JP2000516449A

JP2000516449A - 細胞結合と細胞侵入に関与するミコバクテリア由来タンパク質をコードしている遺伝子とその使用法

Info

Publication number: JP2000516449A
Application number: JP10504612A
Authority: JP
Inventors: エヌ．アナンド，ナヴィーン; エイチ．クライン，マイケル
Original assignee: コノートラボラトリーズリミテッド
Priority date: 1996-07-10
Filing date: 1997-07-09
Publication date: 2000-12-12
Also published as: WO1998001559A1; AU3331897A; US20030088082A1; US6444444B1; BR9712968A; US20030017494A1; EP0938561A1; AU731979B2; US20030018178A1; CA2260368A1; NZ333988A; US20030023056A1

Abstract

(57)【要約】分子量が約４５〜６０ｋＤａであり、細胞結合と細胞侵入に関与しているタンパク質をコードするミコバクテリウム属菌株由来の遺伝子またはそのフラグメントをクローン化した。その遺伝子およびコードされたタンパク質は、免疫原性製剤あるいは診断用として利用が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】細胞結合と細胞侵入に関与するミコバクテリア由来タンパク質をコードしている遺伝子とその使用法発明の属する技術分野本発明は分子生物学の分野、特に、細胞結合と細胞侵入に関与するミコバクテリア由来タンパク質をコードする遺伝子およびその使用法に関する。関連出願のレファレンス本出願は１９９６年７月１０日出願の同時係属出願第０８／６７７，９７０の一部継続出願である。発明の背景結核（ＴＢ）は、世界における、とりわけ、開発途上国での最大の死亡原因である。毎年、８百万から９百万の人々が、臨床診断において新たに結核であると診断され、約３百万人が死亡している。最近まで、米国では結核による死亡率が減少する傾向にあったが、ここにきて、これが逆転して、増加傾向を示している。これは、薬剤耐性菌の増加に深く関連している。結核菌複合体は、ミコバクテリア菌の１種であり、遺伝子的側面で深く関連している。重要な菌種として、ヒトにおける結核の最大の原因菌であるヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis) 、ある特定のヒト結核の別の原因菌であるマイコバクテリウム・アフリカヌム(M ycobacterium africanum)、ウシ結核の原因菌であるウシ結核菌(Mycobacterium bovis)の３種類がある。これらのミコバクテリア菌は、単一の宿主内だけで病原性であるということはない。また、結核はヒトにとっての重要な疾病であるだけでなく、多くの国において動物の疾病としても大きな問題になっている。ウシ結核菌が牛に感染すると、牛の結核を発病するので、感染の症候のある牛はすべて屠殺される。このことによる経済的損失は甚大である。さらに、感染した牛は、ヒト疾病のレザバーとなる可能性もある。多数の感染症例では、吸入された結核菌は、肺胞マクロファージにより消化されて死菌となるか、あるいはそうでない場合には、限定的であるが静脈内で増殖して結核結節と呼ばれる局所部位内に存在し続けることになる。このように感染部位が限定的となるために、その感染主要部位が、外部から観察できるような徴候を示すことなく、そのまま存在することになる。この菌が感染したヒトでは、生涯に亘り発病のリスクを負うことになり、そのうちの約１０％のヒトが実際に結核を発病する。結核菌は肺の中の感染部位から次第に広がり、リンパ管や血液を通して身体の別の部位に移り、菌が存在する部位においては、特徴的な固形の乾酪性（チーズのような）壊死を引き起こす。最悪の場合には、この壊死反応が気管に広がり、その壊死部分が液状化すると菌が全身で急速に増殖することになる。