JP2564540B2 - 免疫分析方法 - Google Patents
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- G01N33/743—Steroid hormones
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫分析方法に係り、特に見かけ上電気的に
中性、又は無電荷若しくは弱電荷の抗原物質に電荷を付
与して電気泳動を可能に抗原等の物質を好適に定量する
免疫分析方法に関する。
中性、又は無電荷若しくは弱電荷の抗原物質に電荷を付
与して電気泳動を可能に抗原等の物質を好適に定量する
免疫分析方法に関する。
従来、実用化されている免疫分析方法の代表的な方法
にラジオイムノアツセイ法がある。ところがこのラジオ
イムノアツセイ法は取扱いが面倒である。この為に、電
気泳動を利用する高感度の免疫分析方法が開発された。
この免疫分析方法に関連する方法は例えば、特開昭60−
57257号に開示されている。この電気泳動を用いる分析
方法では、陽極と陰極との間に反応担体を設け、この反
応担体に被測定物質と特異的に反応する抗体をあらかじ
め結合させておく。そして被測定物質を電気泳動させ反
応担体に到着させ、担体中で被測定物質と、特異的に反
応する抗体とを抗体抗原反応を起こさせる。この方法に
よれば、試料中の被測定物質を定量するにあたり測定誤
差の原因となる試料中の夾雑物質を電気泳動により反応
担体を通過させ反応担体中に保持させないようにするた
め、反応担体における抗原−抗体反応に影響を及ぼさな
い。このために測定精度が高く、また測定対象物質は電
気泳動によつて反応担体に濃縮される状態になり血中微
量成分も高感度が測定される。
にラジオイムノアツセイ法がある。ところがこのラジオ
イムノアツセイ法は取扱いが面倒である。この為に、電
気泳動を利用する高感度の免疫分析方法が開発された。
この免疫分析方法に関連する方法は例えば、特開昭60−
57257号に開示されている。この電気泳動を用いる分析
方法では、陽極と陰極との間に反応担体を設け、この反
応担体に被測定物質と特異的に反応する抗体をあらかじ
め結合させておく。そして被測定物質を電気泳動させ反
応担体に到着させ、担体中で被測定物質と、特異的に反
応する抗体とを抗体抗原反応を起こさせる。この方法に
よれば、試料中の被測定物質を定量するにあたり測定誤
差の原因となる試料中の夾雑物質を電気泳動により反応
担体を通過させ反応担体中に保持させないようにするた
め、反応担体における抗原−抗体反応に影響を及ぼさな
い。このために測定精度が高く、また測定対象物質は電
気泳動によつて反応担体に濃縮される状態になり血中微
量成分も高感度が測定される。
しかし、上記従来方法により被測定物質を分析するに
は、この被測定物質を電気泳動により陽極と陰極との間
で泳動させて反応担体に到達させることが必須の条件で
ある。その被測定物質が蛋白質成分などのように電荷を
持つたものであると電気泳動法による免疫分析方法は有
効に行なわれる。しかしながら、電荷を持たない被測定
物質には電気泳動を利用できない。従つて従来方法は、
見かけ上電気的に中性、又は無電荷若しくは弱電荷の被
測定物質の定量という点について配慮されておらず、例
えばステロイド系物質のハプテンなどを定量するのが困
難であるというような問題点がある。
は、この被測定物質を電気泳動により陽極と陰極との間
で泳動させて反応担体に到達させることが必須の条件で
ある。その被測定物質が蛋白質成分などのように電荷を
持つたものであると電気泳動法による免疫分析方法は有
効に行なわれる。しかしながら、電荷を持たない被測定
物質には電気泳動を利用できない。従つて従来方法は、
見かけ上電気的に中性、又は無電荷若しくは弱電荷の被
測定物質の定量という点について配慮されておらず、例
えばステロイド系物質のハプテンなどを定量するのが困
難であるというような問題点がある。
従つて、本発明の目的は、見かけ上電気的に中性、又
は無電荷若しくは弱電荷性の被測定物質の抗原を電気泳
動を利用して高精度に定量する免疫分析方法を提供する
ものである。
は無電荷若しくは弱電荷性の被測定物質の抗原を電気泳
動を利用して高精度に定量する免疫分析方法を提供する
ものである。
本発明の免疫分析方法は、見かけ上電気的に中性、又
は無電荷若しくは弱電荷の被測定抗原と、該被測定抗原
に対し特異的に反応する一定量の抗体とを反応させ、該
被測定抗原と該抗体とを結合して電荷を帯びさせて電気
泳動を可能にし、反応液を電気泳動させて陽電極と陰電
極との間に設けられた反応担体に向けて泳動し、該被測
定抗原に対して未反応の該抗体を該反応担体上に保持さ
せ、その未反応の該抗体の量を標識測定で検出し、試料
中の該被測抗原を定量する方法である。この場合、抗体
の反応前の量と未反応を量との差を求めて試料中の該被
測定抗原を定量してもよく、又は抗体の標識量に対する
検量線を前もつて求めておけば、次回からは標識量から
直ちに抗体Ａを定量し得る。本発明に係る免疫分析方法
は、抗原と結合されていない標識化抗体を特異的に捕捉
し得る捕捉用物質を担持している担体を準備し、試料中
の被測定抗原と、該被測定抗原との反応にとって過剰で
