JP2000516343A - キャピラリー電気泳動酵素イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生体認識部位を有する酵素のチャネル電気泳動を用いる、高感度酵素増幅アッセイを実行するための方法および装置が開示される。分析物と生体認識部位を有する酵素との結合反応、および電気泳動分離（これは、酵素増幅検出法を用いる）を組み合わせて、単純性、定量的感度、および迅速な分析を提供する、アッセイ方法および装置が提供される。キャピラリー電気泳動フォーマットを用いる、高感度の触媒増幅アッセイ（catalytically-amplified assay）もまた開示される。この方法において、電気泳動の前の結合反応は、均一または不均一であり、かつ直接的または競合的である。電気泳動を用いて高感度の自動化された触媒増幅アッセイを実行するための方法および装置が、マイクロスケールのフォーマットで実施され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 キャピラリー電気泳動酵素イムノアッセイ 本願は、米国特許出願第08/386,224号（1995年２月９日出願）の一部継続出願 であり、米国特許出願第08/386,224号は、米国特許出願第07/944,846号（1992年 ９月14日出願、現在は放棄されている）の継続出願である。 発明の分野 本発明は、一般に、化学種を分析するための技術に関する。詳細には、動電学 的分離に関与する分析のための技術に関する。 発明の背景 キャピラリー電気泳動は、化学成分を分離するための周知の手順である。分離 すべき分子を含むサンプル溶液を、電気泳動媒体を含むある長さのキャピラリー 管に配置する。キャピラリーを横切る電場を印加すると、サンプル中の異なる成 分は、電気泳動媒体中でのそれらの相対的な電気泳動易動度に依存して、キャピ ラリーの反対に荷電した端に向かって、異なった速度で移動する。種々の電気移 動速度に起因して、サンプル成分は、キャピラリーに沿って進むにつれて、次第 に異なるゾーンまたはグループへと分けられる。キャピラリーに沿った同じ位置 で、サンプルの成分が検出される。 電気泳動は、タンパク質、核酸、および細胞のような荷電した物質の分離に適 用されてきた。これらの分離は、荷電密度、分子サイズ、および移動相添加剤と の分配または複合体化における差異に依存する。米国特許第5,061,361号は、ナ ノリットル容積のサンプルをキャピラリー管に導入し、そしてシステムに電場を かけて（impose）、荷電した成分の分離を行う、キャピラリーゾーン電気泳動シ ステムに関する。管の長さに沿った移動の後、サンプル成分を、紫外線吸光度を 用いて検出する。米国特許第5,084,150号は、分離の動電学的方法に関し、ここ で、移動している荷電コロイド粒子の表面は、分離されるべきサンプル分子と選 択的に相互作用するように処理される。電場は、コロイド粒子とサンプルとを含 むキャピラリー管上にかけられて、分離が達成される。米国特許第5,045,172号 は、キャピラリー管の両端に電極が取り付けられ、そして検出器が管に結合され ているキャピラリー電気泳動装置に関する。米国特許第4,181,589号は、電場を 用いて生物学的細胞を分離するための方法に関する。上記の米国特許は、本明細 書中で参考として援用される。 種々の型のアッセイが、臨床的診断として使用される。種々のフォーマットの イムノアッセイは、体液中の分析物を測定するための臨床的診断において広範囲 に用いられる。イムノアッセイはまた、研究的、工業的、および環境的用途にお いて、複合体混合物中の分析物の高感度かつ特異的な測定に用いられる。例えば 、酵素結合イムノソルベントアッセイ（「ELISA」）は、血清および他の生物学 的サンプル中のサイトカイン、甲状腺刺激ホルモン(「TSH」）、および他の分析 物のレベルを測定するために用いられてきた。Engvall，Methods in Enzymology ，70：419(1980)；SchurrsおよびVan Weeman，J ．Immunoassay，1:229(1980)； およびScharpeら、Clin ．Chem.,22:733(1976)は、酵素イムノアッセイ法の一般 的な参考文献であり、それらの全体は、本明細書中で参考として援用される。 特許協力条約(「PCT」）公報第WO 93/220553号および同第WO 93/22054号、な らびに米国特許第5,304,487号（本明細書中で参考として援用される）は、マイ クロスケールの分析装置において実行される種々の型のアッセイを記載する。流 体サンプル中で予め選択された分析物の存在を検出するための装置、またはサン プルを含む流体細胞を分析するための装置が開示される。装置は、代表的には、 サンプル入口ポートと中程度のスケールの（mesoscale）フローシステムとを有 するように微小に作製された（microfabricated）固体基質から作製される。他 の実施態様は、種々のフロー制限設計（flow restriction design）を有する。 この固体基質は、数ミリメートルの厚みおよび約0.2〜2.0平方cmであり得る。フ ローチャネルは、代表的には、0.1μｍ〜500μｍのオーダーである。この装置は 、広範な、種々のフロー導入手段を用いた、自動化され、高感度であり、かつ迅 速である試験において用いられる。 遊離および結合している抗原の電気泳動分離を用いるイムノアッセイが開発さ れてきた。キャピラリー電気泳動を用いるアッセイは、迅速な分離および正確な 定量を提供する。さらに、キャピラリー電気泳動のマイクロ容積スケールは、必 要とされるサンプルおよび試薬の量を低減するだけでなく、生成する廃棄物の量 も低減する。しかし、多くのアッセイは、10^-10〜10^-12Molarのレベルでの分析 物の定量を必要とする。分析物のこれらの低い濃度を仮定すると、キャピラリー 電気泳動と結合させたレーザー誘導蛍光検出器でさえも、分析物を検出するため に十分ではあり得ない。全体として、感度、速度、およびコストは、イムノアッ セイの設計および実施において考慮されるべき重要な因子である。 発明の要旨 本発明は、サンプル中の分析物の分析法を包含し、そしてキャピラリー電気泳 動のフォーマットで生体認識部位を有する化合物を用いて酵素増幅を行うことに より、きわめて少量のサンプルでのキャピラリー電気泳動を使用して分析物の測 定が迅速に行われ得ることの発見に基づく。 本発明の１つの目的は、生体認識部位を有する酵素のキャピラリー電気泳動を 使用する高感度の酵素増幅アッセイを行うための方法および装置を提供すること である。分析物の生体認識部位を有する酵素との結合反応と、酵素増幅検出方法 を使用する電気泳動分離との組合せは、簡便、定量的、高感度、かつ迅速な分析 を提供するアッセイ法および装置を提供する。本発明の別の目的は、電気泳動前 の結合反応が異種間または同種間であるキャピラリー電気泳動フォーマットを使 用する高感度酵素増幅アッセイを提供することである。本発明の別の目的は、キ ャピラリー電気泳動を使用する酵素増幅イムノアッセイを提供することである。 本発明のさらに別の目的は、電気泳動を使用する高感度自動化酵素増幅アッセイ を行うための方法および微小規模の装置を提供することである。 従来の電気泳動とは異なり、本発明により利用される電気泳動は、検出可能な 生成物および／または競合剤(競合剤の量は目的の分析物に比例する)の電気泳動 速度における固有のまたは導入された差異、およびこれらの成分を混合および分 離するための所定の電気泳動媒体中の反応物を利用する。化学種の電気泳動的混 合は、化学分析の分野における従来の方法に勝る特別な利点を与える；すなわち 、 競合剤と反応物との電気泳動的混合は、そのゾーン内に含まれる化学種の実質的 な希釈無しに行われる。印加電位および選択された電気泳動媒体の影響下、化学 種は個別の電気泳動易動度を所持し得、これが化学種に本質的にバルク溶液と独 立して電気泳動させる。従って、競合剤のゾーンおよび反応物のゾーン(これら は電場中で異なる電気泳動易動度で動く)は、バルク溶液の容量添加なしに相互 浸透し得る。さらに、電気泳動的混合は２つのゾーンを完全に合流させるための 乱流を必要としない。従って、本発明の化学分析法は従来の化学分析法よりも簡 便であり、そしてより効果的である。高電位(例えば、300〜2000ボルト／cm)に おいて、２つのゾーンの完全な電気泳動的混合は、しばしばミリ秒のうちに達成 され得る。 本発明の方法の電気泳動分離能は、検出可能な生成物を生成する化学反応の前 ならびに後での、化学種の分離を考慮に入れている。この強力な能力は、従来の 化学分析法には無かった多くの利点を与える。当業者は、競合剤および反応物の ゾーンの連動および離脱の制御を可能にする本発明の方法の実験的パラメーター の範囲、ならびに検出可能な生成物の選択的モニタリングを操作し得る。結果と して、本発明の分析法は、単一のおよび複数の分析物を含むサンプルの分析のた めの任意の化学反応を包含する。電気泳動的混合を使用して行われる反応は、触 媒量の化学種の増幅を提供し、それにより低い検出レベルが直ちに達成され得る 触媒反応である。 本発明の方法は、アッセイの実行の新しい概念に関し、ここで第一の反応物と 競合剤を含むサンプルとは電気泳動的に接触させられ、そして化学反応が引き起 こされて検出可能な生成物が形成または枯渇される。代表的には、サンプルは、 目的の分析物および競合剤が競合または直接反応を起こした反応溶液のアリコー トである。すなわち競合剤は、分析物と直接に、または分析物と競合してのいず れかの結合反応に関係する生体認識部分を有する。結合反応後、反応溶液のアリ コートをチャンネルに導入し、そして電位に供する。実質的には、競合剤の第二 の反応部分がチャンネル中の第一の反応物との反応を触媒して検出可能な生成物 を形成または枯渇する。代表的には、競合剤は抗原、抗体、DNA、またはPNAと連 結した酵素である。 本発明の実施態様において、第一の反応物およびサンプルは電気泳動媒体を含 むチャンネル内に導入される。第一の反応物と競合剤とを混合し、そしてチャン ネルに沿って検出可能な生成物を移動させるのに十分な電位が、チャンネルの長 さに沿ってかけられる。より好適な実施態様において、検出可能な生成物は、検 出され、定量され、そして分析物の量が間接的に測定される。 本発明はまた、本発明の方法を行う際に有用な分析デバイスを特徴とする。そ の最も簡単な形態において、分析デバイスは、電気泳動媒体および検出可能な生 成物を形成または枯渇するための競合剤の第二の反応部分と反応するための第一 の反応物を含むチャンネルを有する。第一の反応物は、電気泳動の動きが第一の 反応物および競合剤の第二の反応部分を、検出可能な生成物を形成または枯渇さ せるように反応させるように、競合剤と分離して設置され得る。本発明の別の実 施態様において、分析デバイスは、電気泳動装置、検出器、および／または定量 分析器を有し得る。本発明の特定の実施態様において、チャンネルはキャピラリ ーであるか、キャピラリー配列の一部であるか、またはマイクロチップのような チップ上に存在するフローシステムを規定する。 本発明の別の実施態様において、分析デバイスはサンプル注入ゾーンおよびチ ャンネルを有する。サンプル注入ゾーンはチップ内のウェルであってもよい。代 表的には、サンプル注入ゾーンは結合反応の場所である。この実施態様の分析デ バイスはまた、チャンネル内に導入される電気泳動媒体および第一の反応物を有 する。上記に記載されるデバイスに存在する多くの特徴および概念が、電気泳動 装置、検出器および／または定量検出器のような本発明のこれらの実施態様にお いて存在する。好ましい実施態様において、デバイスはマイクロチップのような チップである。チップは、少なくともサンプル注入ゾーンおよびチャンネルを含 む。しかしながら、複数のサンプル注入ゾーンおよびチャンネルが、本発明によ り意図される。 本発明の利点は以下を含む。本発明の方法は、サンプル中の１つ以上の分析物 の迅速な分析を可能にする。分析に使用されるキャピラリーの体積が小さい(例 えば、10〜100ナノリットル／cm)ため、本発明による分析のために必要であるサ ンプルの体積が非常に小さい；例えば、わずか１ナノリットルが極小のキャピラ リーでの分析で１分あたり消費され得、従って本発明はサンプルのより経済的な 分析を可能にする。サンプル中の複数の分析物が、本発明により同時に分析され 得、そして１つの生成物のみが、または所望である場合はいくつかの生成物が測 定され得る。 本発明の方法の別の利点は、化学的成分をキャピラリーシステムを通して進め るための機械的なポンプが必要ではないことである。成分はシステムを通して電 気浸透で、すなわちそれらの電荷および電場内での易動度の力により移送される 。従って、多電荷である成分はキャピラリーを通って対電荷の極へ素早く移送さ れる；同様に、相対的に電荷のない成分はゆっくりと動く。 システムは、実行間に、電気浸透によるキャピラリーの１つの極の方への緩衝 液の正味の対流的流れがあるように、自己流水(self-flushing)であるように設 計され得る。電気浸透は、キャピラリー壁のイオンの正味の負電荷または正電荷 により生じる性質である。これらのイオンは電位が印加されたときにキャピラリ ーに向かって動き、そしてそれらとともにキャピラリー内の液体を引きずる(dra g)。この引きずりを減少させる効果がある；すなわち、キャピラリーの内壁に最 も接近した液体はキャピラリーの中央にある液体よりも速く引きずられる。電気 浸透の１つの効果は、キャピラリーが実行間に機械的に流される必要が無いこと である。なぜならば、電気泳動システムが１〜70nL／分の速度でキャピラリーを 通して緩衝液を贈り続けているからである。電気浸透効果はキャピラリー壁の電 荷を変化させことにより、またはキャピラリーの内壁をコートする重合体の粘性 を変化させることにより、またはキャピラリー内の溶液の粘性を変化させること により変化し得る。 本明細書中で記載される方法のパラメーター(例えば、サンプル体積、反応物 体積、電位、キャピラリー長、電気浸透流、など)の制御は、化学反応自身にわ たる洗練された制御、従ってシステムの感受性の制御を当業者に与える。 本発明の方法の別の利点は、化学的成分が反応させられる間の時間が電位を増 大または縮小させることにより制御され得ることである。例えば、化学反応がゆ っくりとしか起こらない場合、化学的成分により多くの反応時間を与え、そして 生成物を形成または枯渇させるために、電位は縮小されるかまたは切られ得る。 あるいは、化学反応が素早く起こる場合、生成物はそれが形成されるかまたは枯 渇されるにつれて分離されるように、電位が増大され得る。このことが分析に必 要な時間を実質的に短縮する。 本発明によるサンプルの分析は、化学反応の初期設定が作成された後は、繰り 返しおよびルーチン的に実行され得る。サンプル中の特定の分析物のための試験 は、キャピラリー中の他の成分(すなわち、反応物、未反応の分析物、または混 入物)と比較して生成物のピークがいつ検出器を通過するかがいったん解れば、 多数のサンプルに対してルーチン的に実行され得る。さらに、複数の分析物が本 発明により同時に分析され得る。より複雑な反応もまた、本発明により分析可能 である。例えば、競合剤(a)は生成物(a)の形成を触媒する；競合剤(b)は生成物( b)を形成する；そして競合剤(c)は生成物(a)を形成する。競合剤(a)および(c)が 電場中で異なる電気泳動易動度を保持するならば、競合剤(a)および(c)のそれぞ れに対する生成物(a)の分析は本発明により容易に完了される。さらに、生成物( a)および(b)が検出に対して異なる性質を保持する場合、これらの生成物もまた 、容易に分析される。従って、同じ生成物を生成する複数の反応および異なる生 成物を生成する複数の反応が、本発明により分析され得る。 本発明は、異なる反応物を使用する多くの異なる分析物の分析を包含する。競 合剤または反応物の例は、以下を含むがそれらに限定されない。競合剤が酵素を 有する場合、反応物は酵素に対する基質であり得る。一方、競合剤が基質部分を 有する場合、反応物は基質を生成物に変換し得る酵素であり得る。競合剤または 反応物はまた、分析物の定量が望まれる場合に化学量論的に生成物へ変換され得 るか、または分析物の単なる検出が望まれる場合に非化学量論的に生成物へ変換 され得る任意の基質を含む。本発明により検出され得る生成物は、任意の従来の 手段により検出可能な性質(例えば、熱量、電磁的エネルギー、照射、または蛍 光)を保持する任意の基質を含む。検出の従来の手法は、本発明により使用され 、そして本明細書中に記載される。 本発明のさらなる利点は、生体認識部位を有する競合剤と共に酵素増幅検出方 法を使用する分析物のアッセイを行うために達成される簡便性、速度、および感 受性を含む。本発明のアッセイは、人および動物の健康のルーチンスクリーニン グおよびモニタリング、ならびに環境的モニタリングおよび工業的プロセシング を含む広範な診断試験に応用可能である。血清のような複雑な混合物由来の生体 認識部位を有する酵素のオンラインでの増幅および定量が、感受性電気泳動フォ ーマットで行われる。詳細には、酵素増幅と共にキャピラリー電気泳動フォーマ ットを使用して、アッセイが15分以内でルーチン的に処理され得る。この方法は 、より少ない手動プロセシングを含み、そして完全に自動化され得る。10^-10モ ル濃度以下の検出感度が容易に達成される。さらに、チャンネル電気泳動フォー マットは、容易なアッセイ最適化およびアッセイ設計の柔軟性に対する増幅およ び検出プロセスの制御を提供する。さらに、多チャンネルデバイスは、処理量を 劇的に増加し得る。 本発明のこれらのおよび他の目的、特色、および利点が、以下の図面、記述、 および請求の範囲から明らかとなる。 図面の簡単な説明 図1(a)〜(d)は、本発明の好適な実施態様の一部である異種競合反応の工程を 概略で表したものであり、ここで中塗りの円は定量される分析物を表し、「Ｙ」 は固定化抗体であり、そしてハッシュテール(hashed tail)のついた中空きの円 は競合剤である。 図2(a)〜(d)は、本発明の好適な実施態様の一部である異種直接反応の工程を 概略で表したものであり、ここで中塗りの円は定量される分析物を表し、「Ｙ」 は固定化抗体であり、そしてハッシュテールのついた中空きの円は競合剤である 。 図3(a)および3(b)は、本発明の好適な実施態様の一部である同種反応の工程を 概略で表したものであり、ここで中塗りの円は定量される分析物を表し、そして ハッシュテールのついた中空きの円は競合剤である。競合剤のハッシュテール部 分と重なる中塗りの円を有する化合物は、分析物-競合剤複合体を表す。 図4(a)〜(g)は、本発明のプロセスを概略で例示したものであり、ここで２つ のゾーン(a)は互いに接近し、(b)は化学的接触を起こして生成物の生成を開始し 、(c)は重ね合わせ(superipose)になり、(d)は次々に相互浸透し、(e)は遊離し 始め、(f)は完全に遊離し、そして(g)は互いに離れていく。点により示される生 成 物は、同時に形成され、そしてゾーン内で反応化学種から電気泳動的に分離され る。 図5(A)〜5(C)は、EMCA酵素アッセイにおける電気泳動図の概略を表したもので あり、ここで(A)ESはPよりも速く動き、そして(B)PはESよりも速く動き、そして (C)生成物の相対易動度がそれらを形成するイソ酵素の易動度よりもゆっくりで ある相対易動度による複数のイソ酵素アッセイである。 