病原性の炎症症候はまず身体の運動系に現れ、次第に身体的衰弱、発熱、胸痛、咳、血痰となって、結核菌が原因となる際だった特徴症状が出てくることになる。結核の効果的な治療法としては抗生物質による治療法がある。しかし、この薬剤は高価であり、多剤を組み合わせて長期に亘り投与する必要があり、ここで、薬剤投与に関連して問題が発生する、つまり、長期に亘り抗生物質を投与するために、薬剤耐性菌が出現してしまうのである。結核にはすでに認知されているワクチンを使用できる。ウシ結核菌を弱毒化させたＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌結核予防接種ワクチン）がそれである。このＢＣＧワクチンは１９２１年に開発されたが、その弱毒化に関してはまだ不明な点がある（参考文献１。この出願書内には、多様な参考文献を括弧を付けて示し、その文献に記載されたもので、本発明が関係する技術内容についてはより詳しく説明してある。引用した各文献の詳細は、本出願書の明細書の最後の部分、つまり、クレームの項のすぐ前に記載している。参考文献で開示されている内容は、この出願書内で参考文献名を示して取り入れている。）ＴＢに対するワクチンとしてのＢＣＧの有効性については論議のあるところで、種々の治験でも０〜７０％と推定され幅がある。ヒト結核菌のビルレンスと病原性に関しての分子的な検討はまだ多くはなされていない。いくつかのビルレンス因子、特にシグマ因子については最近確認されている（文献２）。結核菌は、ＨｅＬａ細胞のような、非細菌毒性細胞に侵入し、一度侵入すると、増殖して生き残ることが培養試験により確認されている（文献３）。結核菌株（Ｈ３７Ｒａ）由来のＤＮＡ分子（長さが１５３５ｂｐ）が、細菌の侵入の仲介をし、哺乳動物細胞内で生存することが最近報告されている。この結核菌由来のＤＮＡフラグメントを大腸菌由来の非細菌毒性株に導入すると、その菌に対して侵入力を与え、その菌は、ヒトのマクロファージ内で２４時間に亘り生存することができることが報告されている。ｍｃｅ遺伝子（ミコバクテリア細胞侵入遺伝子）は、長さが１５３５ｂｐで、分子量が２２〜２７ｋＤａのタンパク質をコードしているＤＮＡフラグメント上の、１８２〜８１０位に広がっているオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にマップされている。ミコバクテリア菌の感染は重篤な疾病の原因となる。ワクチンや抗原を含む他の物質の担体のような免疫原性の製剤や診断用試薬の抗原としてのタンパク質を提供するために、細胞結合と細胞侵入に関与するミコバクテリア菌由来のタンパク質をコードした遺伝子を提供できることは有益なことである。細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリアタンパク質をコードした遺伝子を、ミコバクテリア菌の特別な同定と診断およびミコバクテリア菌の感染が原因となる疾病に対する免疫付与に使用した場合、特に望ましく有益である。発明の概要本発明では、細胞結合と細胞侵入に関与しているタンパク質をコードしているウシ結核菌の遺伝子を分離して、クローン化した結果、その遺伝子には、分子量が約４５〜６０ｋＤａのタンパク質がコードされていることを発見した。これと対応する遺伝子が、ヒト結核菌を含む他の結核菌複合体でも検出された。従って、本発明の１つの態様によれば、本発明は、ミコバクテリア菌または上記のタンパク質断片の細胞結合と細胞侵入に関与している、分子量が約４５〜６０ｋＤａであるミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている、分離核酸分子を提供する。ミコバクテリア菌は、マイコバクテリウム・アフリカヌムを含む他の種類の菌の複合体や、ヒト結核菌およびウシ結核菌の結核菌複合体の菌株の１種である。核酸分子によりコードされた細胞結合と細胞侵入に関与しているこのタンパク質には、表２に示したように、アミノ酸成分が含まれている。本発明の核酸分子は、図５に示したような制限酵素地図を有している。この制限酵素地図は、ウシ結核菌由来のＢＣＧの遺伝子のものである。この核酸分子は、結核菌複合体由来の他のミコバクテリア菌における対応遺伝子の制限酵素地図を有している。