電荷を帯びた既知量の標識化抗体とを反応させて反応生
成物を生じさせ、該反応生成物及び未反応の標識化抗体
を含む反応液を電気泳動させ、前記反応生成物が前記担
体を通過した後に前記担体に捕捉された前記未反応の標
識化抗体を測定し、前記既知量の標識化抗体から測定さ
れた未反応の標識化抗体を差引いて得た前記試料中の被
測定抗原と当量の値により前記試料中の被測定抗原の量
を求めるものである。
は無電荷若しくは弱電荷の被測定抗原と、該被測定抗原
に対し特異的に反応する一定量の抗体とを反応させ、該
被測定抗原と該抗体とを結合して電荷を帯びさせて電気
泳動を可能にし、反応液を電気泳動させて陽電極と陰電
極との間に設けられた反応担体に向けて泳動し、該被測
定抗原に対して未反応の該抗体を該反応担体上に保持さ
せ、その未反応の該抗体の量を標識測定で検出し、試料
中の該被測抗原を定量する方法である。この場合、抗体
の反応前の量と未反応を量との差を求めて試料中の該被
測定抗原を定量してもよく、又は抗体の標識量に対する
検量線を前もつて求めておけば、次回からは標識量から
直ちに抗体Ａを定量し得る。本発明に係る免疫分析方法
は、抗原と結合されていない標識化抗体を特異的に捕捉
し得る捕捉用物質を担持している担体を準備し、試料中
の被測定抗原と、該被測定抗原との反応にとって過剰で
電荷を帯びた既知量の標識化抗体とを反応させて反応生
成物を生じさせ、該反応生成物及び未反応の標識化抗体
を含む反応液を電気泳動させ、前記反応生成物が前記担
体を通過した後に前記担体に捕捉された前記未反応の標
識化抗体を測定し、前記既知量の標識化抗体から測定さ
れた未反応の標識化抗体を差引いて得た前記試料中の被
測定抗原と当量の値により前記試料中の被測定抗原の量
を求めるものである。
本発明の免疫分析方法は、見かけ上電気的に中性、又
は無電荷若しくは弱電荷の抗原と抗体とを反応して結合
体とし、電荷を帯びさせて反応担体に電気泳動し、未反
応の抗体が反応担体に保持されるようにして、抗体の反
応前の量と未反応の量との差から抗原を定量するもので
ある。第１ないし第４の分析方法を第１図に示す分析模
式図によつて説明する。
は無電荷若しくは弱電荷の抗原と抗体とを反応して結合
体とし、電荷を帯びさせて反応担体に電気泳動し、未反
応の抗体が反応担体に保持されるようにして、抗体の反
応前の量と未反応の量との差から抗原を定量するもので
ある。第１ないし第４の分析方法を第１図に示す分析模
式図によつて説明する。
第１の分析方法（本発明に係る）は、第１図（１）に
示す。試料中に含まれる見かけ上電気的に中性、又は無
電荷若しくは弱電荷の被測定抗原Ａと、この抗原Ａに対
し特異的に反応する標識された抗体BLとを反応する。こ
のとき抗原Ａの推定される量よりも幾分多く抗体BLの一
定量を加える。反応液中には生成した抗原−抗体結合体
Ａ−BL、及に未反応体BLが残る。抗原Ａは蛋白質等の抗
体BLと結合するので電荷を帯びて電気泳動されるように
なる。次に電気泳動させると、抗原−抗体結合体Ａ−BL
は反応担体Ｔを通過するが、未反応の抗体BLは反応担体
Ｔにあらかじめ結合されている抗原Ａに結合し、反応担
体Ｔに保持される。そして反応担体上の標識された抗体
BLの量を測定する。従つて標識された抗体BLの反応前の
既知量から未反応の抗体量を減ずることにより抗体Ａの
定量でき、または前もつて基準として既知量の抗原Ａに
対する標識値の検量線を求めておけば、次回から試料抗
原Ａの測定した標識値から直ちに抗体Ａを定量し得る。
示す。試料中に含まれる見かけ上電気的に中性、又は無
電荷若しくは弱電荷の被測定抗原Ａと、この抗原Ａに対
し特異的に反応する標識された抗体BLとを反応する。こ
のとき抗原Ａの推定される量よりも幾分多く抗体BLの一
定量を加える。反応液中には生成した抗原−抗体結合体
Ａ−BL、及に未反応体BLが残る。抗原Ａは蛋白質等の抗
体BLと結合するので電荷を帯びて電気泳動されるように
なる。次に電気泳動させると、抗原−抗体結合体Ａ−BL
は反応担体Ｔを通過するが、未反応の抗体BLは反応担体
Ｔにあらかじめ結合されている抗原Ａに結合し、反応担
体Ｔに保持される。そして反応担体上の標識された抗体
BLの量を測定する。従つて標識された抗体BLの反応前の
既知量から未反応の抗体量を減ずることにより抗体Ａの
定量でき、または前もつて基準として既知量の抗原Ａに
対する標識値の検量線を求めておけば、次回から試料抗
原Ａの測定した標識値から直ちに抗体Ａを定量し得る。
また、第２の方法は第１図（２）に示す。抗原Ａと、
抗原・荷電物質結合体ACと、抗原Ａに対し特異的に反応
する標識された抗体BLの一定量とを反応する。このと
き、抗原Ａと結合体ACは抗体BLに競合的に反応し、生成
される抗原−抗体結合体Ａ−BLとAC−BLは何れも電荷を
帯び電気泳動され得るようになる。また、反応担体Ｔに
は荷電物質Ｃに特異的に反応する抗体BC′を結合させて
おく。図示において荷電物質Ｃに（−−）、抗体BC′に
（＋＋）を付したが、例示したもので逆荷電でもよい。
反応液を電気泳動すると、抗原−抗体結合体Ａ−BLは反
応担体Ｔを通過するが、抗原・荷電物質結合体−抗体の
結合体AC−BL、及び抗原・荷電物質結合体ACは反応担体
Ｔに結合されている抗体BC′によつて保持される。反応
