 309:30-33(1984)、Pierschbacher et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:59 85-5988(1984)を参照のこと。異なるインテグリン特異性を有する種々のＲＧＤポリペプチドについては、Grant et al.，Cell，58:933-943(1989)，Cheresh et al.，Cell，58:945-953(1989)，Aumailley et al.，FEBS Letts.，291:50-54(1 991)及びPfaff et al.，J．Biol．Chem.,269:20233-20238(1994)並びに米国特許第４，５１７，６８６号、４，５７８，０７９号、４，５８９，８８１号、４，６１４，５１７号、４，６６１，１１１号、４，７９２，５２５号、４，６８３，２９１号、４，８７９，２３７号、４，９８８，６２１号、５，０４１，３８０号及び５，０６１，６９３号明細書に記載されている。血管形成は、組織への新たに発生した血管の成長を含む、組織の血管新生の過程であり、新血管形成(neo-vascularization)とも呼ばれている。この過程は、内皮細胞及び平滑筋細胞の浸潤により媒介される。この過程は、以下に示す３つの方法うちの１つにより進行すると考えられている：血管は既存の血管から発生することができる；血管の新規発生は前駆体細胞から起こることができる(血管形成(vasculogenesis))；又は既存の小血管が直径を広げることができる。Blood et al.，Bioch．Biophys．Acta，1032:89-118(1990)を参照のこと。血管内皮細胞は、ビトロネクチン受容体(α_vβ₃又はα_vβ₅)、コラーゲンＩ型及びＩＶ型受容体(α₁β₁)、ラミニン受容体(α₂β₁)、フィブロネクチン／ラミニン／コラーゲン受容体（α₃β₁)及びフィブロネクチン受容体（α₅β₁）を含む、少なくとも５つのＲＧＤ−依存インテグリンを含んでいることが知られている。 Davis et al.，J．Cell．Biochem.，51:206-218(1993)を参照のこと。平滑筋細胞は、α₅β₁、α_vβ₃及びα_vβ₅を含む少なくとも６つのＲＧＤ依存インテグリンを含んでいることが知られている。血管形成は、新生児の成長においては重要な過程であるが、創傷治癒並びに組織炎症、関節炎、腫瘍成長、糖尿病性網膜症、網膜の新血管形成による黄斑変性症及び類似の状態を含む種々の臨床的疾患の病因においても重要である。血管形成と関連するこれらの臨床的症状は、血管形成性疾患と呼ばれている。Folkman et al.，Science，235:442-447(1987)を参照のこと。血管形成は創傷治癒及び黄体成長サイクルにおいては起こるけれども、通常、成人又は成熟した組織では起こらない。例えば、Moses et al.，Science，248:1408-1410(1990)を参照のこと。血管形成の阻害は、腫瘍の成長を制限するための有用な治療法であることが提唱されてきている。血管形成の阻害は、（１）「血管形成分子」、例えばｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）の放出の阻害、（２）例えば抗βｂＦＧＦ抗体の使用による血管形成分子の中和及び（３）血管形成刺激に応答する内皮細胞の阻害により行うことが提唱されている。後者の戦略は注目されており、Folkman et al.，Cancer Biology，3:89-96(1992)には、コラケナーゼ阻害剤、基底膜ターンオーバー阻害剤、(angiostatic steroids)、真菌由来血管形成阻害剤、血小板第４因子、トロンボスポンジン、関節炎薬、例えばＤ−ペニシラミン及び(goldt hiomalate)、ビタミンＤ₃誘導体、α−インターフェロン並びに血管形成を阻害するために使用される物質を含む、数種の内皮細胞応答阻害剤が記載されている。更に提案されている血管形成阻害剤については、Blood et al.,Bioch.Biophys .Acta.，1032:89-118(1990)，Moses et al.，Science，248:1408-1410(1990)，I ngber et al.，Lab．Invest.，59:44-51(1988)及び米国特許第５，０９２，８８５号、５，１１２，９４６号、５，１９２，７４４号及び５，２０２，３５２号明細書を参照のこと。前記の文献に記載される血管形成阻害剤のなかでα_vβ₃の阻害を標的としたものはない。ビトロネクチン受容体α_vβ₃を阻害するＲＧＤ含有ペプチドも文献に記載されている。Aumailley et al.,FEBS Letts.,291:50-54(1991)、Choi et al.,J.Vasc ．Surg.，19:125-134(1994)、Smith et al.，J．Biol．Chem.，265:12267- 12271(1990)及びPfaff et al.，J．Biol．Chem.，269:20233-20238(1994)を参照のこと。例えば、Hammes et al.，Nature Med.，2:529-53(1996)では、本発明の知見が確認されている。詳細には、この論文は、環状ＲＧＤｆＶを含む環状ペプチド（後者の構造及び機能は本出願が優先権主張の基礎としている出願に記載されている）は、低酸素誘導網膜新血管形成マウスモデルの網膜新血管形成を阻害したことを示している。本発明及び本出願の優先権主張の基礎となる出願をも支持する別の研究において、Luna et al.，Lab．Invest.，75:563-573(1996)では、酸素誘導虚血性網膜症マウスモデルの網膜新血管形成を部分的に有効に阻害した２つの特定の環状メチル化ＲＧＤ含有ペプチドが記載されている。対照的に、本発明のペプチドは、本明細書に記載したモデル系において新血管形成をほぼ完全に阻害した。種々のインテグリンα又はβサブユニットに免疫特異的なモノクローナル抗体を使用した、インビトロでの細胞接着の阻害は、微小血管内皮細胞を含む種々の細胞型の細胞接着においてα_vβ₃を関係付けた。Davis et al.,J.Cell.Biol.，5 1:206-218(1993)を参照のこと。更に、Nicosia et al.，Am．J．Pathol.，138:8 29-833(1991)には、コラーゲンゲル中で培養したラット大動脈からの「微小血管」形成をインビトロで阻害するためのＲＧＤペプチドＧＲＧＤＳの使用が記載されている。しかしながら、コラーゲンゲル培養におけるインビトロでの「微小血管」形成阻害は、組織における血管形成阻害のモデルとはならない。なぜなら、微小血管構造は毛細血管の芽（capillary sprout）と同一であること、又はコラーゲンゲル培養における微小血管形成は無傷の組織、例えば関節炎組織、腫瘍組織又は血管形成の阻害が望まれる疾患組織への新生血管の成長と同一であるということが示されていないからである。血管形成が起こるためには、内皮細胞は、始めに、浸潤及び転移形成の間に腫瘍細胞が使用するものと類似の方法で、血管基底膜を破壊し、横断(cross)する。本発明者等は、血管形成は、血管インテグリンと細胞外マトリックスタンパク質との間の相互作用に依存していることを以前報告している。Brooks et al.， Science，264:569-571(1994)参照。更に、血管形成性血管細胞のプログラム細胞死（アポトーシス）は、血管インテグリンα_vβ₃の特定のアンタゴニストにより阻害される相互作用により開始することを報告した。Brooks et al.，Cell，79: 1157-1164(1994)を参照のこと。最近、本発明者等は、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）のビトロネクチン受容体（α_vβ₅）への結合は、アンタゴニストに使用により阻害することができ、これによりプロテイナーゼの酵素機能を阻害することができることを報告した。Brooks et al.，Cell，85:683- 693(1996)を参照のこと。出願人等は、本明細書で報告した研究以外に、細胞接着の阻害剤を使用して組織における血管形成を阻害することができたことの実証を全く認識していない。特に、α_vβ₃機能が組織における血管形成に必要であること又はα_vβ₃アンタゴニストは組織の血管形成を阻害することができることは、第三者によっては全く実証されていない。発明の簡単な説明本発明の開示は、組織における血管形成はインテグリンα_vβ₃を必要とし、α_v β₃阻害剤は血管形成を阻害することができることを実証している。更に、その他のインテグリン、例えばα_IIbβ₃又はα_vβ₁のアンタゴニストは、血管形成を阻害せず、これはおそらくはこれらその他のインテグリンは血管形成の発生に必須ではないためであるということも実証している。それゆえ、本発明は、組織における血管形成を阻害する方法であって、血管形成阻害量のα_vβ₃アンタゴニストを含む組成物を組織に投与することを特徴とする方法に関する。治療する組織は、血管形成の阻害が望まれるあらゆる組織、例えば新血管形成が起こっている患部組織であることができる。例示的な組織には、炎症組織、固形腫瘍、転移、再狭窄を受けた組織等が含まれる。本発明の方法に使用するα_vβ₃アンタゴニストは、α_vβ₃に結合し、α_vβ₃の天然のリガンドに結合する能力を競合的に阻害することができる。好ましくは、アンタゴニストは、その他のインテグリンよりもα_vβ₃に特異性を示す。特に好ましい態様においては、α_vβ₃アンタゴニストは、フィブリノゲン又はその他のＲＧＤ含有リガンドのα_vβ₃への結合は阻害するが、フィブリノゲンのα_IIb β₃への結合は実質的に阻害しない。好ましいα_vβ₃アンタゴニストは、融合ポリペプチド、環状又は直鎖状ポリペプチド、誘導体化ポリペプチド、α_vβ₃と免疫反応するモノクローナル抗体、α_vβ₃の有機模倣物（organic mimetic）又はこれらの機能的断片であることができる。図面の簡単な説明本開示の一部を形成する図面は以下の通りである。図１Ａ〜１Ｄは、正常皮膚及び肉芽組織と呼ばれる創傷治癒を受けている皮膚における、インテグリンサブユニットβ₃及びβ₁の組織分布を示している。β₃ 及びβ₁に対する抗体を用いた免疫組織化学的実験を、実施例３Ａに記載されるようにして行った。図１Ａ及び１Ｂは、それぞれ、正常皮膚及び肉芽組織における抗β₃の免疫反応性を示している。図１Ｃ及び１Ｄは、それぞれ、正常皮膚及び肉芽組織における抗β₁の免疫反応性を示している。図２Ａ〜２Ｄは、それぞれ、正常皮膚及び肉芽組織と呼ばれる創傷治癒を受けている皮膚における、β₃及びβ₁インテグリンサブユニットに結合するフォンビルブラント因子及びラミニンリガンドの組織分布を示している。フォンビルブラント因子に対する抗体（抗ｖＷＦ）及びラミニンに対する抗体（抗ラミニン）を用いた免疫組織化学的実験を、実施例３Ｂに記載されるようにして行った。図２Ａ及び２Ｂは、それぞれ、正常皮膚及び肉芽組織における抗ｖＷＦの免疫反応性を示している。図２Ｃ及び２Ｄは、それぞれ、正常皮膚及び肉芽組織における抗ラミニンの免疫反応性を示している。図３Ａ〜３Ｄは、それぞれ、膀胱ガン、大腸ガン、乳ガン及び肺ガンの生検組織における、ビトロネクチンインテグリン受容体α_vβ₃の組織分布を示している。α_vβ₃に対するＬＭ６０９抗体を用いた免疫組織化学的実験を、実施例３Ｃに記載されるようにして行った。図４は、未処理の１０日齢ニワトリ胚における、血管を欠いている、本発明のＣＡＭの典型的な顕微鏡写真を示している。調製については実施例５Ｂに記載する。図５Ａ〜５Ｃは、本発明のＣＡＭ調製物におけるインテグリンβ₁及びα_vβ₃ の組織分布を示している。図５Ａは、抗β₁抗体であるＣＳＡＴとの免疫蛍光的免疫反応により検出した、未処理の１０日齢ＣＡＭ調製物におけるβ₁サブユニットの分布を示している。図５Ｂは、抗α_vβ₃抗体であるＬＭ６０９との免疫蛍光的免疫反応により検出した、未処理の１０日齢ＣＡＭ調製物におけるα_vβ₃受容体の分布を示している。図５Ｃは、抗α_vβ₃抗体であるＬＭ６０９との免疫蛍光的免疫反応により検出した、ｂＦＧＦ処理した１０日齢ＣＡＭ調製物における α_vβ₃受容体の分布を示している。処理及び結果は実施例５Ｃに記載する。図６は、図６に記載する、未処理及びｂＦＧＦ処理１０日齢ＣＡＭにおける、 α_vβ₃及びβ₁の相対発現の棒グラ７における数量化を示している。Ｘ軸にプロットしたインテグリンのプロフィールに対して、平均蛍光強度をＹ軸にプロットした。図７Ａ〜７Ｃは、未処理の１０日齢ＣＡＭ、ｂＦＧＦ処理ＣＡＭ及びＴＮＦα ＣＡＭの外観を示している。手順及び結果は実施例６Ａに記載する。図８Ａ〜８Ｅは、実施例７Ａ１に記載される、１０日齢ＣＡＭのｂＦＧＦ誘導血管形成に対する局所的抗体処理の効果を示している。図８Ａは、血管を欠いている、未処理ＣＡＭ調製物を示している。図８Ｂは、ｂＦＧＦ処理により誘導したあらかじめ血管構造を欠く領域への、新規血管構造の浸潤を示している。図８Ｃ、８Ｄ及び８Ｅは、それぞれ、β₁に対する抗体（抗β₁、ＣＳＡＴ）、α_vβ₅ に対する抗体（抗α_vβ₅、Ｐ３Ｇ２）及びα_vβ₃に対する抗体（抗α_vβ₃、ＬＭ６０９）の効果を示している。図９Ａ〜９Ｃは、実施例７Ｅ２に記載される、腫瘍に誘導された血管形成に対する、合成ペプチド６６２０３の静脈注射の効果を示している。図９Ａは、腫瘍誘導に由来する血管形成に対する、対照のペプチドを用いた静脈注射処理の阻害作用の欠如（対照ペプチド腫瘍）を示している。ペプチド６６２０３の静脈注射処理による血管形成阻害（環状ＲＧＤ腫瘍）は図９Ｂに示される。腫瘍処理した領域に隣接する領域における、ペプチド６６２０３の静脈内注入による、成熟した既存の血管に対する阻害作用又は細胞障害の欠如は、図９Ｃ（環状ＲＧＤ隣接ＣＡＭ）に示される。図１０Ａ〜１０ｃは、実施例７Ｂ１に記載される、増殖因子誘導血管形成に対するモノクローナル抗体の静脈内適用の効果を示している。図１０Ａは、抗体処理に暴露してないｂＦＧＦ誘導血管形成（対照）を示している。図１０Ｂに示されるように、同様の調製物を抗α_vβ₅抗体Ｐ３Ｇ２で処理したとき、血管形成は阻害されなかった。図１０Ｃに示されるように、抗α_vβ₃抗体ＬＭ６０９での処理では、血管形成は阻害された。図１１Ａ〜１１Ｃは、実施例７Ｃに記載される、抗インテグリン抗体の局所適用の胚の血管形成に対する効果を示している。図１１Ａ及び１１Ｂに示されるように、６日齢のＣＡＭをそれぞれ抗β₁及び抗α_vβ₅抗体で処理することによっては血管形成は阻害されなかった。対照的に、抗α_vβ₃抗体ＬＭ６０９を用いた処理では、図１１Ｃに示されるように血管形成が阻害された。図１２は、実施例７Ｄ１に記載される、ＣＡＭ調製物における腫瘍に進入した血管の数の数量化を示している。グラフは、ＣＳＡＴ(抗β₁)、ＬＭ６０９（抗 α_vβ₃）又はＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）のいずれかの局所適用より得た、Ｙ軸にプロットした血管数を示している。図１３Ａ〜１３Ｄは、実施例９Ａ１に記載される、処理７日後の腫瘍の湿重量と初期重量との比較を示している。各棒は、グループあたり５〜１０の腫瘍の平均±標準誤差を示している。腫瘍は、ヒト黒色腫（Ｍ２１−Ｌ）(図１３Ａ)、膵ガン（Ｆｇ）(図１３Ｂ)、肺ガン（ＵＣＬＡＰ−３）(図１３Ｃ)及び喉頭ガン（ＨＥｐ３）(図１３Ｄ)ＣＡＭ調製物に由来し、ＰＢＳ、ＣＳＡＴ（抗β₁）又はＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で静注により処理した。グラフは、Ｘ軸に示されるＣＳＡＴ(抗β₁)、ＬＭ６０９（抗α_vβ₃）又はＰＢＳのいずれかの静脈内適用得られた、Ｙ軸にプロットされる腫瘍重量を示している。図１４Ａ及び１４Ｂは、Ｐ３Ｇ２（抗α_vβ₅）で処理した腫瘍の組織切片（図１４Ａ）及びＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処理した腫瘍の組織切片（図１４Ｂ）を、実施例９Ａ１ｂに記載されるように、ヘマトキシリン及びエオシンで染色したものを示している。図１４Ａに示されるように、有糸分裂像（矢じり）及び多数の血管（矢印）により、対照の抗体（Ｐ３Ｇ２）で処理した腫瘍は、多数の生存可能なかつ活発に分裂している腫瘍細胞を示した。対照的に、図１４Ｂに示されるように、ＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処理した腫瘍においては、生存可能な腫瘍細胞又は血管はほとんど検出されなかった。図１５Ａ〜１５Ｅは、実施例９Ａ２に記載されるペプチドで処理したＭ２１Ｌ腫瘍に対応するものである。図１５Ａ：対照環状ＲＡＤペプチド(６９６０１)；図１５Ｂ：環状ＲＧＤペプチド(６６２０３)；図１５Ｃ：環状ＲＧＤペプチド（６６２０３）で処理した同一の胚より採取した隣接ＣＡＭ組織；図１５Ｄ：対照のＲＡＤ（６９６０１）で処理した腫瘍の高倍率図(１３×)；図１５Ｅ：環状ＲＧＤペプチド（６６２０３）で処理した腫瘍の高倍率図(１３×)。図１５Ｄは、ＲＡＤ対照ペプチド（６９６０１）で処理した腫瘍の正常な血管を示している。図１５Ｅは、環状ＲＧＤペプチド（６６２０３）で処理した腫瘍の分裂した血管の例を示している(矢印)。図１６Ａ〜１６Ｅは、実施例１０に記載される、インビボウサギ眼モデルアッセイにおける、血管形成のアンタゴニストによる血管形成阻害を示している。図１６Ａ及び１６Ｂは、ｂＦＧＦ及びｍＡｂＰ１Ｆ６（抗α_vβ₅）の存在下における、ウサギの眼の血管形成を示している。図１６Ｃ、１６Ｄ及び１６Ｅは、ｂＦＧＦ及びｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）の存在下における、ウサギの眼の血管形成の阻害を示している。図１７は、インビボマウスの流れ図、すなわち、どのように実施例１１に記載されるヒトキメラマウスモデルを生産するかを示している。ＳＣＩＤマウス由来の皮膚の一部を、ヒト新生児の包皮で置換し、４週間かけて治癒させた。移植片が治癒した後、ヒトの包皮をヒトの腫瘍細胞と共に接種した。続く４週間の間、ヒトの皮膚からヒトの腫瘍へ成長したヒトの血管と共にヒトの腫瘍を含む測定できる腫瘍を確立した。図１８は、実施例１２に記載されるように、ｍＡｂで処理した及びペプチドで処理したＣＡＭに由来し、かつＦＡＣＳ分析により測定されるＡｐｏｐタグ(Apo pTag)で染色した単一細胞の割合を示している。黒及び点描の棒は、それぞれ、アッセイ２４時間前及び４８時間前に処理した胚に由来する細胞を示している。各棒は、３回の反復試験の平均±標準偏差を示している。ＣＡＭは、ｍＡｂＬＭ６０９(抗α_vβ₃)、ＣＳＡＴ(抗β₁)又はＰＢＳで処理した。更に、ＣＡＭを、環状ペプチド６６２０３（ペプチド２０３として示されるシクロ−ＲＧＤｆＶ）又は対照のペプチド６９６０１（ペプチド６０１として示されるシクロ−ＲＡＤｆＶ）で処理した。図１９Ａ及び１９Ｂは、ＣＳＡＴ（抗β₁）(図１９Ａ)又はＬＭ６０９（抗α_v β₃）(図１９Ｂ)で処理し、実施例１２Ｃに記載されるようにして、Ａｐｏｐタグ及びヨウ化プロピジウムで染色し、ＦＡＣＳにより分析した、胚に由来するＣＡＭの単一細胞懸濁液の組み合わせの結果を示している。Ｙ軸は、細胞数におけるＡｐｏｐタグ染色（アポトーシス）を示し、Ｘ軸はヨウ化プロピジウム染色（ＤＮＡ含量）を示している。水平線は、Ａｐｏｐタグ染色についての陰性ゲート（negative gate）を示している。左及び右側のパネルは、それぞれ、ＣＳＡＴ（抗β₁）(図１９Ａ)及びＬＭ６０９（抗α_vβ₃）(図１９Ｂ)で処理した胚に由来するＣＡＭ細胞を示している。細胞周期分析は、１条件あたり約８０００事象（event）の分析により行った。図２０Ａ〜２０Ｃは、ＣＳＡＴ（抗β₁）で処理した胚に由来するＣＡＭ組織及びを示している。図２０Ｄ〜２０Ｆは、実施例１２Ｃに記載されるようにして調製した、ＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処理した胚に由来するＣＡＭ組織を示している。図２０Ａ及び２０Ｄは、Ａｐｏｐタグで染色し、Ｄ．Ｉ．Ｃイメージ上に重ね合わせた蛍光（ＦＩＴＣ）により可視化した組織を示している。図２０Ｂ及び２０Ｅは、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で染色し、蛍光（ローダミン）により可視化した同一組織を示している。図２０Ｃ及び２０Ｆは、Ａｐｏｐタグ及びＬＭ６０９の両者で染色した同一組織の組合せ像を示している。ここで、黄色の染色は共存を示している。棒は、左及び右のパネルにおいて、それぞれ、１５及び５０μｍを表している。図２１は、実施例４Ａに記載されるようにして、ペプチド８５１８９を用いた細胞接着阻害アッセイの結果を示している。ペプチドアンタゴニストの効果を、Ｘ軸にプロット下０．００１〜１００μＭの投与量範囲で評価した。細胞接着は、６００ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ.）で測定した値をＹ軸にプロットした。細胞接着は、ビトロネタチン（破線）及びラミニン（実線）で表面において測定した。図２２Ａ及び２２Ｂは、ニワトリＭＭＰ−２の連続的ｃＤＮＡ配列及び第二の列に示される推定されるアミノ酸配列を示している。第三及び第四の列は、それぞれ、実施例４Ａに示されるように、ヒト及びマウスのＭＭＰ−２の推定されるアミノ酸配列を示している。ニワトリのｃＤＮＡ配列は、配列番号２９に、コードするアミノ酸配列（配列番号３０として別に示されてもいる）とともに記載されている。図２２Ａおいて負の数として示される５’非翻訳領域及びプロ酵素配列をコードする領域の一番目のヌクレオチドの番号付けは、図面よりも長い後者を作成する配列表においては、実際には番号１として示されている。しかしながら、図面のヌクレオチド配列は、番号付けを除いて、配列表に示されるものと、長さ及び配列において同一である。したがって、明細書における、例えばＭＭＰ −２断片増幅に使用するためのプライマー等におけるニワトリ又はヒトのＭＭＰ −２についてのヌクレオチドの部位についての言及は、図面に示されたヌクレオチドの部位に基づくものであり、配列表に示されたものに基づくものではない。図２３は、実施例４Ｂに更に記載される、阻害剤の存在下又は非存在下における、ヨウ化ＭＭＰ−２のα_vβ₃への結合についての固相受容体結合アッセイの棒グラフ形態の結果を示している。データは、種々の可能性のある阻害剤及び対照に対して、結合したＣＰＭをＹ軸にプロットした。図２４は、実施例４Ｂに更に記載される、ＭＭＰ−２阻害剤の存在下における、インテグリン受容体α_vβ₃及びα_IIbβ₃のいずれかに対する、ニワトリ由来ＭＭＰ−２組成物の特異性を示している。データは、図２３における凡例と同様に示した。図２５は、実施例７Ａ３に記載される、ｂＦＧＦ誘導血管形成に対するニワトリＭＭＰ−２（４１０−６３７）ＧＳＴ融合タンパク質の効果を示している。図２５Ａ〜Ｂ及び２５Ｃ〜Ｄは、それぞれ、対照（非ＭＭＰ−２断片含有融合タンパク質）及びＭＭＰ−２断片ＧＳＴ融合タンパク質の効果を示している。図２６及び２７は共に、実施例７Ａ３に記載される、ｂＦＧＦ処理ＣＡＭに対するニワトリＭＭＰ−２（４１０−６３７）ＧＳＴ融合タンパク質（ＣＴＭＭＰ −２と命名）及び対照（ＲＡＰ−ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＲＡＰ）の効果の血管形成指数（angiogenesis index）(分岐点の測定)を棒グラフ形態で示している。血管形成指数は、Ｘ軸の別々の処理に対して、Ｙ軸にプロットした。図２８は、実施例７Ｂ及び１４に記載される、分岐点に対する効果により測定した、ｂＦＧＦ誘導血管形成に対するペプチド及び有機化合物の効果を示している。ｂＦＧＦ単独、ペプチド６９６０１若しくは６６２０３又は有機化合物９６１１２、９６１１３若しくは９６２２９を含むｂＦＧＦ処理ＣＡＭを含む別々の処理をＸ軸に、分岐点をＹ軸にプロットした。図２９は、実施例７Ｂ２に記載される、ｂＦＧＦ誘導血管形成阻害に対する、ペプチド８５１８９の用量反応を図示したものである。ここで、胚へ投与したペプチドの量をＸ軸に、分岐点の数をＹ軸にプロットした。図３０は、実施例７Ｂ２に記載される、ＣＡＭアッセイにおけるｂＦＧＦ誘導血管形成に対する、ペプチド６６２０３（２０３と命名）及び８５１８９（１８９と命名）の阻害活性を示している。対照は、ｂ−ＦＧＦ処理ＣＡＭ中にペプチドを含まないもの及びペプチド６９６０１（６０１と命名）を含んでいるものであった。データは、図２７についての凡例と同様にプロットした。図３１Ａ〜Ｌは、実施例７Ｂ３に記載される、２４時間で開始し、７２時間で終了した、未処理ＣＡＭ調製物に対する種々の処理の効果を示している。未処理、ｂＦＧＦ、ｂＦＧＦ＋ＭＡＩＤ（ｂＦＧＦ処理に続き、ニワトリＭＭＰ−２（２−４）ＧＳＴ融合タンパク質に暴露）及びｂＦＧＦ＋対照（ｂＦＧＦ処理に続きニワトリＭＭＰ−２（１０−１）に暴露）と名称をつけたカテゴリーについての写真は、それぞれ、図３１Ａ〜Ｃ、３１Ｄ〜Ｆ、３１Ｇ〜Ｉ及び３１Ｊ〜Ｌに示される。図３２、３３及び３４は、それぞれ、実施例９Ａに記載される、対照ペプチド６９６０１及びアンタゴニスト８５１８９を静脈内暴露した後の、ＵＣＬＡＰ− ３、Ｍ２１−Ｌ及びＦｇＭ腫瘍についての腫瘍重量の減少を示している。データは、Ｘ軸にペプチド処理を、Ｙ軸に腫瘍重量をプロットした。図３５は、実施例１１Ｂに示される、キメラマウス：ヒトモデルにおける黒色腫成長に対する、ペプチド及び抗体の効果を示している。評価したペプチドは、対照６９６０１（６０１と命名）及びアンタゴニスト８５１８９（１８９と命名）を含んでいた。試験した抗体はＬＭ６０９であった。Ｘ軸に種々の処理を、Ｙ軸に腫瘍容積をｍｍ³の単位でプロットした。図３６Ａ及びＢは、それぞれ、実施例１１Ｃに記載される、１０、５０及び２５０μｇ／注入の投与量範囲における、Ｍ２１Ｌ腫瘍の容積及び湿潤重量の減少について、アンタゴニスト８５１８９（１８９と命名）の効果と対照ペプチド６９６０１（６０１と命名）との比較を示している。図３７Ａ及び３７Ｂは、実施例１１Ｃに記載される、２つの異なる処理計画を用いてのマウス：ヒトモデルにおけるＭ２１Ｌ腫瘍容積阻害に対する、アンタゴニストペプチド８５１８９（１８９と命名。実線及び黒丸）及び対照ペプチド６９６０１（６０１と命名。破線及び透明の四角）の効果を示している。Ｘ軸に日数を、Ｙ軸に腫瘍容積（ｍｍ³）をプロットした。図３８〜４２は、実施例１３に記載する、有機分子α_vβ₃アンタゴニストの種々の化学合成の模式図である。図４３及び４４は、実施例１４に記載される、ＣＡＭアッセイにおけるｂＦＧＦ誘導血管形成に対する、種々の有機分子の効果を示している。Ｘ軸に使用した種々の化合物（図４３では２５０μｇ／ｍｌ。図４４では１００μｇ）を、Ｙ軸には分岐点をプロットした。発明の詳細な説明Ａ．定義アミノ酸残基：ポリペプチドのペプチド結合の化学的消化（加水分解）において生成するアミノ酸。本明細書に記載したアミノ酸残基は、好ましくは「Ｌ」型異性体形態である。しかしながら、所望の機能特性がポリペプチドにより維持される限り、Ｌ型アミノ酸残基を「Ｄ」型異性体形態の残基で置換することができる。ＮＨ₂は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味する。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離のカルボキシル基を意味する。標準化されたポリペプチドの命名法(J．Biol．Chem.、243:3552-59 （1969）に記載されており、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（ｂ）(２)に適合している）と一致させて、アミノ酸残基に対する略語を以下の対応表に示す。対応表記号アミノ酸１文字３文字ＹＴｙｒチロシンＧＧｌｙグリシンＦＰｈｅフェニルアラニンＭＭｅｔメチオニンＡＡｌａアラニンＳＳｅｒセリンＩＩｌｅイソロイシンＬＬｅｕロイシンＴＴｈｒトレオニンＶＶａｌバリンＰＰｒｏプロリンＫＬｙｓリジンＨＨｉｓヒスチジンＱＧｌｎグルタミンＥＧｌｕグルタミン酸ＺＧｌｘＧｌｕ及び／又はＧｌｎＷＴｒｐトリプトファンＲＡｒｇアルギニンＤＡｓｐアスパラギン酸ＮＡｓｎアスパラギンＢＡｓｘＡｓｎ及び／又はＡｓｐＣＣｙｓシステインＸＸａａ未知又はその他のアミノ酸更に、以下に示す略語は、以下の意味を有する。ＢＯＣｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルＤＣＣＩジシクロヘキシルカルボジイミドＤＭＦジメチルホルムアミドＯＭｅメトキシＨＯＢｔ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール本明細書において式により示された全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端という通常の方向において、左から右への配向を有していることに注意すべきである。更に、アミノ酸残基配列の始まり及び末端におけるダッシュは、更なる１以上のアミノ酸残基配列へのペプチド結合を示している。ポリペプチド：隣接するアミノ酸残基のαアミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により互いに結合しているアミノ酸残基の直鎖状連続物。ペプチド：本明細書で使用するとき、ポリペプチド内において、互いに結合した約５０をこえないアミノ酸残基の直鎖状連続物を意味する。環状ペプチド：典型的なペプチド等において幾つかのアミド結合を含むヘテロ原子環構造を有する化合物を意味する。環状ペプチドは、直鎖状ペプチドのＮ末端が直鎖状ペプチドの末端カルボン酸塩とアミド結合を形成している「頭−尾」環化直鎖状ポリペプチドであるか、又はポリマーがホモデティック（homodetic ）又はヘテロデティック（heterodetic）でありかつ閉環するためのアミド結合及び／又はその他の結合、例えばジスルフィド架橋、チオエステル、チオアミド、グアニジノ等の結合を含む環構造を含むことができる。タンパク質：ポリペプチド等で互いに結合した５０をこえるアミノ酸残基の直鎖状連続物を意味する。融合タンパク質：通常ペプチド結合により結合（「融合」）した、少なくとも２つの異なるポリペプチドドメインを含むポリペプチドを意味する。ここで、２つのドメインは、天然においては融合が見出されないものに相当する。合成ペプチド：ペプチド結合により結合したアミノ酸残基の化学的に生成した鎖であって、天然タンパク質及びその断片が存在していないものを意味する。Ｂ．一般的考察一般的に、本発明は、血管形成は特定のビトロネクチン受容体α_vβ₃により媒介され、α_vβ₃機能の阻害は血管形成を阻害するという発見に関するものである。血管形成は種々の疾患過程において役割を果たしているので、この発見は重要である。血管形成を阻害することにより、疾患に介入し、病状を改善し、更にある場合においては疾患を治療することができる。新しい血管の成長が、疾患に関連する病理の原因となるか又はそれに寄与する場合、血管形成の阻害は、疾患の有害作用を減少させるだろう。例としては、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、炎症性疾患、再狭窄等が含まれる。有害な組織の成長を支持するために新しい血管の成長が必要とされる場合、血管形成の阻害は、組織への血液の供給を減少させ、これにより血液供給の要求に基づく組織塊の減少に貢献するだろう。例としては、腫瘍が厚さ数ｍｍよりも大きく成長するため及び固形腫瘍転移の確立のために新血管形成が連続的に要求される場合の腫瘍の成長が含まれる。本発明の方法は、部分的に効果的である。なぜなら、治療は血管形成に対しては高度に選択的であるが、その他の生物学的過程には高度に選択的ではないからである。実施例に示されるように、新しい血管成長のみが、実質的にα_vβ₃を含み、それゆえ、治療方法は、成熟した血管には悪影響を及ぼさない。更に、α_v β₃は、正常組織においては広範囲に分布していないが、新しい血管には選択的に見出される。これにより、治療を新しい血管の成長を選択的に標的とさせることが可能になる。 α_vβ₃単独の阻害は血管形成を効果的に阻害するという発見は、潜在的に高い特異性を有し、それゆえ比較的低毒性の治療用組成物の開発を許容するだろう。本発明は、１以上のインテグリンを阻害することができるペプチドを基本とする薬剤の使用を開示するけれども、より選択的にα_vβ₃を阻害し、それゆえα_vβ₃ により介在されるもの以外の生物学的過程を阻害するという副作用を有しない薬剤を設計することができる。例えば、本明細書に示されるように、α_vβ₃と高い選択性で免疫反応し、α_v β₃機能の阻害に同様に選択的であるモノクローナル抗体を製造することができる。更に、ＲＧＤ含有ペプチドを、本明細書に記載されるように、α_vβ₃の阻害に選択的になるように設計することができる。本発明の開示よりも前に、α_vβ₃の生物学的機能をアンタゴナイズする薬剤の使用により、血管形成及び血管形成に依存するあらゆる過程をインビボで阻害することができるということは知られていなかった。Ｃ．血管形成の阻害方法本発明は、組織における血管形成を阻害し、これにより、血管形成に依存する組織における事象を阻害する方法を提供する。