図6(a)および6(b)は、本発明により印加された電位のプログラムを示し、ここ で電圧はゼロまでおとされ、次いで再び印加され(上部)、そして電気泳動図(下 部)を得る。図6(a)は異種競合または直接反応で得られる電気泳動図である。図6 (b)は同種反応で得られる電気泳動図である。 図７は、本発明の方法を実行するのに有用である装置の概略を図示したもので ある。 図８は、本発明の分析デバイスのチャンネル平面における断面図を描いた概略 を表したものである。 図9(a)および9(b)は、(a)サンプルの導入プロセス、および(b)オフセットピン チ(offset pinched)注入器を用いる電気泳動分離プロセスを描いた概略を表した ものである。 図10は、本発明の好適な分析デバイスの多チャンネルチップのチャンネル平面 における断面図を描いた概略を表したものである。 図11は、本発明の多チャンネルチップ分析を行うための集積装置の概略を表し たものである。 図12(a)〜(f)は、340nmにおけるNADPHの吸収における増加を、ゼロ電位で(a) ２、(b)４、(c)６、(d)８、(e)10、および(f)28分で示している。 図13(a)および13(b)は、G-6-PDHの分析のために(a)高電位、および(b)低電位 で作成された電気泳動図である。 図14(a)および14(b)は、(a)電気泳動が開始される前に蓄積されたNADPH、およ び(b)G-6-PDHが検出窓を通過する直前に蓄積されたNADPHから得られる累積ピー クを示す電気泳動図である。 図15は、ゼロ電位に切り替えることによるNADPHの蓄積を示す電気泳動図であ る。 図16は、検出されたNADPH生成物のピーク領域とG-6-PDH分析物の対応する濃度 との間の関連のプロットである。 図17(a)および17(b)は、(a)高電圧、および(b)低電圧に対する連続電位モード における、期待される電気泳動図（時間対蛍光シグナル）を示している。 図18は、T3電気泳動媒介微量分析酵素イムノアッセイに対する、インキュベー ション時間(分)対蛍光シグナルのプロットである。 図19は、8.0ng／mLのT3を有するT3血清標準を使用するT3電気泳動媒介微量分 析酵素イムノアッセイに対して行われた電気泳動図を示す。20kVの電位が２分間 印加され、続いてゼロ電位で２分間インキュベーションし、続いてアッセイの合 図(remainder)に対して10kVの電位を印加した。 図20は、T3電気泳動媒介微量分析酵素イムノアッセイに供された、血清標準中 の種々の既知濃度のトリヨードチロニン(「T3」)に対する一連の電気泳動図（時 間対蛍光シグナル）を示す；すなわち測定された蛍光シグナルは、T3アルカリホ スファターゼ結合体により生成された蛍光生成物のものであり、その量は最初の 血清サンプル中のT3の量と関連している。 図21は、T3電気泳動媒介微量分析酵素イムノアッセイに対する較正曲線であり 、ここでT3濃度(ng／mL)は対蛍光シグナルでプロットされている。 発明の詳細な説明 本明細書中で使用される限り、用語「第１反応物」は、用語「反応物」と相互 交換可能に使用され得ることに留意すべきである。第１反応物は酵素基質であり 得る。 用語「競合剤」は、第2反応物部分および生体認識部分を有する化合物である 。競合剤の第2反応物部分および生体認識部分は直接連結していてもよく、ある いはリンカーまたは他の実体を介して独立して結合していてもよい。第2反応物 部分は典型的には酵素であるが、第1反応物との反応を触媒して検出可能な生成 物を形成または消失させる他の実体であってもよい。生体認識部分は、目的の任 意の分析物、特に抗原および生体分子(例えば、抗体、DNAおよびRNA)と反応する 能 力、会合する能力、または結合する能力を有する部分である。生体認識部分とし ては、親和性リガンド、抗体、抗原、酵素およびそれらの基質、ペプチド、ペプ チド核酸、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ビオチンおよび それらの標的結合複合体、レクチンおよびそれらの標的炭水化物結合複合体、な らびに細胞レセプター結合タンパク質およびそれらの相補的または標的結合生成 物(補因子、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビターおよび刺激物質(stimul ator)を包含する)が挙げられるが、これらに限定されない。生体認識部分はまた 、オルガネラ、有機体および組織片に会合し得るレセプターであり得る。生体認 識技術およびその種の参考文献は、Morganら、Clin ．Chem.，42:193-209(1996) およびMattosら、Nature Biotechnol，14:595-599(1996)であり、これらは本明 細書中に参考として援用される。好ましい実施態様では、競合剤は酵素標識抗原 、酵素標識抗体、またはペプチド核酸(「PNA」)で標識された酵素である。PCT公 開WO 92/20702およびWO 92/20703はPNAの合成および性質を開示し、これは本明 細書中に参考として援用される。 本明細書において使用される限り、用語「競合剤」は特定の適用においては「 分析物」と呼ばれる化合物を意味し得る。すなわち、チャネルまたはキャピラリ ー中への「競合剤」の導入はチャネルまたはキャピラリー中への「分析物」の導 入と等価であり得る。換言すれば、本発明の特定の実施態様において、「分析物 」がチャネル中に導入され、そしてこれが化学反応に関与して生成物を生成し得 る。他の実施態様において、「競合剤」(例えば、免疫学的活性種)がチャネル中 に導入され、そしてこの競合剤の第2反応物部分が第1反応物と反応して検出可能 な生成物を形成する。競合剤が使用される本発明の特定の局面において、分析物 の量はチャネル中に導入された競合剤の量によって間接的に決定される。競合剤 が使用される本発明の他の局面において、分析物の量は、存在する分析物-競合 剤複合体の量によって間接的に決定される。 用語「生成物」は、しばしば「検出可能な生成物」を意味し、これは例えば第 1反応物と第2反応物部分との間の相互作用によって形成される。用語「キャピラ リー」および「チャネル」はしばしば相互交換可能に使用されるが、ただし、「 キャピラリー」を必要とする特定の実施態様に特に言及する場合を除く。用語 「容器」は、試薬の混合または反応が起こり得る任意の領域、ゾーンまたは位置 をいう。好ましい実施態様においては、容器は、容器中に存在する試薬に対して 不活性な材料で作られた、囲まれた領域、ゾーンまたは位置である。容器の例は 当業者に公知のもののなかでもとりわけ、カップ、ビーカー、フラスコ、試験管 、シリンジ、カラム、キャピラリー、チャネル、マイクロタイタープレートおよ びマイクロウェルである。 用語「固定化反応物」は、固定領域中にとどまり、そして分析物と会合し得る 任意の化学種をいう。固定化反応物と分析物との間の会合は、分析物が固定化反 応物の固定領域中に残留するように、当業者に公知の種々の手段によって起こり 得る。固定化反応物は、物理的吸着または化学的結合を包含する種々の手段によ って固定領域に残留し得る。好ましい実施態様では、固定化反応物は固定化抗体 または固定化PNAである。 用語「分析物−競合剤複合体」は、反応物と競合剤との会合によって形成され る種をいう。会合は、競合剤の生体認識部分に関連する、当業者に公知の任意の 手段によって行われ得る。 本発明は、試料中の分析物の存在および／または濃度を決定するための新規な 方法に関し、この方法は、試料を生体認識部分と第2反応物部分とを有する競合 剤に接触させる工程、次いでこの反応溶液のアリコートをキャピラリー電気泳動 系に配置して、第1反応物(例えば酵素基質)を検出可能な生成物に転換する化学 反応を開始させる工程による。化学反応の開始は電気泳動的移動または電気浸透 流による競合剤と第1反応物との混合に依存し、そして生成物の検出は検出器へ の生成物の輸送に依存する。 化学反応によって生成または消失した生成物の検出が分析物の指標である。分 析物の決定が定量的である場合、第1反応物から生成物への転換または生成物の 消失は化学量論的である。第1反応物から生成物へと化学量論的に転換する場合 、検出される生成物の測定を用いて、試料中に存在する分析物の量が計算され得 る。このように、本発明の方法は試料中の分析物の存在の測定を可能とする。 本発明のキャピラリー電気泳動法は試料中の分析物の決定のための3つの段階 を伴う。すなわち、競合剤と第1反応物との混合；化学反応それ自体；および、 その生成または消失が関心のある分析物の存在、濃度、または量の指標となる種 の検出、である。 本発明に従うアッセイを実施するのに必要とされる時間(t_assay)は以下の時間 段階の各々を包含する：分析物と反応物との電気泳動的混合のために必要とされ る時間(t_mix)、化学反応が起こる時間(t_rxn)、および検出可能な種を検出器に輸 送するために必要とされる時間(t_det)： t_assay＝t_mix＋t_rxn＋t_det (1) 生成物を形成するための分析の混合段階および反応段階の実施に利用できる時間 ウィンドウ(t_form)は一般に、分析物の注入とそれが検出器を通過するまでの間 の時間間隔に限定される： ここでlは注入点から検出点まで測定したキャピラリーの有効長であり、Lは電位 差Vが印加されるキャピラリーの全長であり、μ_emは所与の電気泳動媒体におけ る分析物の電気泳動易動度であり、そしてμ_eoはこのキャピラリー電気泳動系の 電気浸透流である。 1．概要 本発明の実施で用いられるプレ電気泳動反応の簡単な概要を図1〜3に示す。図 1は本発明の好ましいアッセイ方法の一部としての不均一競争反応を示す。図1(a )において、固定化抗体(水平の「Y」で表される)が容器中に存在する。黒丸は測 定される分析物、例えば抗原である。分析物は固定化抗体と接触し、そして図1( b)に示す固定化抗体に結合する。次に、細かく刻まれた尾(hashed tail)付きの 白丸で表される過剰の競合剤を溶液に加える。細かく刻まれた尾の部分は競合剤 の生体認識部分を表し、そして白丸は競合剤の第2反応物部分を表す。第2反応物 部分は典型的には酵素である。図1において、競合剤は酵素標識された抗原であ り得、そのため競合剤は固定化抗体の結合部位に関して分析物と競合する(図1(c ))。競争反応の完了の後に容器から除去されるアリコート(図1(d))が未結合の競 合剤を本質的に含むようにするために、過剰の競合剤が使用される。しかし、反 応が分析物と競合剤との間で固定化抗体結合部位に関して競争的である ので、アリコート中には未結合の分析物もまた存在し得、これが電気泳動分析の ためのチャネルに導入される。アリコート中の未結合の分析物の量は反応条件お よび化学種の結合定数によって影響を受ける。 未結合の競合剤を含むアリコート(図1(d)を次に第1反応物(典型的には酵素基 質)を含むチャネルに導入する。電気泳動的運動を用いて競合剤と第1反応物とを 混合し、それにより競合剤の第2反応物部分と第1反応物とが反応して検出可能な 生成物が形成され、これがチャネルに沿って移動して検出器を通過する。検出器 は検出可能な生成物を検出し、そしてコンピュータのような定量装置と連結され ている場合には検出可能な生成物の量が自動的に計算される。 電気泳動的運動は、しばしば、競合剤の第2反応物部分がより多量の検出可能 な生成物の生成を触媒することを可能とする時間の間、停止される。このやり方 で、少量の検出不可能な量の競合剤が、正確に定量できる多量の検出可能な生成 物の形成によって測定され得る。図1に示される不均一競争反応では、チャネル の電気泳動酵素増幅に供される未結合の競合剤の量は、形成される検出可能な生 成物の量に直接比例する。元の試料中の分析物の量は未結合の競合剤の量に直接 比例する。従って、これらの関係を用いて、分析物の量を形成される検出可能な 生成物の量から計算し得る。 図2において、不均一直接反応の例を本発明の好ましいアッセイ方法の一部と して示す。図2(a)は容器中に存在する固定化抗体を示す(図1〜3において、同様 の構造は同じように表される)。分析物を添加し、これが固定化抗体に結合し、 そして適切な時間の後に過剰の競合剤を添加する(図2(b))。この例において、競 合剤の生体認識部分は分析物を認識し、かつ分析物に結合することができ、「サ ンドイッチ型」配置を形成する(図2c)。例えば、分析物は抗原であり得、そして 競合剤は酵素標識された抗体であり得る。この型の反応技術の一般的な例はELIS Aである。インキュベーションの期間の後、未結合の競合剤を含む反応系のアリ コート(図2(d))を第1反応物および電気泳動媒体を含むチャネルに導入する。電 気泳動的運動を用いて競合剤と第1反応物とを混合し、そして上記のようにプロ セスを続けて、競合剤の第2反応部分で第1反応物の反応を触媒して、検出可能な 生成物を形成する。 図2に示される不均一直接反応スキームは競合剤の量と分析物の量との間に別 の関係を有する。形成される検出可能な生成物の量はチャネル中に導入される未 結合の競合剤の量に比例はするが、分析物の量は未結合の競合剤の量に反比例す る。すなわち、チャネルの電気泳動酵素増幅に供されるアリコート中の未結合の 競合剤が多いほど、容器中の分析物に結合する競合剤(これは元の試料中の分析 物の量に直接比例する)は少ない。再びこれらの関係を用いて、分析物の量を形 成される検出可能な生成物の量から計算し得る。 図3は、本発明の好ましいアッセイ方法の一部を形成する均一反応スキームを 示す。均一反応においては、初期結合反応(図3(a))中またはチャネル電気泳動ア ッセイ中に固定化化合物は存在しない。分析物および競合剤は、競合剤の生体認 識部分を介して互いに結合する任意の種であり得る。分析物と過剰量の競合剤と の間の会合が起こるのに十分な時間をおいた後（図３(b)）、分析物-競合剤複合 体および過剰の競合剤を含むアリコートを第1反応物を含むチャネルに導入する 。 直接均一反応では典型的には大過剰の競合剤を用いて分析物-競合剤複合体の 形成を完了近くまで行わせるので、電気泳動分析に供されるアリコート中には非 常に少量の未結合分析物しか存在しない。他方、競争的均一反応では、分析物と 競合剤は動的可逆的結合相互作用にあるので、そのため、電気泳動分析に供され る反応溶液のアリコート中には分析物、競合剤および分析物-競合剤複合体が含 まれる。所与の時点で存在する各々の種の量は、反応条件および種の結合定数に よって影響を受ける。 アリコートをチャネルに導入した後、電気泳動的運動を用いてアリコート中の 化学種を第1反応物と混合する。チャネルに沿って電流を流すと、競合剤と分析 物−競合剤複合体が異なる電気泳動速度のために分離し、各々がそれぞれのゾー ンで検出可能な生成物を生成する。電気泳動速度の違いは化合物に固有であり得 、そして／あるいは当業者に公知の技術による化学種の電荷の改変に起因し得る 。最終的に、検出可能な生成物は検出器を2つのバンドで通過し、電気泳動図上 に2つの生成物ピークを生成する。1つのピークは過剰の競合剤によって生成され る生成物に対応し、そして他のピークは分析物−競合剤複合体によって生成され る 生成物に対応する。後者のピークは元の試料中の分析物の量に直接比例する。検 出器の出力装置に接続されたコンピュータにより、発生したデータを操作して、 数学的に生成物ピークをそれぞれの源に分類することが可能であり、これにより 分析物の正確な定量が可能となる。 上記の反応は、異なる生体認識部分を有する複数の固定化された反応物、複数 の分析物、および／または複数の競合剤を包含し得ることが理解されるべきであ る。結果として、１つ以上の競合剤が」電気泳動的に媒介されたマイクロ分析に 供され得るか、および／または１つ以上の分析物／競合剤複合体が、直接または 競合的な均一反応において形成され得る。複数の分析物のアッセイにおいて、代 表的には、１つ以上の第１の反応物がチャネル内に導入され、そして複数の検出 可能な生成物が形成または枯渇される。 2．試薬の混合 分析物と反応物との混合は、本発明によれば、化学種間の電気泳動速度の違い を利用して達成される。本発明の方法は、少なくとも1つの化学種(反応物または 分析物)が荷電しており、それゆえ電場中で特徴的な易動度を有することを必要 とする。分析物および反応物の両方が荷電している場合、電荷密度の違いの結果 として、電場中での電気泳動易動度が異なる。電気泳動的混合は、(i)1つまたは 両方の成分が同じ電極に向かって移動する間に、速く動く成分が遅く動く成分を 追い越す場合、または(ii)キャピラリーを通っての移動の間に、反対方向に動く イオン性成分が互いの中へと電気泳動する場合に達成され得る。 所与の種の電気泳動速度は、化学種の電気泳動易動度μ_emとキャピラリー電気 泳動系の電気浸透流μ_eoとの和で定義される。電気泳動易動度は選択された電気 泳動媒体の性質に依存する。緩衝化された電気泳動媒体を用いるフリーゾーンの (free zonal)キャピラリー電気泳動系において、荷電した種の電気泳動易動度は 物質の電荷密度に支配され、そして次式で定義される： ここで、Zは種の有効な正味の電荷であり、eは電子の電荷(electrical charge) であり、ηは溶液の粘度であり、そしてaは種の流体力学的半径である。 キャピラリーゲル電気泳動の場合で使用されるようにふるい媒体が使用され、 電気泳動易動度は電荷密度および分子の大きさの両方から決定される。ミセル電 気泳動分離では、電気泳動易動度は、バルク溶液中の化学種の電気泳動易動度、 およびそれ自体の電気泳動易動度を有する荷電ミセル添加剤としての種の分配定 数の両方に依存する。電気泳動媒体中に複合体形成(complexatory)添加剤を伴う キャピラリー電気泳動分離の種々の形熊では、電気泳動易動度は、分析物の電荷 密度、ならびにそれ自体の電気泳動易動度を有する荷電または非荷電の添加剤と の複合体形成の程度によって決定される。異なる電気泳動媒体が利用できること によって、その電気泳動速度を変化させるように種々の物理的特性の分析物また は反応物の利用が可能となる。これにより、成分を電場中で異なる速度で移動さ せることが可能となる。従って、化学種の空間的に区別されるゾーンを電場内で 物理的に接触させることができる。 典型的には、本発明のアッセイでは、分析物を含むゾーンまたはプラグが反応 物を含むゾーンと合体する。電圧が印加されるにつれ、図4(a)に示すように、所 与の電気泳動媒体中の関心のある2つの成分の電気泳動易動度の違いに応じた速 度で、ゾーン同士が互いの方に向かって移動する。キャピラリー沿いの特定の位 置でゾーンは接触し、そして合体し始める(図4(b))。同時に、生成物が形成し始 め、そしてそれ自体の特徴的な速度で検出器に向かって移動する。図4において 、生成物は点で表される。試薬ゾーンが物理的に接触するのに必要とされる時間 (t_contact)は2つの種間の電気泳動易動度の差(Δμ_em)、ゾーン間の距離(d、電 気泳動速度の高い方のゾーンのリーディングエッジと電気泳動速度の低い方のゾ ーンのトレーリングエッジとの間の距離)、および印加した電場強度(V/L)に基づ いて計算され得る： 2つのゾーンの相互浸透は電圧が維持されている限りは続き、そして生成物の 形成および分離が続く。