担体Ｔに保持されている標識抗体AC−BLの量を標識測定
する。尚、結合体ACは標識化されていないので標識測定
されない。従つて標識抗体AC−BLの標識値を測定するこ
とにより、抗原Ａを定量できる。尚、この場合、抗原Ａ
の試料中の推定量よりも抗原・荷電物質結合体ACの量、
標識された抗体BLの量を幾分多く添加する。
抗原・荷電物質結合体ACと、抗原Ａに対し特異的に反応
する標識された抗体BLの一定量とを反応する。このと
き、抗原Ａと結合体ACは抗体BLに競合的に反応し、生成
される抗原−抗体結合体Ａ−BLとAC−BLは何れも電荷を
帯び電気泳動され得るようになる。また、反応担体Ｔに
は荷電物質Ｃに特異的に反応する抗体BC′を結合させて
おく。図示において荷電物質Ｃに（−−）、抗体BC′に
（＋＋）を付したが、例示したもので逆荷電でもよい。
反応液を電気泳動すると、抗原−抗体結合体Ａ−BLは反
応担体Ｔを通過するが、抗原・荷電物質結合体−抗体の
結合体AC−BL、及び抗原・荷電物質結合体ACは反応担体
Ｔに結合されている抗体BC′によつて保持される。反応
担体Ｔに保持されている標識抗体AC−BLの量を標識測定
する。尚、結合体ACは標識化されていないので標識測定
されない。従つて標識抗体AC−BLの標識値を測定するこ
とにより、抗原Ａを定量できる。尚、この場合、抗原Ａ
の試料中の推定量よりも抗原・荷電物質結合体ACの量、
標識された抗体BLの量を幾分多く添加する。
また、第３の方法は第１図（３）に示す。抗原Ａと、
標識抗原・荷電物質結合体ACLと、抗原Ａに対し特異的
に反応する一次抗体B1の一定量とを反応する。このとき
抗原Ａと結合体ACLは抗体B1に競合的に反応し、抗原−
抗体結合体Ａ−B1とACL−B1になり電気泳動され得るよ
うになる。また、反応担体Ｔには一次抗体B1に対し特異
的に反応する二次抗体B2を結合しておく。反応液を電気
泳動すると、抗原−抗体結合体Ａ−B1及び標識抗原・荷
原物質結合体−抗体結合体ACL−B1は反応担体Ｔの二次
抗体B2により保持されるが、結合体ACLは通過する。反
応担体Ｔに保持されている結合体ACL−B1の量を標識測
定する。従つて標識抗原・荷電物質−抗体結合体ACL−
Ｂの標識値を測定することにより、抗体Ａを定量でき
る。尚、この場合、抗原Ａの推定量よりも標識された抗
原・荷電物質結合体ACLの量、一次抗体B1の量を幾分多
く添加する。
標識抗原・荷電物質結合体ACLと、抗原Ａに対し特異的
に反応する一次抗体B1の一定量とを反応する。このとき
抗原Ａと結合体ACLは抗体B1に競合的に反応し、抗原−
抗体結合体Ａ−B1とACL−B1になり電気泳動され得るよ
うになる。また、反応担体Ｔには一次抗体B1に対し特異
的に反応する二次抗体B2を結合しておく。反応液を電気
泳動すると、抗原−抗体結合体Ａ−B1及び標識抗原・荷
原物質結合体−抗体結合体ACL−B1は反応担体Ｔの二次
抗体B2により保持されるが、結合体ACLは通過する。反
応担体Ｔに保持されている結合体ACL−B1の量を標識測
定する。従つて標識抗原・荷電物質−抗体結合体ACL−
Ｂの標識値を測定することにより、抗体Ａを定量でき
る。尚、この場合、抗原Ａの推定量よりも標識された抗
原・荷電物質結合体ACLの量、一次抗体B1の量を幾分多
く添加する。
また、第４の方法は第１図（４）に示す。抗原Ａと、
標識された抗原ALと、抗原Ａに対し特異的に反応する一
次抗体B1の一定量とを反応する。このとき抗原Ａと標識
抗原ALは一次抗体B1と競合的に反応し、抗原−抗体結合
体Ａ−B1とAL−B1になり、電気泳動され得るようにな
る。また、反応担体Ｔには一次抗体B1に対し特異的に反
応する二次抗体B2を結合しておく。反応液を電気泳動す
ると、抗原−抗体結合体Ａ−B1及び標識抗原−抗体結合
体AL−B1は反応担体Ｔに二次抗体B2により保持される。
しかし未反応の標識抗原ALは電気的に中性で電気泳動さ
れない。反応担体Ｔに保持された標識抗原−抗体結合体
AL−Ｔの量を標識測定する。従つて、標識抗原−抗体結
合体AL−B1の標識値を測定することにより、抗体Ａを定
量できる。尚、この場合、抗原Ａの推定量よりも標識さ
れた抗原ALの量、一次抗体B1の量を幾分多く添加する。
標識された抗原ALと、抗原Ａに対し特異的に反応する一
次抗体B1の一定量とを反応する。このとき抗原Ａと標識
抗原ALは一次抗体B1と競合的に反応し、抗原−抗体結合
体Ａ−B1とAL−B1になり、電気泳動され得るようにな
る。また、反応担体Ｔには一次抗体B1に対し特異的に反
応する二次抗体B2を結合しておく。反応液を電気泳動す
ると、抗原−抗体結合体Ａ−B1及び標識抗原−抗体結合
体AL−B1は反応担体Ｔに二次抗体B2により保持される。
しかし未反応の標識抗原ALは電気的に中性で電気泳動さ
れない。反応担体Ｔに保持された標識抗原−抗体結合体
AL−Ｔの量を標識測定する。従つて、標識抗原−抗体結
合体AL−B1の標識値を測定することにより、抗体Ａを定
量できる。尚、この場合、抗原Ａの推定量よりも標識さ
れた抗原ALの量、一次抗体B1の量を幾分多く添加する。
また、上記の方法において、試料中の被測定抗原と抗
体との反応において、泳動前の反応で標識された物質を
使用しない方法でも行なわれる。これらの場合では、被