一般的に、方法は、α_vβ₃アンタゴニストの血管形成阻害量を含む組成物を組織に投与することからなる。前記のように、血管形成は、「発生(sprouting)」、血管形成又は血管の拡張(これらの疾患は全てα_vβ₃により介在され、α_vβ₃の発現に依存する)を含む組織の新血管形成からなる種々の過程を含んでいる。外傷性創傷治癒、黄体形成及び胚形成を除いて、血管形成過程の大部分は疾患過程と関連し、それゆえ、本発明の治療方法の使用は、疾患に選択的であり、有害作用を有しないとされる。血管形成が重要であり、血管形成性疾患(angiogenic disease)と呼ばれる種々の疾患には、炎症性障害、例えば免疫性炎及び非免疫性炎、慢性関節リウマチ及び乾癬；不適切な又は時機を逸した血管の浸潤と関連する障害、例えば糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、再狭窄、アテローム斑における毛細管増殖及び骨粗しょう症並びにガン関連障害、例えば固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、後水晶体繊維増殖症、血管腫、カポジ肉腫及び腫瘍成長を支持するために新血管形成を必要とするガン等が含まれるが、これらに限定されるものではない。したがって、患部組織における血管形成を阻害する方法は、疾患の病状を改善し、疾患によっては、疾患の治療に貢献することができる。ある態様においては、本発明は、組織における自身での血管形成の阻害を企図する。組織における血管形成の程度、それゆえ本発明により達成される阻害の程度は、種々の方法、たとえば免疫組織化学による、α_vβ₃免疫陽性の未発達かつ新生血管構造検出についての実施例に記載される方法により評価することができる。本明細書に記載されるように、種々の組織又は組織化した組織からなる器官のあらゆるものは、筋肉、内臓、結合組織、関節、骨及び血管が血管形成刺激に侵入することができる組織を含む疾患状態における血管形成を支持する。したがって、１つの関連する態様においては、治療する組織は炎症組織であり、阻害する血管形成は、炎症組織の新血管形成が存在する炎症組織の血管形成である。このクラスにおいては、本発明の方法は、関節炎組織、例えば慢性関節リウマチ患者、免疫性又は非免疫性炎症組織、乾癬組織等における新血管形成の阻害を企図している。発明の本質は、本発明は全ての哺乳動物（「患者」という用語に含まれることが意図される）に関して有効であることを示していると理解されるべきであるけれども、本発明の多数の態様で治療する患者は、望ましくはヒトである。この状況において、哺乳動物は、血管形成に関連する疾患の治療が望まれるあらゆる哺乳類動物種、特に農業用及び家庭用哺乳類動物種を含んでいると理解される。別の関連する態様においては、治療する組織は、網膜疾患、例えば糖尿病性網膜症、黄斑変性症又は血管新生緑内障を患う患者の網膜組織であり、阻害される血管形成は、網膜組織の血管新生が存在する網膜組織血管形成である。更なる関連する態様においては、治療する組織は、固形腫瘍、転移、皮膚ガン、乳ガン、血管腫又は血管線維腫及びガン様の疾患を患う患者の腫瘍組織であり、阻害する血管形成は、腫瘍組織の血管新生が存在する腫瘍組織血管形成である。本発明の方法により治療することができる典型的な固形腫瘍組織には、肺、脾臓、胸部、結腸、咽頭、卵巣等の組織が含まれる。例示的な腫痘組織血管形成及びその阻害については、実施例に記載する。腫瘍組織血管形成の阻害は特に好ましい態様である。なぜなら、新血管形成は腫瘍成長に重要な役割を果たすからである。腫瘍組織に新血管形成が存在しない場合、腫瘍組織は必要な栄養を得ることができず、更なる成長を止め、退行し、最終的には壊死により腫瘍は死滅する。別の言葉で述べると、本発明は、本発明にしたがい腫瘍血管形成を阻害することによる、腫瘍新血管形成を阻害する方法を提供する。同様に、本発明は、血管形成阻害法を実施することによる腫瘍成長の阻害方法を提供する。更に、本発明の方法は、転移形成に対して特に有効である。なぜなら、（１）転移形成は、転移ガン細胞が原発腫瘍から出て行くことができるために、原発腫瘍の血管形成を必要とし、（２）二次部位における転移の確立は、転移の成長を支持するために、新血管形成を必要とするからである。関連する態様においては、本発明は、その他の治療、例えば固形腫瘍に対して向けられ、転移の確立の制御のための従来の化学療法と組み合わせた本発明の方法の実施を企図している。化学療法後、腫瘍組織への血液供給及び栄養の供給により血管形成の回復が誘導されることにより腫瘍組織が毒による攻撃（toxicass ault）に反応するようになるときに血管形成を阻害することが好ましいけれども、血管形成阻害剤の投与は、通常、化学療法の間又はその後に行われる。更に、転移に対する予防として固形腫瘍を除去する手術の後、血管形成阻害法を実施することが好ましい。本発明の方法が腫瘍新血管形成の阻害を提供する限り、本発明の方法は、腫瘍組織成長の阻害を提供し、腫瘍転移形成を阻害し、確立した腫瘍を退行させることができる。実施例は、本発明のα_vβ₃アンタゴニストの単一静脈内投与にしたがう確立した腫瘍の退行を実証している。再狭窄は、経皮的冠動脈形成術部位における平滑筋細胞（ＳＭＣ）の移動及び増殖の過程であり、血管形成術の成功を妨げるものである。再狭窄中のＳＭＣの移動及び増殖は、本発明により阻害される血管形成の過程であると考えることができる。それゆえ、本発明は更に、本発明の方法にしたがい血管形成を阻害することによる、血管形成術にしたがう患者の再狭窄の阻害をも企図する。再狭窄の阻害のために、通常、α_vβ₃アンタゴニストを、血管形成術後、約２〜約２８日間、より一般的には術後の最初の約１４日間投与する。組織の血管形成を阻害する本発明の方法は、それゆえ、血管形成関連疾患の治療方法をも行い、この方法は、血管形成が起こっている又はその危険性がある組織と、α_vβ₃のその天然のリガンドへの結合を阻害することができるα_vβ₃アンタゴニストの治療学的有効量を含む組成物とを接触させることからなる。したがって、この方法は、本発明のα_vβ₃アンタゴニストを含む生理学的に許容される組成物の治療学的有効量を患者に投与することからなる。 α_vβ₃アンタゴニスト投与のための投与量範囲は、本明細書に更に記載されるようにアンタゴニストの形態及びその効力に依存し、血管形成及び血管形成により媒介される疾患症状を改善する所望の効果を生じるのに十分な量である。投与量は、有害な副作用、例えば過粘着性症候群、肺水腫、うっ血性心不全等を引き起こすほどには大きくあるべきではない。一般的には、投与量は、年齢、状態、性別及び患者の疾患の程度により変化し、当業者により決定されることができる。合併症のとき、投与量は、個々の医師により調節されることができる。治療学的有効量は、治療する組織における血管形成を測定可能に阻害するのに十分なα_vβ₃の量、すなわち血管形成阻害量のことである。血管形成の阻害は、生体内原位置で、免疫組織化学（後述する）又は当業者に既知のその他の方法により測定することができる。 α_vβ₃アンタゴニストが、α_vβ₃模倣物、ＲＧＤ含有ペプチド、抗α_vβ₃モノクローナル抗体又はその断片の形態をとることができる限り、効力及び「治療学的に有効な」という表現は変化することができる。しかしながら、本発明のアッセイ方法に示されるように、当業者は、本発明の候補となるα_vβ₃アンタゴニストの効力を容易に評価することができる。 α_vβ₃アンタゴニストの効力は、ＣＡＭアッセイにおける血管形成の阻害、インビトロでのウサギ眼アッセイ、インビボでのキメラマウス：ヒトのアッセイ及び天然のリガンドのα_vβ₃への結合の阻害の測定（これらは本明細書に記載されている）等を含む種々の方法により測定することができる。好ましいα_vβ₃アンタゴニストは、アンタゴニスト濃度０．５μＭ未満、好ましくは０．１μＭ、より好ましくは０．０５μＭ未満で、溶液中、天然のリガンド、例えばフィブリノゲン又はビトロネクチンのα_vβ₃への結合を実質的に阻害する能力を有する。「実質的」とは、α_vβ₃アンタゴニストの存在における阻害により少なくとも５０％のフィブリノゲン結合阻害が見られることを意味する。５０％の阻害について本明細書ではＩＣ₅₀値として言及する。より好ましいα_vβ₃アンタゴニストは、その他のインテグリンよりもα_vβ₃に対して選択性を示す。したがって、好ましいα_vβ₃アンタゴニストは、フィブリノケンのα_vβ₃への結合は実質的に阻害するが、フィブリノゲンの別のインテグリン、例えばα_vβ₁、α_vβ₅又はα_IIbβ₃への結合は実質的に阻害しない。特に好ましいものは、フィブリノゲンのα_vβ₃への結合阻害におけるＩＣ₅₀活性が、フィブリノゲンの別のインテグリンへの結合阻害におけるＩＣ₅₀活性と比較して１０倍〜１００倍低いα_vβ₃アンタゴニストである。フィブリノゲンのインテグリンへの結合阻害についてＩＣ₅₀活性を測定するための例示的なアッセイは、実施例に記載されている。モノクローナル抗体の形態にある本発明のα_vβ₃アンタゴニストの治療学的有効量は、一般的に、通常、生理学的に許容しうる組成物で投与したとき、約０．０１〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜約５μｇ／ｍｌ、通常は約５μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するのに十分な量である。異なる表現では、投与量は、約０．１〜約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２〜約２００ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇを、１日に１回以上、１〜数日間の範囲で変化することができる。アンタゴニストがモノクローナル抗体の断片の形態にある場合、その量は、全抗体の質量に対する断片の質量に基き容易に調節することができる。モル濃度における好ましい血漿濃度は、約２μＭ〜約５ｍＭであり、好ましくは約１００μ Ｍ〜１ｍＭ（抗体アンタゴニスト）である。ポリペプチド又はその他の類似の大きさの小分子α_vβ₃模倣物の形態にある本発明のα_vβ₃アンタゴニストの治療学的有効量は、一般的に、通常、生理学的に許容しうる組成物で投与したとき、約０．１〜約２００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜約１５０μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するのに十分な量である。約５００ｇ／モルの質量を有するペプチドに基くと、モル濃度における好ましい血漿濃度は、約２μＭ〜約５ｍＭであり、好ましくは約１００μＭ〜１ｍＭ（ポリペプチドアンタゴニスト）である。異なる表現では、体重あたりの投与量は、約０．１〜約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２〜約２００ｍｇ／ｋｇを、１日に１回以上、１〜数日間の範囲で変化することができる。本発明のモノクローナル抗体又はポリペプチドは、注射又は時間に対する漸進的な注入（gradual infusion over time）により非経口的に投与することができる。治療する組織は、通常、全身投与により体内でアクセスすることができ、それゆえ、治療組成物の静脈内投与によりほとんどが治療されるが、標的組織が標的分子を含む可能性がある場合、その他の組織及び送達手段が企図される。したがって、本発明のモノクローナル抗体又はポリペプチドは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮的投与することができ、更に蠕動手段により送達することができる。本発明のモノクローナル抗体又はポリペプチドを含む治療組成物は、通常、例えば単位投与量の注射により静脈内投与する。本発明の治療組成物についての言及において使用するとき「単位投与量」とは、対象に対する単一投与として適切な物理的に別個の単位を意味する。各単位は、必要な希釈剤、すなわち担体又はビヒクルと共同して所望の治療効果を生じるように計算された活性物質の予定の量を含んでいる。実施例に記載される１つの好ましい態様においては、α_vβ₃アンタゴニストは、単一投与量で静脈内投与される。本発明の組成物は、投与製剤と適合する方法及び治療学的有効量で投与する。投与量及びタイミングは、治療する患者、活性成分を利用する患者のシステムの能力及び所望の治療効果の程度に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、医帥の判断に依存し、各個体に特有である。しかしながら、全身投与に適切な投与量範囲は本明細書に記載されており、それは投与経路に依存する。適切な投与法は変化することができるが、初期投与、続く１時間以上の間隔をおいた注射又はその他の投与による繰り返しの投与に代表される。代わりに、インビボ治療に特異的な範囲で血中濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入が企図される。実施例に示されるように、血管形成阻害及び腫瘍退行は、アンタゴニストとの最初の接触後早くも７日で起こる。アンタゴニストへの追加又は延長の暴露は、７日〜６週間が好ましく、約１４〜２８日間が好ましい。関連する態様において、実施例は、α_vβ₃阻害とα_vβ₃を有する新生血管構造 (neovasculature)細胞におけるアポトーシスの誘導との関係を実証している。したがって、本発明は、組織の新生血管構造におけるアポトーシスの阻害方法をも企図している。この方法は、記載される全ての組織及び状態における血管形成阻害について、本明細書に記載されるようにして実質的に行われる。唯一の注目すべき差異は効果のタイミングであり、通常アンタゴニストとの接触約４８時間後に急速にアポトーシスが明らかになるが、血管形成阻害及び腫瘍退行は本明細書に記載されるようにもっとゆっくりと明らかになる。この差異は、投与時間及び所望する効果の点からの治療法に影響する。通常、新生血管構造のアポトーシスのための投与は、２４時間〜約４週間であり、好ましくは４８時間〜７日間である。Ｄ．治療組成物本発明は、本明細書に記載される治療方法の実施に有用な治療組成物を企図する。本発明の治療組成物は、生理学的に許容しうる担体と共に、活性成分として担体に溶解又は分散している本明柵書に記載されるα_vβ₅含む。好ましい態様においては、治療用α_vβ₃アンタゴニスト組成物は、治療目的で哺乳類又はヒト患者に投与したとき免疫原性ではない。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容しうる」、「生理学的に許容しうる」及びそれらの文法的変形は、組成物、担体、希釈剤及び試薬について言及するとき互換的に使用され、吐き気、めまい、急性胃蠕動等の好ましくない生理作用の生成なしに哺乳類に投与することができる物質を意味する。溶解又は分散した活性成分を含む医薬組成物の製造は、当該技術分野において十分に理解されており、製剤に基き制限される必要はない。通常、そのような組成物は、溶液又は懸濁液として注射可能に製造される。しかしながら、液中での使用前における、溶液又は懸濁液に適切な固体形態を製造することもできる。製剤は乳化させることもできる。活性成分は、薬学的に許容しうるかつ活性成分と適合する賦形剤と、本明細書に記載される治療方法における使用に適切な量で混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール又はそれらの混合物等である。更に、所望により、組成物は、活性成分の効果を増強する補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤等を微量含むことができる。本発明の治療組成物は、その中に、成分の薬学的に許容しうる塩を含むことができる。薬学的に許容しうる塩には、無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸又は有機酸、例えば酢酸、酒石酸、マンデル酸等を用いて形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離のアミノ基を用いて形成される）が含まれる。遊離のカルボキシル基を用いて形成した塩は、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄及び有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来することができる。特に好ましいのは、環状ポリペプチドα_vβ₃の製造に使用するとき、ＴＦＡ及びＨＣｌの塩である。ペプチドの代表的な塩は、実施例に記載される。生理学的に許容しうる担体は、当該技術分野において周知である。液体担体の例は、活性成分及び水に加えて物質を含まない滅菌水溶液、又は緩衝液、例えば生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理学的食塩水又はその両者、例えばリン酸緩衝生理的食塩水を含む滅菌水溶液である。更に、水性担体は、１以上の緩衝塩並びに塩化ナトリウム、塩化カリウム、ブドウ糖、ポリエチレングリコール及びその他の溶質を含むことができる。液体組成物は、水に加えて及び水を排除して液相を含むことができる。そのような追加の液相の例は、グリセリン、植物油、例えば綿実油及び水−油エマルジョンである。治療組成物は、本発明のα_vβ₅アンタゴニストを血管形成阻害量で含み、通常、治療組成物全重量あたり少なくとも０．１重量％のアンタゴニストを含むように製剤化する。重量％は、全組成物に対する阻害剤の重量の比である。したがって、０．１重量％とは、全組成物１００ｇあたり０．１ｇの阻害剤のことである。Ｅ．インテグリンα_vβ₃のアンタゴニスト α_vβ₃アンタゴニストは、組織における血管形成を阻害する本発明の方法に使用され、天然のα_vβ₃リガンドとの機能的相互作用が妨害されるような方法でα_v β₃と相互作用する化合物を含む種々の形態をとることができる。例示的なアンタゴニストには、α_vβ₃のリガンド結合部位に由来するα_vβ₃の類似体、α_vβ₃ −リガンド結合相互作用に関連する構造領域を模倣する、α_vβ₃又はα_v β₃の天然のリガンドの類似物、α_vβ₃に特異的な天然リガンドの機能的結合ドメインに対応する、特にα_vβ₃の天然リガンドのＲＧＤ含有ドメインに対応する配列を有するポリペプチド及びα_vβ₃又は天然のリガンドのいずれかと免疫反応する抗体が含まれる。これら全ては、本明細書に記載されるようにアンタゴニスト活性を示す。１．ポリペプチド１つの態様においては、本発明は、ポリペプチド形態のα_vβ₃アンタゴニストを企図する。ポリペプチド（ペプチド）α_vβ₃アンタゴニストは、α_vβ₃−リガンド相互作用に関係する領域において、α_vβ₃の天然のリガンド又はα_vβ₃自身のいずれかの配列の特徴を有し、本明細書に記載されるα_vβ₃アンタゴニスト活性を示すことができる。好ましいα_vβ₃アンタゴニストペプチドは、α_vβ₃の天然のリガンド、例えばフィブリノゲン、ビトロネクチン、フォンビルブラント因子、ラミニン、トロンボスポンジン等のリガンドのＲＧＤ含有領域のアミノ酸残基配列に対応する配列を有する。これらのα_vβ₃リガンドの配列は周知である。したがって、α_vβ₃アンタゴニストペプチドは、あらゆる天然リガンドに由来することができる。フィブリノゲン及びビトロネクチンが好ましい。特に好ましいα_vβ₃アンタゴニストペプチドは、前記のその他のインテグリンと比較したとき、α_vβ₃のその天然リガンドへの結合を優占的に阻害する。これらのα_vβ₃特異的ペプチドは特に好ましい。なぜなら、少なくともα_vβ₃に対する特異性は、その他のインテグリンの阻害等の望ましくない副作用の発生率を減少させるからである。α_vβ₃に対する選択性を有する好ましいα_vβ₃アンタゴニストペプチドの同定は、通常の結合阻害アッセイ、例えば実施例に記載するＥＬＩＳＡアッセイにおいて容易に行うことができる。本発明のポリペプチドは、通常、約１００をこえないアミノ酸残基、好ましくは約６０をこえない残基、より好ましくは約３０をこえない残基を含んでいる。ペプチドは直鎖状又は環状であることができる。特に好ましいペプチドは環状である。ポリペプチドが約１００残基よりも大きい場合、本明細書に記載されるように、融合タンパク質又はタンパク質断片の形態で提供される。好ましい環状及び直鎖状ペプチド並びにそれらの名前を、実施例の表１に示す。対象となるポリペプチドは、必要な配列を含み、本明細書に記載されるアッセイにおいてα_vβ₃アンタゴニストとして機能することができる限り、α_vβ₃天然リガンドのアミノ酸配列と同一である必要はない。主題のペプチドは、本明細書に示されるアミノ酸残基配列を有し、α_vβ₃アンタゴニストであるポリペプチドのあらゆる類似体、断片又は化学的誘導体が含まれる。それゆえ、本発明のペプチドは、使用時にある利点を提供する種々の改変、例えば置換、挿入及び削除に付することができる。この点に関して、本発明の α_vβ₃アンタゴニストポリペプチドは、記載されたペプチドの配列と同一であるよりもむしろ相当するものであり、１以上の改変が行われ、本明細書に定義する１以上のアッセイにおいてα_vβ₃アンタゴニストとして機能する能力を維持している。したがって、ポリペプチドは、アミド、タンパク質との結合物、環状ペプチド、重合ペプチド、類似体、断片、化学修飾ペプチド等の類似体を含むあらゆる種々のペプチド誘導体の形態であることができる。「類似体」という用語には、本明細書に詳細に示される配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を有し、１以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されており、本明細書に記載されるα_vβ₃アンタゴニスト活性を示すあらゆるポリペプチドが含まれる。保存的置換の例には、非極性（疎水性）残基、例えばバリン、ロイシン又はメチオニンの間の置換；極性（親水性）残基の置換、例えばアルギニン及びリジン間、グルタミン及びアスパラギン間、グリシン及びセリン間；塩基性残基の置換、例えばリジン、アルギニン又はヒスチジン間；又は酸性残基、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸間の置換が含まれる。「保存的置換」というフレーズには、ペプチドが必要な阻害活性を示すことを条件として、非誘導体化残基の代わりに化学的誘導体化残基を使用することが含まれている。「化学誘導体」という用語は、機能的側基の反応により化学的に誘導体化された１以上の残基を有する主題のポリペプチドを意味する。側基誘導体化に加えて、化学誘導体は、α−アミノ置換基、例えばＮ−メチル、Ｎ−エチル、Ｎ−プロピル等、及びα−カルボニル置換基、例えばチオエステル、チオアミド、グアニジノ等を含む１以上のバックボーン修飾を有することができる。そのような誘導体化分子には、例えば、遊離のアミノ基が誘導体化され、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成する分子が含まれる。遊離のカルボキシル基を誘導体化して、塩、メチルエステル及びエチルエステル又はその他の型のエステル又はヒドラジドを形成してもよい。遊離のヒドロキシル基を誘導体化して、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成してもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化して、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成してもよい。２０の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体の１以上を含むペプチドも化学誘導体に含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換してもよい。５−ヒドロキシリジンでリジンを置換してもよい。３−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換してもよい。ホモセリンでセリンを置換してもよい。オルニチンでリジンを置換してもよい。本発明のポリペプチドには、必要な活性が維持される限り、本明細書に示される配列を有するポリペプチド配列に対して１以上の付加及び／又は削除を有するあらゆるポリペプチドが含まれる。特に好ましい誘導体は、式：シクロ（Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal）(略称：ｃ( RGDf-NMeV))（ペプチドのバリン残基にＮ−メチル置換α−アミノ基が存在し、環化によりペプチドの第一アミノ及びカルボキシ末端が結合している）で示される環状ペプチドである。「断片」という用語は、本明細書に示されるアミノ酸残基を有するポリペプチドのアミノ酸残基配列よりも短いアミノ酸残基配列を有するあらゆる主題のポリペプチドを意味する。本発明のポリペプチドが、α_vβ₃天然リガンドの配列と同一でない配列を有するとき、通常、１以上の保存的置換又は非保存的置換により、通常、約３０％をこえない、好ましくは１０％をこえない数のアミノ酸残基が置換されている。本発明のポリペプチドが標識若しくは固体マトリックス又は担体に都合よく付着することができるようにする「リンカー」を提供する目的で、ポリペプチドのいずれかの末端に追加の残基を付加してもよい。本発明のポリペプチドと共に使用することができる標識、固体マトリックス及び担体については以下に記載する。アミノ酸残基リンカーは、通常、少なくとも１つの残基であり、４０以上の残基であることもでき、たいてい１〜１０残基である。しかし、α_vβ₃リガンドエピトープは形成しない。結合(linking)に使用する典型的なアミノ酸残基は、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸等である。更に、特に述べない限り、主題のポリペプチドは、末端ＮＨ₂アシル化、例えばアセチル化若しくはチオグリコール酸アミド化又は末端カルボキシルアミド化、例えばアンモニア、メチルアミン等を用いた末端修飾により修飾された配列によって、 α_vβ₃リガンドの天然配列とは区別される。末端修飾は、プロテイナーゼ消化の感受性を減少させ、それゆえ、溶液、特にプロテアーゼが存在している生物学的液体においてポリペプチドの半減期の延長に役立つことに有用であることは周知である。この点に関して、ポリペプチド環化も有用な末端修飾であり、環化により形成される安定な構造のため及び本明細書に記載されるそのような環状ペプチドについて見られる生物活性の点から特に好ましい。あらゆる本発明のペプチドを、薬学的に許容しうる塩の形態で使用することができるだろう。本発明のペプチドと塩を形成することができる適切な酸には、無機酸、例えばトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)、塩酸(ＨＣｌ)、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、ホスホリック酢酸(pho sphoric acetic acid)、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、ケイ皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸等が含まれる。ＨＣｌ及びＴＦＡ塩が特に好ましい。本発明のペプチドと塩を形成することができる適切な塩基には、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等；有機塩基、例えばモノ−、ジ−、トリ−アルキル及びアリールアミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン等）並びに適宜置換されたエタノールアミン（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン等）が含まれる。更に、本発明のペプチドは、アミノ酸残基（例えば、Arg、Asp等）側基に存在する荷電した酸性又は塩基住基が互いに結合し、中和して、「内部塩」化合物を形成する遊離のイオン塩を含むことなしに、実施例に記載されるようにして製造することができる。本明細書において主題のポリペプチドと記載されることもある本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ技術を含むポリペプチド分野における当業者に既知のあらゆる技術により合成することができる。合成化学技術、例えば固相メリフィールド型合成は、精製、抗原特異性、好ましくない副産物、生成の容易さ等の理由で好ましい。利用することができる多数の技術の優れた要約は、固相ペプチド合成についてはSteward et al.,“Solid Phase Peptide S ynthesis”,W.H.Freeman Co.,San Francisco，1969;Bodanszky et al.,“Peptid e Synthesis”,John Wiley & Sons,Second Edition,1976;J.Meienhofer,“Hormo nal Proteins and Peptides”,Vol.2,p.46,Academic Press(New York),1983;Mer rifield,Adv.Enzymol.,32:221-96,1969;Fields et al.,Int.J.Peptide Protein Res.,35:161-214,1990及び米国特許第４，２４４，９４６号明細書に、古典的溶液合成についてはSchroder et al.，“The Peptides”，Vol．1，Academic Pres s(New York)，1965に見出すことができる。これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。そのような合成に使用することができる適切な保護基は、前記のテキスト及びJ.F.W.McOmie,“Trotective Groups in Organic Chemis try”,Plenum Press,New York,1973に記載されており、この文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。一般的に、固相合成法は、１以上のアミノ酸残基又は適切に保護されたアミノ酸残基を成長するペプチド鎖に連続的に付加することからなることを企図している。通常、第一アミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基のいずれかを、適切な、選択的に除去することができる保護基により保護する。異なる、選択的に除去することができる保護基を、反応性側基、例えばリジンを含むアミノ酸に利用する。例として、固相合成を利用して、保護された又は誘導体化したアミノ酸を、朱保護のカルボキシル基又はアミノ基を経て不活性固体担体に結合する。次いで、アミノ基又はカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、適切に保護されたコンプライメンタリー（complimentary）(アミノ又はカルボキシル)基を有する配列中の次のアミノ酸を混合し、固体担体にすでに結合している残基とアミド結合を形成するのに適切な条件下で反応させる。新たに付加したアミノ酸残基からアミノ基又はカルボキシル基の保護基を除去し、次ぎのアミノ酸（適切に保護されている）を付加する。以下同様。全ての所望アミノ酸を適切な配列で結合した後、あらゆる残りの末端及び側基の保護基（及び固体担体）を、連続的又は同時にに除去し、最終の直鎖状ポリペプチドを得る。例として前記で製造した直鎖状ポリペプチドを反応させて、対応する環状ペプチドを形成してもよい。環状ペプチドの例示的製造法は、Zimmer et al.,Peptid es 1992,pp.393-394,ESCOM Science Publishers,B.V.,1993に記載されている。通常、ｔ−ブトキシカルボニル保護ペプチドメチルエステルをメタノールに溶解し、水酸化ナトリウム溶液を添加し、混合物を20℃で反応させ、メチルエステル保護基を加水分解により除去する。溶媒を蒸発させた後、ｔ−ブトキシカルボニル保護ペプチドを酢酸エステルを用いて酸性化水性溶媒から抽出する。次いで、ｔ−ブトキシカルボニル保護基を、ジオキサン補助溶媒中、穏やかな酸性条件下で除去する。得られた遊離のアミノ末端及びカルボキシル末端を有する未保護の直鎖状ペプチドを希釈溶液で、ジクロロメタン及びジメチルホルムアミドの混合物中、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＮ−メチルモルフォリンの存在下、ジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させることにより対応の環状ペプチドに変換する。次いで得られた環状ペプチドをクロマトグラフィーにより精製する。