式(4)はまた、dが2つのリーディングエッジまたは2つの トレーリングエッジの間の短い方の距離で定義される場合、2つの試薬ゾーンが 完全に相互浸透(すなわち、小さい方のゾーンが大きい方のゾーン内に完全に合 体する)するのに必要とされる時間を計算するためにも使用され得る(図4(c))。 小さい方のゾーンの大きい方のゾーン内への完全な相互浸透は、図4(d)に示すよ うに、ゾーンが離れ始めるまで(図4(e))続く。 小さい方のゾーンの大きい方のゾーン内への完全な相互浸透が終了する時間は 、dが2つのリーディングエッジまたは2つのトレーリングエッジの間の長い方の 距離で定義される場合に式(4)から計算され得る。ゾーンの全体の合体が起こっ ている時間間隔(Δt_merge)は、 として見積もることができ、ここでΔwは2つのピークの幅の差である。 ゾーンの嵌合は、2つのゾーンが互いに完全に通過したときに(図4(g))終了す る(図4(f))。2つのゾーンが完全に離れる時間は、dが電気泳動速度の大きい方の ゾーンのトレーリングエッジから電気泳動速度の小さい方のリーディングエッジ までの距離で定義される場合に式(4)から計算され得る。 電気泳動的混合は従来のバルク溶液の混合と比べて数多くの利点がある。分子 種はバルク溶液から本質的に独立して電気的移動(electromigrate)するので、電 気泳動的混合は、2つ以上の電気的移動成分のゾーンを、容積を実質的に変化さ せることなく、従ってゾーンを希釈することなく、合体させる。キャピラリー電 気泳動系に対する現在の理論は、横方向の拡散が試薬ゾーンの希釈を引き起こす 主要な因子であることを示唆する。小さい分析物のゾーンをより大きな反応物の ゾーンを通って移動させることによって、分析物のゾーンをそれ自体の容積の数 百倍の反応物に嵌合させることができる。比較的狭い分析物ゾーンが広い反応物 ゾーンに相互浸透するときにその比較的狭い分析物ゾーンに遭遇する反応物容積 の分析物容積に対する比(R_vol)は、2つの種の間の電気泳動易動度の差(Δμ_em) 、分析物ゾーンの幅(w)、2つのゾーンの嵌合が起こる時間(t_engage)、および印 加される電場(V/L)に依存する： 電気泳動的混合は、2つのゾーンを乱流(およびその結果としてのバンドの拡が り)の必要なしに完全に相互浸透させることを可能とする。本発明の化学的分析 では、溶離液のナノリットルの流れおよび基質が数秒以内に混合され、そして生 成物は層流系を通じて、最小限のバンドの拡がりで検出器に輸送される。バンド の拡がりは、化学反応の持続時間と比較して迅速な、検出器への生成物の輸送に よって最小化される。すなわち、生成物は形成されるとすぐに検出器に輸送され る。このすばやい輸送時間は、キャピラリーのサイズが小さいこと、および系に 印加する電圧が大きいことに起因し得る。典型的には、キャピラリーは直径25〜 100μｍおよび長さ5〜100cmである。系に印加される電圧の範囲は通常、1〜300 ボルト/cmの範囲であるが、2000〜3000ボルト/cmもの高さであり得る。より短い アッセイ時間は、多くの方法、例えば、キャピラリーの長さを短くし、かつ系に 印加する電圧を協調的に減少させることにより、あるいはキャピラリーの長さを 長くし、かつ電圧を協調的に増大させることにより、達成され得る。従って、本 発明の方法は、一旦、迅速な電気泳動的混合が化学反応を開始させ、そして生成 物が形成されたら、生成物が迅速に検出器に輸送されるように最適化される。本 発明の分析方法の効率(典型的には理論段数10⁵を越える)は、最小限のバンドの 拡がりで試薬ゾーンを輸送および混合することを可能にする。顕著な乱流が存在 しないこともまた、この分析方法の理論的および実験的考察を単純化する。 本発明の方法のプレ反応段階はまた、同じまたは異なる分析試薬と相互作用し て同じまたは類似の検出可能な生成物を生成または消失させる、1つの試料中の 異なる分析物を分離するためにも使用され得る。電気泳動媒体中での分析物の電 気泳動速度の違いが、分析物が反応物を含むゾーンと嵌合する前に分析物の分離 を行うことによって利用され得る。この可能性により、分析物自体が選択された 電気泳動媒体中で異なる電気泳動易動度を有するならば、識別不能な検出可能な 生成物に転換される複数の分析物の決定が可能になる。 電気泳動易動度はまた、第1反応物と混合する前に、結合した分析物、結合し た競合剤および固定化反応物から未結合の競合剤を分離するためにも使用され得 る。分析物は抗原または生物学的分子であり得る。固定化反応部分は固定化抗体 、固定化DNAまたは固定化PNAであり得る。一般に、定量される分析物は当業者に 公 知の種々の機構によって固定化反応物と結合する。この機構はとりわけ、水素結 合、親和性結合、共有結合、イオン性結合、静電的電荷引力、および疎水性−疎 水性相互作用である。固定化反応物は好ましくは抗体であり、そして分析物は抗 原であるが、以下の議論は任意の分析物および任意の固定化反応物に等しく適用 され得る。 アッセイの結合反応において、抗原は固定化された抗体に結合する。競合剤は いずれも抗体結合部位において抗原と競合する（「競合的な」アッセイ；図１） か、または、「サンドイッチ−タイプ」配列において抗原と結合する（「直接」 アッセイ；図２）。厳密に設計された実験において、過剰の競合剤が使用され、 そのため全ての抗原が結合した後に、非結合性の競合剤が存在する。インキュベ ーション時間の後に、非結合性競合剤が、電気泳動の培地に含まれているチャン ネルに、電気泳動的に移動する電流が印加される。典型的には、固定化された抗 体と競合剤との反応中の緩衝溶液および分析物は、電気泳動の培地と同様である 。非結合性競合剤の、第一の反応物を含むチャンネルへの移動の後に、競合剤の 第二の反応物部分が第一の反応物との反応を触媒して、検出可能な生成物を生成 する。これはチャンネルに沿っても移動して最終的には検出される。本明細書中 で議論される同様の概念の多くは、競合剤、第一の反応物、および検出可能な生 成物の、反応、電気泳動および検出に適用可能である。分析の数量化は本明細書 中他で記述した方法を使用して達成される。 上述の結合反応もまた、本発明の分析装置の外部または遠心分離機の外部、例 えば容器中で行われ得る。結合反応が独立して行われた場合、適切なインキュベ ーション時間の後に、容器からのアリコートの溶液が電気泳動培地および第一の 反応物を含むチャンネル中に導入される。引き続いて、本明細書中他で記述する ように、アッセイが完了される。 電気泳動の易動度もまた、「均質な」アッセイフォーマットで第一の反応物と 混合する前に、分析物−競合剤複合体からの、競合剤の分離に使用され得る（図 ３）。分析物および競合剤は、競合剤の生体認識部位を介してお互いに結合する 任意の種であり得る。分析物と過剰量の競合剤との間の会合の発生にとって十分 な時間の後に、分析物−競合剤複合体および過剰の競合剤を含むアリコートがチ ャンネル中に導入される。アリコートおよび第一の反応物のチャンネルへの導入 は、本明細書中で記述した通常の注入方法によるかまたは、電気泳動の移動によ るものであり得る。第一の反応物もまたチャンネル中に導入される。典型的には 、第一の反応物は、試料の導入前にはチャンネル中に存在する。試料のチャンネ ルへの導入の後に、アリコートと第一の反応物とを混合するために、電気泳動の 動作が使用される。チャンネルに沿った電流の印加において、異なった電気泳動 速度のために、競合剤および分析物−競合剤複合体は分離する。このように、第 一の反応物の競合剤と分析物−競合剤複合体との混合は、チャンネルの異なった ゾーンで、時間が進行するにつれて起こる。 ３．本発明に有用な化学反応 本発明に従って、分析物および競合剤との、電気泳動前結合反応に関わる分析 物を分析するために電気泳動的に行われ得る化学反応に続いて、検出可能な生成 物を生成または枯渇するための試薬を用いて、競合剤の第二の反応物部分の電気 泳動的に媒介された反応。生成物は、その独特の電気泳動易動度または電気泳動 的な性質のために、検出可能である。本発明に従って行われるこの反応は、３つ のカテゴリーに収まり、そのすべては試料分析物と競合剤との間、または競合剤 と反応物との間の反応によって起こる、生成物または複合物の形成を含む。 （１）非触媒反応。熱力学は、触媒の補助無しで、任意の反応の自発的発生を 支持する。例えば、測定された分析物は、分析物より容易に検出されるという性 質を有する生成物を、生成または枯渇するために、競合剤と化学量論的に反応し 得る。この生成物は、独得の電気泳動特性のために検出可能である。 （２）触媒反応。化学反応の活性化のために必要とされるエネルギーは、触媒 （例えば酵素）によって減少される。いくつかの反応は、触媒の存在下のみで起 こる。本発明の方法は競合剤、分析物−競合剤複合体、酵素、基質または反応に 本質的な任意の種（例えば補酵素）の分析に使用され得る。 （３）結合反応。任意の化学反応において、生成物を生成するための、分析物 と競合剤との反応、または競合剤と反応物との反応は、検出可能な生成物を生成 も枯渇もしない。しかしながら、生成物は、検出可能な他の生成物に転換され得 る。例えば、グリセルアルデヒドキナーゼは、グリセルアルデヒドおよびATPを グリセルアルデヒド-3-ホスフェート（G-3-P）およびADPへ転換する。NADの存在 下でのG-3-Pは、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼによって 、3-ホスホグリセリン酸およびNADHに転換される。NADHは独特な吸収を340nmに 有し、このため、試料中の他の物質の存在下で、定量化される。NADHの存在は、 試料中（例えば、グリセルアルデヒド、グリセルアルデヒドキナーゼ、またはAT P）の分析物の存在に関連し得る。反応のこの結合したセットのために、独特の 発色団無しの物質は、NADHの還元反応との結合によって分光光度的に決定される 。結合反応は触媒され得るかまたは触媒され得ない。複数結合した反応は、異な った電気泳動速度を有する、異なった分析物、競合剤、および反応物ゾーンで実 質的に同時に行われ得る。 キャピラリー電気泳動の分離能力もまた、独特の検出性質を有する種を生成す る反応への分析反応の結合の必要を排除し得る。分析反応が、独特の電気的移動 の性質を有する生成物を、生成または枯渇する場合、キャピラリー電気泳動の分 離能力は、独特の検出性質を有する種を生成または消費する必要無く、この物質 が検出されることを可能にし得る。例えば、グルコースは、ADPからATPへの同時 発生的な転換を有するヘキソキナーゼによってグルコース-6-ホスフェートに転 換される。これらの化学種はいずれも独特のUV検出性質を有しないので、グルコ ースの臨床的な酵素の測定は、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼに よって、NADからNADHへの同時転換を用いて、グルコース-6-ホスフェートが酵素 的に6-ホスホグルコネートに転換することを必要とする。結合反応における、NA DHの生成からの結果である、340nmで観測される増加した吸収は、試料中に存在 するグルコースの量に相関し得る。あるいは、グルコースは、グルコースから第 二の反応への転換との結合無しで、ヘキソキナーゼを用いたその反応を介して分 析され得る。ADPおよびATPはそれぞれ270nmに同様のモル吸光度を示す。しかし ながら、ADPおよびATPは異なった電荷密度を有し、そして、それゆえ、異なった 電気泳動の易動度を有する。その結果、グルコース、ヘキソキナーゼ、およびAT Pの間での化学反応におけるATPの消費またはADPの生成は、検出窓を通るADPおよ び／またはATPの電気的移動のモニタリングによって分析され得る。この結果のA DPピークおよびATP欠乏ピークは、それぞれ試料中に存在するグルコースの定量 測定として役立つ。 米国特許出願番号第08/386,224号および同第07/944,846号の表IならびにPCT公 開第WO 94/07132号（本明細書中で参考として援用される）に列挙されるものは 、本明細書中で記述された化学分析のキャピラリー電気泳動の方法に従って行わ れ得る、化学反応の代表的な例である。（本発明に従って行われ得る化学反応の この列挙は、包括的であることを意味するのではなく、単に、分析の過程の間に 行われ得る任意の化学反応を示す。）各反応において、化学系の異なった成分が 測定され得る。例えば、酵素の系では、基質の消失、生成物の蓄積、あるいは反 応の副生成物の出現または消失（例えばNADまたはNADHのような補酵素）が、検 出され得る。さらに、モニターされる種と目的の分析物の間の化学量論的な関係 によって、反応系の種々の成分が定量化される。酵素の系では、モニターされた 種は基質、酵素、補因子、または分析物の定量化に使用され得る。 例えば、続いて実施例２においてより詳細に記載される、トリヨードチロニン （「T3」）酵素イムノアッセイでは、T3-アルカリ性ホスファターゼ（「T3-ALP 複合体」）（競合剤）は、AttoPhos基質、（非蛍光性成分）を、蛍光生成物に転 化し、これは検出および定量される。基本的には、固定化された抗−T3モノクロ ナール抗体結合部位における、T3とT3-ALP複合体との間の競合の後の、試料中の 非結合T3-ALP複合体の量は、本来の生物試料中に存在するT3の量に比例する。す なわち、競合剤がより非結合性であれば、T3がより多く試料中に存在する。 免疫学的な反応からの非結合性T3-ALP複合体は、次にAttoPhos基質を含むキャ ピラリー中に導入される。T3-ALP複合体から形成される蛍光性生成物の量は、非 結合性T3-ALP複合体の量に比例する。非結合性T3-ALP複合体の量は、蛍光性生成 物の量を測定することによって測定される。このように、非結合性T3-ALP複合体 の量が本来の試料中のT3の量に比例するので、最終的には、本来の試料中のT3の 量は定量化され得る。 ４.速度論の考慮 本発明により行われる化学反応を、選択された系の速度論により決定する。単 純な不可逆反応は以下のように表され、 Ａ＋Ｒ→Ｐ ここでＡは分析物、Ｒは分析試薬、およびＰは検出可能な生成物、を実施例とし て与える。本発明の方法によるアッセイを、代表的に、過剰の分析物（[Ａ][Ｒ] ）中で分析試薬とともに行い、そして擬一次速度論を試薬ゾーンを通過する分析 物プラグとして表現する。分析物ゾーンが分析試薬ゾーンを係合するにつれて、 Ａが枯渇し、そしてＰを相互浸透したゾーン内の所定の点で枯渇するＡの瞬間濃 度に直接的に比例する速度で生成する。このような条件下で行われるアッセイに ついて統合した擬一次速度の式は： [Ａ]＝[Ａ]_ie-^kt (7) ここで[Ａ]ならびに[Ａ]は、それぞれＡの初期および最終濃度であり、ならびに ｋは擬一次速度定数である。 分析反応ならびに混合プロセスを行うために必要な時間の知識は、本発明によ るアッセイの計画を可能にする。このアッセイは、分離の長さおよび分析時間を 最小にするために適用された電場に関して設計され得、アッセイの実行に十分な 時間をも可能にする。式（７）を用いる場合、反応の所望の量の程度（ε）に到 達するために必要な反応時間（t_rxn）を、以下のように推定し得る： 本発明により行うアッセイで期待される反応速度論の第二の例は、酵素反応に 関する。Michaelis-Mentenモデルは多くの酵素の速度論特性を説明する： 酵素（Ｅ）は、基質（Ｓ）と結合して、k₁の速度定数を有する酵素−基質複合体 （ＥＳ）を形成する。このＥＳ複合体は、k₂の速度定数を有してＥとＳに分離し 得るか、または進行してk₃の速度定数を有して生成物Ｐを形成し得るかのどちら かである。このMichaelis-Menten式： は、単一の基質と酵素との反応速度（ｖ）は、酵素が基質と飽和した場合の最大 反応速度（V_max）、基質の濃度（[Ｓ]）およびMichaelis-Menten定数（K_m）に依 存することを示す。V_maxはk₃の生成物（ターンオーバー数）および総酵素濃度（ [E_T]）に等しい。それらの生理学的基質を有する多くの酵素のターンオーバー数 は、代表的には１秒当たり１から10⁶の範囲にある。(k₂+k₃)/k₁と定義した、酵 素のK_m値は広範な範囲におよぶが、一般的に、10^-1と10^-7Mの間にある。酵素のK_m 値は、特定の基質ならびに温度、pH、およびイオン強度のような環境条件に依 存する。 Michaelis-Menten式は、高基質濃度（[Ｓ]＞＞K_m）（ここで酵素は基質と飽和 する）で、vがV_maxに接近し、そして基質が枯渇するまたは生成物の蓄積が阻害 を生じるまで相対的に一定のままであることを明らかにする。低基質濃度（[Ｓ ＜＜K_m]）では反応の速度は、基質の濃度に直接的に比例する。基質のゾーンが 酵素を含むゾーンと合併するので、反応の初期速度はオーバーラップした領域の 基質および酵素の相対濃度に依存する。基質の濃度が酵素飽和状態が広まるのに 十分に高い場合、相対的に一定の反応速度（V_max）は十分な基質の枯渇が生じる および酵素飽和状態がもはや存在しなくなるまで、観測される。基質が枯渇する ので、反応速度およびそれゆえ検出可能な生成物の生成または枯渇は減少する。 この基質の枯渇が起こる速度は、酵素および基質の相対的濃度ならびに酵素のタ ーンオーバー数に依存する。この速度はまた、所定の基質に対する酵素のMichae lis-Menten定数に依存する。 ５．生成物の検出 一般的に、本発明の方法による検出プロセスは、キャピラリー電気泳動系の電 気浸透流動により検出可能な生成物の検出器への輸送を可能にすることによって 行われる。検出可能な生成物が、電気浸透流動と同じ方向に配向し、または反対 の方向へ配向するが、より小さな規模である電気泳動易動度を有していれば、分 析物が検出窓を通過する前に形成される任意の検出可能な生成物が観測可能であ る。 検出可能な生成物は一定の速度（分析物と検出可能な生成物との間の電気泳動 易動度の差に等しい）で反応分析物から離れるように電気泳動するので、電気泳 動図において生じたピークが反応速度のプロフィールを提供する。観測された検 出可能な生成物が検出器に移動するために必要な時間（t_mig）は、式（10）、（ 11）および（12）に示されるように算出され得る。T_migは生成物を形成する前の 注入点（ｄ）からキャピラリー内で分析物が移動する（μ_em,a）の間の時間およ び生成物が検出窓への残りの距離（１−ｄ）を移動する（μ_em,p）のに必要な時 間（t_det）に依存する： t_mig＝t_form＋t_det (10)以下の式は、所定の観測された生成物がアッセイで形成する時間の推測を可能に する： 予想されるピークの形状は、反応の速度論に基づいて予想され得る。前に挙げた 単純な擬一次の例において、混合プロセスがt_mix＜＜t_rxnのように非常に迅速に 起こると仮定する場合、生成物の形成時間は、分析物が試薬ゾーンと合併し、そ して反応が起こる間の時間に大体等しい（t_form≡t_rxn）。この仮定は反応速度 およびそれゆえ所定の移動時間で形成される検出可能な生成物の量についての式 の以下の誘導を可能にする。 ｖ＝ｋ[Ａ]_ie^x (14) 検出可能な生成物の電気泳動易動度が分析物より大きい場合、条件 が存在し、分析物の所定の領域によって形成される第一の検出可能な生成物は、 まず検出器に到達し、そしてピークの形状に対する速度論的効果が後続のピーク のエッジ上で観測される。検出可能な生成物の電気泳動易動度が分析物より小さ い場合、条件、が広まる。