測定抗原と抗体とを反応させた後、反応物質を電気泳動
により反応担体に到達させ、その後で、上記の方法で用
いた標識した物質に対応する標識した抗体を反応担体上
でさらに反応させることにより、被測定抗原を定量でき
る。例えば、第１の方法の変法として次のように行な
う。試料中の被測定抗原と、その被測定抗原に対し特異
的に反応する一次抗体とを反応させ、前述と同様に泳動
する。試料中の被測定抗原と反応した抗原−抗体結合体
は反応担体を通過する。しかし、未反応の一次抗体は反
応担体中に結合させてある抗原と反応して反応担体中に
留まる。この後、この一次抗体に対する標識した二次抗
体を加える。担体に留つた一次抗体と反応した二次抗体
の結合体の標識量を測定することにより、被測定抗原を
定量することができる。また過剰の標識された二次抗体
は反応担体を通過する。
体との反応において、泳動前の反応で標識された物質を
使用しない方法でも行なわれる。これらの場合では、被
測定抗原と抗体とを反応させた後、反応物質を電気泳動
により反応担体に到達させ、その後で、上記の方法で用
いた標識した物質に対応する標識した抗体を反応担体上
でさらに反応させることにより、被測定抗原を定量でき
る。例えば、第１の方法の変法として次のように行な
う。試料中の被測定抗原と、その被測定抗原に対し特異
的に反応する一次抗体とを反応させ、前述と同様に泳動
する。試料中の被測定抗原と反応した抗原−抗体結合体
は反応担体を通過する。しかし、未反応の一次抗体は反
応担体中に結合させてある抗原と反応して反応担体中に
留まる。この後、この一次抗体に対する標識した二次抗
体を加える。担体に留つた一次抗体と反応した二次抗体
の結合体の標識量を測定することにより、被測定抗原を
定量することができる。また過剰の標識された二次抗体
は反応担体を通過する。
上述のように本発明方法により、見かけ上電気的に中
性、又は無電荷若しくは弱電荷の測定物質の抗原に電荷
を帯びさせて電気泳動させ得るようにし、電気泳動によ
り免疫分析を行なうので測定物質を高感度に定量する。
性、又は無電荷若しくは弱電荷の測定物質の抗原に電荷
を帯びさせて電気泳動させ得るようにし、電気泳動によ
り免疫分析を行なうので測定物質を高感度に定量する。
また、上述の方法では反応担体上に保持され標識物質
を測定する方法を述べたが、逆に反応担体を通過した反
応液中の標識物質について測定し、測定物質を定量して
もよい。
を測定する方法を述べたが、逆に反応担体を通過した反
応液中の標識物質について測定し、測定物質を定量して
もよい。
また、上述の被測定抗原は電気的に中性、又は無電荷
若しくは弱電荷のものについて述べたが、電荷を持つ抗
原についても免疫分析を行い得ることは勿論である。中
でも電荷を持つ抗原でも、希薄濃度の場合が泳動性を向
上させる場合等に有利行ない得る。
若しくは弱電荷のものについて述べたが、電荷を持つ抗
原についても免疫分析を行い得ることは勿論である。中
でも電荷を持つ抗原でも、希薄濃度の場合が泳動性を向
上させる場合等に有利行ない得る。
実施例１ 試料中の見かけ上電気的に中性、又は無電荷若しくは
弱電荷性の被測定抗原と、該被測定抗原と特異的に反応
する標識化抗体とを反応させる。また被測定抗原として
例えばT3やT4等のハプテンを測定する。また標識物質と
して蛍光物質，リン光物質，酵素等を使用するが、特に
これらに限定されない。また陽電極と陰電極との間に反
応担体を設け、この反応担体に該被測定抗原をあらかじ
め結合させておく。
弱電荷性の被測定抗原と、該被測定抗原と特異的に反応
する標識化抗体とを反応させる。また被測定抗原として
例えばT3やT4等のハプテンを測定する。また標識物質と
して蛍光物質，リン光物質，酵素等を使用するが、特に
これらに限定されない。また陽電極と陰電極との間に反
応担体を設け、この反応担体に該被測定抗原をあらかじ
め結合させておく。
さて、該被測定抗原と一定量の該標識化抗体とを反応
させ、被測定抗原と標識化抗体との結合体を生成させる
ことにより、被測定抗原の結合体は電荷を帯び、電気泳
動させられるようになる。また被測定抗原の量をおおよ
そ推定し、これよりも若干過剰に標識化抗体量を反応さ
せる。その後、抗原−抗体反応物を電気泳動によつて反
応担体に到達させる。このとき、試料溶液中の被測定抗
原−標識化抗体の結合体は、反応担体にあらかじめ結合
している被測定抗原と反応せずに反応担体を通過する。
しかし、未反応の標識化抗体は反応担体に結合させてあ
る被測定抗原と反応することにより反応担体に残る。電
気泳動後、その反応担体に保持されている標識化抗体量
を標識によつて検出する。そして反応前の標識化抗体量
と反応担体上の未反応の標識化抗体量との差を求めるこ
とにより、目的とする試料中の被測定抗原の定量を高感
度に行なう。
させ、被測定抗原と標識化抗体との結合体を生成させる
ことにより、被測定抗原の結合体は電荷を帯び、電気泳
動させられるようになる。また被測定抗原の量をおおよ
そ推定し、これよりも若干過剰に標識化抗体量を反応さ
せる。その後、抗原−抗体反応物を電気泳動によつて反
応担体に到達させる。このとき、試料溶液中の被測定抗
原−標識化抗体の結合体は、反応担体にあらかじめ結合
している被測定抗原と反応せずに反応担体を通過する。