この核酸分子には、図６に示したような、ウシ結核菌由来ＢＣＧのＤＮＡ配列 (SEQ.ID.No:2)または結核菌複合体由来の別のミコバクテリア菌における対応遺伝子をコードしている配列が含まれている。この核酸分子は、また、ウシ結核菌由来ＢＣＧでの配列である、図７に示したようなアミノ酸配列(SEQ.ID.No:3)、または、結核菌複合体由来の別のミコバクテリア菌における対応タンパク質をコードした配列を有している。本発明の別の態様によれば、本発明は、対になったプライマーである４８７９ (SEQ.ID.No:12)と４８８２(SEQ.ID.No:15)の１組、または４８７９(SEQ.ID.No:1 2)と４８６５(SEQ.ID.No:11)の１組,または４８７９(SEQ.ID.No:12)と４８１２( SEQ.ID.No:10)の１組、または、5'プライマー(SEQ.ID.No:19)と3'プライマー(SE Q.ID.No:18)の１組,または、5'プライマー(SEQ.ID.No:20)と3'プライマー(SEQ.I D.No:18)の１組，または5'プライマー(SEQ.ID.No:21)と3'プライマー(SEQ.ID.No :18)の１組、または、5'プライマー(SEQ.ID.No:22)と3'プライマー(SEQ.ID.No:1 8)の１組を含むプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により増幅可能な分離ＤＮＡ分子を提供する。このＤＮＡ分子は、結核菌複合体、特に、ヒト結核菌およびウシ結核菌由来のものである。本発明のさらに別の態様によれば、本発明には、宿主の形質転換をするベクターが含まれ、このベクターは、本発明で提供される核酸分子またはＤＮＡ分子で構成されている。本発明は、さらに、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来の遺伝子を含んでいるプラスミドにも関連しており、このプラスミドは「pBCGcepx」と呼ばれ、そのＡＴＣＣ（アメリカ培養コレクション）の寄託番号は９７５１１である。このベクターは、異種または同種の宿主内において、コードされたタンパク質をリピド化、または非リピド化された形で発現するようになっている。従って、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、宿主の形質転換をする発現ベクターを提供すし、このベクターは、本発明で提供される核酸分子またはＤＮＡ分子から構成され、宿主が細胞結合と細胞侵入に関与しているタンパク質を発現するように、その核酸分子またはＤＮＡ分子に協働的に結合されている発現配列から構成されるものである。その発現配列には、宿主からそのタンパク質が分泌されるように、プロモータとリーダ配列をコードした核酸部分が含まれる。この発現配列は、宿主からタンパク質がリピド化されて形で発現されるように、リピド化シグナルをコードしている核酸部分も含む。この宿主として、例えば、大腸菌、ボルデテラ属菌、バチルス属菌、ヘモフィルス属菌、モラクセラ属菌、真菌、酵母またはバキュロウイルスのグループから選択してよく、セムリキ森林熱ウイルス発現系を使用してもよい。本発明の追加の態様によれば、本発明は、本発明で提供された発現ベクターを含んでいる形質転換宿主を提供する。本発明は、さらに、本発明が提供している形質転換宿主により産生可能な、細胞結合と細胞侵入に関与している組み換えミコバクテリア菌由来タンパク質またはそのタンパク質断片も含む。本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの有効成分である、本発明により提供される核酸分子、ＤＮＡ分子またはタンパク質および薬学的に受け入れ可能な担体またはそのベクターから成る免疫原性成分を提供する。上記の少なくとも１個の有効な成分は、宿主に投与された時に、免疫応答を誘起するものである。本発明の提供する免疫原性成分を、宿主にin vivo投与するために、ワクチンとして調製することもできる。そのような目的のために、その成分を微少粒子、カプセル、ＩＳＣＯＭまたはリポソームとして調製してもよい。