さらに、分析物の所定の領域で形成された第一の検出可能な生成物は 、最後に検出器に到達し、そしてピークの形状に対する速度論的効果が先のピー クのエッジ上で観測される。 実験のピークの形状は、分析物容量またはプラグの幅、分析物および検出可能 な種による拡散、および試薬ゾーンが相互浸透するのに必要な時間による分析物 ゾーンの不規則な枯渇のような因子によって、さらに複雑になっている。速い速 度論での反応について、速度論により予測されたピークの形状はこれらの因子に より不明瞭であり得る。分析物が検出器を通過する前に分析物が反応物容量と十 分に反応しない場合、分析物容量の不完全な反応が観測され得ない。なぜならこ の点の後に形成する任意の検出可能な生成物は、検出されないからである。同様 に、反応物ゾーンの容量が、２つのゾーンを解放する前に分析物の完全な反応に 不十分である場合、不完全な反応が観測され得る。不完全な反応は、検出可能な 生成物について得られるピークの切断により示される。 ６．連続的または中断する電場 電気泳動混合の間、分析物と反応物との間の接触は一過性または連続的であり 得る。異なる速度で移動する２つの狭いゾーンが電気泳動チャネル内で出会った 場合、一過性の接触が起こる。まず、２つのゾーンは、互いの中に移動し、それ ゆえ混合される。これは、それらの電気泳動易動度の相違のため２つの種が離れ て移動するようにゾーン解放に従う。生成物は、２つの種が接触するが、２つの ゾーンが結合する時間の間のみで形成される。化学的反応はゾーン解放の後に停 止する。 連続的な接触がいくつかの方法で達成される。ゾーンエンゲージメントおよび 混合の間、化学反応がゼロ電位（「ストップフロー」モード）または一定電位の どちらかの条件下で実行され得る。ゼロ電位で、電場は電位の停止によって中断 し、生成物が蓄積する場合、動電学的輸送または電気泳動的輸送のどちらも起こ らず、反応物は１つのゾーンで混合されたままになる。これは従来の酵素アッセ イにおける固定時間反応に対応する。検出のために十分な生成物を生成するため のより長いインキュベーション時間を必要とする酵素（例えば、希釈酵素調製ま たは低い代謝回数を有する酵素）は、ゼロ電位モードでアッセイし得る。この連 続的な接触方法は非常に感受性であるが、電場を中断するためにゾーンのエンゲ ージメントモーメントを確定することが必要である。これはゾーンの相対位置を 示す、パラメータの観察によって、または、系の標準化によって達成し得、その 結果、キャピラリーの一定の長さおよび直径、電気的電位および分析物ならびに 反応物の移動性が与えられるとゾーンの位置が予言可能である。試料および反応 物ゾーンの相対的な位置が観察不可能である場合、次にそれらが互いに通過する ことを許容するのに十分長い時間そのゾーンを電気泳動し得、その後反応を全時 間間隔で検出する。 一定電位下、分析物および反応物を混合し、連続的に生成物を分離する。従来 のアッセイは、化学的反応の成分の電気泳動的な混合および分離を含まない。分 析物および反応物の急速な混合が他の成分からの生成物の分離を混乱させ得るが 故に、従来のアッセイにおける同時の生成物蓄積および分離は達成が困難である 。すなわち、試料成分、反応物および生成物の混合および分離は、化学反応間お よび化学反応後の両方で起こる。混合および分離のどちらも化学反応の成分の電 気泳動的移動性に依存するので（すなわち、分析物および反応物の急速な電気泳 動的混合が化学反応を開始し、そして次に生成物が他の成分から電気泳動的に分 離される）、本発明の方法は、反応物からの生成物の分離の混乱を克服する。分 離速度より速い速度順に反応（例えば、酵素触媒）が起こり得る故に、本発明に 従って、一定電位の条件下で実行されたアッセイは、通常は短い固定時間アッセ イに対応する。例えば、モル基準で、生成物形成は酵素の量よりも10²〜10⁴大き くあり得、酵素の代謝回数およびゾーンに印加される電位に依存する。 連続的な接触である他の方法は、分析物を含む試料の容量に対して大容量であ る反応物の使用である。小さな電気泳動的チャネルにおいて（例えば、キャピラ リーにおいて）、分析物は相対的に大きな反応物ゾーンを介して移動するために 時間を費やす。分析物と反応物との反応は、分析物が反応物の大きなゾーンを通 過して移動する間の時間中連続する。この混合の連続的な接触法において、生成 物は反応物のゾーン中のいたるところに形成され、そして連続的に試料ゾーンか ら電気泳動的に離れる。従って生成物は、電場の中断中に形成される蓄積された 生成物よりさらに希釈される。 希釈は、少量の試料で大きくなり、反応物の容量がより大きくなるにつれ少な くなる。従来の化学反応において、試料および反応物との混合の間に起こる試料 の希釈は、一般的に検出感度を低下させる。本発明に従った化学分析の間、試料 の希釈は、また、試料および反応物の相対容量の関数であるが、本明細書中に記 載されるように、試料のある濃度までのみである。その試料濃度を越えて、混合 時の希釈はしない。 電気泳動的な混合において、ほとんど希釈をしない、最大感度を与える試料容 量の最適値が存在する。この試料容量は理論プレート数、キャピラリーの直径、 分析物の分散係数、ランニング緩衝液の粘度、電気的電位およびバンドスプレッ ドを制御する他の変数に関している。この最適容量は以下で算出し得る。 電気泳動バンドスプレッド理論は、キャピラリーカラムの理論的な板のある数 Ｎについて試料は検出部を通過する場合に検出容量（Ｖ_d）中に含有されること を示す。この容量（Ｖ_d）は試料容量（Ｖ_s）とは独立して言われるべきであり、 すなわち、試料容量は容量Ｖ_dまで希釈される。これに関して、電気泳動的混合 は他の様式の混合と同様である；すなわち、混合の全ての方法は試料の希釈を生 じる。しかし、試料容量Ｖ_sが約Ｖ_dまで増加した場合、Ｖ_dにおける増加はほと んどない。結局、分析系においてＶ_sが容量Ｖ_dよりかなり大きいと思われる場合 、ピークの前縁および後縁(leading and trailing edge)以外の希釈は全く行わ れない。 試料ゾーンおよび反応物ゾーンの相対的なサイズもまた、電気泳動的混合が起 こり得る速度および平易性に影響を及ぼす。２つの小さなゾーンの混合は高電圧 で非常に速やかである。それらが正確に同じ形状および容量の場合、まずゾーン の縁を混合し、そして次に２つのゾーンを重ね合わせる。一般的に、混合は瞬間 ではない。従って、反応が混合の完了する前に始まり得、系の分析物および反応 物が反応する速度、ならびに反応物の濃度における反応速度の依存性の両方に依 存する。生成物形成は混合の過程中一定ではない可能性がある。生成物が電気泳 動的ピークとして蓄積される、および検出器へ輸送される場合、このピークは全 ての電気泳動系に特徴付けられる同じバンドスプレッディング（希釈）現象を受 ける。少量の試料容量では、バンドスプレッディング効果は最大である。試料容 量が増加する場合、ほとんどバンドスプレッディングしない。 本発明の方法を実行するために最も便利な容量は、少容量および多容量の組み 合わせを含む。例えば、以下のように、少試料容量は大試料容量と混合し得る（ 少容量が試薬であり、そして大容量が試料であり、手順は基本的に同様である） 。まず、キャピラリーは大容量で満たされ（例えば、試薬）、次に少量試料容量 はキャピラリー入口に導入される。電場はキャピラリー上にかけられ、そして数 秒間の高電気電位後（例えば、100〜300ボルト／cm）、分析物および反応物を混 合する。その後、反応時間を制御し、そして反応を完了に向かわせることを許容 するために電気的電位を変化させることが可能である。例えば、ゼロ電位で生成 物が制限範囲内で蓄積され、そして検出感度がより大きくなる。または、反応が 連続的に起こることを許容すること（すなわち、電位を停止しない）は、分析物 および反応物からの生成物の分離を促進する。継続的な電位下での生成物が、ゼ ロ電位で反応が実行される間に形成された生成物よりも少ない量蓄積し、そして 結果として検出感度の減少が起こる。 ２つの少容量の混合または少容量および大容量の混合に比較して、２つの大容 量の混合は電気泳動に長時間を要する。さらに、２つの大容量での溶融ゾーン内 の化学反応の範囲のさらなる可変性が存在する。２つの大きなゾーンの前縁は後 縁の前に接触し、従って前縁の分析物および反応物は、後縁の分析物および反応 物よりも速く反応する。この可変性は系への電位の印加の増加により減少させら れ得る。従って、速やかな混合および少容量および大容量を使用する反応の開始 が所望可能であるが、高電位で行われる場合に、２つの大容量の混合および開始 はまた、可能である。 ７．酵素活性または濃度のアッセイ 上述のMichaelis-Menten動力学で得られる電気泳動図の形状は、基質および酵 素の相対的な濃度に依存する。本発明に従う任意の酵素のアッセイにおいて、反 応物ゾーン（この実施例において、基質）は、反応に必要な任意の化学種（例え ば、基質および補酵素）の酵素飽和濃度を含有する。分析物（酵素）ゾーンが反 応物（基質）ゾーンに浸透する場合、酵素／基質反応が起こり、それによって検 出可能な生成物を生成または枯渇させる。基質領域を介しての酵素の電気泳動(e lectromigration)全体にわたって、酵素飽和状態を保持するために、基質が十分 な濃度存在する場合、検出可能な種の相対的に一定な反応速度、およびそれゆえ 相対的に一定な生成または枯渇が認められる。ゾーンがまず浸透し始める場合、 検出可能な生成物の量は最小のゾーンが重なる故に低く、そして低い濃度がゾー ンの縁に直面する(encounterd)（図４（ｂ）を参照のこと）。一旦、酵素ゾーン が基質ゾーンと完全にエンゲージすると、相対的に一定な反応速度が観察される べきである。酵素飽和基質ゾーン内で、酵素のほとんどが酵素-基質（ES）複合 体中に隔離され、そして酵素はES複合体の電気泳動的な移動性で、基質領域を横 断する。ES複合体の電気泳動的な移動性は、それぞれＥまたはＳのどちらかの移 動性とは異なり得る。 最高感度（すなわち、最大生成物蓄積）は、高い代謝速度ならびにES複合物お よび検出可能な生成物が電気泳動的な移動性においてほとんど変わらない系を有 する酵素で達成される。結果として得られる電気泳動図は、酵素が基質領域を横 断する場合、反応の相対的な一定速度を表すプラトーを示す。それぞれの酵素が 基質と反応し得る最大速度は与えられた実験条件での酵素の代謝速度により定ま る。反応の観察された速度におけるバリエーションに対応する、酵素の異なる注 入試料のプラトーの高さのバリエーションは、その最大速度で操作する酵素量に 関連するべきである。従って、プラトーの高さは分析物の注入に含まれる酵素量 に直接関連する。プラトーは、結果として得られる電気泳動図において酵素ゾー ンが検出器の位置を通過するまで、または２つのゾーンが脱エンゲージするまで 観察される。 ES複合体の電気泳動速度が検出可能な生成物のものよりも大きい系の理論的な 電気泳動プロフィールは図５（Ａ）で示される。なぜなら、ES複合体は検出器の 方向へ検出可能生成物（Ｐ）より速い速度で移動するので、検出器の窓で観察さ れる第一の生成物（電気泳動図において「Ａ」で示す）は、酵素が検出器を通過 して移動するにつれて形成された生成物である。対照的に、電気泳動図の他方の 端で検出された（すなわち、「Ｂ」で示す）生成物は、酵素が基質ゾーンへ第一 のエンゲージをする場合に形成された生成物である。Ｂのピークまたはスパイク (spike)は、しばしば「注入ピーク」と呼ばれ、基質を含む領域とすぐ近接して 酵素の容量が注入された場合に観察される、アーティファクトである。このスパ イクは、酵素がキャピラリーに導入され、時間電位が印加される時間の間に起こ る分散のために、結果として２つのゾーンの接触面で形成される、検出可能な生 成物として生じる。位置「Ｃ」でトレースする電気泳動図の高さは、酵素がキャ ピラリーを横断している間に形成される、生成物の量に対応し、そして一定電流 の酵素濃度に比例する。 検出可能生成物の電気泳動的速度がES複合物のものよりも大きいES/P系の電気 泳動図は、図５（Ｂ）に示される。検出器に到達するための、第一の検出可能な 生成物（すなわち「Ａ」で示す）は、第一の融合ゾーンとして形成される。検出 器に到達する最後の検出可能な種（すなわち「Ｂ」で示す）は、検出窓を酵素が 通過する際に形成される。どちらの場合においても、注入酵素容量の幅が相対的 に狭い場合、観察されたピークの幅はES複合体と検出可能な種との間の電気泳動 的移動性の差異を示す。従って、分析物の移動時間およびESおよびＰの相対的な 移動速度は、電気泳動図の追跡から容易に確認可能である。 観察されたピークの幅（Δt)は、ES複合体および検出可能な種との電気泳動的 移動性の差（Δμｅｍ）、ゾーンのエンゲージメントが起こる場合のキャピラリ ーの長さ（ｌ）、および印加した電場強度（V/L）に関し得る： 図５（Ｃ）に、２つのイソ酵素によって形成される異なるES複合体が異なる電 気泳動的速度を示す、イソ酵素の複数分析物決定により得られた理論的プロフィ ールを例示する。各反応が同一の検出可能な種を生成するが、選択した電気泳動 性培地において電気泳動性速度の可変性のために特異性が得られる。 ゼロ電位モードにおいて実施される酵素のアッセイのために、酵素容量は電位 の印加下で電気泳動的に基質と混合され、そして次に電位は、検出可能な生成物 が固定された時間に蓄積を許容される間に除去される。基質の酵素飽和濃度はイ ンキュベーション期間中ずっと保持される場合、この時間の間に生成または枯渇 する生成物の量は、最大速度で操作される酵素の量に直接関係する。結果として 得られた電気泳動図は、電気泳動的な混合および生成物の検出窓への移動を誘発 するために必要な、印加された電位期間を示す、生成物を示すプラトー上に重な った蓄積された生成物を示すピークを示す。より高い感度の達成のために、ゼロ 電位モードは、希釈した酵素溶液または低いターンオーバー数を有する酵素を分 析するために、特に好ましい。 本発明の方法の感度は、与えられた実験条件のセット（Δμｅｍ、キャピラリ ーの長さ、および分離長）について適用された電場に反比例する。この効果は、 目的の試料中の、非常に少量な酵素濃度を論じる場合に、特に目的となる。感度 の増強は、酵素のターンオーバー数および時間量に比例し、反応は印加された電 位の不在下での続行を許容される。図6（ａ）は、ゼロ電位モードにおいて使用 される電気的な電位プログラムプロフィール（頂部）、及び予想される電気泳動 的プロフィール（底部）を例示する。注入ピークはピークの上に「I」を有し、 そしてゼロ電位期間中に生成される生成物ピークはピークの上部に「A」を有す る。 ゼロ電位モードにおいて実行される、均質な反応の電気泳動的なプロフィール は異なる。均質アッセイにおいて、固定化反応物は存在しない。標本試料中の分 析物および過剰な競合剤中の分析物は混合され、チャネル内に導入された結果と して得られる試料は未反応競合剤および分析物−競合剤複合体を含有する。最初 は、両方の種がチャネルの同じゾーンに存在する。電気的電位が印加された後、 電荷および/または質量が異なるために、両方の種は異なる電気泳動速度で移動 し始める。競合剤および分析物−競合剤複合体のそれぞれのゾーンへの分離に引 き続き、典型的にチャネルがゼロ電位のインキュベーション時間を受ける。この 時間の間、それぞれの検出可能な生成物は各分離されたゾーンに生成される。十 分な時間の後、電気的電位はチャネルに沿って再びかけられ、生成物のゾーン、 競合剤、分析物−競合剤複合体および第一の反応物（例えば、酵素基質）が再び 移動し始める。 生成物が検出器を通るとき、図6(b)に類似の電気泳動図が認識され、一定電位 の生成物のプラトーの上に２つの主な生成物のピーク（"A"および"B"）の存在を 示す。"I"として同定されるピークは、上で述べたように注入ピークである。一 方のピークは競合物から作られた生成物に対応し、他方のピークは分析物−競合 物複合体から作られた生成物に対応する。それらのピークは、同じアッセイ条件 下での競合物単独の電気泳動によって、およびその保持時間の決定によって識別 され得る。従って、分析物−競合物複合体の量は、その対応しているピークから 定量され得、そしてゆえに分析物の量は同様に決定され得る。 ８．基質濃度に関するアッセイ 本発明による基質濃度のアッセイは、酵素の反応を含み得、従って分析物（基 質）ゾーンはMichaelis-Menten動力学で試薬（酵素）ゾーンに遭遇する。高基質 濃度において、検知可能な生成物の反応速度、およびその結果の生成物または枯 渇物は比較的一定で、そして基質濃度に依存しない。それ故に、純粋な酵素飽和 条件は、基質の決定における分析値を取るに足らなくする。しかし、基質が無く なり、その結果酵素飽和条件がもう存在しないようなると、反応速度は実際に基 質濃度に直接比例するまで増加する。基質のプラグ(plug)が酵素ゾーンを通って 継続する場合、その反応速度、およびその結果、検知可能な生成物の生成または 枯渇が減少する。 基質領域に関する反応速度は、Michaelis-Menten動力学で予測されたような時 間の関数である。検知可能な種は、基質と検知可能な生成物との間の電気泳動の 易動度の差異に依存する一定速度における基質の反応から離れて電気泳動される 。検知可能な生成物として電気泳動図で得られたピークはアッセイ内の任意の所 定 時間での反応速度の測定を提供する。検知可能な生成物が基質／分析物よりも大 きな電気泳動速度を有する場合、形成される第１の検知可能な生成物が最初に検 知され、そして電気泳動図は下降するプラトーが出現するようになる。検知可能 な生成物が基質／分析物よりも小さな電気泳動速度を有する場合、形成される第 １の検知可能な生成物が最後に検知され、そして電気泳動図は上昇するプラトー が出現するようになる。相対的に高くて広いピークは、基質および生成物の相対 的な電気泳動の易動度、試薬の相対濃度、ならびに所定の実験条件における動力 学パラメーターK_IIIおよびに回転数に依存する。実験的に得られた電気泳動図も また、基質容量の幅、基質および検知可能な種のゾーンの希釈、ならびに試薬ゾ ーンの相互浸透間で起こる一様でない基質容量の枯渇によって左右される。 本発明による基質のアッセイにおいて、電気泳動の混合が比較的速く起こると 考えられる場合、そして酵素ゾーンは、２つのゾーンが注入位置から検出位置ま での基質の移動の間ずっと結合したままであるのに十分広い場合、観測された基 質の反応に使用可能な時間は、式(2)で決定したような基質が注入点から検出窓 まで移動するのに必要とされる時間に等しい。Michaelis-Menten式の積分は所定 量の基質が必要とされる時間を与え、酵素的に反応し(t_rxn)： ここで、[S]_iおよび[S]_fはそれぞれ初期基質濃度、および最終基質濃度である。 基質の臨床的なアッセイにおいて、終点アッセイ法はしばしば基質濃度の決定 に使用され、そのため反応は分光光度的な知識を用いる前に基本的に枯渇に達す ることが可能となる。本発明法において、全ての基質は十分に検出窓を通過する 前に反応することが可能である。結果として、得られた下降する、または上昇す るプラトーは、最終的にベースラインに到達し、そして曲線の下の領域は直接注 入した基質の量に比例する。 反応が、検知窓を通過する任意の残った基質より前に終了する場合、そのピー クは、検出窓付近を通過する残っている未反応の基質としてのベースラインに戻 ることなく切り捨てられる。