しかし、未反応の標識化抗体は反応担体に結合させてあ
る被測定抗原と反応することにより反応担体に残る。電
気泳動後、その反応担体に保持されている標識化抗体量
を標識によつて検出する。そして反応前の標識化抗体量
と反応担体上の未反応の標識化抗体量との差を求めるこ
とにより、目的とする試料中の被測定抗原の定量を高感
度に行なう。
次に被測定抗原としてハプテンT4の定量を例にとり、
詳細に説明する。先ず、T4を反応担体の反応膜に結合さ
せる前処理としてT4とアルブミンとの結合体を合成し
た。この為に牛血清アルブミン（BSA）200μｇを0.1Mリ
ン酸塩暖衝溶液（pH6.8）500μに溶解した。一方、T4
フリーアンド〔シグマ（Sigma）社製〕2mgを4mlのジメ
チルホルムアミドに溶解してその50μｇ相当（100μ
）を前者に加えた。次に25％グルタルアルデヒド0.3m
lをリン酸塩緩衝溶液で1.5％にしたものを10μを加え
て混和し、その後で25℃、2.5時間静置した。次いでセ
フアデツクスＧ−100カラムにかけ、リン酸塩緩衝溶液
を用いてT4−BSA結合体を分取した。
詳細に説明する。先ず、T4を反応担体の反応膜に結合さ
せる前処理としてT4とアルブミンとの結合体を合成し
た。この為に牛血清アルブミン（BSA）200μｇを0.1Mリ
ン酸塩暖衝溶液（pH6.8）500μに溶解した。一方、T4
フリーアンド〔シグマ（Sigma）社製〕2mgを4mlのジメ
チルホルムアミドに溶解してその50μｇ相当（100μ
）を前者に加えた。次に25％グルタルアルデヒド0.3m
lをリン酸塩緩衝溶液で1.5％にしたものを10μを加え
て混和し、その後で25℃、2.5時間静置した。次いでセ
フアデツクスＧ−100カラムにかけ、リン酸塩緩衝溶液
を用いてT4−BSA結合体を分取した。
次に、このT4−BSA結合体を反応担体であるポリアク
リルアミドゲル膜に固定化した。その方法は、先ず0.5m
lのT4−BSA結合体フラクシヨンに0.25％のアクロレイン
水溶液を加えて氷冷下で30分間放置した。その後、1/15
MのNaClを含む0.1Mリン酸塩緩衝溶液pH7.4（PBSと称
す）でよく透析した。次にこれに0.32g/mlのアクリルア
ミド溶液1.5ml,0.016g/mlのN,N′−メチレンビスアクリ
ルアミド溶液1.5ml,46μ/mlのN,N,N′,N′−テトラメ
チルエチレンジアミン水溶液を1.25ml、及び1.25mg/ml
の過硫酸アンモニウム溶液を5.75mlを加えてよく攪拌し
た。その後、カラス製のゲル膜成形器に上記の混合液を
注入して静置し、ゲル化させることにより製膜した。こ
の膜から直径9mmの円形膜を切り取つて反応膜にした。
リルアミドゲル膜に固定化した。その方法は、先ず0.5m
lのT4−BSA結合体フラクシヨンに0.25％のアクロレイン
水溶液を加えて氷冷下で30分間放置した。その後、1/15
MのNaClを含む0.1Mリン酸塩緩衝溶液pH7.4（PBSと称
す）でよく透析した。次にこれに0.32g/mlのアクリルア
ミド溶液1.5ml,0.016g/mlのN,N′−メチレンビスアクリ
ルアミド溶液1.5ml,46μ/mlのN,N,N′,N′−テトラメ
チルエチレンジアミン水溶液を1.25ml、及び1.25mg/ml
の過硫酸アンモニウム溶液を5.75mlを加えてよく攪拌し
た。その後、カラス製のゲル膜成形器に上記の混合液を
注入して静置し、ゲル化させることにより製膜した。こ
の膜から直径9mmの円形膜を切り取つて反応膜にした。
尚、電気泳動に用いる電解液として、トリス・グリシ
ン緩衝溶液を用いた。
ン緩衝溶液を用いた。
測定は、先ずT4標準試料とこれよりも幾分過剰な既知
量の市販の蛍光標識のFITC標識抗T4抗体とを反応させ
た。反応後、この反応液を電気泳動装置の反応膜上部に
注入した後、印加電圧250Vで30分間電気泳動した。その
後、反応膜を取り出し、PBSで洗浄し、反応膜の保持さ
れている未反応のFITC標識抗T4抗体の蛍光強度を測定し
た。このとき励起波長は485nm、蛍光測定波長は520nmで
測定した。
量の市販の蛍光標識のFITC標識抗T4抗体とを反応させ
た。反応後、この反応液を電気泳動装置の反応膜上部に
注入した後、印加電圧250Vで30分間電気泳動した。その
後、反応膜を取り出し、PBSで洗浄し、反応膜の保持さ
れている未反応のFITC標識抗T4抗体の蛍光強度を測定し
た。このとき励起波長は485nm、蛍光測定波長は520nmで
測定した。
試料T4の濃度を変えて蛍光強度を測定し、T4検量線を
第２図に示す。第２図から試料中のT4濃度が低いと、試
料T4と標識抗T4抗体との結合体が反応液中で少ししか生
成されないが、未反応の標識抗T4抗体が反応膜に固定化
されているT4−BSA結合体と結合して、この結合体が反
応膜に多く保持させて蛍光強度が大になる。また、T4濃
度が高くなるにつれ、標識抗T4抗体とT4−BSA結合体と
の結合体が減少し、反応膜上で保持される量も減少し
て、蛍光強度が低下する。このように本分析方法によれ
ば、T4濃度は蛍光強度と精度よく相関し、前もつてT4濃
度の検量線を得ていれば、後で蛍光強度を測定すればT4
濃度を求めることができる。
第２図に示す。第２図から試料中のT4濃度が低いと、試