この免疫原性成分を、免疫系の特定細胞または粘膜表面に到達するようにターゲッティング分子と組み合わせた形で提供してもよい。本発明にかかる免疫原性成分（ワクチンを含む）は、少なくとも１個の別の免疫原性または免疫刺激物質から構成されるようにしてもよく、この免疫刺激物質として、少なくとも１個のアジュバントまたは少なくとも１個のサイトカインがある。本発明の別の態様によれば、本発明は、さらに、宿主における免疫応答を誘起させる方法を提供し、その方法は、ヒトを含む霊長動物のような疾病にかかりやすい宿主に、上記の免疫原性成分の有効量を投与するステップから成る。この免疫応答は、体液性または細胞性の免疫応答が含まれ、ミコバクテリア菌が原因となる疾病の感染防御を与える。さらに別の態様によれば、本発明は、細胞結合と細胞侵入に関与するミコバクテリア菌由来タンパク質を宿主に運搬するために、上述した核酸分子またはＤＮＡ分子を含むベクターから成る生きたベクターを提供する。このベクターは、サルモネラ菌、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクシニア、ポリオウイルスから選択してよい。この発明で提供される核酸分子とＤＮＡ分子は、診断分野においても有用である。従って、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、診断対象の試料内に細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている核酸分子が存在しているかどうかを決定する方法も提供し、その方法は、（ａ）試料内に含まれ、特別なハイブリダイゼーションが可能なタンパク質をコードしている核酸分子またはＤＮＡ分子およびその他の任意の核酸分子との複合体を産生させるために、試料と本発明で提供された核酸またはＤＮＡ分子を接触させるステップ、および（ｂ）その複合体の産生を測定するステップから成る。さらに、本発明は、試料内に、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードした核酸が存否を決定するキットを提供し、それは、（ａ）本発明で提供された核酸またはＤＮＡ分子、（ｂ）試料中に含まれ、核酸またはＤＮＡ分子とハイブリダイゼーションをすることのできるタンパク質をコードしている核酸またはＤＮＡ分子およびその他の任意の核酸から成る複合体を産生させるために、その核酸またはＤＮＡ分子を試料と接触させる方法、および（ｃ）その複合体の産生を測定する手段から成る。本発明には、さらに、ミコバクテリア菌の検出のための遺伝子増幅検出分析法の使用法の提供も含まれる。従って、本発明の態様によれば、本発明は、身体の組織や体液のような試料中のミコバクテリア菌の検出の方法を提供し、その方法は、一対になったプライマー、つまり、プライマー４８７９(SEQ.ID.No:12)と４８８２(SEQ.ID.No:15)の１組、または４８７９(SEQ.ID.No:12)と４８６５(SEQ.I D.No:11)の１組,または４８７９(SEQ.ID.No:12)と４８１２(SEQ.ID.No:10)の１組を提供すること、このプライマーと試料を接触させること、細胞結合と細胞侵入に関与したミコバクテリア菌由来タンパク質をコードした、増幅可能なＤＮＡ配列を増幅させるためのＰＣＲ増幅を実施すること、試料中にミコバクテリア菌が存在していることを示す、増幅したＤＮＡ配列を検出することから成る。さらに別の態様によれば、本発明にはプライマー４８７９(SEQ.ID.No:12)、４８８２(SEQ.ID.No:15)、４８６５(SEQ.ID.No:11)、４８１２(SEQ.ID.No:10)から成るプライマー群から選択されたオリゴヌクレオチドプライマーの提供が含まれる。さらに、本発明の別の態様によれば、本発明は、細胞結合と細胞侵入に関与している、実質的に純粋な組み換えミコバクテリア菌由来タンパク質またはその断片を生成させる方法を提供し、その方法は、上述したように宿主をベクターで形質転換させること、タンパク質を発現させるために形質転換させた宿主を増殖させること、タンパク質を分離して、別のタンパク質様物質や細胞物質を精製することから成る。このタンパク質断片を、開始コドン側に5'端部切除部位を含む遺伝子を有するベクターから発現させてもよい。