そのピークをベースラインに外挿する試みは、ピー クテイルが非線形性であるために間違いを系に導入し得る。この切り捨ての効果 は、本手法の線形領域に上限を設定する。しかし、本方法の動的な領域では、キ ャピラリーのその移動の間ずっと酵素が飽和したままである基質の濃度ちょうど まで拡大する。検出器を通過する生成物の量の測定は、十分な基質が検出窓を通 過する基質より前に枯渇される限りは、注入された基質の量の動的な測定である 。得られた測定結果は線形ではないが、これらの条件下で非酵素飽和条件に近づ けることは望ましい。Michaelis-Menten動力学によると反応は正確には完全では ないが、受け入れられる反応限度に達するのに必要とされる時間ξは、反応した 初期の基質のフラクションとして定義され、式(19)から評価され得る： 式(2)および(19)を組み合わせることで、反応し得る基質の最大濃度の計算が 可能となる。 それ故、所定の実験条件の組についての線形領域における上限は、式(21)により 計算される： 基質のより高い濃度は、ξで特定された濃度よりも大きな切り捨てをもたらす。 式(21)はまた、１つの実験条件として与えられた基質の初期条件によって経験さ れた切り捨て度（１−ξ）を評価することを可能にしている。式(21)で決定され たように、線形領域における上限は、キャピラリーの分離長の増加によって、ま たは印加した電界の減少によって拡大され得る。これらの方法はそれぞれ、キャ ピラリー中の基質の反応時間の増加によって反応され得る基質の量を増加させる 。線形領域の拡大は、分離長の増加に比例する分析時間における増加、または印 加した電界の減少に反比例する分析時間における増加に関連する。分析時間を同 時に増加させずに線形領域を拡張させる別の方法は、緩衝溶液中の酵素濃度（お よび、必要であれば補酵素濃度）を増加させることである。これはそれぞれの酵 素のターンオーバー数を変化させることはないが、所定のターンオーバー数で操 作可能な酵素分子の数を引き上げることで、V_max値を比例的に増加させる。 代表的には、１つの基質分子は、１つの生成物の分子へと変換される。従って 、サンプル中の基質のアッセイとして生成物の存在または量の検知は、酵素に対 するアッセイのように増幅することが出来ず、酵素が基質を大量の生成物に変換 してしまう。臨床的な決定において日常的に用いられ、そして本発明によって分 析され得る基質は、例えば、アデノシン5'-三リン酸（"ATP"）、アンモニア、胆 汁酸、二酸化炭素、コレステロール、エタノール、グルコース、乳酸塩、シュウ 酸塩、ビルビン酸塩、トリグリセリド、尿素、窒素、および尿酸である。 10．実験パラメーター 本発明の任意の方法の範囲で改変され得る実験パラメーターは、電気浸透圧流 動、電気泳動易動度、電気泳動媒体の性質、pH、温度、イオン強度、粘度、サン プル容量、電位、キャピラリー長、検出方法、および反応種の濃度を包含する。 これらのパラメーターは本発明によって実行される任意の化学分析について最適 化され得る。これらのパラメーターの１つ以上の改変は、当業者が本発明におけ る多数の化学分析を開発することを可能にし、本発明に基づいて開発された任意 の方法における多様性を与える。 (a)電気浸透圧流動 電気浸透圧流動のコントロールは、再現性のある化学分析を可能にする。電気 浸透圧流動は系に存在するそれぞれの化学種の電気泳動速度に固有のファクター であり、そして試薬の接触の持続時間、ならびに検知可能な生成物の検出窓への 輸送に影響を与える。電気浸透圧流動の振幅と方向は、分析物および反応物の接 触、ならびに式(2)で示されたような化学反応に使用可能な時間を決定する。一 致した、および再生可能な電気浸透圧流動は、本発明による定量分析に必要であ り、これは検出窓を通過する種の速度がピーク面積に反比例するためによる。電 気浸透圧流動は、キャピラリーのコーティング性質を変更させることで、増加、 減少、または逆転され得る。キャピラリーのコーティングの粘度の変化は、系の 分子における薬物溶液の増加または減少によって電気浸透圧流動に直接影響を与 える。さらに、電気泳動媒体のpHならびにそのイオン強度は、キャピラリー／溶 液界面におけるゼータ電位を変化させ、それによって溶液の流動を変化させる。 電気浸透圧流動はまた、機械的なフラッシング(flushing)の必要性が無く、キ ャピラリーのフラッシングを可能にする。電気泳動のシステムは代表的には、１ 分間につき数ナノリットルから数百ナノリットルのバルク溶液を電気浸透圧的に 汲み上げ、これはキャピラリー径、および印加した電圧に依存している。このよ うにキャピラリーは洗浄され得、そして次の分析のための電気泳動条件が再生さ れ得る。システムの電気浸透圧フラッシングはまた電気泳動の間のキャピラリー の温度を低くし、それゆえ高電界時のジュール熱の影響に対抗している。 (b)電気泳動速度 分析の化学成分の電気泳動速度は、電界および電気浸透圧流動におけるその電 気泳動易動度によって決定される。成分の電気泳動速度は、電気泳動媒体の性質 （例えば、pH、イオン強度、および粘度）によって影響される。電気泳動媒体（ 例えば、遊離溶液、シービングゲル(sieving gel)、分配添加物もしくは錯体化 添加物、または等電点電気泳動媒体）が、システムの特定の成分の電気泳動易動 度を選択的に妨害する物理的性質のために選択され得る。例えば、より粘性のあ る媒体は種の分子ドラッグ(drag)を増加させ、それゆえ電気泳動易動度を減少さ せ得る。さらに、系中の電荷を持った分子（例えば、分析物、競合物、または 分析物−競合物複合体）のイオン化強度は、種々のpHにおける媒体の緩衝によっ て、あるいはイオン強度の改変によって選択的に変化され得る。さらに、分子が システムに導入される前または後に、電荷変更因子は分子に結合され得、分子上 の種々の置換基は当業者に公知の方法によって電荷変更され得る。電気泳動に使 用可能な電荷変更方法は、1995年４月20日に出願された米国特許出願第08/425,8 28号の表題であり、これは本発明の同一出願人によって所有され、本明細書中で 参考として援用される。式(4)は、電気泳動速度における差異が電気泳動媒体の 選択、pH、イオン強度、および粘度によって引き起こされ得ることを示している 。 (c)粘度 電気泳動媒体の粘度は、所定の化学種についての拡散係数に影響し得る。媒体 の粘度の改変は、実行しているアッセイがゼロ電位である場合に特に有効である 。媒体の粘度が上昇するにつれて、成分の拡散が明確でなくなる。ゼロ以下の電 位条件では、系の増加した化学成分の拡散は、検知可能な生成物の蓄積を減少さ せるという点で望ましくない。媒体の粘度は、当業者に公知の任意のパラメータ ーによって改変され得、次のものを含んでいる。非分配添加剤が媒体（例えば、 エチレングリコール、または線形ポリマー）に転嫁され得る。媒体はゲルであり 得、ゲルは溶液の正味の粘度を非常に増加させ、そして期間を延長して蓄積した 生成物は、ゆえに少しの生成物の拡散、または拡散なしで起こる。 (d)サンプルおよび反応物の容量 サンプルおよび反応物の容量、ならびにそれらが系に導入される順番は、他の 実験のパラメーター（例えば、分析物および反応物の相対的電気泳動速度、ゾー ンの範囲内の分析物および反応物の濃度、ならびに化学反応それ自身の動力学） を考慮して選択される。一般に、より大きい電気泳動速度を有する成分を含むゾ ーンが、より速い成分がより遅い成分を上回るように、より遅く移動している成 分のゾーンよりも後にキャピラリー中に導入され、与えられた成分の電気泳動速 度は同じ方向に向けられる。種が反対方向の電気泳動速度を持つ場合、分析物お よび反応物のゾーンは、互いに反対方向から接近するようなキャピラリーの異な る末端で導入され得る。 サンプルおよび反応物プラグの相対的な幅は、分析物および反応物の相対濃度 、 ならびに所望の検出感度に基づいて選択される。例えば、高濃度分析物の小さな ゾーンに注入した場合、非常に大きな容積（例えば、反応物のキャピラリー長の 延長）を使用することが望ましい。ゆえに分析物は、それが何回もそれ自身の反 応物の容積（式(6)を参照のこと）に遭遇するように、反応物と定量的に反応し 得る。代表的な分析物／反応物の容積比は、1/10、1/100、または1/1000等で、 より大きな反応容積の使用を伴い、反応した分析物の割合で増加をもたらす。よ り大きい反応容積が好ましいところでの別の例は、相互浸透した試薬のゾーンを 横切る速度と比較して反応速度が非常に遅い。逆に、分析物の濃度に関連して反 応物の濃度が非常に高い場合、それぞれの小さなプラグが注入され、本発明によ る化学分析を行い得る。小さい分析物または反応物はまた、ゾーンが相互浸透さ れる時間と関連して化学反応の時間が速いところで使用され得る。 （ｅ）印加電位 電気泳動動作を与えるのに必要とされる電位は、典型的には、一般的に１セン チメートル当たり数百ボルトから１センチメートル当たり数千ボルトの範囲の電 界強度で操作された高電圧源によって、キャピラリーをわたって印加される。米 国特許番号第4,865,706号および同第4,865,707号を参照のこと（この内容は、本 明細書中で参考として援用される）。電位印加は、手動操作、波形発生器、また はコンピュータ制御のいずれかを介して、制御され得る。 キャピラリー電気泳動における化学種の泳動速度は、電気泳動効果および電気 浸透効果により適用された電界に直接比例する。電界強度の強さは化学種の相対 泳動度に影響しない(等式(２)、(４)、(５)、および(６)、アッセイ時間、ゾー ンエンゲージメント(zonal engagement)が起こる時間、ならびに全相互浸透時間 から明らかである)が、それ故、反応は印加電圧によって影響される。一旦、分 析物と反応物ゾーンがかみ合うようになると、印加電位は接触の性質を決定する ：０より大きい電位では動的であり、０電位では静的である。一般的に、低電位 は、およそ1〜100ボルト/cmを意味し；高電位はおよそ100〜300ボルト/cmを意味 する。しかしながら、行うアッセイおよび使用する装置の計画に依存して、これ らの電圧範囲はかなり変化し得る。より低い電界強度は、より遅い化学種の 移動を生じる。これによって、２つのゾーンの接触時間が増加する。さらに、検 出可能種が分析物(または、酵素アッセイにおける酵素飽和状態の一過性酵素基 質複合体)と異なる電気泳動易動度を有する場合、低電位により、反応の近傍か らの検出可能種の分離率は比例的に減少される。結果として、低電位は最も高い 感度を提供する。低電位の一例は、ゼロ電位モードであり、これにおいて、最大 検出可能生成物は蓄積し、従ってより高い感度である。 より高い電位は、振幅としての速度の利点を提供するが、アッセイに関与する 種の移動率の相対値は、比例的に増加する。高電位はまた、これらの反応に、十 分な反応時間および感度が関与しないための即座にゾーンを混合する能力を提供 して、分析時間を最小化する。アッセイに関与する所定の化学に要する知識を考 えると、当業者は、アッセイに関与するそれぞれの段階を最適化するための電位 を選択し得る。例えば、ゾーンマージング段階は、高電位で行われて、即座の均 一な混合を誘導し得る。しかしながら、次の反応相は、低電位で行われて、反応 を起こし、最大感度を提供するための十分な時間を与え得る。次いで、電位は、 検出器を通って検出可能種を掃引し、分析時間を最小化するために増加され得る 。 化学反応が起こる比率よりも他の比率(すなわち、生成物形態の比率)で混合す ることによって、化学反応を開始するのが望ましい。従って、混合率は、反応率 よりも実質的に高いかまたは低いかのいずれかで行われるべきである。サンプル と反応物ゾーンとの混合率は、キャピラリーに印加する電位を変化させることに よって制御され得る。例えば、反応が即座に起こる場合、生成物形成がサンプル ゾーンにわたって均一であるために非常に即座に混合するか、またはゾーンエン ゲージメントが起こるゾーンにわたって、生成物形成が完全であるように非常に ゆっくりと混合するかのいずれかが望ましい。電気泳動的混合は、高電位におい てより速く起こる。従って、高電位での混合が好ましい。数千V/cmにおいて、混 合はミリ秒で起こる。次いで、電位は混合後に減少されるかまたは中断されて、 反応が起こされ得る。さらに、高電位での時間間隔は短いので、熱はほとんど産 生されない。 機械的混合法に対する電気泳動的混合の独特の特徴は、ゾーンが、異なる移動 率でマージされることである。濃縮は常に、電気泳動系のゾーン全体にわたって 不連続であるので、反応物の濃縮はゾーンエンゲージメント間で変化する。ゾー ンの異なる領域の一定率のエンゲージメントが、望ましい。ゾーンがGaussianで ある場合、ピークの立ち上がりおよび立ち下がりは、ピークの中央よりも低い濃 度を有する。ゾーンが電気泳動的に重ね合わされた場合、低濃度のゾーンがまず 混合される。従って、反応は低濃度で始まり、そして生成物形成率は１つのピー クにわたって一定でない。データ解釈を簡単にするために、即座にゾーンを重ね 合わせて、一定率に近い生成物形成率を得ることが望ましい。例えば、キャピラ リーが反応物で満たされ、次いで、分析物を含む少量のサンプルが導入された場 合、ゾーンの立ち上がりは、立ち下がり(これは即座に重なり合う)に比べてゆっ くりと重なり合う。印加電位が急激になくなる場合、立ち上がりはお互いを通し て電気泳動され、一方、ゾーンの立ち下がりは、次いで、０電位下で接触し得る 。従って、ゾーンの相対位置は、注意深くモニターされるべきである。 （ｆ）チャネル長/キャピラリー長 印加電位と合わせて使用されるチャネル長またはキャピラリー長は電界強度を 決定し、従って、それぞれの化学種の移動率にもまた影響する。チャネルまたは キャピラリーの全長に加えて、分離長(すなわち、チャネルまたはキャピラリー 内への分析物の導入点と、生成物が検出窓で渡す位置との間の長さ)は、アッセ イに影響する別のパラメータである。分離長は、等式(２)に示すように、アッセ イの混合および反応相を行うのに利用可能な時間に影響する。連続した電位下で よりゆっくりとした反応が行われる場合、より長い分離長はしばしば、分析物が 検出器を通過する前に反応を起こすのに十分な時間を必要とする。 スペーサー(分析物と分析試薬ゾーンとの間に配置された非反応媒体を含むゾ ーン)の組込みはまた、分析物の前反応分離の実験的調整を可能にする。この選 択は、サンプルプロセス特有の電気泳動速度内の多くの分析物が分析試薬と反応 して、非常に似通った電気泳動速度を有する同一の検出可能種を形成する場合の 系において重要である。このスキームにおいて、分析物分子は、キャピラリー内 の空間的および/または時間的に別々の位置で試薬ゾーンと遭遇する異なるゾー ンに分割され得る。結果として、検出可能種は、反応チャンバ内の独特の位置お よび/または時間において形成される。それ故、これらはこれらの形成の原因で ある特定の分析物を示して、一度に検出窓で観察される。 （ｇ）速度変更 速度パラメータは、pH、イオン強度、粘度、および温度のような因子の選択に よって変化され得る。反応率は、ボルツマン分布によって記載されるように温度 に非常に依存し、そして活性化エネルギーは所定の反応に必要とされる。サーモ スタットキャピラリー電気泳動系は、反応温度の選択を可能にする。さらに、電 気泳動媒体のpHおよびイオン強度は、逆反応の方向および速度を決定するために 変化され得る。最も酵素的な反応は、可逆であり、従って、分析物基質の最大代 謝回転に対する至適pHおよびイオン強度の範囲を要求する。拡散が制御された反 応の場合、電気泳動媒体の粘度は、反応物の分析物に対する最大利用可能性を決 定し、それ故、生成物形成の全体率を決定する。 粘度、pH、およびイオン強度はまた、異なる粘度、pH、またはイオン強度の２ つのゾーンの界面において種を濃縮することによって、本発明の方法の感受性を 増強するのに用いられ得る。化学種は、２つの粘度の隣接領域における、これら のそれぞれの電気泳動易動度によるか、または２つの粘度領域間の電界の可変性 によって、このような界面で「堆積」され得る。等速電気泳動の原理は、キャピ ラリー電気泳動系のサンプルを濃縮するために、この様式で用いられ得る(Chien およびBurgi、1991，J．Chromatogr．559:141；AebersoldおよびMorrison、1990 ，J．Chromatogr．516:79)。 （ｈ）電気泳動媒体 電気泳動媒体は、EMCAにおいて重大であり、なぜならそれは試薬種の物理的特 性を開発し、前に述べたように、EMCAに関与する物理的プロセスを行うのに必要 な電気泳動速度に可変性を与えるからである。EMCAで用いられるそれらの電気泳 動媒体は、キャピラリー電気泳動で利用されるものと類似している。それぞれが 、試薬種の独特の物理的パラメータを開発する能力を提供する。これらの電気泳 動媒体には、遊離溶液、ゲル、錯体形成試薬、分配添加剤、および両性電解質種 が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。 遊離溶液電気泳動は、典型的には、緩衝化媒体で行われる。遊離溶液における 電気泳動易動度は、所定の種の電荷密度によって決定され、これは前に等式(３) で述べた。pHおよびイオン強度のパラメータは、選択された緩衝化溶液の同一性 および濃度によって決定される。緩衝液は、化学成分に含まれる様々な部分のイ オン化の程度を変化し、従って、これらの電気泳動易動度を変化し得る。電気泳 動媒体はまた、キャピラリー表面のゼータ電位および得られる電気浸透流に影響 する。当業者により選択される電気泳動媒体のタイプは、系の化学成分の電気泳 動速度に関する制御を可能にする。この制御は、本発明の方法に関与する物理的 プロセスに広がる。到達できるpH範囲全体の無数の無機、有機、および生物学的 緩衝液が、キャピラリー電気泳動系で利用される。溶液なしの電気泳動系は、電 荷を獲得し得る全てのタイプの分子(多数のクラスの無機、有機および生物学的 分子を含む)において可変性の電気泳動易動度を与えるのに用いられる。 ゲルキャピラリー電気泳動は、化学種の電荷および分子の次元に基づく電気泳 動易動度における可変性を与える。この事象は、本発明の方法に関与する物理的 プロセスの制御における単一の選択性を提供する。最も一般的にキャピラリー電 気泳動において用いられるゲルは、ポリアクリルアミドおよびアガロースゲルで あり、ペプチド、タンパク質およびDNAフラグメントのような分子を分析するた めに用いられ得る。 電気泳動媒体における錯体形成試薬の使用は、荷電または非荷電試薬種と荷電 または非荷電溶液添加物との選択的相互作用を提供する。当業者は、分析物と錯 体を形成する能力に基づく所定の添加物を選択し得る。次いで、鉗体は特有の易 動度を有する電界で移動する。例えば、クラウンエーテルおよびシクロデキスト ランは、キラル化合物と選択的に錯体形成し得る添加物として用いられる。 分配媒体の使用(例えば、ミセル溶液を生成するためのイオン性界面活性剤の 添加)は、本発明の分析法を微調整する別の方法を提供する。それら自身の特有 の電気泳動易動度を有する荷電ミセル内への種の選択的分配は、遊離溶液で特有 の速度を有さない中性種のための異なる速度の発生を可能にする。多数のイオン 性界面活性剤が用いられ、これにはドデシル硫酸ナトリウム(SDS)および胆汁酸 塩が含まれる。