料T4と標識抗T4抗体との結合体が反応液中で少ししか生
成されないが、未反応の標識抗T4抗体が反応膜に固定化
されているT4−BSA結合体と結合して、この結合体が反
応膜に多く保持させて蛍光強度が大になる。また、T4濃
度が高くなるにつれ、標識抗T4抗体とT4−BSA結合体と
の結合体が減少し、反応膜上で保持される量も減少し
て、蛍光強度が低下する。このように本分析方法によれ
ば、T4濃度は蛍光強度と精度よく相関し、前もつてT4濃
度の検量線を得ていれば、後で蛍光強度を測定すればT4
濃度を求めることができる。
実施例２ 被測定抗体原の試料としてコルチゾールを用いた。予
じめ実施例１と同様な方法により、コルチゾールと牛血
清アルブミン（BSA）との結合体、及び抗BSA抗体結合の
反応膜を調製した。
じめ実施例１と同様な方法により、コルチゾールと牛血
清アルブミン（BSA）との結合体、及び抗BSA抗体結合の
反応膜を調製した。
先ず、コルチゾールを含む試料と、コメチゾール−BS
A結合体と、既知量のアルカリフオスフアターゼ標識抗
コルチゾール抗体とを反応させた。次にこの反応液100
μを電気泳動装置の反応膜上部に注入した後、250V,3
0分間電気泳動した。この後、反応膜を取り出してPBSで
洗浄した。更に反応膜をアルカリフオスフアターゼ基質
緩衝溶液に30分間浸漬し、反応膜に保持されているコル
チゾール−BSA結合体と標識抗コルチゾール抗体との結
合体を発色試薬の添加により発色させた。次にこの結合
体の量を波長500nmでの吸光度の測定し、その量を検出
した。
A結合体と、既知量のアルカリフオスフアターゼ標識抗
コルチゾール抗体とを反応させた。次にこの反応液100
μを電気泳動装置の反応膜上部に注入した後、250V,3
0分間電気泳動した。この後、反応膜を取り出してPBSで
洗浄した。更に反応膜をアルカリフオスフアターゼ基質
緩衝溶液に30分間浸漬し、反応膜に保持されているコル
チゾール−BSA結合体と標識抗コルチゾール抗体との結
合体を発色試薬の添加により発色させた。次にこの結合
体の量を波長500nmでの吸光度の測定し、その量を検出
した。
試料コルチゾールの濃度を変えて吸光度を測定し、そ
の結果からコルチゾールの検量線を第３図に示す。この
コルチゾールの場合も実施例１の場合と同様に、コルチ
ゾール濃度は吸光度と精度よく相関し、コンチゾールを
高感度に測定できることが明らかである。
の結果からコルチゾールの検量線を第３図に示す。この
コルチゾールの場合も実施例１の場合と同様に、コルチ
ゾール濃度は吸光度と精度よく相関し、コンチゾールを
高感度に測定できることが明らかである。
本発明の免疫分析方法により、見かけ上電気的中性、
又は無電荷若しくは弱電荷の被測定の抗原を、標識され
た抗体，抗原・荷電物質結合体と抗体，標識された抗原
・荷電物質結合体と抗体、及び標識された抗原と抗体等
と、反応させ、被測定抗原に荷電を帯びさせるので、電
気泳動を用いた分析法により定量することができ、抗原
の微量濃度でも高感度に分析でき、高精度，高信頼性で
定量できる。特にホルモン系試料の測定には有効な分析
方法である。
又は無電荷若しくは弱電荷の被測定の抗原を、標識され
た抗体，抗原・荷電物質結合体と抗体，標識された抗原
・荷電物質結合体と抗体、及び標識された抗原と抗体等
と、反応させ、被測定抗原に荷電を帯びさせるので、電
気泳動を用いた分析法により定量することができ、抗原
の微量濃度でも高感度に分析でき、高精度，高信頼性で
定量できる。特にホルモン系試料の測定には有効な分析
方法である。
第１図は本発明の免疫分析方法の模式図を示し、第２図
は本免疫分析方法によるT4検量線、第３図はコルチゾー
ル検量線を示す。 Ａ……抗原、AC……抗原・荷電物質結合体、ACL……標
識された抗原・荷電物質結合体、AL……標識された抗
原、BL……標識された抗体、BC′……荷電物質に対し特
異的に反応する抗体、B1……一次抗体、B2……二次抗
体、Ａ−BL……抗原−標識された抗体の結合体、AC−BL
……抗原・荷電物質結合体−標識された抗体の結合体、
Ａ−B1……抗原−一次抗体の結合体、ACL−B1……標識
された抗原・荷電物質−一次抗体の結合体、AL−B1……
標識された抗原−一次抗体の結合体、Ｔ……反応担体。
は本免疫分析方法によるT4検量線、第３図はコルチゾー
ル検量線を示す。 Ａ……抗原、AC……抗原・荷電物質結合体、ACL……標
識された抗原・荷電物質結合体、AL……標識された抗
原、BL……標識された抗体、BC′……荷電物質に対し特
異的に反応する抗体、B1……一次抗体、B2……二次抗
体、Ａ−BL……抗原−標識された抗体の結合体、AC−BL
……抗原・荷電物質結合体−標識された抗体の結合体、
Ａ−B1……抗原−一次抗体の結合体、ACL−B1……標識
された抗原・荷電物質−一次抗体の結合体、AL−B1……
標識された抗原−一次抗体の結合体、Ｔ……反応担体。
Claims (1)
- 【請求項１】抗原と結合されていない標識化抗体を特異
的に捕捉し得る捕捉用物質を担持している担体を準備
し、試料中の被測定抗原と、該被測定抗原との反応にと
って過剰で電荷を帯びた既知量の標識化抗体とを反応さ
せて反応生成物を生じさせ、該反応生成物及び未反応の