環状ペプチド合成の代替の方法は、Gurrath et al.，Eur．J．Biochem.，210: 911-921(1992)及び実施例に記載されている。更に、α_vβ₃アンタゴニストは、融合タンパク質の形態で提供することができる。融合タンパク質は、本明細書に記載される組換えＤＮＡ法により生産されるタンパク質で、主題となるポリペプチドが、第二のキャリヤータンパク質、例えばグルタチオンスルフヒドリルトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はその他の周知のキャリヤーに融合して発現する。好ましい融合タンパク質は、本明細書に記載される、ＭＭＰ−２ポリペプチドを含んでいる。ＭＭＰ−２融合タンパク質の製造は実施例に記載される。本発明の方法における使用に特に好ましいペプチド及び誘導ペプチドは、c-（ GrGDFV）(配列番号４)、c-（RGDfV）(配列番号５)、ｃ−（RADfV）(配列番号６) 、c-（RGDFv）(配列番号７)、c-（RGDf-NMeV）(配列番号１５)及び直鎖状ペプチド YTAECKPQVTRGDVF（配列番号８）(ここで、「c-」は環状ペプチドを示し、大文字はＬ−アミノ酸の単一一文字コードであり、小文字はＤ−アミノ酸の単一一文字コードである)である。これらのペプチドのアミノ酸残基配列は、それぞれ、配列番号４、５、６、７、１５及び８に示されている。更に、本明細書に記載されるＭＭＰ−２に由来するポリペプチドが好ましく、配列番号１７〜２８及び４５に示される配列を有している。２．モノクローナル抗体本発明は、ひとつの態様において、本明細書に記載される、α_vβ₃と免疫反応し、α_vβ₃の天然リガンドへの結合を阻害するモノクローナル形態のα_vβ₃アンタゴニストについて記載する。更に本発明は、抗体を産生する細胞系、細胞系の生産方法及びモノクローナル抗体の製造方法についても記載する。本発明のモノクローナル抗体は、１）単離したα_vβ₃と免疫反応し、２）フィブリノゲンのα_vβ₃への結合を阻害する抗体分子を含んでいる。α_vβ₃と優占的に結合する好ましいモノクローナル抗体には、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ９５３７により分泌されるｍＡｂＬＭ６０９の免疫反応特性を有しているモノクローナル抗体が含まれる。ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ９５３７は、ブダペスト条約の要求にしたがい、American Type Cultuve Collection（ＡＴＣＣ）(Parklawn Drive，Rockville，MD，USA,1987年９月15日)に寄託されている。種々の文法学的形態にある「抗体又は抗体分子」という用語は、本明細書においては、免疫グロブリン分子集団及び／又は免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗体結合部位又はパラトープを含んでいる分子を意味する集合名詞として使用される。「抗体結合部位」とは、抗原と特異的に結合する重鎖及び軽鎖の可変部及び超可変部領域からなる抗体分子の構造部分のことである。本発明における使用にための例示的な抗体は、完全免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子並びに当該技術分野においてＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）₂及びＦ（ｖ）として知られ、抗体断片と呼ばれる部分を含む、パラトープを含む免疫グロブリン分子である。別の好ましい態様においては、本発明は、本発明のモノクローナル抗体に由来するＦａｂ断片を含む切断された免疫グロブリン分子を企図している。Ｆｃ受容体を欠く、Ｆａｂ断片は可溶性であり、血清半減期において治療学的利点を提供し、可溶性Ｆａｂ断片使用の態様において診断的利点を提供する。可溶性Ｆａｂ断片の製造は、免疫学分野において一般的に知られており、種々の方法により達成することができる。例えば、抗体のＦａｂ及びＦ（ａｂ'）₂部分（断片）は、周知の方法により、実質的に完全な抗体を、それぞれ、パパイン及びペプシンのタンパク質分解反応に付することにより製造する。例えば、Theofilopolous及びDixonの米国特許第４，３４２，５６６号明細書を参照のこと。Ｆａｂ’抗体部分も周知であり、２つの重鎖部分を結合しているジスルフィド結合をメルカプトエタノールを用いて還元し、得られたタンパク質メルカプタンを例えばヨードアセトアミド等の試薬を用いてアルキル化することにより生成する。完全な免疫グロブリン分子を含む交代が好ましく、本明細書において実例として利用される。種々の文法的形態にある「モノクローナル抗体」は、特定のエピトープと免疫反応することができる抗体結合部位のわずか１種を含む抗体分子集団を意味する。したがって、通常、モノクローナル抗体には、モノクローナル抗体が免疫反応するいずれかのエピトープに対して単一の結合親和性を示す。それゆえ、モノクローナル抗体は、複数の抗体結合部位（すなわち夫々の部位は異なるエピトープに対して免疫特異的である）を有する抗体分子、例えば二特異性モノクローナル抗体が含まれる。通常、モノクローナル抗体は、わずか１種類の抗体分子を分泌（産生）する、ハイブリドーマと呼ばれる単一細胞のクローンにより産生される抗体を含んでいる。ハイブリドーマ細胞は、抗体産生細胞とミエローマ又はその他の自己不滅（ self-perpetuating）細胞系とを融合することにより形成する。そのような抗体の製造については、Kohler及びMilstein，Nature 256:495-497(1975)に最初に記載され、この記載は参照することにより本明細書に組み込まれる。更なる方法は、Zola，Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques，CRC Press，Inc .(1987)に記載される。そのようにして製造したハイブリドーマ上清を、α_vβ₃ と免疫反応する抗体分子の存在及びα_vβ₃の天然リガンドへの結合の阻害についてスクリーニングすることができる。要約すると、モノクローナル抗体組成物を産生するハイブリドーマを作成するために、ミエローマ又はその他の自己不滅細胞系を、α_vβ₃の源、例えば、Cher esh et al.，J．Biol．Chem.，262:17703-17711(1987)に記載される、Ｍ２１ヒト黒色腫細胞から単離したα_vβ₃で過剰免疫した哺乳類の脾臓から得たリンパ球と融合する。ハイブリドーマ作成に使用するミーエローマ細胞系は、リンパ球と同一種に由来することが好ましい。通常、株１２９ＧｌＸ⁺のマウスが好ましい哺乳類である。本発明におけるし様に適切なマウスミエローマには、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン感受性（ＨＡＴ）細胞系Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３及びＳｐ２／０−Ａｇ１４（それぞれ、ＣＲＬ１５８０及びＣＲＬ１１５８１の名のもと、American Type Culture Collection（Parklawn Drive，Rockville，MD ）より入手することができる）が含まれる。通常、脾細胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００を使用してミエローマ細胞と融合する。融合したハイブリッドは、ＨＡＴに対する感受性により選択する。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、実施例に記載される、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して同定する。本発明のモノクローナル抗体は、適切な特異性を有する抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地からなるモノクローナルハイブリドーマ培養物を開始するにより生産することができる。培養物を、条件下、ハイブリドーマが抗体分子を培地中へ分泌するのに十分な時間期間維持する。次いで、抗体含有培地を集める。抗体分子は、周知の技術により更に単離することができる。これらの組成物の製造に有用な培地は、当該技術分野において周知であり、行行的に入手可能であり、合成培養培地、近交系マウス等が含まれる。例示的な合成培地は、４．５ｇ／ｍｌグルコース、２０ｍＭグルタミン及び２０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ；Dulbecco et al.，Virol． 8:396，1959）である。例示的な近交系マウス株は、Ｂａｌｂ／ｃである。モノクローナル抗体、ハイブリドーマ細胞又はハイブリドーマ細胞培養を生産するその他の方法も周知である。例えば、免疫学的レパートリーからのモノクローナル抗体の単離法は、Sastry et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:5728 -5732(1989)及びHuse et al.，Science，246:1275-1281(1989)に記載されている。ハイブリドーマ細胞及び本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含む培養物も、本発明に企図される。特に好ましいのは、ＡＴＣＣＨＢ９５３７と命名されるモノクローナル抗体ｍＡｂＬＭ６０９を分泌するハイブリドーマ細胞系である。ｍＡｂＬＭ６０９は、Cheresh et al.，J．Biol ．Chem.，262:17703-17711(1987)に記載されるようにして製造し、その製造は実施例にも記載される。本発明は、１つの態様において、ｍＡｂＬＭ６０９の免疫反応特性を有するモノクローナル抗体を企図する。モノクローナル抗体が、本発明のモノクローナル抗体と同一(すなわち、等価) の特異性（免疫反応特性）を有するかどうかについては、後者の予定の標的分子への結合を前者が阻害するかどうかを確認することにより過度の実験なしに測定することができる。標的分子が固相に存在するときの標的分子への結合についての標準競合アッセイにおいて、本発明のモノクローナル抗体による結合の減少により示されるように、試験するモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合する場合、２つのモノクローナル抗体はおそらく同一又は近縁なエピドープに結合するだろう。モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかについて測定する更に別の方法では、本発明のモノクローナル抗体とモノクローナル抗体と標準的に反応する標的分子とを予めインキュベートし、次いで試験するモノクローナル抗体を添加して、試験するモノクローナル抗体が、標的分子に結合する能力において阻害されるか否かを測定する。試験するモノクローナル抗体が阻害される場合、おそらく、本発明のモノクローナル抗体と同一又は機能的に等価のエピトープ特異性を有する。モノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを測定する更なる方法では、問題となる抗体のＣＤＲ領域のアミノ酸残基配列を決定することである。ＣＤＲ領域において同一又は機能的に等価のアミノ酸残基配列を有する抗体分子は、同一の結合特異性を有する。ペプチドの配列決定法は当該技術分野において周知である。抗体の免疫特異性、標的分子結合能力及び抗体がエピトープに対して示す付随の親和性（attendant affinity）は、抗体が免疫反応するエピトープにより定義される。エピトープ特異性は、免疫グロブリン抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸残基配列により少なくとも部部的に定義され、軽鎖可変領域のアミノ酸残基配列により部分的に定義される。「結合特異性を有する」という用語の使用は、同等のモノクローナル抗体が同一又は類似の免疫反応（結合）特性を示し、予定の標的分子への結合ついて競合することを示している。ヒト化モノクローナル抗体は、特にヒトにおいて治療学的に使用することができる限り、マウスモノクローナル抗体に対して特別の利点を提供する。詳細には、ヒト抗体は、「外来」抗原と同様に急速に循環から除去されず、外来抗原及び外来抗体と同様の方法で免疫系において活性化しない。「ヒト化」抗体の製造方法は、通常当該技術分野において既知であり、本発明の抗体に容易に適用することができる。したがって、本発明は、１つの態様において、ヒト免疫系の成分を抗体の抗原への結合能力を実質的に妨害することなしにグラフトし導入することによりヒト化した本発明のモノクローナル抗体を企図している。３．α_vβ₃特異的模倣物本発明は、α_vβ₃アンタゴニストは本発明に使用することができ、これにはポリペプチド、抗体及び「模倣物」と名づけられるその他の分子が含まれる。模倣物はα_vβ₃機能を妨害する能力を有する。特に好ましいのは、α_vβ₃機能を特異的に妨害し、その他のインテグリンの機能は妨害しないアンタゴニストである。これに関連して、種々の試薬が、必要な生物学的活性を有している限り、本発明における使用に適していることが理解されるだろう。これらの試薬は、一般的に模倣物と呼ばれる。なぜなら、模倣物は、受容体とリガンドの機能的相互作用に関連するα_vβ₃又はα_vβ₃リガンドのいずれかの結合ドメインを「模倣」する能力を有しているからである。 α_vβ₃模倣物は、抗体又はリガンドに由来するペプチドを除く、前記特性を示すあらゆる分子のことである。合成ペプチド、ペプチドの類似体若しくは誘導体、前記結合ドメインの結合ポケットに似た形状である化合物、例えば有機模倣分子又はその他の分子であることができる。本発明の好ましい模倣物は、有機を基本とした分子であり、それゆえ有機模倣物と呼ばれる。α_vβ₃のリガンドを模倣することによりα_vβ₃アンタゴニストとして機能する特に好ましい有機模倣分子は、実施例１０に記載される化合物７、９、１０、１２、１４、１５、１６、１７及び１８である。 α_vβ₃模倣物の設計は、分子モデリング、二次元核磁気共鳴（２Ｄ−ＮＭＲ）分析、Ｘ線結晶学、ペプチド、ペプチド類似体若しくはその他の化学ポリマー又は化合物ライブラリー及びドラッグデサイン方法論を含む当該技術分野において既知のドラッグデザイン用のあらゆる種々の構造分析法により行うことができる。多種多様に異なる構造を有しかつα_vβ₃の選択的阻害能力を有するα_vβ₃アンタゴニストは、融合タンパク質(例えば、ＭＭＰ−２融合タンパク質)、小さいポリペプチド、環状ペプチド、誘導ペプチド、有機模倣分子又はモノクローナル抗体であることができることを示す、本明細書に示される広い構造的証拠を考慮すると、本発明の方法に有用な主題のα_vβ₃アンタゴニストの構造は制限されないが、本明細書において定義されるあらゆるα_vβ₃模倣物を含んでいる。Ｆ．α_vβ₃のアンタゴニストの同定方法本発明は、更に、本発明の方法にしたがう使用についての候補となるα_vβ₃アンタゴニストを同定するためのアッセイ法を記載する。これらのアッセイ法において、候補となる分子は、α_vβ₃の天然リガンドへの結合能力を阻害する能力について評価され、更に組織における血管形成阻害能力についても評価される。第一のアッセイは、天然リガンドのα_vβ₃への直接の結合の阻害を測定し、好ましい態様は実施例に記載される。通常、アッセイは、天然のリガンド、例えばフィブリノゲンの固相にあるα_vβ₃への結合の阻害の程度をＥＬＩＳＡにより測定する。このアッセイを、α_vβ₃に対する特異性を示し、かつ天然リガンドの他のインテグリンへの結合を阻害しない化合物の同定にも使用することができる。特異性アッセイは、パラレルＥＬＩＳＡアッセイにより行うことができる。パラレルＥＬＩＳＡアッセイにおいては、α_vβ₃及びその他のインテグリンを共に、別々の反応チャンバー中、同時に、天然リガンドへ結合する能力及びインテグリンの予定リガンドへの結合能力を阻害する候補となる化合物についてスクリーニングする。好ましいスクリーニングアッセイのフォーマットは実施例に記載される。第二のアッセイは、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）における血管形成を測定し、ＣＡＭアッセイと呼ばれる。ＣＡＭアッセイは他に詳細に記載されており、更に、腫瘍組織における血管形成及び新血管形成の両者を測定するために使用された。 Ausprunk et al.,Am.J.Pathol.,79:597-618(1975)及びOssonski et al.,Cancer Res.,40:2300-2309(1980)を参照のこと。ＣＡＭアッセイは、インビボでの血管形成についての十分に認識されたアッセイモデルである。なぜなら、全組織が新血管形成を起こし、実際のニワトリ胚血管はＣＡＭ又はＣＡＭ上に成長した組織へ成長するからである。本明細書において実証されるように、ＣＡＭアッセイは、新血管の成長の量及び程度に基づき新血管形成の阻害を示す。更に、ＣＡＭに移植されたあらゆる組織、例えば腫瘍組織の成長をモニターすることも容易である。最後に、このアッセイは、アッセイ系において毒性の内部標準が存在するので特に有用である。ニワトリ胚をあらゆる試験試薬に暴露し、胚の健康状態を毒性の指標とする。血管形成を測定する第三のアッセイは、インビボウサギモデルであり、ウサギ眼アッセイと呼ばれる。ウサギ眼アッセイは、他の文献に詳細に記載されており、例えばサリトマイド等の血管形成阻害剤の存在下、血管形成及び新血管形成の両者を測定するためにも使用する。D'Amato et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.， USA， 91:4082-4085(1994)を参照のこと。ウサギ眼アッセイは、インビボ血管形成についての十分に認識されたアッセイである。なぜなら、角膜の縁から角膜へ成長するウサギ血管によって例示される新血管形成過程は、天然の眼の透明な角膜を経て容易に可視化されるからである。更に、新血管形成の刺激若しくは阻害又は新血管形成の退行を時間に対して容易にモニターすることができる。最後に、ウサキをあらゆる試験試薬に暴露し、ウサギの健康状態を試験試薬の毒性の指標とする。第四のアッセイは、キメラマウス：ヒトモデルにおける血管形成を測定し、キメラマウスアッセイと呼ばれる。このアッセイは他の文献に詳細に記載されており、更に、血管形成、新血管形成及び腫瘍の退行を測定することが文献に記載されている。Yan et al.，J．Clin．Invest.，91:986-996(1993)を参照のこと。キメラマウスアッセイは、インビボ血管形成についての有用なアッセイモデルである。なぜなら、移植された皮膚片は、正常なヒト皮膚と組織学的に非常に似ており、全組織において新血管形成が起こり、実際のヒト血管は移植ヒト皮膚から移植ヒト皮膚表面上のヒト腫瘍組織へ成長するからである。ヒト移植片への新血管形成の起源は、ヒト特異的内皮細胞マーカーを用いて新血管構造を免疫組織化学的に染色することにより測定することができる。本明細書に記載されるように、キメラマウスアッセイは、新しい血管の成長の退行の量及び程度に基づき、新血管形成の退行を示す。更に、移植皮膚に移植したあらゆる組織、例えば腫瘍組織等の成長に対する影響をモニターすることも容易である。最後に、このアッセイは有用である。なぜなら、アッセイ系に毒性に対する内部標準が存在するからである。キメラマウスをあらゆる試験試薬に暴露し、マウスの健康状態を毒性の指標とする。Ｇ．製品本発明は、本発明のα_vβ₃アンタゴニストを提供するためのラベルされた容器製品をも企図する。製品は、包装材料及びその中に含まれる医薬を含んでいる。製品中の医薬は、開示された指示にしたがい本明細書に記載される薬学的に許容される形態へ製剤化された、あらゆる本発明のα_vβ₃アンタゴニストである。製品は本明細書に記載される状態の処理に使用するのに十分な量の医薬を、単一又は複数の投与量で含んでいる。包装材料は、例えば血管形成の阻害により援助される状態及び本明細書に開示される類似の状態の処理のための、含まれる医薬の使用を示すラベルを含んでいる。更にラベルは、市場取引に要求される使用のための指示及び関連する情報を含むことができる。包装材料は、医薬の保存のための容器を含むことができる。本明細書で使用するとき、包装材料という用語は、ガラス、プラスチック、紙、箔等の固定された方法で医薬を保持することができる材料を意味する。したがって、包装材料は、例えばプラスチック又はガラスバイアル、積層エンベロープ等医薬を含む医薬組成物を含むために使用されるものであることができる。好ましい態様においては、包装材料は、製品の内容及び含まれる医薬の使用を記載する具体的な表現であるラベルを含んでいる。実施例本発明に関する以下に示す実施例は、例示であって、本発明を特定に限定するものとして解釈されるべきものではない。更に、当業者の範囲内にある、現在知られている又は今後開発される本発明の変形は、請求の範囲の本発明の範囲内にあると考えられる。１．合成ペプチドの製造ａ．合成手順表１に記載される直鎖状及び環状ペプチドを、標準固相合成技術、例えばMerr ifield,Adv.Enzymol,32:221-96,(1969)及びFields,G.B.and Noble,R.L.,Int.J.P eptide Protein Res.,35:161-214,(1990)に記載される技術を使用して合成した。始めに、２ｇのBOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe（配列番号１）を、６０ｍｌのメタノールに溶解し、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液１．５ｍｌを添加し混合物を形成した。次いで混合物を２０℃で３時間撹拌した。蒸発後、残渣を膵中に取り出し、希釈ＨＣｌを用いてｐＨ３に酸性化し、酢酸エチルを用いて抽出した。抽出物をＮａ₂ＳＯ₄を用いて乾燥し、再び蒸発し、得られたBOC-Gly-D-Arg-Gl y-Asp-Phe-Val-OH（配列番号２）を、ジオキサン中、２ＮＨＣｌ２０ｍｌと共に２０℃で２時間撹拌した。得られた混合物を蒸発し、H-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Ph e-Val-OH（配列番号３）を得、これをジタロロメタン１８００ｍｌ及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２００ｍｌの混合物中に溶解し、０℃に冷却した。その後、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）０．５ｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）０．３ｇ及びＮ−メチルモルホリン０．２３ｍｌを撹拌しながら連続的に添加した。得られた混合物を、０℃で更に２４時間、次いで２０℃で４８時間撹拌した。溶液を濃縮し、混合ベッドイオン交換剤で処理し、塩から遊離した。得られた樹脂をろ過により除去した後、清澄液を蒸発し、残渣をクロマトグラフィーにより精製し、シクロ（-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val）(配列番号４)を回収した。一文字コードのアミノ酸残基略語を使用して表１に記載され、ペプチド番号による指定により同定される以下に示すペプチドは同様に得た。シクロ（Arg-Gly-Asp-D- Phe-Val）(配列番号５)、シクロ（Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val）(配列番号６)、シクロ（Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val）(配列番号９)、シクロ（Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val） (配列番号７)及びシクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal)（メチル化がバリン残基アミド結合α−アミノ窒素上で起こっている）(配列番号１５)。６６２０３と命名されるペプチドは、ペプチド６２１８４と同一の配列を有するが、６２１８４がＴＦＡ塩で存在するのに対し、ＨＣｌ塩を含んでいる点で異なる。同様のことが、ペプチド６９６０１及び６２１８５並びに８５１８９及び１２１９７４についても言える。ｂ．代替の合成手順ｉ．シクロ−(Arg-Gly-Asp-Dphe-NmeVal)、ＴＦＡ塩の合成 Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-Dphe-NmeVal-Onaを、固相メリフィールド型手順を使用して、NmeVal、DPhe、Asp(OBut)、Gly及びFmoc-Arg(Mtr)を段階的方法で４−ヒドロキシメチル−フェノキシメチル−ポリスチレン樹脂（ワング型樹脂）に連続的に添加することにより合成した(ペプチド合成の慣習的なメリフィールド型法は、Houben-Weyl，1.c.，Volume 15/11，Pmges 1−806(1974)に記載されるように適用した。ポリスチレン樹脂及びアミノ酸残基前駆体は、アルドリッチ(Aldrich)、シグマ（Sigma）又はフルカケミカルカンパニー(Fluka chemical companies)より商業的に入手可能である)。アミノ酸残基の連続添加の完了後、樹脂を、ＴＦＡ／ジクロロメタンの１：１混合物を使用してペプチド鎖から取り除いた。これにより、Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NmeVal-OHを得た。次いで、Fmoc基を、ピペリジン／ＤＭＦの１：１混合物を用いて除去し、粗Arg(Mt r)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH前駆体を得、次いで慣習的な方法でＨＰＬＣにより精製した。環化のために、１５ｍｌのＤＭＦ（ジメチルホルムアミド、アルドリッチ）中のArg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH（前記で合成）８５ｍｌジクロロメタン（アルドリッチ）で希釈し、５０ｍｌのＮａＨＣＯ₃を添加した。乾燥氷／アセトン混合物中で冷却した後、４0μｌのジフェニルホスホリルアジド（アルドリツチ）を添加した。室温で１６時間放置後、溶液を濃縮した。濃縮物をゲル濾過（イソプロパノール／水＝８：２中、セファデックスＧ１０カラム）し、慣習的な方法でＨＰＬＣにより精製した。ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／Ｈ₂Ｏ（９８：２）を用いた処理により、シクロ−（Arg-Gly-Asp-Dphe-NmeVal）×ＴＦＡを得、慣習的な方法においてＨＰＬＣにより精製した。ＲＴ＝１９．５、ＦＡＢ−ＭＳ(Ｍ＋Ｈ)：５８９であった。ｉｉ．「内部塩」の合成水中にシクロ−（Arg-Gly-Asp-Dphe-NmeVal）×ＴＦＡを懸濁させ、減圧下で蒸発し、ＴＦＡを除去することにより、前記環状ペプチドからＴＦＡ塩を除去した。形成した環状ペプチドを「内部塩」と呼び、シクロ−（Arg-Gly-Asp-Dphe-N MeVal）と命名した。「内部塩」という用語が使用される。なぜなら、環状ペプチドは、互いを内部電子的に相殺し、全体として荷電していない分子を形成する２つの正反対に荷電した残基を含んでいるからである。荷電残基の１つは酸部分を含み、他方の荷電残基はアミノ部分を含んでいる。酸部分及び網の部分が互いに近傍に接近したとき、酸部分はアミノ部分により脱プロトン化され、全体として中性に荷電したカルボキシレート／アンモニウム塩種を形成する。ｉｉｉ．ＨＣｌ処理によるシクロ−（Arg-Gly-Asp-Dphe-NmeVal）×ＨＣｌの提供８０ｍｇのシクロ−(Arg-Gly-Asp-Dphe-NMeVal)を、５〜６倍の０．０１ＭＨＣｌ中に溶解し、溶解操作の後凍結乾燥した。続くＨＰＬＣによる精製により、シクロ−（Arg-Gly-Asp-Dphe-NMeVal）×ＨＣｌを得た。ＦＡＢ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝５８９であった。ｉｖ．メタンスルホン酸処理によるシクロ−（Arg-Gly-Asp-Dphe-NMeVal ）×ＭｅＳＯ₃Ｈの提供８０ｍｌのシクロ−(Arg-Gly-Asp-Dphe-NmeVal)を、５〜６倍の０.０１ＭＭｅＳＯ₃Ｈ（メタンスルホン酸）に溶解し、各溶解操作の後凍結乾燥した。続くＨＰＬＣによる精製により、シクロ−（Arg-Gly-Asp-Dphe-NMeVal）×ＭｅＳＯ₃ Ｈ（ＲＴ＝１７．８ｍ、ＦＡＳ−ＭＳ(Ｍ＋Ｈ)：５８９）を得た。環化についての代替の方法には、非環式ペプチド前駆体の側基をスルフヒドリル部分で誘導体化することを含み。これにより、標準的生理学的ｐＨ条件（ｐＨ７．５）よりもわずかに高いｐＨに暴露したとき、分子に存在する別のスルフヒドリル基とジスルフィド結合を分子内で形成する。更に、非環式ペプチド前駆体のＣ末端カルボン酸塩部分を、分子内に存在する遊離のスルフヒドリル部分と反応させて、チオエステル環化ペプチドを形成することができる。合成ペプチドを使用した実施例７に記載される血管形成阻害アッセイにおいて、ＨＣｌ中の６６２０３ペプチドは血管形成阻害においてＴＦＡ中の同一のペプチドよりもわずかに効果的であった。＊アスタリスクを用いて示されたペプチドは、ＨＣｌ中で製造され、同一の列に示されるペプチドと同一の配列を有する。アスタリスクのないペプチドはＴＦＡ中で製造されたものである。小文字はＤアミノ酸を示している。大文字はＬアミノ酸を示している。＊＊合成ペプチド用ヒトＭＭＰ−２アミノ酸残基配列は、図２２Ａ及び２２Ｂに示される対応の残基の部位により示される(ＭＭＰ−２はマトリックスメタロプロテイナーゼ酵素の一員である)。ヒトＭＭＰ−２配列は、天然のシステイン残基を用いて示されるが、融合タンパク質について述べるとき操作したシステイン残基を用いて示されない。非天然システイン残基で、天然アミノ酸残基を、指示された部位で置換して、合成ペプチド及び発現融合タンパク質の溶解性を促進し、結合部位の提示用の適切な折りたたみを保証する。＊＊＊合成ペプチド用ニワトリＭＭＰ−２アミノ酸残基配列は、図２２Ａ及び２２Ｂに示される対応の残基の部位により示される。ニワトリＭＭＰ−２配列は、天然システイン残基を用いて示されるが、前記のように、融合ペプチドについて記載するときは操作したシステイン残基を用いて示されない。２．モノクローナル抗体ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ９５３７により分泌されるモノクローナル抗体ＬＭ６０９は、標準的ハイブリドーマ法を使用して、セファロース−レンチルレクチンビーズヘ吸着させた単離α_vβ₃を用いて免疫することにより製造する。 α_vβ₃は、Ｍ２１と命名されるヒト黒色腫細胞から単離し、抗体は、Cheresh et al.,J.Biol.Chem.,262:17703-17711(1987)に記載されるようにして製造した。Ｍ２１細胞は、Dr．D．L．Morton（カリフォルニア大学ロサンゼルス校、カリフォルニア）より提供を受け、２ｍＭＬ−グルタミン、５０ｍｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン及び１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４0培養培地中で懸濁培養により増殖させた。モノクローナル抗体ＬＭ６0９は、α_vβ₃複合体と特異的な免疫反応を示したが、α_vサブユニット、β３サブユニット又はその他のインテグリンとは免疫反応を示さなかった。３．α_vβ₃発現の組織分布の特徴付けＡ．抗インテグリン受容体抗体創傷治癒の間、血管の基底膜は、フォンビルブラント因子、フィブロネクチン及びフィブリンを含む幾つかの接着タンパク質を発現する。更に、接着受容体のインテグリンファミリーの幾つかのメンバーは、培養した平滑筋細胞及び内皮細胞上に発現する。Cheresh,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，84:6471(1987);Janatetal .，J．Cell Physiol.，151:588(1992);Cheng et al.，J．Cell Physiol.，139:2 75(1989)を参照のこと。α_vβ₃、フォンビルブラント因子、フィブリノゲン（フィブリン）及びフィブロネクチンに対する細胞受容体に対する内皮細胞受容体はこれらのインテグリンに含まれる(Cheresh,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:6471(19 87))。インテグリンは、カルシウム依存性シグナル伝達経路を開始し、内皮細胞の移動を導く。それゆえ、血管細胞学において基本的な役割を果たしているらしい(Leavelsey et al.