ミセル相は、アミノ酸、薬物および薬物代謝物のような種の分析 に利用される。 両性電解質分子の電気泳動媒体への添加は、分析物、反応物および生成物が電 気泳動易動度においてわずかな差異のみを有する分析を微調整する方法を提供す る。両性電解質分子はまた、電気的中性が存在する場合のキャピラリーの一点に 移動する反応に関与する種の場合に有用であり、それ故、電気泳動易動度を止め る。次いで、得られる不均質溶液は、検出器を通過して進み得る。９．EMCAによる複数分析物決定 本発明の方法は、サンプル中の複数分析物の実質的同時決定を可能にする。従 って、例えば、血液サンプルは、多くの異なる分析物について同時に分析され得 る。異なる分析物は、同様のまたは異なる電気易動度を有し得、そして複数の分 析物が、１種以上の反応物と接触した後形成された生成物と同様のまたは異なる 易動度を有する電界において、移動し得る。サンプル中の複数の分せく物の分析 例は、以下のようである。 分析物Ａ、Ｂ、およびＣは反応物Ｒと反応して、生成物Ｐを生成するかまたは 枯渇する。Ｐは、Ｒと共に分析物Ａ、Ｂ、およびＣを含むそれぞれの化学反応に ついて、実質的に同一であり得る。あるいは、Ｐはそれぞれの反応に対して異な り得るが、電界で同じ速度で移動し、従って、その電気泳動速度の点では、区別 不能であり得る。 Ａ＋Ｒ→Ｐ Ｂ＋Ｒ→Ｐ Ｃ＋Ｒ→Ｐ この例における分析物Ａ、Ｂ、およびＣは、選択した電気泳動媒体において、こ れらが異なるかつ既知の相対電気泳動易動度を有する場合、区別可能であり得る 。これら特有の電気泳動易動度は、Ｒとの結合する前に３つの分析物の電気泳動 分離が可能であるという利点となり得る。従って、分析物Ａ、Ｂ、およびＣをそ れぞれ分離した後、Ｒとの化学反応を行って、Ｐを生成する。Ｐの３つの別々の ゾーンが生成される。Ｐの各ゾーンが検出器を通過して移動するので、検出され るＰ量は、サンプル中に存在するＡ、Ｂ、およびＣのそれぞれの濃度に関連付け られ得る。 分析物Ａ、Ｂ、およびＣは、反応物Ｒと反応して、３つの異なる生成物Ｐ_A、 Ｐ_B、およびＰ_Cを生成するかまたは枯渇し得る。これらの生成物は、独特の検出 特性または独特の電気泳動易動度のいずれかを有する。 Ａ＋Ｒ→Ｐ_A Ｂ＋Ｒ→Ｐ_B Ｃ＋Ｒ→Ｐ_C この例では、分析物の前反応分離は必ずしも必要ではないし、また分析物が異な る相対電気泳動易動度を有することも必要ではない。生成物Ｐ_A、Ｐ_BおよびＰ_C のそれぞれの別々の電気泳動検出特性または易動度が既知でなければならない。 分析物あ、Ｂ、およびＣと反応物Ｒとの電気泳動的混合および化学反応は、同時 におよび/または同じ速度で起こり得る。各生成物が検出器を通過して移動する ので、その検出された量は、サンプル中の対応する分析物の濃度に対応する。 分析物Ａ、Ｂ、およびＣは、反応物Ｒ_A、Ｒ_B、Ｒ_Cと反応して、生成物Ｐ_A、Ｐ_B 、およびＰ_Cを生成するかまたは枯渇し得る。 Ａ＋Ｒ_A→Ｐ_A Ｂ＋Ｒ_B→Ｐ_B Ｃ＋Ｒ_C→Ｐ_C この例では、３つの生成物が独特の検出または電気泳動特性を有さない場合、分 析物は電界において種々の相対易動度を有さなければならないし、そして分析物 の前反応分離が行われなければならない。分析物が電界で同じ速度で移動する場 合、これらは、生成物が別々の相対電気泳動易動度または別々の検出特性を有す る場合に同時に分析され得る。 １２．装置 図７において、装置１０は入口端１４および出口端１６を有するキャピラリー １２を含む。キャピラリーは、引っ張られたガラス管、または微量サンプルを電 気泳動するための任意の手段であり得る。荷電した電極１８は、導電性媒体２６ および導電性媒体３０を有する反対に荷電した電極２０と連絡している。電極１ ８および２０は、電源２２に電気的に接続されている。装置１０はまた、コンジ ット２４を介して管１２の入口１４に供給される、新鮮に供給される導電性媒体 ２６を含む。緩衝液は管を満たし、そしてコンジット２８からリザーバ３０に出 る。キャピラリーは１〜500μｍ、好ましくは25〜200μｍ、そして最も好ましく は75〜100μｍの範囲の直径を有し得る。キャピラリーの長さは、入口端から出 口端まで１〜500cm、好ましくは5〜100cmの範囲であり得る。１cmあたり数百ボ ルトから数千ボルト以上の電界で作動するキャピラリーが好ましい。米国特許第 4,865,706号および同4,865,707号(本明細書中で参考として援用される)を参照の こと。 検出器３６からの出力は、レコーダー４４に接続され、レコーダーはコンピュ ータ46に接続される。レコーダー４４は、電気泳動図４８としてデータを記録す る。サンプル３４はコンジット３２を介して管１２に導入される。検出器３６は 、管を通過する化学成分を、例えば位置３８で検出する。検出器３６は、検出器 が連絡するキャピラリー管１２を横切るようなサンプルの成分を感知し得る任意 の検出器であり得る。電磁放射線の変化を感知することによって作動する検出器 (例えば、紫外線、赤外線、および蛍光検出器)は、キャピラリー管２４上に存在 する任意の有機材料の保護コーティングが、検出器が作動するべきキャピラリー の領域にわたって除去されていなければならない。 他のオンカラム(on-column)検出方法は、反応の放射性標識成分の検出を含み 、適切に設計された放射性感知デバイスを用いる。この検出アプローチもまた、 オフライン回収およびそれに次ぐ決定で使用され得る。 検出器が、分離されたサンプル構成成分を、それらがキャピラリー管１２から 出る際に直接感知することによって作動することも可能である。このような検出 器の例は、質量分光光度検出器および電気化学検出器を含む。質量分光測定検出 器において、キャピラリー管１２の出口端１６は質量分析器の入口に非常に近い 位置に配置され、そして電極もまたこのキャピラリー端に近い位置に配置され、 キャピラリーを出る導電性媒体と接触する。キャピラリーを横切る電界は、キャ ピラリー端のこの電極と、キャピラリー管入口端１４が接触している導電性媒体 と接触する対応の電極またはワイヤとの間に確立される。検出器またはプローブ が、キャピラリー管１２を出る導電性媒体と接触を生じなければならない場合に 有用である、さらなる別の検出器の実施態様において、キャピラリー管の出口端 は、多孔性ガラススリーブによってキャピラリー管の非常に短い付加部分に接続 され、そしてこのスリーブは導電性媒体に浸漬される。電気泳動場にかけるため の電気的接触は、キャピラリー管のそれぞれの末端で導電性媒体のリザーバとな され、そして検出器プローブは、キャピラリー延長を出る導電性媒体と接触する ように配置される。 任意のプログラム可能コンピュータは印加された電位を制御するために任意の の波形発生器に連絡され得、そして入力を指示し得る。コンピュータは、単一の デバイスまたは２つの独立したデバイスであり得る。発生器は順に連絡され、そ して電源２２に入力を指示し得る。電源２２からの電気的出力は、電極１８に沿 って導電性媒体２６に達するか、または電極２０に沿って導電性媒体３０に達す る。 プログラム可能コンピュータは波形発生器を指示するようにプログラムされ得 、所定の電気泳動化学反応で所望される振幅または周波数を生成する。コンピュ ータはまた、任意の自動サンプラーの動作を指示し得、これは順に電気泳動系へ のまたは系からのサンプルの入力または出力を指示し得る。例えば、サンプラー は、サンプル３４と媒体２６との間の入口端１４を短絡し得、サンプルまたは媒 体をキャピラリー管に導入する。 波形発生器は任意の従来の波形発生器(例えば、Model 75、Wavetech、San Die go、CA)であり得る。波形はコンピュータ制御によって、または独立モード(stan d-above mode)で実行され得る。好ましくは、種々の波形(正弦波、方形波、三角 波などを含む)を、規定された参照電圧に関して正または負の検出で提供し得る 。 作動の際に、装置１０は分析物を検出するために以下のように使用され得る。 例えば、検出される分析物が酵素の活性である場合、酵素３４を含むサンプルは 電気泳動によって、またはコンジット３２を通じて吸引することによって入口１ ４でキャピラリー１２に導入され、基質はキャピラリー１２内に含まれる。電位 が印加される場合、この例における酵素および基質は電荷およびそれらをキャピ ラリー中で反対方向に向ける電気泳動移動性を有する。電源２２は作動され、そ して電極１８および２０を介してキャピラリーに印加電位を送達するように調節 される。従って、図４に示されるように、酵素および基質は電界を移動し始め、 そして生成物が形成されて、そして検出器３６に向かって移動し始める。生成物 が検出器３６に達すると、信号がレコーダー４４およびコンピュータ４６に伝達 される。次いで、電気泳動図４８が生成され、キャピラリー１２中で電気泳動的 に試薬と混合される（すなわち、管内の各荷電成分は、その電荷に従って管に沿 って移動し、従って異なる速度で移動する他の成分と混合する）。 迅速な混合は、反応後検出器(post-reaction detector)を用いて達成され得(E l Rassi，1976、Journal of Chromatography 559:367)、液体クロマトグラフィ ー系においても同様である(Schlabachら、1978、CliniCal Chemistry 24:135l ；Snyder、976、Journal of Chromatography 125:287；Deelderら、1977、Journ al of Chromatography 125:287)。例えば、基質は、キャピラリー管の入口端で 混合ティー(mixing-tee)を通じて系に添加され得(例えば、ここでコンジット３ ２および３４が図７に加わる)、次いで反応混合物はキャピラリー管に汲み上げ られる。生成物の検出は、任意の従来のキャピラリー電気泳動検出器を用いてキ ャピラリーの出口端の近傍で達成される。混合ティーと検出器との間の通過時間 は一定であるので、この系は固定時間アッセイを近似し得る。酵素活性または基 質濃度は、それが検出される検出器に酵素および基質を含む酵素反応の生成物を 電気泳動することによってアッセイされ得る。本明細書中で記載されるように、 一定電位のもとで、酵素および生成物の輸送速度は一般に異なり、そして生成物 は、それが形成された後すぐに酵素から分離され得る。 生体認識部分を有する競合剤を含むアッセイを行うのに有用な装置は、上記の デバイスに類似し得る。すなわち、デバイスのチャネルは単純なキャピラリー管 であり得、そして装置全体は、図７に示されるような実施態様によって表され得 る。 その最も簡単な形態の１つにおいて、本発明の分析用デバイスはチャネルを含 み、上記のように電気泳動媒体を含むチャネルおよび競合剤の第２の反応物部分 と反応する第１の反応物を有する。この分析用デバイスは、特定の分析物または 分析物の群に特異的な診断キットの一部であり得ることが考えられる。分析物の 標本を得るに際し、結合反応は容器中で行われ、次いで反応容器からチャネルへ サンプルを導入する。分析用デバイスは、チャネルへのサンプルの導入前または 後のいずれかで、電気泳動装置中に配置され得る。次いで、電位が印加され、チ ャネルの分子が移動し始め、そして競合剤の第２の反応物部分(通常酵素)が反応 するか、または検出可能な生成物の産生を触媒する。次いで、検出可能な生成物 は、検出器を通ってチャネルに沿って移動し、そして検出される。定量器(quant itator)が存在する場合、検出可能な生成物は当業者に公知の定量器によって定 量され得る。代表的には、定量器は装置と相互接続されたコンピュータである。 検出器からの入力信号の操作および結果の提示は当業者に公知である。定量器の 使用は、所望の形式で正確でかつ迅速な結果を提供する。チャネルは上記のよう にキャピラリーであり得るか、またはマイクロチップの一部のようなフロー系(f low system)であり得る。 分析用デバイスは、結合反応を行うためのサンプル注入ゾーン、およびチャネ ルを含み得る。再度、このデバイスは診断キットの一部であると考慮される。ア ッセイが同種であるべき場合、固定化された反応物は存在しない。競合剤(単数 または複数)は存在し得る。しかし、アッセイが異種であるべき場合、固定化さ れた反応物は、サンプル注入ゾーンに存在する。デバイスは、サンプル注入ゾー ンの固定化された反応物に加えて競合剤を有し得、サンプル注入ゾーンに導入さ れたサンプルと混合される。デバイスは分離ゾーンを有し得る。いくつかのデバ イスは、サンプルインキュベーションゾーンを含み得る。類似の装置が米国特許 出願番号第08/726,093号(1996年10月４日出願)に開示されており、これは本発明 の共通の譲受人によって所有されており、そして本明細書中で参考として援用さ れる。 図８を参照すると、より好ましい装置５０は、サンプル注入ゾーン５２を含む 。１つ以上の固定化された反応物５４および競合剤５６は、サンプル注入ゾーン ５２内に配置されており、その結果、サンプル注入ゾーン５２へのサンプルの導 入の際に、固定化された反応物５４および競合剤５６はサンプル注入ゾーン５２ に導入されたサンプルと接触する。好ましくは、固定化された反応物５４は、固 定化された抗体である。装置は、そこに配置された電気泳動媒体６０および第１ の反応物６２を有するチャネル５８をさらに含む。チャネル５８は、サンプル注 入ゾーン５２、緩衝液リザーバ６４、注入/廃棄リザーバ６６、および廃棄リザ ー バ６８と連絡している。流体連絡は、代表的には、これらのゾーンの間に存在す る。特定の実施態様において、チャネル５８を有するサンプル注入ゾーン５２の 交差部は、チャネル５８を有する注入/廃棄リザーバ６６の交差部から上流にあ る。このオフセット設計は、より大きな注入容量を実現し得る。 図９、パネルＡを参照すると、異種アッセイのための１つの可能な系構成の動 作が記載されている。分析物がサンプル注入ゾーン５２に添加され、そして結合 反応が、サンプル注入ゾーン５２に存在する非結合競合剤の脱離を生じる。電圧 (V)が、ゾーン６６に印加されたグランド(GND)に対してゾーン６４、５２および ６８に印加され、そして流れるサンプル流をピンチオフするように制御されて、 サンプリング時間から独立した注入容量を提供するチャネル５８へのサンプル７ ０の拡散を防止する。次いで、ゾーン６４、５２、６８および６６の間の電位を 停止し、そして電位をゾーン６４とゾーン６８との間にかけて非結合競合剤５６ を、第１の反応物６２を含むチャネル５８内に移動する。図９、パネルＢに示さ れるように、印加された電圧の制御は、例えば、競合剤５６および第１の反応物 ６２と非結合競合剤５６上の第２の反応物部分との反応から形成される検出可能 な生成物７２のサイズおよび電気泳動易動度による分離を可能にする。以前に述 べたように、装置は連続モード(すなわち、電位が連続的に印加される)、または 「ストップ−フロー」モード(チャネル５８が十分な時間０電位に供され、検出 可能な生成物７２の量の増加を可能にする)で作動され得る。 装置は、温度制御手段７４と接触して配置され得る(図８)。温度制御手段７４ は、アッセイが実施される温度を制御するために活性化され得、反応条件および 動力学に関してさらなる制御を提供する。 装置はまた、固体基材上に形成された複数の平行チャネルを有するマイクロチ ップのようなチップであり得る。このようなデバイスは、多くの別個の分析を並 行して行うことができ、高いスループットを達成する。図１０を参照すると、装 置７６は、サンプル注入ゾーン５２、緩衝液リザーバ６４、注入/廃棄リザーバ ６６、および廃棄リザーバ６８をそれぞれ有する複数のキャピラリーチャネル５ ８を含む。装置は、温度制御手段７４と接触して配置され得る。任意の公知の検 出手段が、本発明の装置で使用され得、そして当業者によって容易に選択され得 る。本発明の方法および組成物に従って使用される場合、装置は分析物、競合剤 、分析物-競合剤複合体または検出可能な生成物の定性的および定量的検出を可 能にする。 微流量系(microfluidic system)(例えば、本発明のマイクロチップ)は、通常 固体基材から構築される。微流量系は、マイクロエレクトロニクス製造産業で使 用されるものに類似の微細加工技術を用いて組み立てられ得る。例えば、マイク ロチップ分離デバイスは、化学エッチング剤(etchant)と組み合わせた写真平板 を用いて作製され得、固体基板(例えば、溶融シリカウエハ)にチャネル構造を形 成する。エッチングの深さ、従ってチャネルのサイズはエッチング時間をモニタ ーし、チャネルの深さを測定することによって制御され得る。アクセスホールは 、エッチングされたウエハを通してチャネル末端でレーザー穿孔される。そうす ることが所望である場合、第２のウエハはエッチングされたウエハに結合され、 遮蔽されたチャネルを生成する。結合した後、ウエハはその意図された用途に応 じて個別の分離チップに切断され得る。 微流量系のための固体基材は、その用途に適切な任意の材料であり得る(例え ば、ガラスまたはシリカ)。しかし、微流量デバイスはまた、適切なポリマー材 料(例えば、ポリスチレン)から作製され得る。ポリマー材料から作製された微流 量デバイスは、完全な系において高価ではない成型部品の使用を可能にし、それ により試験当たりのコストを減少する。 図１１を参照すると、溶融シリカマイクロチップは、電源およびチップベース アッセイのための蛍光光学と連結され得る。高電圧は、切換回路および抵抗ネッ トワークを通じてSpellman CZE 1000R電源(Plainview、NY)または他の適切な電 源によって提供され得る。レーザー誘導された蛍光検出は、Omnichrome(Chino、 CA)アルゴンイオンレーザー、または他の適切なデバイスを用いて行われ得る。 顕微鏡対物レンズは、蛍光放出を収集するために使用され得る。収集された光は 、像平面の開口部によって空間的にフィルターにかけられ得、そして光学的に帯 域通過フィルターでフィルターにかけられ得る。電位計(例えば、Keithley 614( Cleveland、OH))に接続された光電子倍増管(例えば、Hamamatsu R928(Bridgewat er、NJ))は、蛍光シグナルを検出し得る。シグナルは、PC制御されたデータ取得 シス テム(例えば、Data Translation 2804(Marlborough、MA))でデジタル化され得、 そして適切なソフトウェア(例えば、ADI(Alameda、CA)からのCaesar software) を用いて解析され得る。 従来のキャピラリー管に比べて、微細加工技術の主な利点は、チャネル交差部 を有するチャネル構造を構築することができ、その結果複数の流体の流れが接触 に導かれ得る。本発明において、第１の反応物(例えば、酵素基質)は、第２の反 応物部分(例えば、酵素)を有する競合剤を含むサンプルの導入とは異なる点でチ ャネルに導入され得る。従って、第１の反応物と第２の反応物部分との間の反応 のタイミングおよび場所に関してより良い制御が可能である。さらに、結合反応 のゾーンは増幅のゾーンから分離され得、アッセイ手順の設計により大きな柔軟 性を提供する。 13．キャピラリーの調製 本発明で使用されるキャピラリーは、代表的にはコーティングされていない。 しかし、コーティングされたキャピラリーが使用され得る。コーティングされた キャピラリーは、外表面が試薬（例えば、ポリイミド）でコーティングされたシ リカから構成され得、シリカの脆い性質による破損を防止する。