標識化抗体を含む反応液を電気泳動させ、前記反応生成
物が前記担体を通過した後に前記担体に捕捉された前記
未反応の標識化抗体を測定し、前記既知量の標識化抗体
から測定された未反応の標識化抗体を差引いて得た前記
試料中の被測定抗原と当量の値により前記試料中の被測
定抗原の量を求めることを特徴とする免疫分析方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62080038A JP2564540B2 (ja) | 1987-04-01 | 1987-04-01 | 免疫分析方法 |
| DE3811083A DE3811083A1 (de) | 1987-04-01 | 1988-03-31 | Immunoassay |
| US07/177,347 US5055415A (en) | 1987-04-01 | 1988-04-01 | Method for immunoassay procedure for the detection of antigen by reacting with antibody which increases its electrical charge and electrophoretic mobility |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62080038A JP2564540B2 (ja) | 1987-04-01 | 1987-04-01 | 免疫分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63246671A JPS63246671A (ja) | 1988-10-13 |
| JP2564540B2 true JP2564540B2 (ja) | 1996-12-18 |
Family
ID=13707078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62080038A Expired - Lifetime JP2564540B2 (ja) | 1987-04-01 | 1987-04-01 | 免疫分析方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5055415A (ja) |
| JP (1) | JP2564540B2 (ja) |
| DE (1) | DE3811083A1 (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5221454A (en) * | 1992-01-31 | 1993-06-22 | Biometric Imaging Inc. | Differential separation assay |
| US5843680A (en) * | 1992-01-31 | 1998-12-01 | Biometric Imaging, Inc. | Differential separation assay methods and test kits |
| US5137609A (en) * | 1992-01-31 | 1992-08-11 | Biometric Imaging Inc. | Differential separation assay |
| WO1993018139A1 (en) * | 1992-03-10 | 1993-09-16 | La Jolla Cancer Research Foundation | Recombinant calf intestinal alkaline phosphatase |
| US5958202A (en) * | 1992-09-14 | 1999-09-28 | Perseptive Biosystems, Inc. | Capillary electrophoresis enzyme immunoassay |
| WO1994009185A1 (en) * | 1992-10-14 | 1994-04-28 | Labintelligence, Inc. | Electrophoretic quantitation of specific binding complexes |
| US5348633A (en) * | 1993-01-22 | 1994-09-20 | Northeastern University | Method for quantitating trace amounts of an analyte in a sample by affinity capillary electrophoresis |
| NL9300965A (nl) * | 1993-06-04 | 1995-01-02 | Proteios B V | Werkwijze voor het bij een proefobject detecteren van de aanwezigheid van ten minste een hapteen, een macromolecuul, een pathogeen of immuunreactie opwekkend deel daarvan, alsmede een dergelijke werkwijze voor het detecteren van een eventuele immuunreactie. |