，J．Cell Biol.，121:163(1993))。血管形成の間のα_vβ₃発現を調査するために、ヒト創傷肉芽組織又は隣接する正常組織皮膚を同意した患者から得、１ｍｌリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、Ｏ．Ｔ．Ｃ．培地（ティシュー・テック(Tissue Tek)）中に埋め込んだ。埋め込んだ組織を、液体窒素中約３０〜４５秒間急速冷凍（snap froze）した。６μｍ厚の切片を凍結塊からクリオスタットミクロトーム上で切断し、β₃インテグリン（α_vβ₃又はα_IIbβ₃）又はβ₃インテグリンサブファミリーの意連れかに対して特異的な抗体を用いてイムノペルオキシダーゼ染色した。正常なヒトの皮膚及び創傷肉芽組織の染色の結果を図１Ａ〜１Ｄに示す。それぞれがβ₃及びβ₁インテグリンに対するモノクローナル抗体ＡＰ３及びＬＭ５３４を、凍結切片の免疫組織化学分析のために使用した。４つの異なるヒト供与者から得た組織に関する実験は同一の結果を与えた。顕微鏡写真は３００×の拡大率で示される。 α_vβ₃インテグリンは、肉芽組織中の血管に大量に発現したが（図１Ｂ）、同一の供与者に由来する正常皮膚の真皮及び上皮には検出されなかった（図１Ａ）。対照的に、β₁インテグリンは、正常皮膚（図１Ｃ）及び肉芽組織（図１Ｄ）両者の血管及び間質細胞に多量に発現し、Adams et al.，Cell，63:425(1991)に既に記載されているように、内皮の基底細胞にも多量に発現した。Ｂ．抗リガンド抗体を用いた免疫蛍光前記で調製したヒト正常皮膚及び肉芽組織の追加の切片を、β₃及びβ₁インテグリンに対するリガンド、フォンビルブラント因子及びラミニンそれぞれの存在について試験した。フォンビルブラント因子は、正常皮膚（図２Ａ）及び肉芽組織（図２Ｂ）の血管に局在化していたが、一方、ラミニンは、組織調製物両者の全ての血管及び上皮性基底膜に局在化していた（図２Ｃ及び２Ｄ）。Ｃ．ガン組織における抗α_vβ₃抗体の分布前期の分析に加えて、ヒト患者由来のガン組織の生検を、α_vβ₃の分布について調べた。インテグリン受容体複合体α_vβ₃に特異的なモノクローナル抗体ＬＭ６０９（実施例２において製造）を用いて染色したことを除いて、実施例１と同様にして組織を調整した。更に、代表的組織をブリンス（Bulins）固定液中で８時間固定し連続切片を切断し、Ｈ＆Ｅ染色することにより、顕微鏡組織学的分析用に組織を調製した。膀胱、大腸、乳及び肺ガン組織のイムノペルオキシダーゼ染色の結果を、それぞれ図３Ａ〜３Ｄに示す。α_vβ₃は、分析した４つのガン生検に存在する血管にのみ豊富に発現し、組織に存在するその他の細胞には全く発現しなかった。個々に示される結果は、α_vβ₃インテグリン受容体は、特定の組織型、すなわち肉芽、転移組織及び血管形成が起きているその他の組織において選択的に発現するが、新しい血管の形成が停止している正常組織には発現しないということを示している。４．細胞接着阻害及びリガンド−受容体結合アッセイにより検出した、α_vβ₃特異的合成ペプチドの同定Ａ．細胞接着の阻害本発明のアンタゴニストのインテグリン受容体特異性を測定するときには、声望接着阻害アッセイを以下に示すようにして行った。簡潔に述べると、始めに、α_vβ₃及びα_vβ₅の発現を欠くＣＳ−１ハムスター黒色腫細胞を、Filardo et al.，J．Cell．Biol.，130:441-450(1995)に記載されるようにしてβ３サブユニットを発現するプラスミドでトランスフェクトした。可能性のあるα_vβ₃アンタゴニストの特異性を、α_vβ₃発現ＣＳ−１細胞のＶＮ又はラミニンコーティングしたプレートへの結合を遮断する能力により測定した。典型的なアッセイの例のとき、ウェルを１０μｇ／ｍｌ基質を用いて一晩コーティングした。すすぎ及びＰＢＳ中の１％熱変性ＢＳＡを用いて室温下で３０分間で遮断した後、０．０００１〜１００μＭの濃度範囲のペプチド８５１８９（配列番号１５）を別々にＣＳ−１と混合し、５０，０００細胞／ウェルの細胞数でウェルに適用した。３７℃で１０〜１５分間のインキュベート後、細胞及びペプチドを含む溶液を処分した。接着細胞の数を、１％クリスタルバイオレットを用いた染色にしたがい測定した。細胞に結合したクリスタルバイオレツトを、１０％酢酸の１００μｌの添加により溶離した。細胞接着を、６００ｎｍの波長における溶離クリスタルバイオレットの光学密度を測定することにより定量化した。図２１は、α_vβ₃アンタゴニスト、個々ではペプチド８５１８９を用いた典型的なアッセイの結果を示している。ラミニンコーティング表面においてはペプチドによる阻害は検出されなかった。対照的に、投与量−反応曲線に示されるように、ビトロネクチンコーティング表面においては、１０μＭ以上ペプチド濃度で結合は完全に阻害された。同様のアッセイを、ＭＭＰ−２タンパク質の種々の領域を含む融合タンパク質を用いて行った。ＭＭＰ−２由来ポリペプチドは、α_vβ₃との結合相互作用において活性なＭＭＰ−２のＣ末端領域を含んでおり、これによりＭＭＰ−２活性化及び関連する活性を阻害することができる。これらのポリペプチドは、実施例１に記載されるようにして、ＭＭＰ−２のＣ末端ドメインに由来する配列を有する合成ポリペプチドとして、又は以下に記載されるようにして、ＭＭＰ−２のＣ末端ドメインの全部又は一部を含む融合タンパタ質として製造される。ＭＭＰ−２Ｃ末端分子は、ニワトリ及びヒト特異的配列について示される。ニワトリ由来ＭＭＰ−２Ｃ末端ドメインは、ＭＭＰ−２にアミノ酸残基４４５〜６３７を含む、ヒンジ領域と直接隣接しているヘモペキシンドメインとも呼ばれる。ニワトリＭＭＰ−２の完全ヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列は以下に示される。ニワトリの４４５〜６３７の領域に対応する、ヒトＭＭＰ −２のＣ末端ドメインは、図２２Ａ及び２２Ｂに示されるように、ヒト配列から６残基が欠けているため、アミノ酸残基４３９から始まり、６３１で終了する。本発明の方法の実施に使用する、ヒト及びニワトリ由来Ｃ末端ＭＭＰ−２合成ペプチドを表１に示す。合成ペプチドのアミノ酸残基配列は、ＧＳＴ融合構成部分を除いて組換え融合タンパク質対応物によって生成したものとは同一であった。ニワトリ及びヒトに由来するＣ末端ＭＭＰ−２融合タンパク質は以下に示すようにして製造する。ＭＭＰ−２融合タンパク質は、担体（融合）タンパク質、例えばグルタチオンスルフヒドリルトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合（共有ペプチド結合により機能的に結合）した、ＭＭＰ−２Ｃ末端ドメイン又はその部分配列を有するキメラポリペプチドである。ニワトリ及びヒトＭＭＰ−２の種々の領域を増幅するために、ニワトリ及びヒトＭＭＰ−２それぞれの既知のｃＤＮＡ配列に基づきプライマー配列を設計した。未処理のニワトリＭＭＰ−２のｃＤＮＡヌクレオチド配列の完全トップストランド（topstrand）は、プロゼラチナーゼとも呼ばれ、図２２Ａ及び２２Ｂに、２列に示される推定アミノ酸配列と共に示されている（Aimes et al.,Biochem.J .,300:729-736,1994)。図の３列及び４列は、それぞれ、推定ヒトアミノ酸配列（Collier et al.，J．Biol．Chem.，263:6579-6587(1988)）及びマウスＭＭＰ −２（Reponenetal.，J．BiolChem，267:7856-7862(1992)）を示している。同一の残基はドットにより示され、異なる残基はＩＵＰＡＣ−文字表記により示される。欠損残基はダッシュにより示される。アミノ酸残基の番号付けは、負の番号で示されるシグナルペプチドの残基と共に、プロ酵素の第一残基から始まる。それに応じてヌクレオチド配列を番号付けする。翻訳の推定の開始部位(ＡＴＧ)は、３つの前向きの矢印で示され、翻訳終止シグナル（ＴＧＡ）はアスタリスクで示される。ニワトリプロ酵素及び活性酵素のアミノ末端配列は、菱形及び１本の矢印内に含まれる。ニワトリプロゼラチナーゼヌクレオチド及びアミノ酸残基配列は、共に配列番号２９に一緒に示される。コードされたアミノ酸残基配列は配列番号３０に別に示される。ニワトリＭＭＰ−２の増幅領域を生成するための鋳型は、完全長成熟ニワトリＭＭＰ−２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ(ニューヨーク州立大学（Stoney Brook，New York）のDr．J．P．Quigleyより提供を受けた)、又は標準技術によりニワトリ漿尿膜組織の切除したサンプルから由来する全細胞ＲＮＡ鋳型から生成したｃＤＮＡのいづれかである。後者について、ｃＤＮＡは、ＮｕＬＶ逆転写酵素及び３’−末端ヌクレオチドに特異的な下流プライマー： 5'ATTGAATTCTTCTACAGTTCA 3'（配列番号３１）(５’及び３’末端は、それぞれ、公開されているニワトリＭＭＰ−２配列のヌクレオチド１９３２〜１９１２に相補的である。)を用いて得た。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡＰＣＲキット（パーキンエルマー(Perkin El mer)）用の製造者の仕様書にしたがい行った。更に、プライマーを、内部ＥｃｏＲＩ制限部位を含むように操作した。前記ｃＤＮＡプライマーのいずれかからの、多数のニワトリＭＭＰ−２Ｃ末端領域（それぞれ、カルボキシル末端の６３７番目の部位に天然システイン残基を有する）は、以下に示す多数の５’プライマーの１つと対を形成する前記３’プライマー（配列番号３１）を用いたＰＣＲにより得た。増幅した領域は、図２２Ａ及び２２Ｂに示され、配列番号30に示されるアミノ酸残基部分に対応する配列：１）２０３〜６３７、２）２７４〜６３７、３）２９２〜６３７、４）４１０〜６３７、５）４４５〜６３７を有する、以下に示すＭＭＰ−２融合タンパク質をコードしていた。前記ＭＭＰ−２融合タンパク質をコードする各ヌクレオチド領域を増幅するための上流又は５’プライマーを、ポリペプチド開始部位３’が操作された、すなわちＰＣＲ−誘導、内部ＢａｍＨＩ制限部位をコードし、ｐＧＥＸ−１λＴ又はｐＧＥＸ−３Ｘ発現ベクターのいづれかに指向性結合することを許容するように設計した。５’プライマーは、以下に示す配列、すなわち、図２２Ａ及び２２Ｂに示されるニワトリＭＭＰ−２配列の示された５’及び３’ヌクレオチド部位に対応する５’及び３’末端（アミノ酸残基部位は各プライマー部位についても示されている）：１）２０３開始部位をコードするヌクレオチド５９９〜６１９２）２７４開始部位をコードするヌクレオチド８０９〜８３０３）２９２開示部位をコードするヌクレオチド８６３〜８８３４）４１０開始部位をコードするヌタレオチド１２１７〜１２３７５）４４５開始部位をコードするヌクレオチド１３２５〜１３４５鋳型ｃＤＮＡの示されたヌクレオチド領域は、拡張高適合性ＰＣＲシステム（ Expand High Fidelity PCR System）(ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Ma nnheim))の製造者の指示にしたがい連続的に３５サイクルで増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ゲル精製し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、再精製し、ｐＧＥＸ−１λＴ又はｐＧＥＸ−３Ｘベクター(ファルマシア・バイオテック(Pharmacia Biotech)、ウプサラ、スウェーデン)（結合反応の前に同様に消化及び脱リン酸化されている）に結合した。プラスミドの選択は、増幅産物の必要な読み枠に基づいた。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＢＳＪ７２又はＢＬ２１細胞を、熱ショックにより別々の構築物を用いて形質転換した。得られたクローンを、各ＭＭＰ−２融合タンパク質コードプラスミドの取りこみについて、陽性クローンのジデオキシ配列決定の前のＰＣＲによりスクリーニングし、導入されたコード配列の完全性について証明した。更に、プラスミド取りこみの証明を、適切な大きさのＧＳＴ−ＭＭＰ−２融合タンパク質の発現により確認した。各組換えＧＳＴ−ＭＭＰ−２融合タンパク質の精製を、基本的には、ＧＳＴ遺伝子融合系（ファルマシア・バイオテック）の製造者により記載されたようにして、ＩＰＴＧ−誘導対数期培養を使用して行った。要約すると、回収した細菌を、超音波処理により溶菌し、界面活性剤と共にインキュベートし、精製し、グルタチオン結合セファロース４Ｂ（ファルマシア・バイオテック）上の組換えタンパク質を固定化した。大規模な洗浄の後、固定化融合タンパク質を、５０ｍＭＴｒｊｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、中の１０ｍＭ還元グルタチオンを用いて、アフィニティーマトリックスから別々に溶離し、ＰＢＳに対して大規模に透析し、残留グルタチオンを除去し、使用した。唯一のコードされたシステイン残基を有するニワトリＭＭＰ−２残基４４５及び６３７間の融合タンパク質を製造する先行する試みでは、不溶性産物が生じた。それゆえ、前記融合タンパク質に存在する内生末端システイン残基を含まない、Ｃ末端由来の可溶性ＭＭＰ−２融合タンパク質を生成するために、必要ならば、特定の融合タンパク質に依存して、ヌクレオチド配列を増幅ＭＭＰ−２領域に導入して、システイン残基をコードさせた。システイン残基は、ニワトリＭＭＰ −２配列の４４６及び６３７番目の部位に天然に存在している。ヒト配列においては、これらの部位は、それぞれ、４４０及び６３１に対応する。それゆえ、構築物の要求により、融合タンパク質を、興味の対象となるニワトリＭＭＰ−２配列のアミノ末端又はカルボキシル末端に操作された末端システイン残基を含むように設計して、その他の末端に天然に存在するシステインとのジスルフィド結合を提供する。したがって、オリゴヌクレオチドプライマーを、可溶性ＭＭＰ−２／ＧＳＴ融合タンパク質の発現用のニワトリＭＭＰ−２Ｃ末端領域の増幅を許容するように設計する。増幅ニワトリＭＭＰ−２Ｃ末端領域は、部位４４５〜５１８、４４５〜５５２、５１６〜６３７及び５４９〜６３７のアミノ酸残基をコードする配列を含んでいる。残基５１７を含む融合タンパク質については、天然にコードされるチロシン残基をシステインで置換し、４４６又は６３７部位のいずれかのシステイン残基とジスルフィド結合を許容する。要約すると、前記で製造した組換えＧＳＴ／ＭＭＰ−２（４１０〜６３７）融合タンパク質をコードするｐＧＥＸ−３Ｘプラスミド構築物を、拡張高適合性ＰＣＲキット（ベーリンガー・マンハイム）用の製造者プロトコルにしたがい、公開されたニワトリＭＭＰ−２配列（図２２Ａ及び２２Ｂに示される）に基づくデザインを有するオリゴヌクレオチドプライマー対を利用して使用した。１つの上流プライマーは、ｐＧＥＸ−３ＸＧＳＴベクターへ挿入するための操作された内部ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位の後ろに部位４４５におけるニワトリＭＭＰ−２タンパク質開始部位をコードするように設計され、ヌクレオチド配列（5’CTCGGATCCTCTGCAAGCACG 3’(配列番号３７)）を有している。プライマーの５’及び３’末端は、それぞれ、図面におけるニワトリＭＭＰ−２配列の部位１３２５〜１３４５に対応している。別の上流プライマーは、ｐＧＥＸ−１λＴＧＳＴベクターへ挿入するための操作された内部ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位の後ろに部位５１６におけるニワトリＭＭＰ−２タンパク質開始部位をコードし、部位５１７にシステイン残基をコードするように設計され、ヌクレオチド配列（5’GCAGGATCCGAGTGCTGGGTTTATAC 3’(配列番号３８)）を有している。プライマーの５’及び３’末端は、それそれ、ニワトリＭＭＰ−２配列の部位１５３７〜１５６２に対応している。声三の上流プライマーは、ｐＧＥＸ−１λ ＴＧＳＴベクターへ挿入するための操作された内部ＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位の後ろに部位５４９におけるニワトリＭＭＰ−２タンパク質開始部位をコードし、部位５５１にシステイン残基をコードするように設計され、ヌクレオチド配列（5’GCAGAATTCAACTGTGGCAGAAACAAG 3’(配列番号３９)）を有している。プライマーの５’及び３’末端は、それぞれ、ニワトリＭＭＰ−２配列の部位１６３９〜１６６５に対応している。これらの上流プライマーを、以下に示す下流プライマーの１つと共に別々に使用して、ニワトリＭＭＰ−２のＣ末端ドメインから前記の領域を生成する。第一の下流プライマー（アンチセンス）は、部位５１８にニワトリＭＭＰ−２タンパク質終止部位をコードし、部位５１７にシステイン残基をコードし、ＧＳＴベクターへの挿入用の内部ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ部位を含むように設計され、ヌクレオチド（5’GTAGAATTCCAGCACTCATTTCCTGC 3’(配列番号４０)）を有する。５’〜３’の方向で記載される、プライマーの５’及び３’末端は、それぞれ、ニワトリＭＭＰ−２配列の部位１５６２〜１５３７に部分的に対応する。第二の下流プライマーは、部位５５２にニワトリＭＭＰ−２タンパク質終止部位をコードし、部位５５１にシステイン残基をコードし、ＧＳＴベクターへの挿入用の内部ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ部位を含むように設計され、ヌクレオチド (5’TCTGAATTCTGCCACAGTTGAAGG 3’(配列番号４１)）を有する。５’〜３’の方向で記載される、プライマーの５’及び３’末端は、それぞれ、ニワトリＭＭＰ−２配列の部位１６６６〜１６４３に部分的に対応する。第三の下流プライマーは、部位６３７にニワトリＭＭＰ−２タンパク質終止部位をコードし、ＧＳＴベクターへの挿入用の内部ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ部位を含むように設計され、ヌクレオチド（5’ATTGAATTCTTCTACAGTTCA 3’(配列番号４２)）を有する。５’ 〜３’の方向で記載される、プライマーの５’及び３’末端は、それぞれ、ニワトリＭＭＰ−２配列の部位１９３２〜１９１２に部分的に対応する。特定の組み合わせで使用され、前記のように少なくとも１つの操作されたシステイン残基を含む融合タンパク質を生成する、前記上流及び下流プライマーにより結合したニワトリＭＭＰ−２カルボキシ末端領域は、拡張高適合住ＰＣＲキット（ベーリンガー・マンハイム）用の製造者プロトコルにしたがい、５５℃のアニーリング温度を使用して３０サイクルで別々に増幅した。得られた増幅産物を別々に精製し、必要に応じＢａｍＨＩ又はＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、再精製し、ｐＧＥＸ−３Ｘ又はｐＧＥＸ−１λＴのいずれかの適切なＧＳＴ融合タンパク質ベクターへ、上流オリゴヌクレオチドプライマーの読み枠により前記で示されるようにして結合した。増幅ＭＭＰ−２産物を結合するために、結合反応前にベクターを同様に消化し、脱リン酸化した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１細胞を、熱ショックにより、得られたＭＭＰ−２含有ベクター構築物を用いて形質転換した。得られたコロニーを、適切な融合タンパク質コードプラスミドの取りこみについて、陽性クローンのジデオキシ配列決定の前のＰＣＲ及び適切な大きさのＧＳＴ融合タンパク質の製造によりスクリーニングし、導入されたコード配列の完全性について証明した。組換えＧＳＴ融合タンパク質の精製を、基本的には、その他のＧＳＴ−ＭＭＰ−２融合タンパク質の製造用に記載されたようにして、ＩＰＴＧ−誘導対数期培養を使用して行った。種々のニワトリＭＭＰ−２たんぱく質およびその他のペプチドを用いた細胞接着阻害アッセイの結果は、ＭＭＰ−２（１〜４４５）及び対照のペプチド６９６０１を除き、完全ＭＭＰ−２、残基４４５〜６３７に由来する融合タンパク質ＣＴＭＭＰ−２（２−４）及びペプチド６６２０３（配列番号５）は、β₃発現ＣＳ−１細胞のビトロネクチンへの細胞接着は阻害したが、ラミニンへの細胞接着は阻害せず、したがって、正常α_vβ₃結合活性を妨害することによるビトロネクチン受容体（α_vβ₃）のビトロネクチンへの結合を阻害するということを示している。その他の試験したＣＴＭＭＰ−２融合タンパク質である残基２７４〜６３７由来のタンパク質７−１、残基２９２〜６３７由来の１０−１、残基２７４〜４００由来の４−３は、２−４と比較して、細胞接着に対して作用しなかった。前記ニワトリＭＭＰ−２ＧＳＴ融合タンパク質に加えて、２つのヒトＭＭＰ− ２ＧＳＴ融合タンパク質を、成熟ヒトＭＭＰ−２プロ酵素ポリペプチドのアミノ酸領域２０３〜６３１及び４３９〜６３１のアミノ酸領域を発現するように製造した。示された領域は、それそれ、ニワトリＭＭＰ−２領域の２０３〜６３７及び４４５〜６３７に対応している。ヒトＭＭＰ−２ＧＳＴ融合タンパク質は、ニワトリＭＭＰ−２ＧＳＴ融合タンパク質について前記したようにして、完全ヒトＭＭＰ−２読み枠をコードするｃＤＮＡ鋳型（国立がん研究所（ベテスダ、メリーランド）のDr．W．G．Stetler-Stevensonより提供を受けた）を利用して、ＰＣＲにより生成した。上流５’プライマー配列は、既に公開されている（Collir e et al.，J．Biol．Chem.，263:6579-6587(1988)）に基づき設計し、導入される内部ＥｃｏＲＩ制限部位をコードしており、増幅産物の適切な発現ベクターへの挿入を許容する。１つの上流プライマーは、ｐＧＥＸ−１λＴＧＳＴベクターへ挿入するための操作された内部ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ制限部位の後ろに部位２０３におけるヒトＭＭＰ−２タンパク質開始部位をコードするように設計され、ヌクレオチド配列（5’GATGAATTCTACTGCAAGTT 3’(配列番号４３)）を有している。プライマーの５’及び３’末端は、それぞれ、ヒトＭＭＰ−２読み枠配列の部位６８５〜７０４に対応している。別の上流プライマーは、ｐＧＥＸ−１λＴＧＳＴベクターへ挿入するための操作された内部ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ制限部位の後ろに部位４３９におけるヒトＭＭＰ−２タンパク質開始部位をコードするように設計され、ヌクレオチド配列（5’CACTGAATTCATCTGCAAACA3’(配列番号４４)）を有している。プライマーの５’及び３’末端は、それぞれ、ヒトＭＭＰ−２読み枠配列の部位１３９２〜１４１２に対応している。前記各プライマーは、ＭＭＰ−２読み枠に対して末端で終了し、アミノ酸残基６３１の後のタンパク質終止を命令するヒトＭＭＰ−２配列の塩基１９９８及び１９７８にそれぞれ相補的な５’及び３’末端を有する下流プライマーと共に別々に使用した。生成した増幅産物はヒトＭＭＰ−２アミノ酸残基２０３〜６３１ (配列番号４５)及び４３９〜６３１（配列番号１８）を含む融合タンパク質を発現した。得られたＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩで消化し、再精製し、結合反応前に同様に消化し、脱リン酸化したｐＧＥＸ−１λＴプラスミドへ結合した。細胞を前記のようにして形質転換した。アミノ酸残基４１０〜６３１(配列番号１７)、４３９〜５１２(配列番号１９) 、４３９〜５４６(配列番号２０)、５１０〜６３１（配列番号２１）及び５４３〜６３１（配列番号２２）を含むその他のヒトＭＭＰ−２融合タンパク質を、本発明の方法における使用のための前記記載と同様にして製造した。Ｂ．リガンド−受容体結合アッセイ前記ＭＭＰ−２融合タンパク質と共に実施例１で製造した合成ペプチドを、精製リガンド−受容体結合アッセイにおいて、α_vβ₃及びα_IIbβ₃受容体結合をアンタゴナイズする能力を測定することにより、更にスクリーニングした。これらの結合研究のための方法は、Barbas et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90: 10003-10007(1993)、Smith et al.，J．Biol．Chem.，265:11008-11013(1990)及びPfaff et al.，J．Biol．Chem．，269:20233-20238(1994)に記載されている。これらの文献は参照することにより本明細書に組み込まれる。リガンド−受容体結合アッセイにおいてアンタゴニストを同定する方法であって、受容体が固体担体に固定化されており、リガンド及びアンタゴニストが可溶性である方法が記載される。要約すると、選択した精製インテグリンを、タイターテック（Titertek）マイクロタイタープレートに、コーティング濃度５０ｎｇ／ウェルで、別々に固定化した。リガンド−受容体結合アッセイに使用する受容体の精製は、当該技術分野において既知であり、当業者に周知の方法を用いて容易に得ることができる。４ ℃ で１８時間のインキュベート後、プレート上の非特異的結合部位を、Ｔｒｉｓ− 緩衝生理食塩水中の１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンで遮断した。阻害研究のために、表１の選択したペプチドを種々の濃度で、¹²⁵Ｉ−ビトロネクチン又は¹²⁵Ｉ−フィブリノゲンのインテグリン受容体α_vβ₃及びα_IIbβ₃への結合を遮断する能力について試験した。これらのリガンドは、特定のインテグリンに対して最適の結合を示す（α_vβ₃に対するビトロネクチン、α_IIbβ₃に対するフィブリノゲン）けれども、いずれかの受容体に対するフィブリノゲンの結合を遮断するペプチドを使用した結合阻害の研究は、受容体のリガンドへの結合を最大半減阻害するのに必要なペプチドのμＭの正確な測定を許容する。放射標識したリガンドは１ｎＭの濃度で使用し、末標識の合成ペプチドと共に別々に結合に挑戦させた。３時間のインキュベート後、洗浄により遊離のリガンドを除去し、結合したリガンドをガンマ計数により検出した。表１に示される選択した環状ペプチドそ使用して受容体及び放射標識フィブリノゲンの別々に固定化したα_vβ₃及びα_IIb β₃受容体への結合を阻害させたアッセイのデータは、通常１１％末満のデータポイント間の誤差を有する高度に再現性のあるものであった。μＭのＩＣ₅₀データ（ＩＣ₅₀μＭ）は、表２に示されるように、二重のデータポイントの平均値± 標準偏差で表される。したがって、ＲＧＤ含有又はＲＧＤ誘導体化環状ペプチド、６２１８１、６２１８４、６２１８５及び６２１８７（それぞれ、１つのＤアミノ酸を有する）は、α_IIbβ₃受容体と比較して低い最大半減阻害に必要なペプチド濃度で測定したとき、フィブリノゲンのα_vβ₃受容体への結合を優先的に阻害した。対照的に、その他のＲＧＤ含有又はＲＧＤ誘導体化環状ペプチド、６２１８６、６２１７５及び６２１７９は、フィブロネクチンのα_vβ₃への結合の遮断に対して有効ではなく、α_vβ₃と比較したときフィブロネクチンのα_IIbβ₃への結合の優先的な阻害も示さなかった。これらの結果は、最近発行された文献（Pfaffetal.,J.Biol. Chem.,269:20233-20238(1994)）の環状ペプチドＲＧＤＦＶ（ＦはＤアミノ酸残基を示す）は、フィブリノゲンのα_vβ₃インテグリンへの結合を特異的に阻害するが、α_IIbβ₃又はα５β₁インテグリンへの結合は特異的に阻害しないという結果と一致する。同様の結合阻害アッセイを、ＲＧＤモチーフを有する又は有しない直鎖状ペプチドを用いて行った。ペプチドの配列は、α_v受容体サブユニットαＩＩｂ受容体サブユニット又はビトロネクチンリガンドアミノ酸残基配列に由来するものである。直鎖状ペプチドの配列、６２８８０（ＶＮ由来アミノ酸残基３５〜４９）、６２４１１（α_v由来アミノ酸残基６７６〜６８７）、６２５０３（α_v由来アミノ酸残基６５５〜６６７）及び６２５０２（αＩＩｂ由来アミノ酸残基２９６〜３０６）を表１に示す。これらのペプチドのそれぞれを、ビトロネクチン（ＶＮ）又はフィブリノゲン（ＦＧ）いずれかのα_IIbβ₃又はα_v β₃いずれかへの結合を阻害についての別々のアッセイに使用した。各実験に対する各アッセイのμＭのＩＣ₅₀データ（ＩＣ₅₀μＭ）を表３に示す。直鎖状ペプチドを用いた選択したインテグリン受容体に対するリガンド結合阻害アッセイの結果は、ペプチド６２８８０のみが、α_IIbβ₃受容体と比較して低い最大半減阻害に必要なペプチド濃度で測定したとき、ＦＧ又はＶＮのα_vβ₃受容体への最大半減結合の阻害に有効であることを示した。その他の直鎖ｚ上ペプチドは、リガンドのα_vβ₃への結合の遮断に全く有効でなかった。しかし、ペプチド６２５０２は、ＶＮのα_IIbβ₃への結合の遮断に有効であった。受容体の結合又は阻害の検出を、ＥＬＩＳＡ及びペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて行ったことを除いて前記と同様にして行ったその他のリガンド受容体結合アッセイでは、５〜５０ｎｇ／ウェル及び示した有効性の濃度のリガンドＶＮ、ＭＭＰ−２及びフィブロネクチンは、固定化α_vβ₃受容体には結合したが、コラーゲンには結合を示さなかった。更に、ＭＭＰ−２又はＶＮの固定化α_vβ₃への結合を阻害するペプチドの能力を、ペプチド６９６０１（配列番号６）及び６６２０３（配列番号５）についても評価した。ペプチド６６２０３のみが、いずれかの基質のα_vβ₃への結合の阻害に有効であった。しかし、対照のペプチド６９６０１は、いずれかのリガンドについても効果を有しなかった。ＭＭＰ−２のインテグリン受容体への結合の特異性を、固相受容体結合アッセイで確認した。このアッセイでは、ヨウ素標識ＭＭＰ−２がα_vβ₃への結合を示したが、固相に固定化したα_IIbβ₃への結合は示さなかった(３００結合ＣＰＭ対約１０結合ＣＰＭ)。ＭＭＰ−２のα_vβ₃への特異的結合を阻害するＭＭＰ− ２由来ペプチド又は融合タンパク質の能力を、比較アッセイにおいて実証した。結果を図２３に示す。前記の通り製造したＧＳＴ−ＣＴＭＭＰ−２（４４５−６３７）(ＣＴＭＭＰ−２（２−４）と呼ばれることもある)融合タンパク質、標識ＧＳＴ−ＭＡＩＤは、ヨウ素化ＭＭＰ−２のα_vβ₃への結合を阻害したが、ＧＳＴ単独では、阻害剤が全く存在しないウェル（標識ＮＴ）と比較可能な程、結合ＣＰＭのレベルに作用しなかった。ＣＴＭＭＰ−２（２７４−６３７）と呼ばれるＭＭＰ−２融合タンパク質、ＣＴＭＭＰ−２（１０−２）と呼ばれるＭＭＰ− ２融合タンパク質は、標識ＭＭＰ−２のα_vβ₃への結合を阻害しなかった。受容体のＭＭＰ−２由来アンタゴニストとの相互作用の特異性を、固相結合アッセイにおける結合及び阻害を用いて確認した。図２４においては［１２５Ｉ］ＧＳＴ２−４として標識されているＣＴＭＭＰ−２（２−４）は、α_vβ₃には結合したが、α_IIbβ₃には結合しなかった。一方、図２４においては［１２５Ｉ］ＧＳＴ１０−１として標識されているＣＴＭＭＰ−２（１０−１）は、インビトロ固相アッセイにおいてはいずれの受容体とも結合しなかった。更に、標識ＧＳＴ２−４の結合は、未標識ＧＳＴ２−４と競合した。したがって、本明細書に記載するリガンド−受容体アッセイは、本発明の実施においてビトロネクチン受容体（α_vβ₃）アンタゴニストを使用するとき、特定のインテグリン受容体、特にα_vβ₃に対して選択的特異性を示す環状及び直鎖状合成ペプチドについてのスクリーニングに称することができる。５．未処理ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）の特徴付けＡ．ＣＡＭの調製正常胚血管形成により成熟血管の形成が起こった後、ニワトリ漿尿膜(ＣＡＭ) において血管形成を誘導することができる。Leibovich et al.，Nature，329:63 0(1987)及びAusprunk et al.，Am．J．Pathol.，79:597(1975)に記載されるように、血管形成は、特定のサイトカイン又は腫瘍断片に反応して誘導されることが示されている。ＣＡＭをニワトリ胚から調製し、実施例６及び７に記載される血管形成の誘導及び阻害に使用した。１０日齢のニワトリ胚を、マッキンタイア（ McIntyre）養鶏（レークサイド、カリフォルニア）より入手し、６０％の湿度、３７℃でインキュベートした。スモールクラフトドリル（ドレメル、エマーソン・エレクトロニック（Emerson Electric Co.）の一部門、ラシーン、ウィスコンシン）を使用して、気嚢に対して直接、卵の縁に殻を通して小孔を作成した。卵をキャンドリング（candling）することによりあらかじめ測定した胚血管を欠く領域で、卵の広い側に、第二の孔をドリルで作成した。最初の孔に負圧を適用し、殻膜からＣＡＭ（漿尿膜）を引張り、ＣＡＭに対して仮性気嚢（falseair sac ）を作成した。