本発明で使用さ れるキャピラリーの長さまたは内径に固有の制限はないが、代表的な長さの範囲 は５〜100cmである。10と500μｍとの間の直径を有するキャピラリー管が本発明 で有用である。 本発明の方法において、キャピラリーコーティングを使用することはしばしば 有利である。これらのコーティングは、コーティングされていないシリカの使用 に対していくつかの利点を提供する。シラノール基のイオン化は、負に荷電した シリカ表面を生成する。正に荷電した分析物（例えば、タンパク質）は、負に荷 電した壁に吸着し、それによってシリカ／溶液界面でのゼータ電位を変化させる 。ゼータ電位の破壊により、電気浸透流が変化し、再現性が減少し得、そして生 成物の回収が減少する。電気浸透流の変化性は、定量分析において特に有害であ る。なぜなら、キャピラリー電気泳動において観察されるピーク面積が、種の電 気泳動速度に反比例するからである。任意の電気浸透流の変化は、ピーク面積に おけ る同時の変化を生じる。キャピラリー表面修飾もまた、電気浸透流を制御するの に有用であり得る。電気浸透流を調節する能力は、本発明を実施するための強力 なツールとして役立つ。ゾーンの電気泳動混合のプロセスならびに検出器への検 出可能な生成物の輸送は、電気泳動速度、それゆえ、系の電気浸透流に依存する 。 キャピラリー電気泳動に使用されているこれらのコーティングは、キャピラリ ー壁を動力学的に修飾するためのシリカ表面の共有結合修飾ならびに緩衝添加剤 の使用を含む。共有結合修飾技術の代表的な例は、エポキシポリマー(Townsら、 1992、J.Chromatogr．599:227)、ポリエチレン−イミン(TownsおよびRegnier、1 990、J.Chromatogr．516:69)、アミノプロピルーシリル化コーティング(Moseley ら、1991、Anal.Chem．63:109)、ポリアクリルアミド(Cobbら、1990、Anal.Chem .62:2478;Hjerten、1985、J.Chromatogr．471:429)を含む。動力学的コーティン グの使用の代表的な例は、アミン添加剤(LauerおよびMcManigill、1986、Anal.C hem．58:166;Nielsenら、1989、Anal.Biochem．177:20)、カチオン性ポリマー(W iktorowiczおよびColburn、1990、Electrophoresis 11:769)、およびカチオン性 フルオロ界面活性剤(Emmerら、1991、J.Chromatogr．547:544)を含む。吸着した 動力学的コーティングに結合した共有結合修飾もまた、例えば、シラン誘導体化 表面に吸着した非イオン性界面活性剤の使用において利用されている(Townsおよ びRegnier、1991、Anal.Chem．63:1126)。 14．検出器および検出方法 任意の従来の検出方法が、本発明で使用され得、従来のキャピラリー電気泳動 方法において使用される方法を含む。化学種の任意の物理特性の検出を可能にす る検出方法が、選択され得る。これらの検出システムとしては、紫外線または可 視光線の吸光度、蛍光、化学発光、屈折率、ラマン、質量分析、電気化学、およ び導電率が挙げられるがこれらに限定されない。電気泳動的に輸送された生成物 の検出は、キャピラリーの長さに沿った分離した位置にてオフラインで、または キャピラリーの全長をイメージングすることにより、起こり得る(Wuら、1992、A nal.Chem．54:219、本明細書中で参考として援用される)。 15．注入方法 サンプルまたは反応物容量は、キャピラリー電気泳動システムで使用される任 意の方法により導入され得、流体力学的、動電学的、真空、注入ポート、および シリンジ方法を含む。さらに、このシステムは、市販の自動注入器を用いて注入 を容易に自動化され得る。 16．本発明の好ましい実施態様 本発明は、サンプル中の分析物（例えば、サンプル中の酵素活性または基質濃 度）をアッセイするために、化学反応を行う超微量方法に特徴がある。酵素がサ ンプル中に存在し得、そして基質の転化がサンプル中の酵素の存在の指標として モニターされ得る。あるいは、基質がサンプル中に存在し得、そして酵素活性（ 例えば、補因子の利用または酵素の不活化）が基質の存在を示すためにモニター され得る。酵素活性のアッセイは、基質の飽和濃度下で行われ、一方、基質濃度 のアッセイは、酵素の飽和濃度下で行われる。アッセイは、例えば、図７に示す ように、キャピラリー電気泳動装置において不活化溶融シリカキャピラリー中で 行われ得る。 実施例 以下に示す結果は、酵素に結合した生体認識部分を有する少量の酵素または競 合剤が、本明細書に記載の方法に従って、キャピラリー中で酵素アッセイを行う ことにより、キャピラリーゾーン電気泳動システムにおいて検出され得ることを 例示する。アッセイは、印加された電位下で、酵素、競合剤、分析物−競合剤複 合体、試薬、および生成物の異なる輸送速度に依存し、反応物を電気泳動的に混 合し、そして生成物から酵素、競合剤および／または分析物−競合剤複合体を電 気泳動的に分離する両方のために使用され得る特性を有する。生成物は、検出器 に到達するまでキャピラリー管を通って輸送され、ここで、その濃度を決定し、 そして、サンプル中の酵素、競合剤または分析物−競合剤複合体の活性または濃 度と関連付ける。本発明の方法による検出限界は、従来のアッセイの検出限界よ りも３桁より感度が高いようである。 実施例１は、酵素反応を使用してキャピラリー電気泳動フォーマットにおける 検出可能な生成物の形成を触媒することを例示する。実施例２は、生体認識部分 を有する競合剤が、免疫反応溶液のアリコートを酵素増幅キャピラリー電気泳動 分析に供する前に、異種競合免疫反応に関与する本発明の方法を例示する。 １．酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの分析 酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ(G-6-PDH、EC 1.1.1.49)を、本 発明による分析のための代表的な酵素として使用し得る。G-6-PDHは、ほとんど 全ての動物組織および微生物において見出され、そしてヘキソース−リン酸短絡 (shunt)経路における第１の反応を触媒する。G-6-PDH欠乏の臨床生化学は、広範 に概説されている(Yoshida、1973、Science 179:532)。 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ(G-6-PDH)、D-グルコース-6-リン酸 :NADPオキシドレダクターゼとも呼ばれる、を選択し、超微量酵素アッセイを試 験した。なぜなら、この酵素は容易に分光光度的にアッセイし得るからである(S igma診断手順Ｎｏ.345-UV、1990)。G-6-PDHは、グルコース-6-リン酸(G-6-P)を6 -ホスホグルコネート(6-PG)に酸化し、一方、G-6-Pの存在下で、ニコチンアミド アデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)をその還元形態NADPHに還元する。 生成物NADPHの吸光度スペクトルは、G-6-PDHまたはランニング緩衝液のいずれの 吸光度スペクトルとも独自に異なる。NADPHは、340nm(ξ=6.22×10⁶cm²/mole)に て吸収極大を有する。酵素６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ(6-PDH)は 、例えば、G-6-PDHを含まない赤血球からの6-PGDHが混入した血清サンプル中で 、干渉し得る。6-PGDHの存在下、6-ホスホグルコン酸はさらに酸化されて、第２ のモルのNADPHを生成し得る。インキュベーション混合物へのマレイミドの添加 は、6-PGDHを阻害する。図12は、０電位での(a)2、(b)4、(c)6、(d)8、(e)10お よび(f)28分後の、340nmでのNADPHの吸光度の増加を示す。 本実施例に記載の本発明の方法は、任意の従来のキャピラリー電気泳動システ ム（例えば、上記で参考として援用される米国特許に記載のもの）を用いて実施 される。好ましいキャピラリー電気泳動装置は、ISC03850キャピラリー電気泳動 システム(Instrument Specialties Company，Lincoln，NE)である。このシステ ムを、ソフトウエア「Inject」(Bioanalytical Systems，Lafayette，IN)を用い てパーソナルコンピューターに接続し、データを収集および処理し得る。別の好 ましいキャピラリー電気泳動システムを、50μｍの内径、360μｍの光学密度(OD )、および35〜60cmの長さのポリアミンコーティングされた溶融シリカキャピラ リー(Polymicro Technologies，Phoenix，AZ)を用いて構成し、カラムを調製す る。分離長は、15〜40cmで変化する。検出を、可変波長UV吸光度検出器(Model V 4，Instrument Specialties Company，Lincoln，NE)を用いて達成する。タンパ ク質溶出を、200nmにてモニターし、そして生成物を適切な波長（例えば、NADPH は340nmでモニターする）でモニターする。中性マーカーであるメシチルオキシ ドを、254nmで検出する。ストリップチャート記録を、Linear 2000レコーダー(L inear，Reno，Nevada)を用いて得る。 試薬（例えば、基質、補因子、酵素、またはマーカー）を、任意の製薬または 化学会社(例えば、Sigma Chemical Co.(St．Louis，MO)、Aldrich(Milwaukee,WI )、またはCalbiochem(San Diego，CA))から得得る。本明細書に詳細に記載した 実施例において、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ試薬およびG-6-PDH基質 溶液を、Sigma Chemical Co.から購入した。試薬を調製し、そしてLohrら、グル コース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、H.U.Bergmeyer(編)、Methods of Enzymatic Analysis、第２英語版、Verlag Chemie、Weinheim and Academic Press、New Y ork、1974、636頁に記載のようにアッセイを行った。エチレングリコールジグリ シジルエーテル(EGDE)、3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(GOX)、1,4 -ジアザビシクロ[2.2.2]-オクタン(DABCO)、メシチルオキシド、溶媒および緩衝 液を、Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，WI)から得た。緩衝液を、脱イオン化 し２回蒸留した水を用いて調製した。 タンパク質サンプルを、サイホンによりキャピラリー電気泳動装置に注入し得 る。キャピラリーの入口端部をタンパク質サンプルに挿入し、そして５秒間約５ cm上昇させ得る。中性マーカーを、同様の方法でキャピラリーに導入する。ラン ニング緩衝液は、酵素活性をアッセイするのに必要な全ての試薬を含み得る。ア ッセイ試薬を、試薬供給者(Sigma Chemical Co.、St．Louis、MI)に従って再構 成する(Jorgensonら、1982、Analytical Chemistry 53:1298)。例えば、本明細 書に記載のG-6-PDHアッセイについて、緩衝溶液は、安定化剤および溶解剤に加 えて、0.7mmol/Lのグルコース-6-リン酸(G-6-P)、0.5mmol/Lの補酵素であるニコ チンアミドジヌクレオチド二リン酸(NADP)および4mmol/Lのマレイミドを含有し た。操作電流を、印加電位を制限することにより35〜50μＡの範囲内に制御し、 そして60μＡを越えて操作しなかった。全てのアッセイを、温度制御することな く、室温で行った。キャピラリーを、0.01Mの水酸化ナトリウム、２回蒸留した 水、次いで作用緩衝溶液で流すことにより洗浄した。 不活化を、共有結合したエポキシポリマー層を用いて達成した。このコーティ ングは、キャピラリー電気泳動において95％より大きなタンパク質回収を与える ことを示した。これらの不活化キャピラリー中の電気浸透流は、実質的に減少し 、そして負に荷電した種(例えば、NADPH)は、30cmのキャピラリーを通過するた めに20〜30分を必要とし得る。G-6-PDHは比較的高いpI値を有するので、素早く 輸送される。G-6-PDHおよびNADPH電気泳動易動度は、それぞれ５分および18分で あることを見出した。 キャピラリーゾーン電気泳動システムを使用し、ここで、緩衝液タンクおよび キャピラリーを、酵素を除いてアッセイに必要な全ての試薬を含有するランニン グ緩衝液で満たした。サンプル酵素を、注入によりキャピラリーに導入し、そし て電位を印加して酵素と基質との電気泳動混合を開始した。生成物の形成を、34 0nmにてUV検出器で測定した。アッセイを、一定の電位モード（ここで、アッセ イの時間経過中、一定電位下で反応物が残った）下、および０電位モード（ここ で、反応物の分離はアッセイの一部の間に停止した）下で別々に行った。 図13(a)の一定電位下で得たG-6-PDHアッセイの電気泳動図は、それが触媒する 反応の生成物よりも大きい輸送速度を有する酵素について一般的な形状を有する 。この場合においてアッセイに必要な総時間は、12分よりもわずかに短い。より 希釈した酵素溶液を用いてより長いキャピラリーを使用した場合、図13(b)は、 プラトー高さがより低く、そして酵素の溶出時間がより長いことを示す。この場 合、後続の注入人為的ピークを溶出する前にデータ収集を停止した。（注入人為 的ピークの高さは変化し得、そして分析値を有しない。）注入人為的ピークのサ イズは、以下の３つの因子に関連することを見出した：注入の間の混合のサイズ 、容量および程度；サンプル中の酵素濃度；および注入と電気泳動の開始との間 の経過時間。 サンプルの注入と電気泳動の開始との間に数分経過させた電気泳動図の例を図 14(a)に示す。比較のために、図14(b)に示す電気泳動図を、サンプルを素早く注 入し、そして酵素が検出器を通過する前に数分間電位が０に降下したアッセイの 結果として作成した。約８分の大きなピークは、電位の数分（５分）の実行への 中断の結果である。 分析時間はまた、キャピラリーの短縮により感度を損失することなく、12分よ り少なく減少し得た。分析時間を最小にするという観点から最適の長さは、プラ トーまでの生成物溶出曲線に必要な長さである。分析時間を短縮するための電位 の増加は、電位の増加が生成物蓄積および感度を減少させるので、逆効果である こを見出した。 図10(a)および図10(b)中の3.5分および6.0分で溶出する小さなピークは、それ ぞれ200nmおよび340nmで吸着し、そして340nmで吸着するかまたはNADPHを結合す るが触媒作用において役割を果たさないかのいずれかであるサンプル中のタンパ ク質であり得る。 キャピラリーから酵素が溶出する前に、電位を０に切り換えると、インキュベ ージョン時間が増加し、従って感受性になる。０電位アッセイを、約６分までの ０電位ポーズ(pause)、キャピラリーの4cmのセグメントで行う。電位を３分後に 中断し、そして電位が生成物溶出に対する8700Ｖに戻った後、０電位を５分間保 持する。4.6×10^-17モルのG-6-PDHを含むことが推定されるサンプルの電気泳動 図を図15に示す。この推定は、２nLの注入容量の仮定に基づくものである。20分 におけるピークに留意のこと（これは、５分の０電位インキュベージョンから得 られる）。このアッセイ手順を用いるG-6-PDHに関する用量-反応曲線を、図16に 示す。この図に関するデータを表１から得た。表１に示されるG-6-PDHアッセイ は、17.8/41cm GOX-EDGEコーティングされたキャピラリー（内径50μｍ）を用い て行った。電源を、8700ボルト、50mAに設定した。サンプルをキャピラリー管の カソード端部を10秒間上げることによって注入した。検出を340nm、0.02auの感 度で行った。定量は電気泳動図の一定電位生成物プラトーの上のピーク領域の測 定に基づく。１単位／mLのG-6-PDHを含む溶液は、約３×10^-8Ｍである。このア ッセイの直線動的範囲を決定する試みはしなかったが、類似の巨視的アッセイ は、それが２オーダー程度であり得ることを示唆している(Sigma diagnosticspr ocedure No.345-UV、1990)。 表１ キャピラリー電気泳動アッセイによって得られたG-6-PDH活性２．トリヨードチロニンの分析 トリヨードチロニン（3,3',5-トリヨード-L-チロニン；「T3」）およびチロキ シン（「T4」）は、血流中に見出される２つの活性甲状腺ホルモンである。約20 ％の循環T3を甲状腺による直接合成および分泌から誘導するが、それに対して80 ％は末梢組織のT4の脱ヨウ素化によって産生する（Larson、Metabolism、21；10 73-1092(1972)）。 T3は、血清タンパク質、特にチロキシン結合グロブリン（「TBG」）、チロイ ド結合プレアルブミン（「TBPA」）およびアルブミンにまず結合された末梢血流 を通って輸送される。約0.3％の全血清T3のみが、結合しておらず、組織に拡散 するように遊離しており、その生物学的影響を及ぼす。T3は、実質的にすべての 組織において酸素消費率および熱産生率に対してその主な影響を有する。ホルモ ンはまた、成長における重要な役割である、成長生物体の発達および性的成熟を 果たす。全T3の決定は、甲状腺疾患（特に、甲状腺機能亢進症）の区別および臨 床的診断において用いられる１つのパラメーターである（Sterlingら、Annual R eview of Physiology、39:349-372(1977)）。 T3を、本発明の方法を用いて、血清、複合体生体サンプル混合物からアッセイ した。T3アッセイは、競合アッセイである。サンプル中のT3は、抗-T3モノクロ ーナル抗体でコーティングされたウェル上、抗体結合部位に対してT3-アルカリ ホスファターゼ（「T3-ALP複合体」）と競合する。結合部位数は限定されるので 、部位がT3によって占められるほど、T3-ALP複合体を結合し得る部位は少なくな る。インキュベーション期間後、サンプル中のT3の量は、ウェルで結合したT3-A LP複合体の量に反比例し、そしてインキュベーション溶液中の結合していないT3 -ALP複合体の量に正比例する。従って、インキュベーション溶液のアリコートを 、結合していないT3-ALP複合体の酵素増幅された電気泳動的に媒介されたミクロ 分析のために、キャピラリーに注入し、血清サンプル中のT3の量を間接的に決定 する。 T3-ALP複合体、免疫学的活性種を、キャピラリー電気泳動フォーマットにおい てオンラインで酵素的に増幅および定量した。T3のその臨床学的範囲（10^-10Ｍ ）のより低い制限に対する定量を、酵素学的増幅とレーザー誘導された蛍光検出 とを組み合わせることによって容易に達成した。