| US5939160A (en) * | 1997-02-25 | 1999-08-17 | Sealand Technology, Inc. | Low odor permeable hose |
| US7214300B2 (en) * | 2001-06-04 | 2007-05-08 | Epocal Inc. | Integrated electrokinetic devices and methods of manufacture |
| FR2862134B1 (fr) * | 2003-11-12 | 2007-07-27 | Sebia Sa | Analyse et typage de proteines monoclonales par electrophorese capillaire et immunodeplacement |
| CN101809166A (zh) * | 2007-09-10 | 2010-08-18 | 莱泽尔诊断公司 | 用于快速竞争性同质性分析的装置、组合物和方法 |
| US8507218B2 (en) * | 2008-02-08 | 2013-08-13 | The Regents Of The University Of California | Detection of degradative enzymes in bodily fluids |
| EP4136455A1 (en) | 2020-04-15 | 2023-02-22 | Hemex Health, Inc. | Using electrophoresis for disease detection based on controlled molecular charge |
| US12332179B2 (en) * | 2020-07-10 | 2025-06-17 | Thomas G. Mason | Colliding and reacting molecules and colloids electrophoretically |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3654090A (en) * | 1968-09-24 | 1972-04-04 | Organon | Method for the determination of antigens and antibodies |
| US3966897A (en) * | 1973-04-02 | 1976-06-29 | Marine Colloids, Inc. | Medium for use in bioassay and method of using same |
| DE2406959C3 (de) * | 1974-02-14 | 1979-02-08 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Anordnung und Verfahren zur Bestimmung von Antigenen |
| US4048298A (en) * | 1975-02-25 | 1977-09-13 | Rohm And Haas Company | Solid phase double-antibody radioimmunoassay procedure |
| US4287300A (en) * | 1979-07-26 | 1981-09-01 | Syva Company | Charge effects in enzyme immunoassays |
| JPS6057257A (ja) * | 1983-09-09 | 1985-04-03 | Hitachi Ltd | イムノアツセイ法 |
| DE3445816C1 (de) * | 1984-12-15 | 1986-06-12 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Flaechenfoermiges diagnostisches Mittel |
-
1987
- 1987-04-01 JP JP62080038A patent/JP2564540B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-03-31 DE DE3811083A patent/DE3811083A1/de active Granted
- 1988-04-01 US US07/177,347 patent/US5055415A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5055415A (en) | 1991-10-08 |
| DE3811083A1 (de) | 1988-10-20 |
| DE3811083C2 (ja) | 1993-02-18 |
| JPS63246671A (ja) | 1988-10-13 |
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