さらに別の態様によれば、本発明は、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリウム属菌から分離し精製した、分子量が約４５〜６０ｋＤａのミコバクテリア菌由来タンパク質を提供する。このタンパク質はミコバクテリウム属菌由来のものか、あるいは、上述したような組み換え手段により得たものである。本発明により提供されるタンパク質様物質を、有効成分として、免疫原性成分に含めてもよい。本発明には、本発明にかかる核酸分子、ＤＮＡ分子、タンパク質を薬品として使用する方法も含まれる。本発明は、さらに本発明にかかる核酸、ＤＮＡ分子、タンパク質を有効薬剤成分として、およびミコバクテリア菌の感染が原因となる疾病の感染防御の調剤成分として使用する方法も含む。本発明は、長所として以下の点が挙げられる。 ― ミコバクテリウム属菌株由来の、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている分離精製した核酸分子であること、 ―細胞結合と細胞侵入に関与するミコバクテリア菌由来タンパク質であること、 ―ミコバクテリア菌の特異的な同定のための診断キットおよび免疫原性試薬を含むこと。図面の簡単な説明以下の一般的な説明と特定の例を図面を参照して読むことにより、本発明をさらに詳しく理解するであろう。図１は、そのパネルＡ，Ｂ，Ｃにより、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている遺伝子のＰＣＲによる増幅の状態を示したものである。図２は、そのパネル（Ａ）と（Ｂ）により、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている遺伝子のサザンブロット分析を示している。図３は、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている遺伝子を含むプラスミドを図示したものである。図４は、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている遺伝子を含んだＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列(SEQ.ID.1) を示したものである。図５は、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている遺伝子の制限酵素分析を示したものである。図６は、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている遺伝子の塩基配列(SEQ.ID.No:2)を示したものである。図７は、ヌクレオチド配列(SEQID.No:2)と、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質の推定のアミノ酸配列(SEQ.ID.No:3)を示したものである図８は、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしたウシ結核菌遺伝子のＤＮＡ塩基配列(BCGINV-33)(SEQ.ID.No:2)と、ヒト結核菌のDＮA断片の塩基配列(MTMCE)(SEQ.ID.No:17)を比較を示したものである。図９は、ヒト結核菌を臨床的に分離した分離菌における、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードした遺伝子の同定を示したものである。図１０は、ヒト結核菌の別の菌株における、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードした遺伝子のキャラクタリゼーションを示したものである。図１１は、パネルＡとＢにより、他の菌とミコバクテリア菌を特異的に区別して同定する状態を示したものである。図１２は、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードした遺伝子を含む発現プラスミドの全長と、その遺伝子の5'末端の３個の端部切断部を示したものである。