T3アッセイは、この方法論が、 キャピラリー電気泳動フォーマットによって提供されたコントロールおよび柔軟 性、ならびにこの方法の自動化し易さ(amenability)を考えると、より感受性な 臨床アッセイに適用可能であることを示す。 本実施例で記載された本発明の方法は、任意の従来のキャピラリー電気泳動シ ステム（例えば、上記引用文献によって援用された米国特許および本明細書中に 記載の任意の微小流体システムに記載のもの）を用いて行われ得る。好ましいキ ャピラリー電気泳動装置は、Laser Module 488アルゴンイオンレーザーを有する A P/ACE 2050キャピラリー電気泳動機器である（Beckman Instruments，Fullert on，CA）。このシステムを、レーザー誘導蛍光(「LIF」)検出のための520ナノ メータ(nm)のバンドパスフィルタで使用した。分離を、注入部位のアノード、通 常極性様式で行った。適切なキャピラリーは、未処理のキャピラリー（Polymicr o Technologies，Phoenix，AZ，USA）（35センチメートル(cm)長（検出器まで28 cm、内径50μｍを有する）。 試薬（例えば、基質、補因子、酵素、競合剤、生体認識化合物、生体分子、ま たはマーカー）は、任意の製薬会社または化学会社（例えば、Sigma Chemical C o.（St.Louis，MO）、Aldrich（Milwaukee，WI）、JBL Scientific（San Luis O bispo，CA）またはCalbiochem（San Diego，CA）から得られ得る。PNAモノマー シントンおよびPNAは、PerSeptive Biosystems，Inc.（Framingham，MA）から得 られ得る。詳細に記載される本明細書中の実施例において、血清中のT3およびAt toPhosアルカリホスファターゼ基質（「Attophos基質」）の定量決定のためのMi crozyme Enzyme Immunoassay Test Kitは、Diatech Diagnostics Inc.（Boston ，MA）から購入した。トリス-ボレート-エチレンジアミン四酢酸（「TBE」）緩 衝液粉末を、Sigma Chemical Co.（St.Louis，MO）から得、そしてTBE緩衝液溶 液（pH8.3）は、緩衝液を脱イオンした２倍希釈の水で調製することによって調 製した。 T3-ALP複合体を、パラ-ニトロフェニルホスフェート（「pNPP」）よりもはる かに高い感度のため、T3電気泳動媒介ミクロ分析酵素イムノアッセイのために選 択した。T3-ALPは、AttoPhos基質、非蛍光化合物を以下に示すような蛍光生成物 に転換する： この蛍光生成物を、430nmの励起波長および560nmの発光波長でのレーザー誘導蛍 光によって検出する。大きなストークスシフト(130nm)のため、バックグラウン ド蛍光および光散乱は著しく減少する。 T3を含む血清サンプルを抗-T3モノクローナル抗体でコーティングされたマイ クロタイタープレートのウェル中のTBE緩衝液に添加した。T3を約１時間固定化 した抗体に結合させた。次いで、T3-ALP複合体のキャリブレーション溶液をウェ ルに添加し、T3-ALP複合体を抗体結合部位と競合させた。約15分間後、インキュ ベーションした溶液の測定アリコートをキャピラリーに注入した。 キャピラリーおよびバッファリザーバをAttoPhos基質を含むTBE緩衝溶液で満 たした。インキュベーション溶液からのT3-ALP複合体のアリコートをキャピラリ ーの一端に注入した。一般に、アッセイは、一定または０電位様式で行い得る。 一定電位アッセイは単一工程で行う。酵素複合体をキャピラリーに注入した後、 一定電位を、酵素複合体および生成物の両方が検出器のウィンドウを通過するま で維持する。生成物は続いて酵素複合体から流される(swept away)が、生成物が 生成される反応速度は、少量の生成物を蓄積する分離時間よりも十分に高い。酵 素複合体-基質複合体の電気泳動易動度が生成物のそれよりも大きい場合、注入 ピークは、図５(Ａ)、６(a)および６(b)に示されるように、吸光度プラトーの右 側の電気泳動図において明らかである。 ０電位様式の間、生成物は蓄積し、次いで検出器に移送される。０電位アッセ イは、以下の３工程で行われる：分離、インキュベーション、および生成物移送 。分離工程において、注入された酵素複合体は、あらかじめ決定された期間、電 界下で、緩衝化された基質で満たされたキャピラリーに移動する。次いで電力を 中断し、そして生成物をインキュベーション工程において固定された時間蓄積さ せる。次いで、形成された生成物を電位に再度印加することによって検出器に移 送する。この様式のプロフィールは、図６(a)に示されるようなプラトーの上部 のピークである。 連続的な電位様式（または一定の電位様式）において、蛍光生成物のプラトー が予期される。図17(a)および17(b)は、連続様式における、それぞれ、高印加電 圧および低印加電圧の代表的な電気泳動図を示す。明らかなように、蛍光シグナ ルは、印加電圧が減少するにつれて増加する。より低い印加電圧において、T3-A LP複合体はAttosPhos基質で満たされたキャピラリー中をよりゆっくりと移動し 、T3-ALP複合体とAttoPhos基質との接触時間は増加し、より高いプラトーによっ て 証明されるようにより多くの蛍光生成物を生成する（図17(b))。 ０電位様式において、蛍光生成物はキャピラリーのゾーンに蓄積し、ここでT3 -ALP複合体は停止した。T3-ALP複合体が検出器を通過する前に、電位を０に切り 換えて、インキュベーション時間を増加させ、従って感受性を増加させた。すな わち、T3-ALP複合体がより多量の蛍光生成物を生成するため、検出されたT3-ALP 複合体の量は非常に少量であり得る（すなわち、T3-ALP複合体の量は「増幅」さ れる）。結果として、非常に感受性の分析が達成される。図18は、T3電気泳動的 に媒介されたミクロ分析酵素イムノアッセイについてのインキュベージョン時間 対蛍光シグナルを示す。明らかなように、インキュベーション時間が長いほど、 蛍光シグナルはより大きくなる。Attophos基質は大過剰であるため、インキュベ ーション時間と蛍光シグナルとの間には直線関係が存在する。 高電圧および低電圧の両方をアッセイで試験した。高電圧（20または30kV）で 、分析時間は、０電位インキュベーション期間なしで３分間に減少した。低電圧 （10kV）において、より安定なベースラインおよびシグナルが０電位インキュベ ーション期間後においてさえも観察された。良好な結果を得るように、高電圧（ 20kV）および低電圧（10kV）の組み合わせを最終的に決定した（図19）。０電位 インキュベーション期間前に高電圧を印加して分析時間を減少し、そしてＯ電位 インキュベーション期間後に低電圧を印加してベースラインを安定化した。 ０電位アッセイを、１、２、および３分間の０電位ポーズで行った。蛍光シグ ナルは実質的に全ての時間において直線であった。T3電気泳動媒介ミクロ分析ア ッセイ条件は、キャピラリーにおける０電位インキュベーション期間がシグナル の直線性に影響し得ないほどの生成物から蛍光シグナルを増幅するように最適化 した。T3-ALP複合体の最適な電気泳動媒介ミクロ分析を３分間の０電位インキュ ベーションを有するように決定した。 図20の電気泳動図は、T3血清標準の種々の公知の濃度のものであり、これはT3 -ALP複合体との免疫反応および上記の最適条件を用いるキャピラリー電気泳動ミ クロ分析に供された。結合していないT3-ALP複合体から生成される生成物の蛍光 シグナルを、T3-ALP複合体との比較反応に供したT3の各濃度について測定した。 同じ実験条件で、検出された生成物の量と血清標準のT3の量との間の相互関係に ついてキャリブレーション曲線を構築し得た（図21）。定量化は、電気泳動の一 定電位生成物プラトーの上のピーク高さの測定に基づいた。一定電位生成物プラ トーの上のピーク領域はまた、形成された生成物の量を決定するのに使用され得 る。 結合していないT3-ALP複合体の量は、サンプル中に存在するT3の量に比例する 。T3電気泳動媒介ミクロ分析酵素イムノアッセイにおいて、結合していないT3-A LPの量を定量的に蛍光生成物の測定によって決定し、元のサンプル中のT3の量を 算出し得る。キャリブレーション曲線を所定のセットの実験条件下でT3の公知の 量を用いて構築し、蛍光シグナルの結果を決定する。同じ関係を用いて、同じセ ットの実験条件下で、サンプル中のT3の未知の量を構築したキャリブレーション 曲線を用いて定量的に決定し得る。 結果は、種々のシグナルは電気泳動媒介ミクロ分析法に関係しないことを示し た。種々のシグナルの可能な供給源は、遊離のALPおよび／またはT3-ALP複合体 マイクロプレート壁への非特異的結合、血清標準のインキュベーション時間の変 化およびバックグラウンドを破壊する高い遊離ALP濃度であり得る。 他の実施態様は、以下の請求の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヤオ，シャン−ウェイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01701，フラミンハム，エドマンズ ロー ド 11，スイート 76 (72)発明者 テイラー，トッド エイ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01701，フラミンハム，バーノン ストリ ート 10 (72)発明者 フチス，マーティン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01569，アクスブリッジ，ソフィア ドラ イブ 11 (72)発明者 シュマルジン，ディエター アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139，ケンブリッジ，ビゲロー ナンバ ー７ 36 (72)発明者 コートニー，ランス アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02186，ミルトン，ユニオン アベニュー 14 (72)発明者 ナシャベス，ワッシム アメリカ合衆国 カリフォルニア 94404, フォスター シティ，ボニータ レーン 236

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アッセイを実施する方法であって、以下の工程を包含する、方法： （ａ）第１の反応物およびサンプルを、電気泳動媒体を含むチャネルに導入する 工程であって、該サンプルが、 生体認識部分（biorecognition portion）、および 第２の反応物部分、を含む、競合剤（competitor） を含み、 ここで、該第１の反応物および該第２の反応物部分は、反応して検出可能な生成 物を形成または枯渇させる（deplete）、工程； （ｂ）該チャネルの長さに沿って、該検出可能な生成物を該チャネルに沿って移 動させるのに十分な電位をかける（impose）工程；ならびに （ｃ）該検出可能な生成物を検出する工程。 ２．以下のさらなる工程を包含する、請求項１に記載の方法： （ｄ）前記チャネル中で形成または枯渇した前記検出可能な生成物の量を、定量 的に測定する工程。 ３．請求項１に記載の方法であって、ここで、前記第１の反応物または前記第２ の反応物部分のうちの一方が、酵素を含み、かつ、該第１の反応物または該第２ の反応物部分のうちの他方が、酵素基質を含む、方法。 ４．工程（ａ）の前に、以下のさらなる工程を包含する、請求項１に記載の方法 ： （ｉ）固定化された反応物と分析物とを溶液中で接触させる工程； （ｉｉ）該溶液に、前記競合剤を添加する工程；および （ｉｉｉ）該溶液のアリコートを用いる工程であって、該アリコートが、該サン プルを規定する、工程。 ５．前記固定化された反応物が、固定化された抗体である、請求項４に記載の方 法。 ６．前記サンプルが、免疫反応の結果である、請求項１に記載の方法。 ７．前記免疫反応が、競合反応である、請求項６に記載の方法。 ８．請求項１に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、分析物−競合剤 複合体をさらに含み、ここで、該分析物−競合剤複合体が、分析物と前記競合剤 との会合により形成される、方法。 ９．請求項８に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）が、前記競合剤と前記 分析物−競合剤複合体とを分離させるのに十分な電流をかける工程をさらに包含 する、方法。 １０．前記分析物が荷電している、請求項８に記載の方法。 １１．前記分析物−競合剤複合体が、荷電改質剤（charge modifier）を含む、 請求項８に記載の方法。 １２．請求項１に記載の方法であって、ここで、前記生体認識部分が、以下から なる群から選択される、方法：抗体、抗原、酵素、ペプチド、ペプチド核酸、オ リゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ビオチン、およびそれらの相 補的結合複合体、レクチンおよびそれらの相補的炭水化物結合複合体、ならびに 細胞レセプター結合タンパク質およびそれらの相補的結合生成物。 １３．請求項１に記載の方法であって、工程（ａ）で用いられる前記チャネルが 、前記サンプルを導入する前に、前記第１の反応物を含む、方法。 １４．工程（ｃ）の前に、以下のさらなる工程を含む、請求項１に記載の方法： 前記競合剤と前記第１の反応物とを、前記検出可能な生成物が形成または枯渇 するのに十分な時間にわたって接触させた後に、前記電位を除くことによって、 前記チャネルを０の電位に供する工程。 １５．請求項１４に記載の方法であって、前記チャネルを０の電位に供する工程 の後で、かつ工程（ｃ）の前に、以下の工程をさらに包含する、方法： 該チャネルの長さに沿って、該検出可能な生成物を該チャネル中で移動させる のに十分な時間にわたって、該電位を再びかける（re-impose）工程。 １６．請求項１に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、異なる生体認 識部分を含む１つ以上の競合剤を含む、方法。 １７．請求項１６に記載の方法であって、ここで、１つ以上の第１の反応物が、 前記チャネル内に導入される、方法。 １８．請求項１７に記載の方法であって、ここで、複数の検出可能な生成物が、 形成または枯渇される、方法。 １９．アッセイを実行する方法であって、以下の工程を包含する、方法： （ａ）分析物と、生体認識部分および第２の反応部分を含む競合剤とを含む容器 内で、結合反応を実施する工程； （ｂ）電位をかけて、サンプルを、該容器から該容器と連通しているチャネル内 に移動させる工程であって、該チャネルが、第１の反応物を含む、工程； （ｃ）該第２の反応部分および該第１の反応物により、検出可能な生成物を形成 または枯渇させる工程；ならびに （ｄ）該検出可能な生成物を検出する工程。 ２０．請求項１９に記載の方法であって、以下のさらなる工程を包含する、方 法： （ｄ）前記チャネル内で形成または枯渇した前記検出可能な生成物の量を、定量 的に測定する工程。 ２１．請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記第１の反応物または前記 第２の反応物部分のうちの一方が、酵素を含み、そして、該第１の反応物または 該第２の反応物部分のうちの他方が、酵素基質を含む、方法。 ２２．請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記生体認識部分が、以下か らなる群から選択される、方法：抗体、抗原、酵素、ペプチド、ペプチド核酸、 オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ビオチン、およびそれらの 相補的結合複合体、レクチンおよびそれらの相補的炭水化物結合複合体、ならび に細胞レセプター結合タンパク質およびそれらの相補的結合生成物。 ２３．請求項１９に記載の方法であって、工程（ａ）が、固定化された反応物を さらに含む容器内で前記反応を実施する工程をさらに包含する、方法。 ２４．請求項２３に記載の方法であって、ここで、前記固定化された反応物が、 固定化された抗体である、方法。 ２５．請求項１９に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）で用いられる前記 チャネルが、前記サンプルを導入する前に、前記第１の反応物を含む、方法。 ２６．請求項１９に記載の方法であって、工程（ｃ）の前に、以下のさらなる工 程を包含する、方法： 前記競合剤と前記第１の反応物とを、前記検出可能な生成物が形成または枯渇 するのに十分な時間にわたって接触させた後に、前記電位を除くことによって、 前記チャネルを０の電位に供する工程。 ２７．請求項２６に記載の方法であって、前記チャネルを０の電位に供する工程 の後で、かつ工程（ｃ）の前に、以下の工程さらに包含する、方法： 該チャネルの長さに沿って、該検出可能な生成物を該チャネル中で移動させる のに十分な時間にわたって、該電位を再びかける工程。 ２８．チャネルを備える分析装置であって、該チャネルが、以下を含む、装置： 電気泳動媒体、および 競合剤の第２の反応部分と反応させるための第１の反応物であって、検出可能 な生成物を形成または枯渇させるための生体認識部分を含む、第１の反応物。 ２９．請求項２８に記載の装置であって、前記チャネルを横切る電位をかけるお よび中断するための電気泳動装置をさらに備える、装置。 ３０．請求項２９に記載の装置であって、前記検出可能な生成物を検出するため の検出器をさらに備える、装置。 ３１．請求項３０に記載の装置であって、検出された前記検出可能な生成物の量 を定量的に測定するための定量分析器（quantitator）をさらに備える、装置。 ３２．前記チャネルが、キャピラリーである、請求項２８に記載の装置。 ３３．請求項２９に記載の装置であって、ここで、前記競合剤と前記第１の反応 物とが、該チャネル内で間隔を空けられており、その結果、前記電気泳動装置に よって前記チャネルの長さに沿って電場を印加すると、該競合剤または該第１の 反応物が、該チャネル内で移動して、該第１の反応物を、該競合剤の前記第２の 反応部分と反応させ、前記検出可能な生成物を形成または枯渇させる、装置。 ３４．結合反応を実施するためのサンプル注入ゾーンとチャネルとを備える分析 装置であって、該サンプル注入ゾーンが該チャネルと連通しており、そして該チ ャネルが、以下を含む、装置： 電気泳動媒体、および 生体認識部分を含む競合剤の第２の反応部分と反応させて、検出可能な生成物 を形成または枯渇させるための、第１の反応物。 ３５．請求項３４に記載の装置であって、前記チャネルを横切る電位をかけるお よび中断するための電気泳動装置をさらに備える、装置。 ３６．請求項３５に記載の装置であって、前記検出可能な生成物を検出するため の検出器をさらに備える、装置。 ３７．請求項３４に記載の装置であって、先端を備え、該先端が、前記サンプル 注入ゾーンおよび前記チャネルを備える、装置。 ３８．請求項３７に記載の装置であって、前記先端が、複数の独立したサンプル 注入ゾーンおよびチャネルを備える、装置。 ３９．請求項３４に記載の装置であって、前記サンプル注入ゾーンが、固定化さ れた反応物を含む、装置。