スモールモデル研削砥石（ドレメル）を使用して、垂らした（dropped）ＣＡＭに殻を通して１ｃｍ×１ｃｍ平方の窓を切断した。小窓は、内在するＣＡＭの直接のアクセスを許容した。えられたＣＡＭ調製物を、活性な新血管形成により特徴付けられる段階である胚形成６日目（胚の新血管形成に対する影響を評価するために使用するモデルを反映するＣＡＭに対しては更なる処理なし）に、又は血管形成が沈静する胚形成１０日目のいずれかの時点で使用した。後者の調製物は、本発明においては、実施例６に記載されるように、サイトカイン処理又は腫瘍との接触に対する再生新血管形成を誘導するために使用した。Ｂ．ＣＡＭの組織学ニワトリ胚ＣＡＭ及び／又は実施例８に記載されるようにニワトリ胚から切除したヒト腫瘍の顕微鏡構造を分析するために、実施例３Ａに記載されるようにして、ＣＡＭ及び腫瘍を凍結切片に調製した。６μｍ厚の切片を、免疫蛍光分析用に、クリオスタットミクロトーム上で凍結塊から切断した。図４は、未処理１０日齢ＣＡＭにおける血管を欠く領域の典型的な顕微鏡写真を示している。ＣＡＭ系における血管形成は、胚形成のこの段階では沈静しているので、この系は、本発明において、既存の血管から現時点であらゆる血管を欠くＣＡＭ領域への新血管の形成を刺激するために有用である。Ｃ．免疫蛍光により検出した、ＣＡＭにおけるインテグリンプロフィールＣＡＭ組織に存在するインテグリン受容体の組織分布をみるために、腫瘍組織及びニワトリ胚ＣＡＭ組織の６μｍ凍結切片を、アセトン中３０秒間かけて固定し、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂＣＳＡＴ(β₁インテグリンサブユニットに特異的なモノクローナル抗体。Buck et al.，J．Cell Biol.，107:2351(1988)に記載。対照として使用)又は実施例２で製造したＬＭ６０９を用いて免疫蛍光染色した。一次免疫に続き、１：２５０に希釈したヤギ抗マウスローダミン標識二次抗体 (タゴ(Tago))で染色し、一次免疫反応産物を検出した。次いで、切片を、ツァイス（Zeiss）免疫蛍光化合物顕微鏡を用いて分析した。免疫蛍光分析の結果は、未処理１０日齢ニワトリ胚に存在する成熟血管はインテグリンβ₁サブユニットを発現したことを示している(図５Ａ)。対照的に、図５Ａに示される組織の連続組織切片においては、ＬＭ６０９との免疫反応は現れなかった(図５Ｂ)。したがって、ＬＭ６０９抗体により検出されるインテグリン α_vβ₃は、１０日齢未処理ニワトリ胚に存在する成熟血管によっては活性に発現されなかった。ＣＡＭモデル及び以下に示す実施例に示されるように、正常胚形成において血管が新たな成長しているか又はサイトカイン又は腫瘍により血管ガ誘導されている間、血管はα_vβ₃を発現している。しかしながら、活性な新血管形成に続いて、血管は発達を停止し、α_vβ₃の発現は、免疫蛍光分析によって検出不可能なレベルまで減少する。成熟血管における発現の欠如とは対照的に、血管形成している血管におけるα_vβ₃発現の調節は、ＣＡＭ血管形成アッセイ系を使用した以下に示す実施例に示されるように、本発明に、血管形成の制御及び阻害する能力を提供する。その他のプロフィールにおいては、１０日齢ＣＡＭモデルにおけるｂＦＧＦ誘導３日後に、メタロプロテイナーゼＭＭＰ−２及びα_vβ₃が血管形成している内皮細胞上に共存していた。更に、ＭＭＰ−２は、インビボでの血管形成性Ｍ２１ −Ｌ腫瘍関連血管（実施例１１に記載されるように、Ｍ２１−Ｌヒト黒色腫細胞を、ＳＣＩＤマウス上で成長するヒト皮膚移植片の真皮へ注射することにより得られた腫瘍）上でα_vβ₃と共存していた。しかし、血管に関連する先在非腫瘍には共存していなかった。ＭＭＰ−２及びα_vβ₃の選択的関連性についての類似の結果が、ＣＡＭモデルにおけるα_vβ₃を有するＣＳ−１黒色腫において得られたが、α_vβ₃を欠くＣＳ−１細胞については得られなかった。６．ＣＡＭ血管形成アッセイＡ．増殖因子により誘導される血管形成実施例５Ａに示されるように、血管形成は、サイトカイン又は増殖因子により誘導されることが示された。本明細書に記載する実験においては、実施例５に記載されるＣＡＭ調製物における血管形成を、増殖因子により誘導した。本明細書に記載されるように、増殖因子は局所的にＣＡＭ血管へ適用した。ハンクス液（ＨＢＳＳ、ギブコ(GIBCO)、グランドアイランド、ニューヨーク）又は１５０ｎｇ／ｍｌ組替え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）(ジェンザイム(Genzyme)、ケンブリッジ、マサチューセッツ)を含むＨＢＳＳで飽和した５ｍｍ×５ｍｍワットマン（Whatman）フィルターディスク（ワットマンろ紙Ｎｏ．１）を、１０日齢ニワトリ胚のＣＡＭＭ菅を欠く領域及び窓に置き、後者はテープでシールした。その他のアッセイにおいては、１２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦも血管成長の誘導に効果的であった。血管形成阻害をアンタゴニストの静脈内注射を用いて上昇させるアッセイについて、血管形成は、線維芽細胞増殖培地中の１〜２μｇ／ｍｌのｂＦＧＦを用いて始めに誘導した。血管形成を、７２時間後の顕微鏡写真でモニターした。ＣＡＭを急速冷凍し、６μｍクリオスタット切片を、アセトンを用いて固定し、実施例５Ｃに記載されるようにして、１０μｇ／ｍｌの抗β₁モノクローナル抗体ＣＳＡＴ又はＬＭ６０９を用いて免疫蛍光により染色した。図５Ｃの免疫蛍光顕微鏡写真は、ニワトリＣＡＭにおけるｂＦＧＦ誘導血管形成の間のα_vβ₃の増強された発現を示している。対照的に、図５Ｂに示されるように、未処理ニワトリＣＡＭにおいてはα_vβ₃の発現は存在しなかった。α_vβ₃ は、ｂＦＧＦ処理ＣＡＭの血管の多く（７５〜８０％）において容易に検出可能であった。更に、インテグリンβ₁の発現は、未処理ＣＡＭにおいてみられるものと変化はなかった。β₁も刺激化血管において容易に検出可能であった。ｂＦＧＦ誘導血管形成中のα_vβ₃及びβ₃インテグリンの相対的発現を、ＣＡＭクリオスタット切片のレーザー共焦点イメージにより定量化した。染色した切片を、ツァイスレーザー共焦点顕微鏡を用いて分析した。ＬＭ６０９を用いて染色した２５の血管及びＣＳＡＴを用いて染色した１５の血管（表中の大きさ：〜１２００平方ｍｍ²、３５０〜３５００ｍｍ²の範囲）を、ランダムフィールド（ random field）から選択し、レーザー共焦点イメージ分析により、１領域あたりの各血管についての平均ローダミン蛍光を任意の単位で測定した。データは、血管の任意の単位における平均蛍光強度±標準誤差（ＳＥ）で表した。図６にプロットした結果は、ウィルコクソン順位和検定（Ｐ＜０．０００１）により測定したとき、ｂＦＧＦで処理したＣＡＭにおいて有意に増強した（４倍以上）ことを示している。一方、β₁染色は、ｂＦＧＦ処理と有意な差異はなかった。更にＣＡＭアッセイを使用して、β₁及びβ₃インテグリンの発現に対する別の可能性のある血管形成誘導剤である腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の効果について調べた。ｂＦＧＦ又はＴＮＦαのいづれかで含浸したフィルターディスクを１０日齢のＣＡＭに置いたところ、７２時間後に局所的な血管形成の促進が見出された。結果を、未処理(図７Ａ)、ｂＦＧＦ処理（図７Ｂ）又はＴＮＦα処理（図７Ｃ）の顕微鏡写真に示す。ｂＦＧＦ及びＴＮＦα処理調製物においては、血管形成が容易に明らかになったが、未処理ＣＡＭにおいては存在しなかった。したがって、増殖因子／サイトカインの局所適用は、隣接領域の成熟血管から元は血管を欠いていた領域への血管形成の誘導を引き起こした。図５Ｃに示されるように、ｂＦＧＦにより誘導された血管及びα_vβ₃同時発現の観点において、ＴＮＦα処理は比較できる活性を生じた。これらの知見は、ヒト及びニワトリの、血管形成に関連する血管は、α_vβ₃の増加した発現を示すことを示している。これと一致して、内皮細胞におけるα_v β₃の発現は、種々のサイトカインによりインビトロで誘導することができる(Ja natetal.,J．Cell Physiol.,151:588(1992)、Enenstein et al.,Exp.Cell Res., 203:499(1992)及びSwerlicketal.，J．Invest．Derm.，99:715(1993))。抗体及びペプチド阻害剤による増殖因子誘導血管形成への効果は、実施例７Ａ及び７Ｂに示される。Ｂ．胚血管形成胚新血管構造の天然の形成に対する血管形成阻害剤の効果を評価するためのＣＡＭ調製物は、前記したように、６日齢の胚性ニワトリ胚であった。発達のこの段階において、血管は新規に成長し、それゆえ、α_vβ₃が胚の血管形成に関与するかどうかを測定するための有用な系を提供する。ＣＡＭ系は、アッセイを１０日齢よりもむしろ６日齢の胚で行ったことを除いて、前記と同様に調製した。本発明の抗体及びペプチドを用いた処理による胚の血管形成に対する効果は、実施例７Ｃに示される。Ｃ．腫瘍により誘導される血管形成腫瘍誘導血管形成におけるα_vβ₃の役割を調べるために、種々のα_vβ₃陰性ヒト黒色腫及び悪性腫瘍断片を、１７日齢ニワトリ胚のＣＡＭで予め成長し単離したＣＡＭアッセイにおいて使用した(Brooks et al.，J．Cell Biol.，122:1351( 1993)及び本明細書)。断片は、緩衝液単独の存在下において、大規模な新血管形成を誘導した。ＣＡＭへの腫瘍断片の直接の付加により、ＣＡＭアッセイ系に血管形成を誘導した。ニワトリ胚ＣＡＭの調製は、前記手順と同一であった。フィルターディスクの代わりに、５０〜５５ｍｇの、ヒト黒色腫Ｍ２１−Ｌ、ヒト肺ガンＵＣＬＡＰ−３、ヒト膵ガン細胞系ＦＧ（Cheresh et al.，Cell 58:945-953，1989）又はヒト咽頭ガン細胞系ＨＥｐ３（これらは全てα_vβ₃陰性腫瘍である）の１つの断片を、ＣＡＭの元々血管を欠く領域に置いた。Ｍ２１−Ｌヒト黒色腫細胞系、ＵＣＬＡＰ−３ヒト肺ガン細胞系、ＦＧヒト膵ガン細胞系又はＨＥｐ３ヒト咽頭ガン細胞系（これらは全てα_vβ₃陰性腫瘍である）を使用して、ニワトリ胚のＣＡＭに固形ヒト腫瘍を成長させた。始めに、８ ×１０⁶のＭ２１Ｌ、ＵＣＬＡＰ−３及びＦＢ又は５×１０⁵ＨＥｐ３細胞の単一細胞懸濁液を、総容量３０μｌの滅菌ＨＢＳＳ中ＣＡＭに適用した。窓をテープでシールし、胚を７日間インキュベートし、ヒト腫瘍病変を成長させた。７日間の終わり、すなわち１７日齢に、腫瘍をＣＡＭから切除し、周辺ＣＡＭ組織をから切除した。血管形成又は腫瘍成長のアッセイにおける使用のために、腫瘍を５０〜５５ｍｇの腫瘍断片にスライスした。腫瘍断片を、実施例６Ａに記載されるように、新しい１０日齢ニワトリ胚ＣＡＭの血管を欠く領域に置いた。ニワトリ胚ＣＡＭにおけるインビボでの腫瘍の成長を、実施例３Ａに記載されるｍＡｂＬＭ６０９を用いてα_vβ₃について染色した。腫瘍細胞の特異的染色が見られなかったことは、α_vβ₃発現が欠如していることを示した。これらのＣＡＭ腫瘍調製物を、実施例７Ｄ及び７Ｅに記載されるようにして、腫瘍誘導血管形成に対する抗体及びペプチドの効果について測定するために処理した。ＣＡＭ腫瘍調製物を、実施例８、９及び１２に記載されるようにして、腫瘍の退行並びに血管形成性血管及び血管細胞のアポトーシスに対する抗体及びペプチドの効果を測定するために処理した。７．ＣＡＭアッセイで測定される血管形成の阻害Ａ．阻害剤の局所投与による増殖因子誘導血管形成の阻害１）モノクローナル抗体を用いた処理 α_vβ₃が血管形成において活性な役割を果たすかどうかを決定するために、ｂＦＧＦ又はＴＮＦαで飽和したフィルターディスクをＣＡＭに置き、次いでモノクローナル抗体(ｍＡＢと呼ばれることもある)、ＬＭ６０９(α_vβ₃に特異的)、ＣＳＡＴ（β₁に特異的）又はＰ３Ｇ２若しくはＰ１Ｆ６（共にα_vβ₅に特異的）を調製物に添加した。１０日齢ニワトリ胚由来のＣＡＭに、ｂＦＧＦで飽和したフィルターディスクにより血管形成を誘導した。ディスクを、総容量２５μ１滅菌ＨＢＳＳ中の２５ｍｇのｍＡｂを含む５０ｍｌＨＢＳＳで、０、２４及び４８時間において処理した。７２時間時に、ＣＡＭを収穫し、３５ｍｍペトリ皿に置き、１ｍｌリン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄した。ろ紙の底部及びＣＡＭ組織を、オリンパス（Olym pus）立体顕微鏡下で、二重盲検式における二人の観察者により分析した。ＣＡＭが、ディスク下に直接のＣＡＭ血管浸潤において＞５０％減少を示したとき、血管形成は有意であるとした。実験は、１条件あたり６〜７の胚を用いて、１種の抗体あたり４回繰り返した。ｂＦＧＦ誘導血管形成に対するｍＡｂ処理の効果の結果を、図８Ａ〜８Ｂに示す。血管を欠く未処理ＣＡＭ調製物は図８Ａに示され、これは図８Ｂに示されるｂＦＧＦ血管誘導及び図８Ｃ〜８Ｅに示されるｍＡｂによる効果と比較される。ｍＡｂ図８Ｅに示されるように、ＬＭ６０９で処理したＣＡＭの約７５％が、＞５０％の血管形成阻害を示し、多くが血管浸潤を欠いていた。対照的に、緩衝液対照（図８Ａ）並びにｍＡｂＣＳＡＴ（図８Ｃ）及びＰ３Ｇ２（図８Ｄ）で処理したディスクは一致して広範囲の血管新生を示した。ＴＮＦαを用いて血管形成を誘導したとき、同一の結果が得られた。血管を欠く領域に隣接する領域への正常血管の発達から示される先在する成熟血管に対する同一の抗体の効果を調べるために、ｍＡｂで飽和したフィルターディスクを、サイトカインの局所適用を受けていない１０日齢胚由来のＣＡＭの血管新生領域に置いた。立体顕微鏡下における可視化による評価により、３種のｍＡｂは先在する血管に全く影響しなかった。したがって、ｍＡｂＬＭ６０９は、新規血管成長のみを選択的に阻害し、隣接する領域に存在する成熟血管には影響しなかった。これと同一の効果が、実施例７Ａ２）及び７Ｅ２）にそれぞれ記載されるように局所又は静脈内に適用した合成ペプチドについて見られた。２）合成ペプチドを用いた処理本発明の合成ペプチドを用いて、ＣＡＭアッセイを行い、増殖因子誘導血管形成に対する環状及び直鎖状ペプチドの効果を測定した。ペプチドは実施例１に記載されるようにして合成し、総容量２５ｍｌの滅菌ＨＢＳＳ中に８０μｇのペプチドを提供した。ペプチド溶液を直ちにＣＡＭ調製物に適用し、２４時間及び４８時間の時点に繰り返した。７２時間の時点において、ろ紙及び周囲のＣＡＭ組織を切り取り、前記のようにして観察した。このアッセイが明らかにした結果は、合成ペプチドを腫瘍誘導血管に静脈内注射した実施例７Ｅ２）に記載される、図９Ａ〜９Ｃに示される結果結果と類似していた。対照のペプチド６２１８６を用いたとき、ｂＦＧＦ誘導血管は、図９Ａに示されるように平静なままであった。対照的に、環状ＲＧＤペプチド６２８１４をフィルターに適用したとき、血管形成は阻害され、新しい血管構造を欠く領域が残った。この効果は、以下の実施例７Ｅ２）に記載される図９Ｂに示される効果と外見上類似していた。更に、静脈内投与したペプチドについて示す図９Ｃに示されるように、増殖因子飽和フィルターの位置から離れて成熟血管が既に存在する領域においては、これら範囲外血管に対する合成ペプチド局所処理の影響はなかった。したがって、血管形成に対するペプチドの阻害活性は、増殖因子により誘導される血管形成領域に限定され、隣接する先存成熟血管には影響しないか又は周辺領域に対して有害な細胞毒性を生じない。実施例１において製造し、表１に示されるその他の合成ペプチドについて、同様のアッセイを行った。３）ＭＭＰ−２ペプチド断片を用いた処理血管形成に対するＭＭＰ−２ペプチド断片の生物学的効果を実証するために、ｂＦＧＦをＨＢＳ中１．０μｇ／ｍｌの濃度で１０分間飽和したフィルターディスクを用いて血管形成を誘導したことを除いて、前記と同様にしてＣＡＭアッセイを行った。ＣＡＭの先存の血管の数が減少している領域にディスクを置いた。前記と同様に製造したＣ末端ＣＴＭＭＰ−２（４１０−６３７）融合タンパク質又は対照のＧＳＴ受容体関連融合タンパク質（ＲＡＰ）(３０μｌのＨＢＳＳ中１．５μｇ)を、１日に１回フィルターディスクに局所的に３日間適用した。インキュベーション期間の終わりに、胚を屠殺し、フィルターディスク及び内在するＣＡＭ組織を切除し、立体顕微鏡を用いて血管形成について分析した。フィルターディスクの範囲内で生じた血管の分岐点の数を計数することにより、血管形成を定量化した。分岐血管は、新しい血管形成性発芽血管に主に対応すると考えられる。定量化は、少なくとも二人の独立した観察者により、二重盲検法で行った。結果は、血管形成指数（Angiogenic Index）として表した。血管形成指数とは、フィルターディスクあたり分岐点の数（ｂＦＧＦ刺激）から分岐点の数（対照未刺激）を引いたものである。実験は、通常１条件あたり６〜１０の胚を用いた。ＣＡＭ血管形成の結果は、図２５Ａ−Ｄ、２６及び２７に示される。図２５において、一連の写真は４つに分けられる。図２５Ａ−Ｄは、ＣＴＭＭＰ−２融合タンパク質（ＣＴＭＭＰ−２(４１０−６３７)）(図２５Ｃ〜Ｄ)の存在下では血管形成が阻害されたこと、対照のＧＳＴ融合タンパク質の存在下（図２５Ａ〜Ｂ）では阻害されなかったことを示している。図２６及び２７は、ＣＴＭＭＰ−２（前記と同一のタンパク質）を用いたＣＡＭ血管形成アッセイの血管形成指数と、対照（ｂＦＧＦのみ又はＧＳＴ−ＲＡＰタンパク質）との比較を示す棒グラフである。図２７においては、ＣＴＭＭＰ−２（４１０−６３７）融合タンパク質を使用した２つの別の実験（＃１及び＃２）が示される。３つの図面に示されるこれらの結果は、ＣＴＭＭＰ−２融合タンパク質又はＭＭＰ−２のＣ末端ドメインを含むポリペプチドは、α_vβ₃阻害によるｂＦＧＦ媒介血管形成阻害用の組成物に有用であることを示している。Ｂ．阻害剤の静脈内適用による、増殖因子誘導血管形成の阻害１）モノクローナル抗体を用いた処理ＣＡＭ調製物へ静脈内注射したモノクローナル抗体を用いての増殖因子誘導血管形成に対する効果を、本発明における使用について評価した。静脈内注射用ニワトリ胚ＣＡＭの調製は、幾つかの修飾をのぞいて実施例７Ａと基本的に同じであった。キャンドリング手順の間、目立つ血管を選択し、卵殻にその位置を示すように印をつけた。殻にドリルで孔をあけ、ＣＡＭを垂らし、ｂＦＧＦ飽和ろ紙を前記と同様にＣＡＭに置いた。窓を滅菌テープでシールし、胚をインキュベーター中に置いた。２４時間後、予め決定した目立つ血管に対して直接、卵殻の側面に第二の小窓を注意深くあけた。外側の卵殻を注意深く除去し、胚膜を完全な状態で残した。数滴の鉱油（パーキンエルマー、ノーウォーク、コネティカット）を用いて卵殻膜を透明にし、これにより血管を可視化することを容易にした。精製滅菌ｍＡｂ又は合成ペプチド（後者は以下に記載する）を、総容量１００μｌの滅菌ＰＢＳ中、胚あたり２００μｇのＩｇＧの投与量を一度に、３０ゲージニードルを用いて血管に直接接種した。窓をテープでシールし、胚を７２時間までインキュベートした。フィルターディスク及び周辺ＣＡＭ組織を前記と同様にして分析した。本実施例及び以下の実施例に示される、ＬＭ６０９を用いて静脈内接種したＣＡＭ組織又は腫瘍組織におけるＬＭ６０９ｍＡｂの局在を測定するために、固定化切片を、ＨＢＳＳ中の２．５％ＢＳＡを用いて室温下で１時間遮断し、続いてヤギ抗マウスローダミン標識二次抗体（タゴ）の１：２５０希釈物を用いて染色した。切片を、ツァイス免疫蛍光化合物顕微鏡を用いて分析した。ｂＦＧＦ誘導血管ＣＡＭ調製物に対する抗体の静脈内処理の結果は図１０Ａ〜１０Ｃに示す。図１０Ａには、ｂＦＧＦ処理の結果として血管形成が誘導されたことが示されている。図１０Ｂに示されるように、ｍＡｂＰ３Ｇ２、抗α_vβ₅ 抗体に静脈内暴露したときは、ｂＦＧＦ誘導血管の存在に変化は見られなかった。対照的に、ＬＭ６０９、抗α_vβ₃抗体を用いたｂＦＧＦ誘導血管形成処理では、図１０Ｃに示されるように、フィルター領域への新しい血管の成長の完金な阻害が起こった。したがって、血管形成に対する阻害効果は、ＬＭ６０９抗α_vβ₃ 特異的抗体によるα_vβ₃受容体活性の阻害により起こる。α_vβ₅の遮断は、ＣＡＭフィルター部位への新生血管構造の形成を阻害しないので、α_vβ₃と比較して、α_vβ₅は新しい血管の成長に必須ではない。２）合成ペプチドを用いた処理前記したようにして１〜２μｇ／ｍｌのｂＦＧＦを用いて血管形成を誘導したＣＡＭ調製物に対して、合成ペプチド６９６０１（対照）及び６６２０３（配列番号５）を別々に、ｂＦＧＦ誘導血管形成１８時間後のＣＡＭ調製物へ静脈内注射した。調製物を更に３６〜４０時間維持し、その後分岐点の数を前記と同様に測定した。結果は図２８に示され、ペプチド６６２０３は、ｂＦＧＦ誘導血管形成を完全に阻害した。対照的に、対照のペプチドでは阻害は存在しなかった。その他のアッセイにおいては、ペプチド８５１８９（配列番号１５）を、１０〜３００μｇ／胚の投与量範囲で、ＣＡＭアッセイにおけるｂＦＧＦ誘導血管形成阻害について評価した。アッセイは前記と同様にして行った。結果は図２９に示され、最小の有効投与量は３０μｇであり、１００及び３００μｇではほぼ完全に血管形成を阻害した。更なるアッセイにおいては、ペプチド８５１８９とペプチド６９６０１及び６６２０３とを、抗血管形成活性について比較した。５０μｇのペプチドを用いたことを除いて、アッセイを前記と同様にして行った。図３０に示す結果は、ｂＦＧＦ処理（ｂＦＧＦと命名）及び６９６０１処理（６０１と命名）対照とと比較して、ペプチド６６２０３（２０３と命名）及び８５１８９（１８９と命名）はｂＦＧＦ媒介血管形成の有効な阻害剤であることを示している。ペプチド８５１８９の異なる塩製剤の有効性を、同様のｂＦＧＦ誘導ＣＡＭアッセイにおいて評価した。ペプチドは１００μｇ／胚で使用した。ＨＣｌ中（ペプチド８５１８９）及びＴＦＡ中（ペプチド１２１９７４）の同一のペプチド配列はｂＦＧＦ誘導血管形成を阻害した。ＨＣｌ製剤化ペプチドは、ＴＦＡよりもわずかに効率的であった(ペプチド８５１８９対１２１９７４の分岐点の数は３０対６０であった)。「サイトカインなし」と名づけた未処理ＣＡＭは、ｂＦＧＦ処理において見られる分岐点（１９０）の約半分（７０）を有していた。対照のペプチド６９６０１を用いた処理は、血管形成に対して影響しなかった(２３０の分岐点)。実施例１で製造したその他の合成ペプチドを別々に、前記と同様にして、ＣＡＭ調製物の増殖因子誘導血管へ静脈内注射した。血管の生存度に対するペプチドの効果を同様に評価した。３）ＭＭＰ−２断片を用いた処理前記手順を用いて、ＭＭＰ−２融合タンパク質、ＣＴＭＭＰ−２（２−４）( ＣＴＭＭＰ−２（４４５−４６７）とも呼ばれる)及びＣＴＭＭＰ−２（１０− １）（ＣＴＭＭＰ−２（２７４−６３７）とも呼ばれる）の効果についても評価した。５０μｇの融合タンパク質をｂＦＧＦ処理胚に投与したことを除いて、アッセイを前記と同様にして行った。２４時間、４８時間及び７２時間に、融合タンパク質処理を評価した。選ばれた時間期間について、図３１Ａ〜Ｌに結果が示される。これらの図は、未処理、ｂＦＧＦ処理、ｂＦＧＦ処理に続くＣＴＭＭＰ−２（２−４）処理(ｂＦＧＦ＋ＭＡＩＤ（ＭＡＩＤ＝ＭＭＰ−２血管形成阻害ドメイン）と命名)、ｂＦＧＦ処理に続くＣＴＭＭＰ−２（１０−１）(ｂＦＧＦ＋対照と命名)のアッセイ条件下で評価した写真である。ｂＦＧＦ処理４８及び７２時間後の血管形成の有意な誘導は、ＣＴＭＭＰ−２（２−４）への暴露によってのみ完全に阻害された。ＣＴＭＭＰ−２（２−４）を用いた阻害の程度は、ＣＴＭＭＰ−２（１０− １）を用いたときの程度（インビボでいくらかの抗血管形成活性を示した）て見られたものよりも大きかった。前記のようにして製造した、その他のＭＭＰ−２組成物、全ＭＭＰ−２、断片及び融合タンパク質を別々に、前記のようにして調製したＣＡＭ調製物の増殖因子誘導血管へ静脈内注射した。Ｃ．局所適用による胚血管形成の阻害１）モノクローナル抗体を用いた処理 α_vβ₃が胚血管形成に関与するかどうかを測定するために、ＣＡＭの血管の新規成長に対するＬＭ６０９の効果を、実施例５Ａに記載される活性な新血管形成により特徴付けられる段階である６日齢の胚で調べた。ｍＡｂで飽和したディスクを、サイトカインの非存在下、６日齢の胚のＣＡＭに置くという局所適用により、ＣＡＭアッセイを実施例６Ｃに記載されるようにして調製した。３日後、ＣＡＭを切除し、写真に撮った。１グループあたり６の胚を含む各実験を２回繰り返した。抗体ＬＭ６０９（図１１Ｃ）はこれらの条件下で血管成長を阻害したが、ＣＳＡＴ（図１１Ａ）又はＰ３Ｇ２（図１１Ｂ）は阻害しなかった。このことは、α_v β₃は、血管形成を誘導するために添加した増殖因子とは独立した胚新血管形成において実質的な役割を果たすことを示している。２）合成ペプチドを用いた処理実施例１で製造した合成ペプチドを別々に、前記及び実施例５Ａ２）に記載されるようにして調製した胚ＣＡＭ調製物へ、ＣＡＭへの局所適用又は血管系の静脈内適用により添加した。血管の生存度に対するペプチドの効果を同様に評価した。Ｄ．局所適用による、腫瘍誘導血管形成の阻害１）モノクローナル抗体を用いた処理抗α_vβ₃アンタゴニスト、ＬＭ６０９及び種々のペプチドの胚血管形成に対する効果を評価した前期の血管形成アッセイに加えて、腫瘍誘導血管形成における α_vβ₃の役割についても評価した。誘導剤として、予め増殖させ、１７日齢ニワトリ胚のＣＡＭから単離したα_vβ₃陰性ヒトＭ２１−Ｌ黒色腫断片を使用した。断片は実施例６Ｃに記載されるようにして調製した。前記実施例７Ａ１）に記載されるように、ｍＡｂは別々に、２５μｌのＨＢＳＳ中２５μｇの濃度で、腫瘍断片に局所的に適用した。次いで窓をテープでシールした。ｍＡｂを２４時間及び４８時間の時点で同様の方法で再添加した。７２時間の時点で、腫瘍及び周辺のＣＡＭ組織を、実施例７Ａ１）に記載されるようにして分析した。実施例６Ｃに記載されるように、腫瘍は、培養したＭ２１−Ｌ細胞の移植に最初に由来しており、１０日齢のニワトリ胚にはインテグリンα_vβ₃は発現していない(Felding-Habermann et al.，J．Clin．Invest.，89:2018(1992))。これらのα_vβ₃陰性断片は、緩衝液単独、ｍＡｂＣＳＡＴ（抗β₁）又はＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）の存在下で大規模の新血管形成を誘導した。対照的に、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）は、腫瘍塊及び周辺ＣＡＭへのほとんどの血管の浸潤を無効にした。腫瘍誘導血管形成に対するｍＡｂの効果を定量化するために、ＣＡＭの焦点面内の腫瘍に進入している血管を、立体顕微鏡下、二重盲検法における二人の観察者により計数した。図１２に示される各データは、各グループにおいて１２のＣＡＭ（二重の実験）から得た平均血管数±標準誤差を表している。この定量分析により、ウィルコクソン順位和検定により決定したとき、ｍＡｂＬＭ６０９で処理した腫瘍に進入した血管の数は、緩衝液又はその他のｍＡｂ、Ｐ３Ｇ２又はＣＳＡＴ（Ｐ＜０．０００１）で処理した腫瘍と比較して３倍減少したことが明らかになった。Ｍ２１−Ｌ腫瘍がα_vβ₃を発現しないという事実は、ｍＡｂＬＭ６０９は、腫瘍細胞よりも血管に直接作用することにより血管形成を阻害することを示している。これらの結果は、α_vβ₃の分布が腫瘍内の血管に限定され、主要細胞自身に限定されないことを示す図３Ａ〜３Ｄに示されるガン組織生検における組織学的分布と対応する。２）合成ペプチドを用いた処理ＭＭＰ−２誘導ペプチド及び融合タンパク質を含む、実施例１で製造した合成ペプチドを、前記したようにして、腫瘍誘導血管形成ＣＡＭアッセイ系に局所的に適用した。血管の生存度に対するペプチドの効果を同様に評価した。Ｅ．静脈内投与による、腫瘍誘導血管形成の阻害１）モノクローナル抗体を用いた処理実施例７Ｅ１に記載されるようにして調製した腫瘍誘導血管を、静脈内注射によりｍＡｂで処理した。実施例７Ｄ１）に記載されるようにして、腫瘍をＣＡＭに置き、窓をテープでシールし、２４時間後、前記したように、２００μｇの精製ｍＡｂを一度に、ニワトリ胚血管に静脈内接種した。ニワトリ胚を７日間インキュベートした。血管形成の程度を前記のようにして観察した。以下に示す実施例８に記載されるように、この時間期間後、腫瘍を切除し、その重量を分析し、腫瘍の成長又は抑制に対する抗体暴露の効果を測定した。２）合成ペプチドを用いた処理ＣＡＭアッセイ系の腫瘍誘導血管に対するペプチド暴露の効果も評価した。ｍＡｂの静脈内注射の代わりに、実施例１及び実施例７Ａ２）に記載されるようにして製造した合成ペプチドを別々に可視血管へ静脈内注射したことを除いて、腫瘍−ＣＡＭ調製物を前記と同様に使用した。ＨＣｌ塩を含む環状ペプチド６６２０３、対照のペプチド６２１８６を用いたＣＡＭアッセイの結果を図９Ａ〜９Ｃに示す。図９Ａにおいて、対照のペプチドを用いた処理は、腫瘍処理により元々は血管を欠くＣＡＭ領域への成長を誘導された大量の大きな血管に作用しなかった。対照的に、環状ＲＧＤペプチド６６２０３、α_vβ₃に対するアンタゴニストをフィルターに適用したとき、図９Ｂに示されるように、血管形成は阻害され、新しい血管構造を欠く領域が残った。ＲＧＤ含有ペプチドの阻害効果は、腫瘍の位置に隣接して位置する血管に対してあらゆる有害作用がなかったことにより証明されるように、特異的であり、局在化されている。したがって、図９Ｃおいて、阻害性ペプチドをＣＡＭアッセイ系に静脈内注射したとき、腫瘍の位置から離れて隣接している領域に存在する先存成熟血管においては効果が見られなかった。この位置における先存血管は、血管内を流れる阻害性ペプチドの影響は受けなかったが、先存血管から腫瘍塊への新しい血管の生成が阻害された。したがって、実施例４におけるリガンド−受容体アッセイに示される、α_vβ₃のアンタゴニストである６６２０３及び６２１８４を含む合成ペプチドは、発達している血管に限定され、成熟先存血管に限定されない血管形成を阻害することが実証された。更に、ペプチドの静脈内注入は、図９Ｃの完全な血管構造により証拠付けられるように、周辺領域に対して有害な細胞毒性を起こさなかった。本発明のＭＭＰ−２組成物と共に実施例１で製造し、表１に示したその他のペプチドについても同様のアッセイを行った。３）ＭＭＰ−２断片を用いた処理ＣＳ−１腫瘍（β₃性）を、前記と同様にしてＣＡＭ内に調製した。腫瘍成長２４時間後、ＣＴＭＭＰ−２（２−４）と命名し、実施例４Ａに記載されるようにして製造したＭＭＰ−２断片組成物を、１００μｌのＰＢＳに５０μｇの断片の濃度で静脈内投与した。６日後、腫瘍は塊に成長した。ＣＴＭＭＰ−２（２− ４）を用いて処理した細胞は、ＣＴＭＭＰ−２（１０−１）又はＰＢＳ対照を用いて処理した対照の腫瘍の成長速度と比較したとき、約５０％に低下した。したがって、α_vβ₃アンタゴニストは腫瘍の成長を阻害した。８．ＣＡＭアッセイで測定した、α_vβ₃アンタゴニストを用いた腫瘍組織成長阻害実施例７Ｅ１）に記載されるように、増殖因子又は腫瘍誘導血管形成に対する抗α_vβ₃アンタゴニストの効果を可視的に評価することに加えて、アンタゴニストの効果を、暴露後の腫瘍塊のあらゆる変化を測定することによっても評価した。この分析のために、腫瘍誘導血管形成ＣＡＭアッセイ系を、実施例６Ｃ及び７Ｄに記載されるようにして調製した。インキュベーション期間７日の終わりに、得られた腫瘍をＣＡＭから切除し、あらゆる残留ＣＡＭ組織を除去し、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、各腫瘍について重量を測定した。更に、顕微鏡組織学的分析用の腫瘍の調製は、組織の代表例のブリンス固定液中での８時間の固定及びパラフィン中への埋め込みを含んでいた。連続切片を切断し、顕微鏡分析用にヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Glad son et al.，J．Clin．Invest.，88:1924(1991)を参照のこと。オリンパス化合物顕微鏡を用いて、２５０×で写真を撮った。Ａ．局所適用対照の緩衝液(ＨＢＳＳ)、Ｐ３Ｇ２（抗α_vβ₅）又はＬＭ６０９（抗α_vβ₃）の局所適用により得た典型的なヒト黒色腫腫瘍（Ｍ２１Ｌ）重量の結果を、表４に示す。各処理について多数の胚を、表の下側に示される平均値の標準誤差と共に計算した重量（ｍｇ）で評価した。ＣＡＭアッセイ系のα_vβ₃陰性ヒト黒色腫腫瘍塊のＬＭ６０９への暴露により、未処理平均腫瘍重量が１７２ｍｇ±２６から５２ｍｇ±１３へと減少した。Ｐ３Ｇ２抗体は腫瘍塊に対して作用しなかった。したがって、α_vβ₃特異的ＬＭ６０９抗体の局所適用によるαＶβ。受容体の遮断は、前述の実施例に示されるように、血管形成の阻害と共に腫瘍開の退行を引き起こした。Ｐ３Ｇ２への暴露により得た腫瘍塊の測定した直径は、平均で約８ｍｍ〜１ｃｍであった。対照的に、ＬＭ６０９処理腫瘍は平均直径が約２〜３ｍｍであった。これらの腫瘍の凍結切片は、Ｐ３Ｇ２に暴露した腫瘍についての完全な腫瘍細胞構造を明らかにしたが、ＬＭ６０９に暴露した腫瘍においては欠如又は組織化した細胞構造が明らかになった。それゆえ、α_vβ₃受容体活性は、α_vβ₃発現新血管構造の発達により栄養補給されるα_vβ₃陰性腫瘍がその塊を維持するのに必須である。本発明のα_vβ₃アンタゴニストを用いたα_vβ₃の遮断は、腫瘍への血管形成の阻害を起こし、最終的には腫瘍塊の縮小を引き起こす。