図１３は、パネルＡとＢで構成されているが、この中には、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質の発現と、図１２の発現プラスミドからの端部切断部の発現に関するウエスタンブロット分析結果が示されており、パネルＡは、全細胞抽出液に関しての分析であり、パネルＢはペレット化した封入体に関しての分析である。図１４は、パネルＡとＢで構成されているが、ここには、タンパク質被覆ラテックスビーズでインキュベートしたＨｅＬａ細胞の電子顕微鏡写真が示されている。パネルＡは、そのタンパク質が、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質であり、細胞の侵入（矢印）があるＨｅＬａ細胞を示している。パネルＢは、そのタンパク質がウシ血清アルブミンであり、細胞侵入のないＨｅＬａ細胞を示している。発明の一般的説明図１において、ウシ結核菌ＢＣＧ由来の、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードした遺伝子のＰＣＲによる増幅法が図示されている。この遺伝子のことを、この出願では、時々、「ｍｃｅ」遺伝子と呼ぶことがある。細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質のことを、この出願でも時に「ｍｃｅｐ」と呼ぶことがある。図１で示した種々のプライマーの塩基配列を下記の表１にリストにしてある。ヒト結核菌のｍｅｃ遺伝子をコードしたＯＲＦ１配列（１８１〜８１０ｂｐ）（これは１５３５ｂｐの挿入断片の一部である）の5'末端と3'末端に対応した２つのプライマーである４６７６(SEQ.ID.No:4)と４６７７(SeQ.ID.No:5)を、ＢＣＧ由来の対応ｍｃｅ遺伝子を増幅するために、Arrudaらが公表している配列に従って設計した。ＢＣＧ・ＤＮＡを使用したＰＣＲ実験とその後の電気泳動では、予想したＤＮＡバンドを産生することはなかった（パネルＡ、レーン２；パネルＢ、レーン２；図１）。一方、対照として使用したプラスミドpzx7（図１では、「pBmce」とレベル。レーン１，パネルＡ）のほうは予想した増幅産物を産生した。別の一対のオリゴマーである、４４１４(SEQ.ID.No:6)と４４４８(SEQ.ID.N o:9)（これは、オープンリーディングフレームにおいて、末端から約２０の塩基を取り除いている）は、ＢＣＧと対照プラスミドに対して正確な大きさを有する予想した通りの産物を生み出した。対になったプライマーである４７７６(SEQ.I D.No4)／４４４８(SEQ.ID.No.9)、４４１４(SEQ.ID.No.6)／４４４７(SEQ.ID.No .8)、４４１５(SEQ.ID.No.16)／４４４７(SEQ.ID.No.8)を使用して別の増幅実験を実施し、その産物をゲル電気泳動法により分析し、その結果を図１に示した。４６７６／４４４８の対と４４１４／４４４８の対のプライマーだけが、すでに公表されているヒト結核菌のｍｃｅ遺伝子配列を基礎にしたＰＣＲ反応法を、ＢＣＧ・ＤＮＡに実施することにより、予想した増幅産物を産生することができた。プラスミドpZX7（図では、「pBmce」または「plasmid」とレベル）を使用した対照実験では、すべて予想した大きさに増幅されているフラグメントを産生した。ウシ結核菌ＢＣＧ由来の対応遺伝子をクローン化するために、ｍｃｅ遺伝子特異的プローブを使用して、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法により、遺伝子のウシ結核菌のゲノム内の特定フラグメントを同定した。ウシ結核菌ＢＣＧ・ＤＮＡの制限酵素消化試験およびＰＣＲ増幅産物（４４１４／４４４８の対のプライマー；レーン２；パネルあ、図１）をプローブとして使用したサザンブロット分析の結果、SalＩおよびXhoＩによる消化産物上の１．５ｋｂおよび５ｋｂのフラグメントに、ｍｃｅ遺伝子が存在することが明らかになった。この場合、対応バンドは切断され、適当に消化されているpUC18およびp Bluescript II sk(+)プラスミドにそれぞれ結合させた。