Ｂ．静脈内適用対照の緩衝液(ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水)、ＣＳＡＴ（抗β₁）又はＬＭ６０９（抗α_vβ₃）の静脈内適用により得た典型的な悪性腫瘍（ＵＣＬＡＰ− ３）の重量の結果を表５に示す。各処理について多数の胚を、表の下側に示される平均値の標準誤差と共に計算した平均腫瘍重量で評価した。ＣＡＭアッセイ系のα_vβ₃陰性ヒト悪性腫瘍のＬＭ６０９への暴露は、未処理平均腫瘍重量の８５ｍｇ±７から３０ｍｇ±６への減少を引き起こした。ＣＳＡＴ抗体は、腫瘍塊の重量に有意に作用しなかった。したがって、α_vβ₃特異的ＬＭ６０９抗体の静脈内適用によるα_vβ₃受容体の遮断は、前記実施例に示される血管形成の阻害を伴う黒色腫腫瘍塊と同様に、悪性腫瘍の退行を引き起こした。更に、ヒト黒色腫腫瘍成長は、ＬＭ６０９の静脈内注射により同様に阻害された。９．ＣＡＭアッセイにおいて測定される、α_vβ₃アンタゴニストを用いた腫瘍組織成長の阻害腫瘍の成長及び生存に対するα_vβ₃アンタゴニストの効果を更に評価するために、ヒト黒色腫の断片並びに肺、膵臓及び咽頭の悪性腫瘍の断片を、実施例５Ａに記載されるようにして１０日齢の胚のＣＡＭに置いた。Ａ．静脈内適用１）モノクローナル抗体を用いた処理ａ．ＬＭ６０９（抗α_vβ₃）及びＣＳＡＴ（抗β₁）を用いた処理 α_vβ₃陰性ヒト黒色腫Ｍ２１−Ｌ、膵ガンＦＧ、ヒト肺ガンＵＣＬＡＰ−３又はヒト咽頭ガンＨＥｐ３の悪住腫瘍断片のＣＡＭへの埋め込み２４時間後に、ＰＢＳ単独又はｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）若しくはＣＳＡＴ（抗β₁）の単一投与量（３００ｎｇ／１００μｌ）を胚に静脈内注射した。腫瘍を更に６日間繁殖させた。インキュベーション期間の終わりに、腫瘍を注意深く切除し、周辺ＣＡＭ組織を除去した。腫瘍の切除は、二入の別の研究者により行い、用意に定義できる固形腫瘍塊のみを除去した。腫瘍は十分に定義されたマージン（margin ）を有しており、それゆえ、固形腫瘍と容易に区別することができる、薄い半透明膜（ＣＡＭ）は、腫瘍塊自身を乱すことなく除去した。切除した腫瘍を秤量し、形態学的及び組織学的に調べた。図１３に示されるように、７日終了時に腫瘍の湿重量を測定し、処理前の初期腫瘍重量と比較した。各棒は、１グループあたり５〜１０の腫瘍の平均値±標準誤差を示している。ｍＡｂＬＭ６０９は、全ての試験した腫瘍における対照と比較したとき、腫瘍成長を有意に阻害した(ｐ＜０．００１)。ＰＢＳ又はＣＳＡＴで処理した腫瘍は、全ての場合において増殖した。対照的に、ｍＡｂＬＭ６０９はこれらの腫瘍の成長を阻害しただけではなく、ほとんどの場合において大規模な退行を誘導した。重要なことに、これらの腫瘍細胞はインテグリンα_vβ₃ を発現しておらず、このことは成長の阻害は、腫瘍細胞直接よりもむしろ新血管構造に対する抗体の抗血管形成効果によるものであることを示している。ｂ．ＬＭ６０９（抗α_vβ₃）及びＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）を用いた処理ヒトＭ２１−Ｌ黒色腫腫瘍断片（５０ｍｇ）を、実施例５Ａに記載されるようにして１０日齢の胚のＣＡＭに埋め込んだ。２４時間後、ＰＢＳ単独又はｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）若しくはＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）の単一投与量を胚に静脈内注射した。腫瘍を、前記実施例９Ａ１）に記載されるようにして増殖させ、本明細書に記載されるようにして増殖させ、本明細書に記載されるようにして形態学的及び組織学的に調べた。ｍＡｂＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）又はＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処理したＭ２１ −Ｌ腫瘍の代表例を形態学的に調べた。Ｐ３Ｇ２処理腫瘍は大きく(直径８ｍｍ) 、十分に血管形成していた。一方、ｍＡｂＬＭ６０９で処理した腫瘍は非常に小さく(直径３ｍｍ)、検出可能な血管を欠いていた。更に、腫瘍を、組織学的切片の調製及び実施例９Ａ１）ａに記載されるようにしてヘマトキシリン及びエオシンで染色することにより調べた。図１４（上部パネル）に示されるように、ｍＡｂＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）で処理した腫瘍は、腫瘍の間質の至るところに、有糸分裂的外観で示される多数の可視できるかつ活性な分裂腫瘍細胞（矢じり）及び多数の血管（矢印）を示した。対照的に、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処理した腫瘍においては、可視できる腫瘍細胞又は血管はほとんど検出されなかった（図１４、下部パネル）。これらの結果は、インテグリンα_vβ₃のアンタゴニストは、腫瘍誘導血管形成を阻害し、種々のヒト腫瘍のインビボでの成長阻害及び退行を導くということを実証している。腫瘍成長７日後（胚形成17日）に調べた胚は、α_vβアンタゴニストで処理したかどうかについてのを大まかな試験（gross examination）において正常であったということを指摘することを重要である。これらの知見は、このインテグリンアンタゴニストが胚の発達に対して無毒性であるということを示している。２）合成ペプチドを用いた処理ヒトＭ２１−Ｌ黒色腫腫瘍断片（５０ｍｇ）を、実施例５Ａに記載されるようにして１０日齢の胚のＣＡＭに埋め込んだ。２４時間後、胚に、シクロ−ＲＡＤｆＶ（６９６０１）又はシクロ−ＲＧＤｆＶ（６６２０３）のいずれかの３００ μｇ／１００μｌを単一静脈内注射した。計７２時間後、腫瘍を除去し、形態学的に調べ、実施例９Ａ１）に記載されるようにして立体顕微鏡を用いて写真を撮った。図１５Ａ〜１５Ｅに示されるパネルは、以下に示すものに対応する。図１５Ａ：シクロ−ＲＡＤｆＶペプチド（６９６０１）で処理した二重のサンプル；図１５Ｂ：シクロ−ＲＧＤｆＶペプチド（６６２０３）で処理した二重のサンプル；図１５Ｃ：シクロ−ＲＧＤｆＶペプチド（６６２０３）で処理した同一の胚から採取した隣接ＣＡＭ組織;図１５Ｄ及び１５Ｅ：ペプチド処理した腫瘍の高倍率( １３×)図。図１５Ｄは、対照のペプチド（６９６０１）で処理した腫瘍から得た正常血管を示している。図１５Ｅは、シクロ−ＲＧＤｆＶペプチド（６６２０３）で処理した腫瘍から分断した血管の例を示している(矢印)。結果は、対照のペプチド６９６０１とは対照的に、ペプチド６６２０３のみが血管形成を阻害するが、腫瘍に隣接するＣＡＭ組織の血管は影響を受けないことを示している。更なる腫瘍退行アッセイを、対照としての６９６０１に対してα_vβ₃反応性ペプチド８５１８９（配列番号１５）を用いて行った。１００μｇのペプチドを、埋め込み１８時間後のＣＡＭに静脈内注射したことを除いて、アッセイを前記と同様にして行った。４８時間以上経過後、腫瘍を切除し、湿重量を測定した。図３２、３３及び３４は、それぞれ、ペプチド８５１８９への静脈内暴露後のＵＣＬＡＰ−３、Ｍ２１−Ｌ及びＦｇＭ腫瘍重量の減少を示している。対照的に、ＰＢＳ又はペプチド６９６０１については効果がなかった。１０．インビボウサギ眼モデルアッセイにより測定した、α_vβ₃アンタゴニストを用いた腫瘍組織成長の阻害増殖因子誘導血管形成に対する抗α_vβ₃アンタゴニストの効果は、眼の角膜に代表される天然の透明構造において見ることができる。新しい血管は、角膜の縁（豊富な血液供給）から角膜の中心（通常、血液供給はない）へ向かって成長する。例えばｂＦＧＦ等のような血管形成刺激剤を角膜に適用すると、角膜の縁からの新しい血管の成長を誘導する。角膜に適用された血管形成のアンタゴニストは、角膜の縁からの新しい血管の成長を阻害する。したがって、内皮細胞の角膜の縁から硬いコラーゲン充填角膜組織への浸潤（容易に可視できる）を経て、角膜は血管形成を受ける。それゆえ、ウサギ眼モデルは、眼の角膜への化合物の直接の埋め込みに続く血管形成阻害及び刺激の直接の観察用のインビボモデルを提供する。Ａ．インビボウサギ眼モデルアッセイ１）増殖因子により誘導された血管形成増殖因子ｂＦＧＦを用いて、インビボウサギ眼モデルアッセイにおいて血管形成を誘導した。以下の節に記載する。ａ．増殖因子及びモノクローナル抗体含有ハイドロン（Hydron）ペレットの調製増殖因子及びｍＡｂを含むハイドロンポリマーぺレットを、D'Amato et al.， Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91:4082-4085(1994)に記載されるようにして製造した。個々のペレットは、ｂＦＧＦを安定化し周辺組織への徐放を保証するスクラルファート(Carafet、マリオン・メリル・ダウ・コーポレーション（Marion M errell Dow Corporation)）に結合した６５０ｎｇの増殖因子ｂＦＧＦを含んでいた。更に、ＰＢＳ中に４０μｇのｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）又はｍＡｂＰ１Ｆ６（抗α_vβ₅）のいずれかを含むハイドロンペレットを製造した。ペレットは、その表面にドリルで孔を開けられた２．５ｍｍのコアを有するテフロンペグ（peg）中で特別に注型された。約１２μｌの注型材料を、各ペグ中に置き、滅菌フード中で一晩重合した。次いで、紫外線放射によりペレットを滅菌した。ｂ．モノクローナル抗体を用いた処理各実験は、３頭のウサギから構成され、ウサギの一方の眼はｂＦＧＦ及びＬＭ６０９を含むペレットを処理し、他方の眼はｂＦＧＦ及びマウスｍＡｂＰ１Ｆ６（抗α_vβ₅）を含むペレットを処理した。ＬＭ６０９（抗α_vβ₃）とその他のｍＡｂ及びＰＢＳ対照とを比較するための対の眼の試験は、試験したｍＡｂ間の優位な差異を実証するための厳密な試験を提供した。Ｐ１Ｆ６は、血管内皮細胞表面に見出されるインテグリンα_vβ₅と免疫反応するが、おそらく、血管形成とは関連していない。ｍＡｂＰ１Ｆ６が血管形成と関連しているかどうかを測定するために、このｍＡｂのみを含むペレットを製造し、以下に示すようにしてアッセイし、ｍＡｂが血管形成を誘導しないことを確認した。試験した全てのｍＡｂは、周知の方法に従い、プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂアフィニティーカラムクロマトグラフィーを使用して、腹水から精製した。溶離した免疫グロブリンをＰＢＳに対して透析し、デトキシーゲル（De toxi-gel）(ピアース・ケミカルズ(Pierce Chemicals))で処理し、内毒素を除去した。内毒素は、可能性のある血管形成及び炎症刺激剤であることが示されている。それゆえ、ｍＡｂを、色素生産性リムルス細胞分解産物アッセイ（バイオーホイッタカー(Bio-Whittaker)）を用いて、内毒素の存在について試験し、検出可能な内毒素が存在しないｍＡｂのみをウサギ眼モデルアッセイに使用した。ｂＦＧＦ及びｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）又はＰ１Ｆ６（抗α_vβ₅）を含むハイドロンペレットを、ウサギの眼に形成した角膜ポケットに挿入した。更に、ハイドロンペレットは、アッセイの間ｂＦＧＦを安定化するためのスクラルファートを含んでいた。個々のペレットを、ウサギの角膜の中央の支質（mid-stro ma）に形成した、外科的に作成した「ポケット」へ埋め込んだ。外科手順を、個々の角膜を写真により記録するためのカメラを実装したビームスプリッターを備えるワイルドモデルＭ６９１手術用顕微鏡を使用して、滅菌技術下で行った。３ｍｍ×５ｍｍの「ポケット」は、６９ビーバーブレードを用いて、角膜厚の半分まで３ｍｍ切開部を作成することにより角膜支質に作成した。虹彩スパーテルを使用して、支質を周辺へ（peripherally）切開し、ペレットを角膜輪部から２ｍｍの周辺マージンをもって埋め込んだ。続く１４日間の間、ｂＦＧＦ及びｍＡｂは、埋め込んだペレットから周辺組織へ拡散し、これにより、角膜の縁からの血管形成に作用した。各処理の代表的結果は、図１６Ａ〜１６Ｅに示される。存在する血管の量を定量化し、以下に示すように定義した時計時間の観点から記載した。時計を時間に分けたのと同様にして、眼を１２の同等の切片に分けた。「血管の１時計時間」は、時計における１時間に相当する眼の領域を満たす血管の量を意味する。ｂＦＧＦのみの処理を受けた５頭のウサギは、通常、血管を有しない角膜の縁から角膜の中心に向かって新しい血管が成長する鮮紅色の血管形成を示した。これらのウサギのうち１頭は、ペレットに対して１時計時間のみを有していた。ｂＦＧＦ及びｍＡｂＬＭ６０９で処理したウサギの２頭は、手術１４日後まで検出可能な血管形成をまったく有していなかった。これらのウサギのうちの１頭は、出血性かつ発芽性血管の３病巣を１４日までに有した。ｂＦＧＦ及びｍＡｂＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）で処理したウサギの２頭は、角膜の縁から角膜へ新しい血管が成長した大規模の血菅形成を示した。これらのウサギのうちの１頭は、ペレットに対して１〜２時間の血管のみを有していた。ウサギ眼モデルアッセイにおいて証拠付けられるように、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処理したウサギにおいては、増殖因子ｂＦＧＦの存在下の正常な辺縁（paralimbal）血管における血管形成は見られなかった。対照的に、ｍＡｂＰ３Ｇ２（抗α_vβ₅）で処理したウサギにおいては、増殖因子ｂＦＧＦの存在下の正常な辺縁血管における血管形成が見られた。ｍＡｂＬＭ６０９による角膜血管形成の完全な阻害は、既報のあらゆる抗血管形成剤よりも実質的に大きかった。ｃ．ポリペプチドを用いた処理各実験は、一方の眼に１００ｎｇのｂＦＧＦを含むペレットを処理し、他方の眼に１μｇのＶＥＧＦを含むペレットで処理した８頭のウサギから構成された。ペレットを、前記のようにして角膜ポケットに挿入し、サイトカインは、新しい血管の角膜への成長を連続的に刺激した。ペプチドを、ペレット挿入１日目に、ウサギのｋｇあたり５０μｇの初期投与量（１ｍｌＰＢＳ中）で皮下（ｓ．ｑ .）投与し、その後は２０μｇ／ｋｇの投与量で毎日皮下投与した。７日後、角膜を前記のようにして評価した。ｖＦＧＦ及びＶＥＧＦでで刺激した眼は共に、対照のペプチド６９６０１で処理したとき、７日目に実質的な角膜血管成長を示した。ペプチド８５１８９で処理したペプチドは、ｖＦＧＦで刺激した眼においては対照と比較して５０％未満の角膜血管成長量を示し、ＶＥＧＦ刺激した眼においてはほぼ１００％の阻害を示した。１１．キメラマウス：ヒトアッセイにより測定した、α_vβ₃アンタゴニストを用いた腫瘍組織成長のインビボ退行インビボキメラマウス：ヒトモデルは、ＳＣＩＤマウス由来の皮膚部分をヒト新生児包皮で置換することにより作成した(図１７)。皮膚移植が確立した後、ヒト包皮に悪性腫瘍細胞を接種した。測定可能な腫瘍が確立した後、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）又はＰＢＳをマウス尾部静脈に注射した。２〜３週間後、腫瘍を切り取り、重量及び組織学により分析した。Ａ．インビボキメラマウス：ヒトアッセイインビボキメラマウス：ヒトモデルは、基本的に、Yan et al.，J．Clin．I nvest.，91:986-996(1993)に記載されるようにして作成した。要約すると、２ｃｍ²の皮膚を外科的にＳＣＩＤマウス（６〜８週齢）から除去し、ヒト包皮で置換した。マウスに麻酔し、シェービングにより側腹領域の各面の５ｃｍ²の毛を除去した。２ｃｍ²の２つの環状移植床は、筋膜までの皮膚全層を除去することにより作成した。ヒト新生児包皮由来の同一の大きさの全層ヒト皮膚移植片を、創傷床に置き、縫合した。移植片を、皮膚を縫合するバンドエイドで覆った。細孔布テープを適用し創傷を覆った。Ｍ２１−Ｌヒト黒色腫細胞系又はＭＤＡ２３.１乳ガン細胞系(ＡＴＣＣＨＴＢ２６；ｍＡｂ組織切片のＬＭ６０９との免疫反応性によりα_vβ₃陰性)を使用して、ＳＣＩＤマウス上のヒト皮膚移植片に固形ヒト腫瘍を形成した。５× １０⁶ Ｍ２１−Ｌ又はＭＤＡ２３．１細胞の単一細胞懸濁液を、ヒト皮膚移植片に皮内注射した。マウスを２〜４週間観察し、測定可能なヒト腫瘍を成長させた。Ｂ．静脈内適用１）モノクローナル抗体を用いた処理測定可能な成長の後、Ｍ２１Ｌ腫瘍細胞を注射したＳＣＩＤマウスの尾部静脈に、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）又はＰＢＳを１週間に２回、２〜３週間静脈内注射した。この後、腫瘍を皮膚から切除し、周辺組織を除去した。数頭のマウスを、各処理についての計算した平均腫瘍重量を用いて評価し、表６の底部に示す。マウス：ヒトキメラマウス系におけるＭ２１ α_vβ₃陰性ヒト悪性腫瘍塊のＬＭ６０９（抗α_vβ₃）への暴露により、ＰＢＳ処理した平均腫瘍重量の１９８ｍｇから１１３ｍｇへの減少を引き起こした。ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）及びＰＢＳで処理したＭ２１Ｌ腫瘍の代表例を形態学的に調べた。ＰＢＳ処理した腫瘍は大きく（直径８〜１０ｍｍ）、十分に血管形成していた。一方、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処理した腫瘍は非常に小さく（直径３〜４ｍｍ）、検出可能な血管を欠いていた。マウス：ヒトキメラアッセイ系においてＭ２１−Ｌ黒色腫腫瘍細胞を用いたその他の実験においては、ｍＡｂＬＭ６０９との反応と、合成ペプチド８５１８９（配列番号１５）を用いて得られた反応とを、対照の合成ペプチド（配列番号６)との比較により比較した。アッセイは前記と同様にして行った。図３５に示される結果は、合成ペプチド８５１８９は腫瘍容積を、腫瘍容積が約３６０ｍｍ³であった対照のペプチドと比較して、２５ｍｍ³未満まで減少させた。更に、ｍＡｂＬＭ６０９は腫瘍容積を約６０ｍｍ³まで有意に減少させた。ＭＤＡ２３．１細胞を注射した皮膚移植片に形成した腫瘍は、検出可能かつ測定可能なものであった。確立した腫瘍の形態学的調査は、移植ヒト組織からＭＤＡ２３．１腫瘍細胞への新血管形成が起こったことを明らかにした。 α_vβ₃特異的ＬＭ６０９抗体及びペプチドの静脈内適用によるα_vβ₃受容体の遮断は、実施例９及び１０にそれぞれ記載されるＣＡＭ及びウサギ眼モデル系と同様な方法で、このモデル系における悪注腫瘍の退行を引き起こした。２）合成ペプチドを用いた処理前記モノクローナル抗体と同様の手順において、α_vβ₃ペプチドアンタゴニストを、測定可能なＭ２１−Ｌ腫瘍を有するＳＣＩＤマウスの尾部静脈に静脈内注射した。予備分析において、投与応答曲線を、ペプチド６９６０１（対照）似ついて作成し、８５１８９（試験）を１０〜２５０μｇ／ｍｌの濃度範囲で注射した。処理後に切除した腫瘍の平均容量及び重量を測定し、それぞれの結果を図３６Ａ及び３６Ｂに示す。ペプチド８５１８９は、試験した濃度範囲でＭ２１− Ｌ腫瘍成長の阻害に効果的であった。対照的に、対照のペプチドを用いた処理では２５０μｇ／ｍｌでもっとも有効であった。時間経過に対するペプチド８５１８９処理の効果を分析するために、同一のＳＣＩＤ腫瘍モデルにおいて２つの処理を評価した。１つのアッセイにおいて、８５１８９又は６９６０１のいずれかを用いた処理を６日目に開始し(０日に、３ ×１０⁶細胞のＭ２１−Ｌ腫瘍をマウス皮膚に皮下注射した)、２９日まで、２５０μｇ／ｍｌのペプチド８５１８９又は対照６９６０１を毎日腹腔内注射した。その他のアッセイは、２０日に処理を開始したことを除いて同様に行った。アッセイの終了時に、腫瘍を切除し、平均腫瘍容積（ｍｍ³）を測定した。データは、この値±平均の標準誤差でプロットした。これらのアッセイの結果を、それぞれ図３７Ａ及び３７Ｂに示す。ペプチド８５１８９は、処理開始後種々の日で、特定の処理に依存して、腫瘍の成長を阻害したが、６９６０１は阻害しなかった。１２．ＣＡＭアッセイにおいて測定した、インテグリンα_vβ₃のアンタゴニストの存在下における、血管細胞の細胞周期への参加（enter）及びアポトーシスの刺激血管形成過程は、例えばｂＦＧＦ及びＶＥＧＦ等のサイトカインの血管細胞増殖能力に明らかに依存している。Mignatti et al.，J．Cell．Biochem.，471:20 1(1991);Takeshita et al.，J．Clin．Invest.，93:662(1994);Koyama et al.， J．Cell．Physiol.，158:1(1994)を参照のこと。しかしながら、シグナル伝達事象は、これらの血管細胞の成熟血管への分化をも制御することが明らかである。したがって、新たな成長又は血管形成を受けている血管細胞の成長又は分化に関連するシグナルの妨害は、血管形成の混乱を引き起こすことが考えられる。インテグリン結合事象は、細胞増殖及びインビトロにおけるアポトーシス又はプログラム細胞死に関与していることが示されている。Schwartz，Cancer Res. ，51:1503(1993);Meredith et al.,Mol.Biol.Cell.,4:953(1993);Frisch et al. ，J．Cell Biol.，124:619(1994)及びRuoslahti et al.，Cell，77:477(1994)を参照のこと。血管形成に対するα_vβ₃アンタゴニストの効果についての厳密な調査は、不連続かつ崩壊した腫瘍関連血管の存在を明らかにした。それゆえ、血管の連続性の喪失は、血管細胞の選択的壊死又はアポトーシスによるものである可能性がある。この可能性を調査するために、増殖因子ｂＦＧＦを用いて血管形成誘導し、本発明のｍＡｂ及び環状ペプチドで処理した後に、ＣＡＭを調べた。Ａ．モノクローナル抗体を用いた処理組織から単離したＤＮＡを直接調べてのＤＮＡの断片化の検出及び断片化ＤＮＡの遊離３’ＯＨを特異的に検出する抗体を用いた完全組織における３’ＯＨの検出を含む種々の方法により、アポトーシスを検出することができる。１）ＤＮＡ断片化の分析実施例６Ａに記載されるように、ｂＦＧＦで飽和したフィルターディスクを１０日齢の胚のＣＡＭに置くことにより、血管形成を誘導した。ＬＭ６０９（抗α_v β₃）を用いたＣＡＭの免疫組織学的分析は、ｂＦＧＦを用いた血管形成開始１２〜２４時間後の血管上でのα_vβ₃の発現のピークを明らかにした。したがって、ｂＦＧＦを用いた刺激２４時間後、胚に、１００μｌのＰＢＳ又は３００μｇのｍＡｂＣＳＡＴ（抗β₁）又はＬＭ６０９（抗α_vβ₃）を含有するＰＢＳを静脈内接種した。ＤＮＡ断片化は、ｍＡｂＬＭ６０９(抗α_vβ₃)、ＣＳＡＴ（抗β₁）又はＰＢＳの静脈内接種２４又は４８時間後に、ｂＦＧＦ飽和フィルターディスク直下のＣＡＭ組織を切除することにより検出した。切除したＣＡＭ組織を、滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、細かく刻み、０．２５％細菌コラケナーゼ（ウオージントン・バイオケミカル(Worthington Biochemical)、フリーホールド、ニュージャージー）中に再懸濁し、時折ボルテックスしながら３７℃で９０分間インキュベートした。既報と同様にして、単一細胞懸濁液由来の等数のＣＡＭ細胞からＤＮＡを抽出した。Bissonette et al.，Nature，359:552(1992)を参照のこと。要約すると、等数のＣＡＭ細胞を、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００（シグマ(Sigma)、セントルイス、ＭＯ）中の１０ｍＭＥＤＴＡで溶菌した。細胞溶解物を、４℃下、１６０００×ｇで１５分間遠心分離し、完全クロマチンペレットから可溶性断片化ＤＮＡを分離した。断片化ＤＮＡを洗浄し、１．２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で分析した。可溶性断片化ＤＮＡを、各処理由来の等数のＣＡＭ細胞から単離し、アガロースゲル中で電気泳動により分離し、臭化エチジウムを用いた染色により可視化した。処理後の３つの異なる処理から得られたＤＮＡ断片の相対量において差異は見られなかった。しかしながら、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）を用いての処理４８時間後では、ｍＡｂＣＳＡＴ（抗β₁）又はＰＢＳ単独で処理した胚と比較して、ＤＮＡ断片化において有意な増加が見られた。２）血管細胞の細胞周期への刺激これらの過程におけるα_vβ₃の役割を実験的に調べるために、ｂＦＧＦで処理又は未処理のＣＡＭ由来の細胞を、ヨウ化プロピジウムで染色し、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で免疫反応させた。ｍＡｂＬＭ６０９(抗α_vβ₃)、ＣＳＡＴ（抗β₁）又はＰＢＳでの処理２４及び４８時間後の胚から単離したＣＡＭを、前記細菌コラゲナーゼと共にインキュベートすることにより、単一細胞懸濁液へ分離した。単一細胞を透過化処理し、Ａｐｏｐタグ原位置検出キットを製造者（オンコール(Oncor)、ゲーサーズバーグ、ＭＤ）の指示に従い用いて染色した。Ａｐｏｐタグは、断片化ＤＮＡの遊離３’ＯＨ基を特異的に検出する抗体である。遊離３’ＯＨ基の検出は、アポトーシス細胞検出用の確立された方法である。Gavrieli et al.,J.Cell.,Biol.,11 9:493(1992)を参照のこと。Ａｐｏｐタグ染色細胞を、０．１（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００中ですすぎ、ＰＢＳに０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム及び２００μｇ／ｍｌのＲＮＡ分解酵素Ａを含むＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。細胞を１．５時間インキュベートし、洗浄し、蛍光発色セルソーターにより分析した。細胞の蛍光は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して測定し、分析データは以下に示す。細胞の蛍光を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson)、マウンテンビュー、ＣＡ）を使用して測定した。側部散乱（ＳＳＣ）及び前方散乱（ＦＳＣ）を同時に測定し、全てのデータを、ＦＡＣＳｃａｎリサーチソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン、マウンテンビュー、ＣＡ）を備えたヒューレット・パッカード（Hewlet Packard）(ＨＰ９０００)コンピュータを用いて集めた。データは、Ｐ．Ｃライシスバージョン１ソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン、マウンテンビュー、ＣＡ）を用いて分析した。Ａｐｏｐタグキットからの一次抗体の添加なしの細胞懸濁液を使用することにより、陰性対照ゲートをセットした。同一のゲーティング（gating）を細胞集団に適用し、１つの異なる細胞処理あたり約８０００細胞の分析を行った。ＦＡＣＳ分析により測定した、ｍＡｂ処理し、Ａｐｏｐタグを用いて染色したＣＡＭ由来の単一細胞の百分率を図１８に示す。黒色の棒は、分析２４時間前に処理した胚由来の細胞を示している。ストリップ状の棒は、分析４８時間前に処理した胚由来の細胞を示している。各棒とも、三重の試験の平均値±標準誤差で表している。図１８に示されるように、２日前にｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処理したＣＡＭは、ＰＢＳ単独又はＣＳＡＴ（抗β₁）で処理したＣＡＭと比較して、３〜４倍のＡｐｏｐタグの増加を示した。Ｂ．合成ペプチドを用いた処理実施例６Ａに記載される、増殖因子誘導血管形成を用いたＣＡＭアッセイを、本発明のペプチドを用いて行い、アポトーシスに対する環状ペプチドの効果を測定した。ペプチドシクロ−ＲＧＤｆＶ（６６２０３）及びシクロ−ＲＡＤｆＶ（６９６０１）は、実施例１に記載されるようにして製造した。ペプチド溶液又はＰＢＳを、３００μｇ／ｍｌの濃度でＣＡＭ調製物へ注射した。２４及び４８時間後、ろ紙及び周辺組織を切除し、Ａｐｏｐタグで染色し、前記実施例１２Ａ２）に記載されるようにしてアポトーシスを検出した。図１８Ａに示されるように、２日前にペプチド６９２０３（シクロ−ＲＧＤｆＶ）で処理したＣＡＭは、ＰＢＳ単独又は対照の環状ペプチド６９６０１（シクロ−ＲＡＤｆＶ）で処理したＣＡＭと比較して、Ａｐｏｐタグの３〜４倍の増加を示した。Ｃ．アポトーシス及び細胞周期に対する、モノクローナル抗体を用いた処理の効果単一細胞懸濁液を、ヨウ化プロピジウムを用いた染色により染色体ＤＮＡのコピー数を調べ、細胞周期に対するモノクローナル抗体を用いた処理の効果を測定し、Ａｐｏｐタグを用いた染色によりアポトーシスについて調べた。２４又は４８時間前に、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）若しくはＣＳＡＴ（抗β₁）又はＰＢＳで処理したＣＡＭの単一細胞懸濁物は、実施例１２Ａ１）に記載されるようにして調製した。Ａｐｏｐタグを用いた細胞の染色について、細胞懸濁液を、ＰＢＳ中に２．５（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む緩衝液で３回洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、前記と同様にして３回洗浄した。非特異的結合を防ぐために、単一細胞懸濁液を、ＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで、４℃、一晩遮断した。Ａｐｏｐタグで染色する前に、細胞を前記のようにして洗浄し、前記実施例１２Ａに記載されるようにしてＦＡＣＳｃａｎを用いて細胞蛍光を測定した。各実験由来の細胞を、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で１時間染色し、ＰＢＳで２回洗浄し、染色体凝縮及び分断を含むアポトーシスの典型的な核の特徴について分析した。アポトーシス細胞の百分率は、少なくとも１０〜１５のランダムに選択した顕微鏡視野の細胞の形態学的分析により推定した。Ａｐｏｐタグ及びヨウ化プロピジウムで染色し、ＦＡＣＳにより分析した、ＣＳＡＴ（抗β₁）又はＬＭ６０９（抗α_vβ₃）のいづれかで処理した胚のＣＡＭ由来の単一細胞懸濁液の組み合わせた結果を図１９に示す。Ｙ軸はＡｐｏｐタグ染色（アポトーシス）を示し、Ｘ軸はヨウ化プロピジウム染色（ＤＮＡ含量）を示している。横線は、Ａｐｏｐタグ染色用の陰性ゲートを示している。左及び右のパネルは、それぞれ、ＣＳＡＴ及びＬＭ６０９で処理した胚由来のＣＡＭ細胞を示している。細胞周期分析は、１条件あたり約８０００事象の分析により行い、データを計数プロットで示す。ＤＮＡ色素ヨウ化プロピジウムで染色した単一細胞のサンプルは、処理４８時間後のＬＭ６０９（抗α_vβ₃）処理細胞の２５〜３０％が、核凝縮及び／又は分断の証拠を示したことを明らかにした。これらの過程は、アポトーシスを受けている細胞の特徴である。これとは対照的に、ＣＳＡＴ（抗β₁）で処理したＣＡＭは、細胞の９０〜９５％が正常な核染色を示した。図１９に示されるように、ＬＭ６０９によるアポトーシス誘導と一致して、１コピー朱満のＤＮＡを含むピーク内の有意な細胞数が見られた(Ａ０)。このピークは、後期アポトーシス細胞における断片化ＤＮＡをあらわすことが示されている。Telford et al.，Cytometry，13:137(1992)を参照のこと。更に、Ａ０細胞はＡｐｏｐタグで容易に染色され、このことはアポトーシス細胞を検出するこの試薬の能力を確認している。しかしながら、Ａ０における細胞染色に加え、１コピーよりも大きいＤＮＡを含む有意数の細胞を、Ａｐｏｐタグで染色した(図１９)。これらの結果は、すでに細胞周期が進行している血管細胞間のアポトーシスを促進するＬＭ６０９の能力を実証している。対照的に、細胞周期が進行している対照ＣＡＭ由来の細胞は、最小のＡｐｏｐタグ染色が対照処理ＣＡＭにおいて検出されたいくつかのアポトーシス細胞と一致することを示している。細胞周期が進行（Ｓ及びＧ２／Ｍ期）しているｂＦＧＦ刺激ＣＡＭにおける細胞間で、７０％がＬＭ６０９（抗α_vβ₃）による陽性染色を示した。これは、非ｂＦＧＦ処理細胞由来の周期細胞間における１０％のＬＭ６０９染色と比較される。これらの知見は、ｂＦＧＦ刺激後、α_vβ₃を有する細胞の大部分が活性な増殖を示すということを示している。まとめると、これらの知見は、α_vβ₃アンタゴニストｍＡｂ又は環状ペプチドの静脈内注射は、血管形成に続くニワトリＣＡＭ内のアポトーシスを促進することを示している。更に、ＣＡＭを、ＬＭ６０９との免疫反応性によりα_vβ₃の発現について、及びＡｐｏｐタグとの免疫反応性によりアポトーシスを受けている細胞について組織学的に調べた。実施例５Ａにおいて調製した、ＬＭ６０９(抗α_vβ₃)、ＣＳＡＴ（抗β₁）又はＰＢＳで４８時間前に処理した胚から切除したＣＡＭ切片を洗浄し、ＯＴＣ（バクスター(Baxter)）中に埋め込み、液体窒素中で急速冷凍した。ＣＡＭ組織の６μｍ切片を切断し、アセトン中で３０秒間固定し、使用するまで−７０℃で保存した。組織切片を、７０％（ｖ／ｖ）エタノール（ＥＴＯＨ）中での短期間のすすぎ、続くＰＢＳ中での３回の洗浄により染色用に調製した。次に、切片を、ＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで２時間遮断し、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂＬＭ６０９と共に２時間インキュベートした。切片を洗浄し、１：５０希釈のローダミン結合ヤギ抗マウスエｇＧ（フィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Scientific)、ピッツバーグ、ＰＡ）で２時間インキュベートした。最後に、同一の切片を洗浄し、実施例１２Ａ２）に記載されるようにしてＡｐｏｐタグで染色した。染色組織切片を共焦点免疫蛍光顕微鏡に置き分析した。図２０において、パネルＡ〜ＣはＣＳＡＴ（抗β₁）で処理した胚由来のＣＡＭ組織を示し、パネルＤ〜ＦはＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で処理した胚由来のＣＡＭ組織を示している。パネルＡ及びＤは、Ａｐｏｐタグで染色し、Ｄ．Ｉ．Ｃ．イメージに重ね合わせた蛍光（ＦＩＴＣ）により可視化した組織を示している。パネルＢ及びＥは、ｍＡｂＬＭ６０９（抗α_vβ₃）で染色し、蛍光（ローダミン）により可視化した同一の組織を示している。パネルＣ及びＦは、Ａｐｏｐタグ及びＬＭ６０９で染色した同一組織の組み合わせのイメージを示しており、黄色の染色は共存を示している。棒は、左及び右のパネルそれぞれにおいて１５及び５０μｍを表している。図２０（Ａ〜Ｃ）に示されるように、ＣＳＡＴ又はＰＢＳ対照の静脈内注射後のＡｐｏｐタグ染色は最小かつランダムであり、これは組織内のアポトーシスの最小レベルを示している。対照的に、ＬＭ６０９又は環状ペプチド２０３で処理した胚由来のＣＡＭは、Ａｐｏｐタグで激しく染色された血管の大部分を示しており、一方、最小の反応性は周辺非血管細胞のなかで見られた(図２０Ｄ〜Ｆ)。更に、Ａｐｏｐタグ及びＬＭ６０９を使用してこれらの組織を染色したとき(1９Ｃ及び１９Ｆ)、α_vβ₃アンタゴニストで処理した胚由来のＣＡＭにおけるこれらのマーカーの間で有意な共局在化が見られた(図２０Ｆ)。これらの知見は、インビボにおける血管形成誘導後に、インテグリンα_vβ₃の阻害剤は、α_vβ₃を有する血管のアポトーシスを選択的に促進することを実証している。血管形成は、多数の分子及び細胞の生物学的事象を含む複合過程であるが、証拠のいくつかの流れは、血管細胞インテグリンα_vβ₃がこの過程において比較的遅発の役割を果たしていることを示唆している。第一に、免疫組織学的分析は、血管細胞上のα_vβ₃発現が、ｂＦＧＦによる血管形成誘導１２〜２４時間後に最大に達することを明らかにした。第二に、α_vβ₃アンタゴニストは、多数の活性化剤により誘導される血管形成を混乱させた。このことは、この受容体は、おそらく血管形成を誘導する全ての一次シグナル伝達事象から下流の共通経路に関連することを示唆している。第三に、ｍＡｂＬＭ６０９又は環状ペプチドで処理したＣＡＭは、これらのアンタゴニストでの処理４８時間後まで、ＤＮＡラダリング（laddering）により測定されるアポトーシスの有意な増加を示さなかった。最後に、α_vβ₃アンタゴニストは、既に細胞周期の進行が誘導されている血管細胞のアポトーシスを促進した。本明細書に示される結果は、インテグリン結合事象がインビボでの細胞の生存を調節することができるという第一の直接的証拠を提供する。それゆえ、一度血管形成が始まると、個々の血管細胞は分裂し、血管形成源へ向かって移動し、その後、α_vβ₃結合は連続的な細胞の生存を許容するシグナルを提供し、これが分化及び成熟血管の形成を誘導すると仮定される。しかしながら、α_vβ₃結合が阻害される場合、細胞はこの分子の合図を受け取ることができず、デフォルトによりアポトーシスヘ進行する。この仮説は、分化が起こった後、成熟血管はもはや生存するためのα_vβ₃シグナル伝達を必要とせず、それゆえ、このインテグリンのアンタゴニストに耐えるということも予想している。最後に、本明細書に示された結果は、インテグリンα_vβ₃のアンタゴニストは、腫瘍形成又は血管形成により特徴付けられるその他の疾患の治療に対する強力な治療学的アプローチを提供するかもしれない。第一は、α_vβ₃アンタゴニストは、先存血管構造に影響することなく、新しい血管形成を混乱させる。第二は、これらのアンタゴニストは、ニワトリ胚の生存度に対して有意に作用せず、無毒性であることを示唆している。第三は、血管形成刺激にもかかわらず、血管形成は有意に遮断された。最後に、α_vβ₃アンタゴニストの全身投与は、種々の組織学的に異なるヒトの腫瘍を劇的に退行させる。１３．有機分子α_vβ₃アンタゴニストの製造有機α_vβ₃アンタゴニスト、化合物７(９６１１２)、９(９９７９９)、１０( ９６２２９)、１２(１１２８５４)、１４(９６１１３)、１５(７９９５９)、１６(８１２１８)、１７（８７２９２）及び１８（８７２９３）の合成が以下に記載され、図面にも示される。有機アンタゴニストは、括弧内の数字によっても呼ばれる。前記で定義したように本発明の有機模倣物とも呼ばれる、得られた有機分子を、実施例１１に記載されるα_vβ₃媒介血管形成の阻害方法に使用した。以下に記載する各合成に対して、旋光度は、パーキンエルマー２４１分光光度計で測定し、ＵＶ及び可視光スペクトルはベックマンＤＵ−７０分光計で記録した。¹Ｈ及び¹³ＣＮＭＲスペクトルは、ブルカー（Bruker）ＡＭＸ−４００及びＡＭＸ−５００分光計を用い、４００及び５００ＭＨｚで記録した。高分解能マススペクトル（ＨＲＭＳ）は、高速原子衝撃（ＦＡＢ）条件下、ＶＧＺＡＢ −ＺＳＥ質量分析器で記録した。カラムクロマトグラフィーは、７０〜２３０メッシュのシリカゲルを用いて行った。分離用ＴＬＣは、メルクアート（Merck Ar t.）５７４４（０．５ｍｍ）で行った。融点は、トーマス・フーバー（Thomas H oover）装置で測定した。Ａ．図３８に示される化合物１：ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステル化合物１０．１０Ｍ（Ｍ）中のＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−チロシン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシン）(１．０当量。アルドリッチ(Aldrich))溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）(１．５当量)を２５℃で添加し、１時間撹拌した。次に、１．５当量のベンジルアルコールを添加し、混合物を２５ ℃で更に１２時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回(２×)、塩水で１回（１×）洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。化合物１、ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステルは、シグマから商業的に購入することもできる。Ｂ．図３８工程ｉに示される化合物２：(Ｓ)−３−（４−（４−ブロモブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−プロピオン酸ベンジルエステル化合物２ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステル(前記で合成。２ｇ、５．３８ｍｍｏｌ)、１，４−ジブロモブタン(１．９ｍｌ、１６．２ｍｍｏｌ。アルドリッチ)、炭酸カリウム（５ｇ）及び１８−クラウン−６（０．１ｇ。アルドリッチ）の混合物を、８０℃で１２時間加熱した。冷却後、沈殿物をろ別し、反応混合物を減圧下で蒸発させ乾燥した。粗生成物を、１００％ヘキサンを用いた結晶化により精製し、２．５ｇ（９２％）の化合物を得た。Ｃ．図３８工程ｉｉに示される、化合物：(Ｓ)−３−（４−（４−アジドブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−プロピオン酸ベンジルエステル化合物３化合物（２．５ｇ、４．９ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）( ２０ｍｌ)中のアジ化ナトリウム（１．６ｇ、２５ｍｍｏｌ）と共に２５℃で１２時間撹拌した。溶媒を蒸発し、残渣を水（約１０ｍｌ）で処理し、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を組み合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発し、２．０ｇ（９０％）の化合物３を無色のシロップとして得た(ＦＡＢ−ＭＳ：４６９(Ｍ＋Ｈ⁺))。Ｄ．図３８工程ｉｉｉに示される、化合物４：(Ｓ)−３−（４−（４−アジドブチルオキシ）フェニル−２−アミノ−プロピオン酸ベンジルエステル化合物４化合物３（２．０ｇ(４．４ｍｍｏｌ)）を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；２ｍｌ）に溶解し、室温下で３時間撹拌した。減圧下で蒸発することにより、１．６ｇ（定量的）の化合物４を無色のシロップとして得た。これを更なる精製をすることなしに次工程に使用した。ＦＡＢ−ＭＳ：３６９(Ｍ⁺Ｈ⁺)。Ｅ．図３８工程ｉｖに示される、化合物５：(Ｓ)−３−（４−（４−アジドブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミド−プロピオン酸ベンジルエステル化合物５化合物４(１．６ｇ；４．３ｍｍｏｌ)、ブタンスルホン酸塩化物（０．８４ｍｌ；６．６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５当量）の混合物を、塩化メチレン（２０ｍｌ）中、室温下で１２時間撹拌した。反応混合物を蒸発し、残渣を酢酸エチル中に溶解し、希釈ＨＣｌ、水性炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄した。乾燥するまで蒸発した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル１５：１）により精製し、１．４ｇ（６７％）の化合物５を無定形の固体として得た。Ｆ．図３８工程ｖに示される、化合物６：(Ｓ)−３−（４−（４−アミノブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミド−プロピオン酸化合物６化合物５（１．３ｇ(２．６ｍｍｏｌ)）を、２０ｍｌの酢酸エチル／メタノール／水（５／３／１）及び０．２ｍｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に溶解し、水素下(１気圧、パール・シェーカー（Parr Shaker）装置)、２５℃、１００ｍｇパラジウム（木炭中１０％）の存在下で水素化した。３時間後、触媒をろ別し、溶媒を蒸発し、化合物６を油性残渣として得た。水からの凍結乾燥後、１．０ｇ（定量的）の化合物を白色粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：３７３(Ｍ⁺Ｈ⁺)。Ｇ．図３８工程ｖｉに示される、化合物７：(Ｓ)−３−（４−（４−グアニジノブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミド−プロピオン酸化合物７ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、５ｍｌ）中の化合物６(２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ)、３，５−ジメチルピラゾール−１−カルボキサミジン硝酸塩（ＤＰＦＮ）(１７０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ；アルドリッチ・ケミカル・カンパニー)及びトリエチルアミン（０．１５ｍｌ、１．０ｍｍｏｌ）を６０℃で１２時間加熱した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発し、残渣をＨＰＬＣ（リコカート（Lichroca rt）ＲＰ−１８、勾配：アセトニトリル／水＋０．３％ＴＦＡ９９：１〜１：９９）により精製し、凍結乾燥後、５０ｍｇ（２５％）の化合物７を白色無定形粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：４１５(Ｍ⁺Ｈ⁺)。融点：７０℃。Ｈ．図３９工程ｉｉｉに示される、化合物８：(Ｓ)−３−（４−（４−アミノブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−プロピオン酸化合物８化合物３（０．５ｇ(１．０７ｍｍｏｌ)）を、１０ｍｌの酢酸エチル／メタノール／水（５／３／１）及び０．１ｍｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に溶解し、水素下(１気圧、パール・シェーカー装置)、２５℃、３０ｍｇパラジウム（木炭中１０％）の存在下で水素化した。３時間後、触媒をろ別し、溶媒を蒸発し、化合物８を油性残渣として得た。水からの凍結乾燥後、３７０ｍｇ（定量的）の化合物８を白色粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：３５３(Ｍ⁺Ｈ⁺)。Ｉ．図３８工程ｉｖに示される、化合物９：(Ｓ)−３−（４−（４−グアニジノブチルオキシ）フェニル−２−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−プロピオン酸化合物９ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，５ｍｌ）中の化合物８(２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ)、３，５−ジメチルピラゾール−１−カルボキサミジン硝酸塩（ＤＰＦＮ）(１７０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ；アルドリッチ・ケミカル・カンパニー)及びトリエチルアミン（０．１５ｍｌ、１．０ｍｍｏｌ）を６０℃で１２時間加熱した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発し、残渣をＨＰＬＣ（リコカートＲＰ−１８、勾配：アセトニトリル／水＋０．３％ＴＦＡ９９：１〜１：９９）により精製し、凍結乾燥後、１６０ｍｇ（９０％）の化合物９を白色無定形粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：３９５(Ｍ⁺Ｈ⁺)。Ｊ．図４０工程ｉ〜ｖｉに示される、化合物１０：(Ｒ)−３−（４−（４−グアニジノブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミド−プロピオン酸化合物１０化合物７合成と同一の反応順序を使用して、Ｄ−チロシン類似体１０を製造した。２０５ｍｇを白色無定形物質として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：４１５(Ｍ⁺Ｈ⁺)。続いて、中間体化合物１００−６００を使用して化合物１０を形成した。１）図４０に示される、化合物１００：ｔ−Ｂｏｃ−Ｄ−チロシンベンジルエステル化合物１０００．１０Ｍ塩化メチレン中のＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）Ｄ−チロシン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシン）(１．０当量、アルドリッチ)に溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）(１．５当量)を２５℃で添加し、１時間撹拌した。次に、１．５当量のベンジルアルコールを添加し、混合物を２５℃で更に１２時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカケルカラムクロマトグラフィーにより精製した。２）図４０工程ｉに示される化合物２００：(Ｒ)−３−（４−（４−ブロモブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−プロピオン酸ベンジルエステル化合物２００ｔ−Ｂｏｃ−Ｄ−チロシンベンジルエステル(前記で合成。２ｇ、５．３８ｍｍｏｌ)、１，４−ジブロモブタン(１．９ｍｌ、１６．２ｍｍｏｌ。アルドリッチ)、炭酸カリウム（５ｇ）及び１８−クラウン−６（０．１ｇ。アルドリッチ）の混合物を、８０℃で１２時間加熱した。冷却後、沈殿物をろ別し、反応混合物を減圧下で蒸発させ乾燥した。粗生成物を、１００％ヘキサンを用いた結晶化により精製し、２．５ｇ（９２％）の化合物２００を得た。３）図４０工程ｉｉに示される、化合物：(Ｒ)−３−（４−（４−アジドブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−プロピオン酸ベンジルエステル化合物３００化合物（２．５ｇ、４．９ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）( ２０ｍｌ)中のアジ化ナトリウム（１．６ｇ、２５ｍｍｏｌ）と共に２５℃で１２時間撹拌した。溶媒を蒸発し、残渣を水（約１０ｍｌ）で処理し、酢酸エチルで２回抽出した。有機層を組み合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発し、２．０ｇ（９０％）の化合物３００を無色のシロップとして得た(ＦＡＢ−ＭＳ：４６９(Ｍ＋Ｈ⁺))。４）図４０工程ｉｉｉに示される、化合物４００：(Ｒ)−３−（４−（４− アジドブチルオキシ）フェニル−２−アミノ−プロピオン酸ベンジルエステル化合物４００化合物３００（２．０ｇ(４．４ｍｍｏｌ)）を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；２ｍｌ）に溶解し、室温下で３時間撹拌した。減圧下で蒸発することにより、１．６ｇ（定量的）の化合物４００を無色のシロップとして得た。これを更なる精製をすることなしに次工程に使用した。ＦＡＢ−ＭＳ：３６９(Ｍ⁺Ｈ⁺)。５）図４０工程ｉｖに示される、化合物５００：(Ｒ)−３−（４−（４−アジドブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミド−プロピオン酸ベンジルエステル化合物５００化合物４００(１．６ｇ；４．３ｍｍｏｌ)、ブタンスルホン酸塩化物（０．８４ｍｌ；６．６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５当量）の混合物を、塩化メチレン（２０ｍｌ）中、室温下で１２時間撹拌した。反応混合物を蒸発し、残渣を酢酸エチル中に溶解し、希釈ＨＣｌ、水性炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄した。乾燥するまで蒸発した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー( シリカゲル、トルエン／酢酸エチル１５：１)により精製し、１．４ｇ（６７％）の化合物５００を無定形の固体として得た。６）図４０工程ｖに示される、化合物６：(Ｒ)−３−（４−（４−アミノブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミド−プロピオン酸化合物６００化合物５００（１．３ｇ（２．６ｍｍｏｌ））を、２０ｍｌの酢酸エチル／メタノール／水（５／３／１）及び０．２ｍｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に溶解し、水素下(１気圧、パー・シェーカー装置)、２５℃、１００ｍｇパラジウム（木炭中１０％）の存在下で水素化した。３時間後、触媒をろ別し、溶媒を蒸発し、化合物６００を油性残渣として得た。水からの凍結乾燥後、１．０ｇ（定量的）の化合物６００を白色粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：３７３(Ｍ⁺Ｈ⁺)。７）図４０工程ｖｉに示される、化合物１０：(Ｒ)−３−（４−（４−グアニジノブチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミド−プロピオン酸ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、５ｍｌ）中の化合物６００(２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ)、３，５−ジメチルピラゾール−１−カルボキサミジン硝酸塩（ＤＰＦＮ）(１７０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ；アルドリッチ・ケミカル・カンパニー)及びトリエチルアミン（０．１５ｍｌ、１．０ｍｍｏｌ）を６０℃で１２時間加熱した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発し、残渣をＨＰＬＣ（リコカートＲＰ−１８、勾配：アセトニトリル／水＋０．３％ＴＦＡ９９：１〜１：９９）により精製し、凍結乾燥後、５０ｍｇ（２５％）の化合物１０を白色無定形粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：４１５(Ｍ⁺Ｈ⁺)。融点：７０℃。Ｋ．図４に示される、化合物１１：(Ｓ)−３−（４−（４−アミドブチルオキシ）フェニル−２−（１０−ショウノウスルホンアミド）−プロピオン酸ベンジルエステル化合物１１塩化メチレン（２０ｍｌ）中の化合物４(１．０ｇ、２．７ｍｍｏｌ)、１０− ショウノウスルホン酸塩化物（６．６ｍｍｏｌ、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー）及びトリエチルアミン（１．５当量）の混合物を、室温下で１２時間撹拌した。反応混合物を蒸発し、残渣を酢酸エチル中に溶解し、希釈ＨＣｌ、水性炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄した。乾燥するまで蒸発した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカケル、トルエン／酢酸エチル１５：１）により精製し、１．４ｇ（６７％）の化合物１１を無定形の固体として得た。Ｌ．図４１工程ｉ〜ｉｉに示される、化合物１２：(Ｓ)−３−（４−（４−グアニジノブチルオキシ）フェニル−２−（１０−シヨウノウスルホンアミド）− プロピオン酸化合物１２以下に示す条件に従い、化合物１１の水素化及びグアニル化（guanylation）の後に化合物１２を得た。工程ｉ：化合物１１（１．３ｇ(２．６ｍｍｏｌ)）を、２０ｍｌの酢酸エチル／メタノール／水（５／３／１）及び０．２ｍｌトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に溶解し、水素下(１気圧、パール・シェーカー装置)、２５℃、１００ｍｇパラジウム（木炭中１０％）の存在下で水素化した。３時間後、触媒をろ別し、溶媒を蒸発し、中間体アミンを油性残渣として得た。水からの凍結乾燥後、１．０ｇ（定量的）の中間体アミンを白色粉末として得た。異化に続く工程に使用した。工程ｉｉ：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，５ｍｌ）中の前記で形成した中間体アミン化合物(２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ)、３，５−ジメチルピラゾール− １−カルボキサミジン硝酸塩（ＤＰＦＮ）(１７０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ；アルドリッチ・ケミカル・カンパニー)及びトリエチルアミン（０．１５ｍｌ、１．０ｍｍｏｌ）を６０℃で１２時間加熱した。冷却後、溶媒を減圧下で蒸発し、残渣をＨＰＬＣ（リコカートＲＰ−１８、勾配：アセトニトリル／水＋０．３％ＴＦＡ９９：１〜１：９９）により精製し、凍結乾燥後、５０ｍｇ（２５％）の化合物１２を白色無定形粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：５０９．６(Ｍ⁺Ｈ⁺) 。Ｍ．図４１に示される化合物１３：(Ｓ)−３−（４−（５−ブロモブチルオキシ）フェニル−２−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−プロピオン酸ベンジルエステル化合物１３ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロシンベンジルエステル(前記で合成化合物１。４．５ｇ、１２．１ｍｍｏｌ)、１，５−ジブロモブタン(５ｍｌ、３６．７ｍｍｏｌ。アルドリッチ)、炭酸カリウム（１０ｇ）及び１８−クラウン−６（０．２５ｇ。アルドリッチ）の混合物を、８０℃で１２時間加熱した。冷却後、沈殿物をろ別し、反応混合物を減圧下で蒸発させ乾燥した。粗生成物を、１００％ヘキサンを用いた結晶化により精製し、５．３５ｇ（８５％）の化合物１３を得た。Ｎ．図４１工程ｉ〜ｖに示される、化合物１４：(Ｓ)−３−（４−（５−グアニジノペンチルオキシ）フェニル−２−ブチルスルホンアミド−プロピオン酸化合物１４臭素−アジド−交換、Ｂｏｃ−切断、ブタンスルホン酸塩化物を用いたスルホニル化、水素化及びＤＰＦＮを用いたグアニル化の５工程反応順を、中間体１〜６を使用して、前記手順と同様にして行い、化合物７を形成するか、又は化合物１００〜６００を使用し、前記と同様にして化合物１０を得た。化合物１４を白色粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳ：４２９(Ｍ⁺Ｈ⁺)。Ｏ．図４２に示される化合物１５：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４ −（２−カルボキシ−２−アミノ−エチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン二塩酸塩１）化合物１５用の出発物質：２−Ｎ−ＢＯＣ−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩の合成化合物１５０．１０Ｍメタノール中の（Ｄ又はＬ）−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ（Ｄ）−チロシン（ｔ−ＢＯＣ−Ｌ（Ｄ）−チロシン）(１．０当量。シグマ)及び希釈１％ＨＣｌのエステル化により、出発物質２−Ｎ−ＢＯＣ−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩を得た。反応混合物を２５℃で１２時間撹拌し、炭酸カルシウムを用いて中和し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、２−Ｎ−ＢＯＣ−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩を得た。２）化合物１５用出発物質３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５− メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノンの合成：以下に示す３工程手順：塩化メチレン（０．１０Ｍ）中のｐ−アミノベンゾニトリル（１．０当量、アルドリッチ）を、２，３−エポキシプロパノール（１．０当量、アルドリッチ）と共に２５℃で１２時間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、得られた粗４− （２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリルを以下に示す次工程に使用した。ジメチルホルムアミド（０．１０Ｍ）中の４−（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリル（前記、１．０当量）を２５℃で炭酸ジエチル（１．１当量、アルドリッチ）と共に撹拌し、ｔｅｒｔ−ブチルカリウム（１．１当量、アルドリツチ）と共に１１０℃で６時間撹拌した。次に、反応混合物を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル −２−オキサゾリジンを得、以下に示す次工程で使用した。塩化メチレン（０．１０Ｍ）中の３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジン（１．０当量、前記）を、１．１当量硫化水素、１．１当量ヨウ化メチル及び１．１当量酢酸アンモニウムと共に２５℃で撹拌した。反応混合物を６時間撹拌し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、アミジンを得、以下に示す次工程で使用した。前記で合成したアミジン１．０当量を、塩化メチレン（０．１０Ｍ）中の１．１当量ＢＯＣ−ＯＮ（２−（ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル、アルドリッチ）で保護した。次に、反応混合物を６時間撹拌し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を０．１０Ｍ塩化メチレン及び１．１当量メタンスルホン酸塩化物中でエステル化した。反応混合物を０℃で６時間撹拌し、水（５当量）でクエンチし、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノンを得た。３）中間体２−Ｎ−ＢＯＣ−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩と３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノンとのカップリングによる、化合物１５の保護された形態：３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２− メトキシ−カルボニル−２Ｎ−ＢＯＣ−アミノエチル）フェニオキシルメチル− ２−オキサゾリジノンの形成１．９ｇの２−Ｎ−ＢＯＣ−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩(前記)、２０ｍｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮａＨ（１．０当量）の混合物を、室温下で３０分間撹拌した。撹拌後、１０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１．８ｇの３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノン（前記）を添加し、再び室温下で１５分間撹拌した。反応混合物を、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１５の保護された形態：３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシ−カルボニル−２Ｎ−ＢＯＣ−アミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンを形成し、次工程に使用した。４）化合物１５の保護された形態の脱保護による化合物１５：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−アミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン二塩酸塩の形成（図４２）化合物１５の保護された形態：３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５− （４−（２−メトキシ−カルボニル−２Ｎ−ＢＯＣ−アミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノン（１．０当量、前記で合成）と、４ｍｌの２ＮＮａＯＨとを、室温下４時間処理した。混合物に、ジオキサン中の２ＮＨＣｌ溶液４０ｍｌを、０〜２５℃で３時間かけて滴下した。反応混合物を、炭酸水素ナトリウム（５当量）でクエンチし、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、３ −（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−アミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン二塩酸塩を得た。融点は１６５℃ （ｄ）であった。Ｐ．図Ｘ（元１４）に示される化合物１６：３−（４−アミジノフェニル）− ５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン１）化合物１６用の出発物質：２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ−３−（４ −ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩の合成化合物１６０．１０Ｍメタノール中の（(Ｄ又はＬ)チロシン）(１．０当量。シグマ)及び希釈１％ＨＣｌのエステル化により、出発物質２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ −３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩を得た。反応混合物を２５ ℃で１２時間撹拌し、炭酸カルシウムを用いて中和し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を以下に示す工程で使用した。前記化合物(４．３ｍｍｏｌ)、ブタンスルホン酸塩化物（６．６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５当量）の混合物を、塩化メチレン（２０ｍｌ）中、室温下で１２時間撹拌した。反応混合物を蒸発し、残渣を酢酸エチル中に溶解し、希釈ＨＣｌ、水性炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄した。乾燥するまで蒸発した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカケル、トルエン／酢酸エチル(１５：１)）により精製し、掲題の化合物を得た。２）化合物１６用出発物質３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５− メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノンの合成：以下に示す３工程手順：塩化メチレン（０．１０Ｍ）中のｐ−アミノベンゾニトリル（１．０当量、アルドリッチ）を、２，３−エポキシプロパノール（１．０当量、アルドリッチ）と共に２５℃で１２時間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、得られた粗４− （２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリルを以下に示す次工程に使用した。ジメチルホルムアミド（０．１０Ｍ）中の４−（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリル（前記、１．０当量）を２５℃で炭酸ジエチル（１．１当量、アルドリッチ）と共に撹拌し、ｔｅｒｔ−ブチルカリウム（１．１当量、アルドリッチ）と共に１１０℃で６時間撹拌した。次に、反応混合物を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジンを得、以下に示す次工程で使用した。塩化メチレン（０．１０Ｍ）中の３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジン（１．０当量、前記）を、１．１当量硫化水素、１．１当量ヨウ化メチル及び１．１当量酢酸アンモニウムと共に２５℃で撹拌した。反応混合物を６時間撹拌し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、アミジンを得、以下に示す次工程で使用した。前記で合成したアミジン１．０当量を、塩化メチレン（０．１０Ｍ）中の１．１当量ＢＯＣ−ＯＮ（２−（ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル、アルドリッチ）で保護した。次に、反応混合物を６時間撹拌し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を０．１０Ｍ塩化メチレン及び１．１当量メタンスルホン酸塩化物中でエステル化した。反応混合物を０℃で６時間撹拌し、水（５当量）でクエンチし、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノンを得た。３）中間体２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩と３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノンとのカップリングによる、化合物１６の保護された形態：３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４ −（２−メトキシ−カルボニル−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンの形成１．９ｇの２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩(前記)、２０ｍｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮａＨ（１．０当量）の混合物を、室温下で３０分間撹拌した。撹拌後、１０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１．８ｇの３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ −フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノン（前記）を添加し、再び室温下で１５分間撹拌した。反応混合物を、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１６の保護された形態：３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシ−カルボニル−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンを形成し、次工程に使用した。４）化合物１６の保護された形態の脱保護による化合物１６：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノンの形成（図４２）化合物１６の保護された形態：３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５− （４−（２−メトキシ−カルボニル−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノン（１．０当量、前記で合成）と、４ｍｌの２ＮＮａＯＨとを、室温下４時間処理した。混合物に、ジオキサン中の２ＮＨＣｌ溶液４０ｍｌを、０〜２５℃で３時間かけて滴下した。反応混合物を、炭酸水素ナトリウム（５当量）でクエンチし、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１６：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノンを得た。融点は２３６〜２３７℃であった。Ｑ．図４２に示される化合物１７：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４ −（２−カルボキシ−２−Ｎ−プロピル−スルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン１）化合物１７用の出発物質：２−Ｎ−プロピル−スルホニルアミノ−３− （４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩の合成化合物１７０．１０Ｍメタノール中の（(Ｄ又はＬ)チロシン）(１．０当量。シグマ)及び希釈１％ＨＣｌのエステル化により、出発物質２−Ｎ−プロピル−スルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩を得た。反応混合物を２５℃で１２時間撹拌し、炭酸カルシウムを用いて中和し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を以下に示す工程で使用した。前記化合物(４．３ｍｍｏｌ)、ブタンスルホン酸プロピル塩化物（６．６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５当量）の混合物を、塩化メチレン（２０ｍｌ）中、室温下で１２時問撹拌した。反応混合物を蒸発し、残渣を酢酸エチル中に溶解し、希釈ＨＣｌ、水性炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄した。乾燥するまで蒸発した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル(１５：１)）により精製し、掲題の化合物を得た。２）化合物１７用出発物質３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５− メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノンの合成：以下に示す３工程手順：塩化メチレン（０．１０Ｍ）中のｐ−アミノベンゾニトリル（１．０当量、アルドリッチ）を、２，３−エポキシプロパノール（１．０当量、アルドリッチ）と共に２５℃で１２時間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、得られた粗４− （２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリルを以下に示す次工程に使用した。ジメチルホルムアミド（０．１０Ｍ）中の４−（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリル（前記、１．０当量）を２５℃で炭酸ジエチル（１．１当量、アルドリッチ）と共に撹拌し、ｔｅｒｔ−ブチルカリウム（１．１当量、アルドリッチ）と共に１１０℃で６時間撹拌した。次に、反応混合物を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジンを得、以下に示す次工程で使用した。塩化メチレン（０．１０Ｍ）中の３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジン（１．０当量、前記）を、１．１当量硫化水素、１．１当量ヨウ化メチル及び１．１当量酢酸アンモニウムと共に２５℃で撹拌した。反応混合物を６時間撹拌し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、アミジンを得、以下に示す次工程で使用した。前記で合成したアミジン１．０当量を、塩化メチレン（０．１０Ｍ）中の１．１当量ＢＯＣ−ＯＮ（２−（ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル、アルドリッチ）で保護した。次に、反応混合物を６時間撹拌し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を０．１０Ｍ塩化メチレン及び１．１当量メタンスルホン酸塩化物中でエステル化した。反応混合物を０℃で６時間撹拌し、水（５当量）でクエンチし、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノンを得た。３）中間体２−Ｎ−プロピル−スルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシ− フェニル）プロピオン酸塩と３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノンとのカップリングによる、化合物１７の保護された形態：３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５− （４−（２−メトキシ−カルボニル−２−Ｎ−ブチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンの形成１．９ｇの２−Ｎ−プロピル−スルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩(前記)、２０ｍｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮａＨ（１．０当量）の混合物を、室温下で３０分間撹拌した。撹拌後、１０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１．８ｇの３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノン（前記）を添加し、再び室温下で１５分間撹拌した。反応混合物を、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１７の保護された形態：３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシ−カルボニル−２−Ｎ−プロピル− スルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンを形成し、次工程に使用した。４）化合物１７の保護された形態の脱保護による化合物１７：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノンの形成（図４２）化合物１７の保護された形態：３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５− （４−（２−メトキシ−カルボニル−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノン（１．０当量、前記で合成）と、４ｍｌの２ＮＮａＯＨとを、室温下４時間処理した。混合物に、ジオキサン中の２ＮＨＣｌ溶液４０ｍｌを、０〜２５℃で３時間かけて滴下した。反応混合物を、炭酸水素ナトリウム（５当量）でクエンチし、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１７：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−プロピルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２− オキサゾリジノンを得た。融点は２００℃（ｄ）であった。Ｒ．図４２に示される化合物１８：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４ −（２−カルボキシ−２−Ｎ−エチル−スルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノン１）化合物１８用の出発物質：２−Ｎ−エチル−スルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩の合成化合物１８０．１０Ｍメタノール中の（(Ｄ又はＬ)チロシン）(１．０当量。シグマ)及び希釈１％ＨＣｌのエステル化により、出発物質２−Ｎ−エチル−スルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩を得た。反応混合物を２５℃で１２時間撹拌し、炭酸カルシウムを用いて中和し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を以下に示す工程で使用した。前記化合物(４．３ｍｍｏｌ)、エチルスルホン酸プロピル塩化物（６．６ｍｍｏｌ、アルドリッチ）及びトリエチルアミン（１．５当量）の混合物を、塩化メチレン（２０ｍｌ）中、室温下で１２時間撹拌した。反応混合物を蒸発し、残渣を酢酸エチル中に溶解し、希釈ＨＣｌ、水性炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄した。乾燥するまで蒸発した後、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、トルエン／酢酸エチル(１５：１)）により精製し、掲題の化合物を得た。２）化合物１８用出発物質：３−ｐ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノンの合成：以下に示す３工程手順：塩化メチレン（０．１０Ｍ）中のｐ−アミノ−ベンゾニトリル（１．０当量、アルドリッチ）を、２，３−エポキシプロパノール（１．０当量、アルドリッチ）と共に２５℃で１２時間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、得られた粗４ −（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリルを以下に示す次工程に使用した。ジメチルホルムアミド（０．１０Ｍ）中の４−（２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ）ベンゾニトリル（前記、１．０当量）を２５℃で炭酸ジエチル（１．１当量、アルドリッチ）と共に撹拌し、ｔｅｒｔ−ブチルカリウム（１．１当量、アルドリッチ）と共に１１０℃で６時間撹拌した。次に、反応混合物を酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジンを得、以下に示す次工程で使用した。塩化メチレン（０．１０Ｍ）中の３−（４−シアノフェニル）−５−ヒドロキシメチル−２−オキサゾリジン（１．０当量、前記）を、１．１当量硫化水素、１．１当量ヨウ化メチル及び１．１当量酢酸アンモニウムと共に２５℃で撹拌した。反応混合物を６時間撹拌し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、アミジンを得、以下に示す次工程で使用した。前記で合成したアミジン１．０当量を、塩化メチレン（０．１０Ｍ）中の１．１当量ＢＯＣ−ＯＮ（２−（ＢＯＣ−オキシイミノ）−２−フェニルアセトニトリル、アルドリッチ）で保護した。次に、反応混合物を６時間撹拌し、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を０．１０Ｍ塩化メチレン及び１．１当量メタンスルホン酸塩化物中でエステル化した。反応混合物を０℃で６時間撹拌し、水（５当量）でクエンチし、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノンを得た。３）中間体２−Ｎ−エチル−スルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩と３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノンとのカップリングによる、化合物１８の保護された形態：３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシ−カルボニル−２−Ｎ−エチル−スルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンの形成１．９ｇの２−Ｎ−エチル−スルホニルアミノ−３−（４−ヒドロキシ−フェニル）プロピオン酸塩(前記)、２０ｍｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮａＨ（１．０当量）の混合物を、室温下で３０分間撹拌した。撹拌後、１０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の１．８ｇの３−ｐ−Ｎ−ＢＯＣ−アミジノ−フェニル−５−メタンスルホニルオキシ−メチル−２−オキサゾリジノン（前記）を添加し、再び室温下で１５分間撹拌した。反応混合物を、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１８の保護された形態：３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５−（４−（２−メトキシ−カルボニル−２−Ｎ−エチル−スルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノンを形成し、次工程に使用した。４）化合物１８の保護された形態の脱保護による化合物１８：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−エチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノンの形成（図４２）化合物１８の保護された形態：３−（４−ＢＯＣ−アミジノフェニル）−５− （４−（２−メトキシ−カルボニル−２−Ｎ−エチルスルホニルアミノエチル）フェニオキシルメチル−２−オキサゾリジノン（１．０当量、前記で合成）と、４ｍｌの２ＮＮａＯＨとを、室温下４時間処理した。混合物に、ジオキサン中の２ＮＨＣｌ溶液４０ｍｌを、０〜２５℃で３時間かけて滴下した。反応混合物を、炭酸水素ナトリウム（５当量）でクエンチし、酢酸エチル（０．１０Ｍ）で希釈し、水で２回洗浄し、塩水で１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１８：３−（４−アミジノフェニル）−５−（４−（２−カルボキシ−２−Ｎ−エチルスルホニルアミノエチル）フェノキシ）メチル−２−オキサゾリジノンを得た。融点は２１２℃（ｄ）であった。１４．ＣＡＭアッセイにより測定した、α_vβ₃リガンド有機模倣物による、増殖因子誘導血管形成の阻害ＣＡＭ調製物に静脈内注射した、α_vβ₃リガンドの有機模倣物による、増殖因子誘導血管形成に対する効果を、本発明における使用について評価した。１０日齢のＣＡＭ調製物を前記実施齢５Ａと同様にして使用した。ｂＦＧＦ誘導血管形成開始２４時間後、化合物１６(８１２１８)、１７（８７２９２）及び１８（８７２９３）と呼ばれる有機模倣物を別々に、２０％テトラグリコール− ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中の濃度１ｍｇ／ｍｌ（１００μｇ／胚）の１００μｌを、ＣＡＭ調製物に静脈内注射した。並列アッセイにおいて、化合物７(９６１１２)、化合物９(９９７９９)、１０(９６２２９)、１２（１１２８５４）及び１４（９６１１３）を同様に評価した。有機模倣物の効果を、４８時間後に行い、二重盲検法でフィルターディスク領域の血管分岐点の数を計数することにより行った。結果をそれぞれ図４３及び４４に示す。図４３において、化合物１４(９６１１３)、１０(９６２２９)、９（９９７９９）及び１２（１１２８５４）は、対照のｂＦＧＦ誘導及び化合物７（９６１１２）と比較して、新しい血管の分岐点の数の減少において効果的であった。図４４において、化合物１７（８７２９２）及び１８（８７２９３）は、末処理ｂＦＧＦ対照及び化合物１６（８１２１８）での処理と比較して、抗血管形成特性を示した。第三のアッセイにおいて、有機化合物７(９６１１２)、１０（９６２２９）及び１４（９６１１３）を、ペプチド６９６０１及び６６２０３と共にｂＦＧＦ誘導血管形成阻害剤として評価した。このアッセイのために、２５０μｇ／ｍｌの有機化合物を、実施例７Ｂに記載されるようにして、ｂＦＧＦ処理１８時間後に投与した。結果を図２８に示す。化合物１４（９６１１３）及び１０（９６２２９）はほぼ完全に、ｂＦＧＦにより誘導された新しい血管の形成を阻害した。したがって、前記実施例は、インテグリンα_vβ₃は、種々の刺激により誘導される血管形成において鍵となる役割を果たし、更に、α_vβ₃は、新血管形成により特徴付けられる疾患用の本発明のα_vβ₃アンタゴニストの価値のある治療学的標的となることを実証している。前記の詳細な説明は、当業者が本発明を実施するのに十分なものであると考える。本発明は、寄託された細胞系によりその範囲を制限されるものではない。なぜなら、寄託された細胞系は本発明の１態様を単に示すものとして意図されたものであり、機能的に等価なあらゆる細胞系は本発明の範囲に含まれるからである。物質の寄託は、本明細書に含まれる記載が、ベストモードを含む本発明のあらゆる態様の実施に不適切であるということ、及び請求の範囲を示される詳細な説明に限定するものとして解釈されるという承認を構成しない。実際、本明細書に示されたものに加えて、本発明の種々の修飾が、前記記載から当業者に明らかであり、これらは請求の範囲に含まれる

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者チェレッシュディヴィッドエイアメリカ合衆国カリフォルニア州 92007 カーディフシーヴィレッジサークル 2108

Claims

【特許請求の範囲】１．包装材料及び該包装材料に含まれる医薬を含む製品であって、該医薬は、組織における血管形成の阻害に有効であり、該包装材料は、該医薬は血管形成の阻害により状態を治療するために使用することができることを示すラベルを含み、該医薬は、マトリックスメタロプロテイナーゼのカルボキシ末端ドメインの一部を含むアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含むα_vβ₃アンタゴニストの血管形成阻害量を含み、該ポリペプチドは、インテグリンα_vβ₃に結合することができることを特徴とする製品。２．ポリペプチドが、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８に示されるアミノ酸残基を含んでいる、請求の範囲第１項記載の製品。３．組織が炎症を起こしており、状態が関節炎又は関節リウマチである、請求の範囲第１項に記載の製品。４．組織が固形腫瘍又は固形腫瘍転移である、請求の範囲第１項に記載の製品。５．組織が網膜組織であり、状態が網膜症、糖尿病性網膜症又は黄斑変性症である、請求の範囲第１項に記載の製品。６．マトリックスメタロプロテイナーゼのカルボキシ末端ドメインの一部を含むアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含むα_vβ₃アンタゴニストであって、該ポリペプチドは、インテグリンα_vβ₃に結合することができることを特徴とするアンタゴニスト。７．ポリペプチドが、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８に示されるアミノ酸残基を含んでいる、請求の範囲第６項記載のアンタゴニスト。８．ポリペプチドが融合タンパク質である、請求の範囲第６項記載のアンタゴニスト。９．ポリペプチドが、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８に示されるアミノ酸残基を有している、請求の範囲第６項記載のアンタゴニスト。 10．薬学的に許容しうる担体中に、組織における血管形成を阻害するのに十分な量の請求の範囲第６項に記載のα_vβ₃アンタゴニストを含む医薬。 11．血管形成阻害量のα_vβ₃アンタゴニストを含む組成物を、組織に投与することを特徴とする組織における血管形成の阻害方法。 12．アンタゴニストが、融合タンパク質、ポリペプチド、誘導体化ポリペプチド、環状ポリペプチド、モノクローナル抗体又は有機模倣化合物である、請求の範囲第11項に記載の方法。 13．インテグリンα_vβ₃アンタゴニストが、フィブリノゲンのα_vbβ₃への結合と比較して、フィブリノゲンのα_vβ₃への結合を優先的に阻害する、請求の範囲第11項に記載の方法。 14．α_vβ₃アンタゴニストが、マトリックスメタロプロテイナーゼのカルボキシ末端ドメインの一部を含むアミノ酸残基配列を有するポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、インテグリンα_vβ₃に結合することができる、請求の範囲第11項に記載の方法。 15．ポリペプチドが、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８に示されるアミノ酸残基を含んでいる、請求の範囲第11項に記載の方法。 16．ポリペプチドが融合タンパク質である、請求の範囲第11項に記載の方法。 17．ポリペプチドが、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８に示されるアミノ酸残基を有している、請求の範囲第11項に記載の方法。 18．組織が炎症を起こしており、血管形成が炎症組織血管形成である、請求の範囲第11項に記載の方法。 19．組織が関節炎を起こしている、請求の範囲第18項に記載の方法。 20．炎症組織が、関節リウマチの哺乳類に存在している、請求の範囲第19項に記載の方法。 21．組織が、糖尿病性網膜症患者の網膜組織であり、血管形成が網膜血管形成である、請求の範囲第11項に記載の方法。 22．組織が、固形腫瘍又は固形腫瘍転移であり、血管形成が腫瘍血管形成である、請求の範囲第11項に記載の方法。 23．投与が、静脈内、経皮、滑液内、筋肉内又は経口投与である、請求の範囲第 11項に記載の方法。 24．投与を、化学療法と組み合わせて行う、請求の範囲第22項に記載の方法。 25．投与が、静脈内単一投与を含んでいる、請求の範囲第11項に記載の方法。 26．患者の固形腫瘍組織退行を誘導する方法であって、固形腫瘍組織の新血管形成を阻害するのに十分な治療学的有効量のインテグリンα_vβ₃アンタゴニストを含む組成物を患者に投与することを特徴とする方法。 27．アンタゴニストが、融合タンパク質、ポリペプチド、誘導体化ポリペプチド、環状ポリペプチド、モノクローナル抗体又は有機模倣化合物である、請求の範囲第26項に記載の方法。 28．α_vβ₃アンタゴニストが、請求の範囲第６項に記載のα_vβ₃アンタゴニストである、請求の範囲第26項に記載の方法。 29.患者の新血管形成を受けている固形腫瘍組織の成長を阻害する方法であって、固形腫瘍組織の成長を阻害するのに十分な治療学的有効量のインテグリンα_v β₃アンタゴニストを含む組成物を患者に投与することを特徴とする方法。 30．アンタゴニストが、融合タンパク質、ポリペプチド、誘導体化ポリペプチド、環状ポリペプチド、モノクローナル抗体又は有機模倣化合物である、請求の範囲第29項に記載の方法。 31．α_vβ₃アンタゴニストが、請求の範囲第６項に記載のα_vβ₃アンタゴニストである、請求の範囲第29項に記載の方法。 32．新血管形成が起こっている炎症組織を有する患者を治療する方法であって、治療学的有効量のインテグリンα_vβ₃アンタゴニストを含む組成物を患者に投与することを特徴とする方法。 33．アンタゴニストが、融合タンパク質、ポリペプチド、誘導体化ポリペプチド、環状ポリペプチド、モノクローナル抗体又は有機模倣化合物である、請求の範囲第32項に記載の方法。 34．α_vβ₃アンタゴニストが、請求の範囲第６項に記載のα_vβ₃アンタゴニストである、請求の範囲第32項に記載の方法。 35．新血管形成が網膜組織に起こっている患者を治療する方法であって、新血管形成阻害量のインテグリンα_vβ₃アンタゴニストを含む組成物を患者に投与することを特徴とする方法。 36．アンタゴニストが、融合タンパク質、ポリペプチド、誘導体化ポリペプチド、環状ポリペプチド、モノクローナル抗体又は有機模倣化合物である、請求の範囲第35項に記載の方法。 37．α_vβ₃アンタゴニストが、請求の範囲第６項に記載のα_vβ₃アンタゴニストである、請求の範囲第35項に記載の方法。 38．血管形成術後に平滑筋細胞移動が起きている組織における再狭窄患者を治療する方法であって、治療学的有効量のインテグリンα_vβ₃アンタゴニストを含む組成物を患者に投与することを特徴とする方法。 39．アンタゴニストが、融合タンパク質、ポリペプチド、誘導体化ポリペプチド、環状ポリペプチド、モノクローナル抗体又は有機模倣化合物である、請求の範囲第38項に記載の方法。 40．α_vβ₃アンタゴニストが、請求の範囲第６項に記載のα_vβ₃アンタゴニストである、請求の範囲第38項に記載の方法。 41．患者における、新たな成長を支持するために血液供給を必要とする組織への血液供給を減少させる方法であって、該組織への該血液供給を減少させるのに十分な治療学的有効量のインテグリンα_vβ₃アンタゴニストを含む組成物を該患者に投与することを特徴とする方法。 42．アンタゴニストが、融合タンパク質、ポリペプチド、誘導体化ポリペプチド、環状ポリペプチド、モノクローナル抗体又は有機模倣化合物である、請求の範囲第41項に記載の方法。 43．α_vβ₃アンタゴニストが、請求の範囲第６項に記載のα_vβ₃アンタゴニストである、請求の範囲第41項に記載の方法