コンピテント大腸菌の形質転換の後に得たライブラリを、ハイブリダイゼーションによるｍｃｅ遺伝子の探知に使用し、２つの陽性クローンを同定した。これらのクローンを増殖させ、プラスミドを分離して、２つのプラスミドを特定した。その１つは、ｍｃｅ遺伝子特異的プローブとハイブリダイズする約５ｋｂのＤＮＡ挿入断片に含まれるプラスミドpBCGcepxであり、他方は、ｍｃｅ遺伝子特異的プローブに同じようにハイブリダイズする１．５ｋｂ SalＩ挿入断片を含むプラスミドpBCGceSである（図３）。プラスミドpBCcepSとpBCGcepXの挿入断片の塩基配列決定をプライマー・ウオーク法により実施した。プラスミドpBCGceSには、ウシ結核菌ＢＣＧ遺伝子を含んでいる１．５ｋｂ挿入断片（図３で黒いボックスで示した部分）と無規則に縦列をなしている１．５ｋｂ・SalＩ・挿入断片（図３で、灰色のボックスで示した部分）が含まれていた。挿入断片から得た配列データをインテリジェネテッック(Intellignetics)社の配列組立プログラム(sequence assembly program)を使用して、その配置を決定した。pBCGcepSの１．５ｋｂ・SalＩ・挿入断片は、より大きいpBCGcepXクローンの内部フラグメントであることが判明した。プラスミドpBCGcepXにクローン化させた４７４０ｂｐ・ＤＮＡフラグメントの完全な配列 (SEQ.ID.No:1)を図４に示した。すでに記載した（文献４）ヒト結核菌のｍｃｅ遺伝子のＯＲＦ（オープン・リーディング・フレーム）は、本発明が提供するＢＣＧ遺伝子の内部配列の１つである。対応するヒト結核菌のＯＲＦは２３３６位で始まり、その後の６０２ｂｐは、ウシ結核菌ＢＣＧ配列と同じである。２つの配列はその後分岐し、ヒト結核菌配列は終止コドン２１ｂｐで終了し、ＢＣＧ・ＯＲＦはさらに４２３ｂｐだけ延びる。ウシ結核菌ＢＣＧ遺伝子の推定の開始点も、ヒト結核菌ｍｃｅ遺伝子のＧＴＧ開始配列の５０５上流である。それ故に、配列は全く異なっている。コード配列の同一性と、プラスミドpZX7（文献４）とpBCGcepXとの間の5'配列と3'配列における差違を図示している核酸配列の配置を図８に示している。図５は、pBCGcepXにおける４．７ｋｂ挿入断片のエンドヌクレアーゼ消化部位をリストしたチャートを示したものである。４７４０ｂｐ・ＤＮＡ配列の可能なＯＲＦを探した。ＯＲＦが配列の１８０２位と３３８３位との間に見つかった（図４）。このＯＲＦのＤＮＡ配列(SEQ.ID.No :2)を図６に示した。ＯＲＦはＡＴＧで開始され、ＴＧＡには終止コドンはない。ＯＲＦは１５８１のヌクレオチド長さである。細胞結合と細胞侵入に関与しているウシ結核菌ＢＣＧのミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしているＤＮＡ配列での、その他の推定ＡＴＧおよびＧＴＧ開始コドンを図４の中でボックスで囲んで示している。Arrudaら（文献４）が提案したＭｃｅＰタンパク質の開始コドンは、図４において、ヌクレオチドの２３３６位として示されている。このＯＲＦは、分子量が約５５ｋＤａで、５２７アミノ酸のタンパク質をコードしている。このタンパク質は、転写後プロセッシングがなされている間に取り除かれＮ末端にあるシグナル配列を有する前駆タンパク質である。細胞結合と細胞侵入に関与しているウシ結核菌ＢＣＧ・タンパク質の配列が図７に示されている(SEQ .ID.No:3)。ヒト結核菌ｍｃｅ遺伝子と上記のウシ結核菌ＢＣＧ遺伝子のＯＲＦＩ（文献４）翻訳フレームは同じである。それ故、文献４に記載されたヒト結核菌のＭｃｅＰタンパク質もまた本発明にかかるウシ結核菌ＢＣＧ由来のタンパク質の内部ポリペプチドである。上述したように、ヒト結核菌Ｈ３７Ｒａ（文献４）の細胞侵入を仲介する先行技術での遺伝子は、ウシ結核菌ＢＣＧから始めて分離した遺伝子とは全く異なっている。図９には、臨床的に得たヒト結核菌の分離菌の遺伝子と、ウシ結核菌ＢＣＧの遺伝子に対応する遺伝子の同定法が図示されている。別の１２の臨床的に得た分離菌由来のＤＮＡについて、組み合わせプライマー４６７６／４６７７（公表されているヒト結核菌のｍｃｅ遺伝子の位置は図９の下部に示している）を使用して、ＰＣＲ増幅を実施したが、予想した大きさの個別増幅産物は観察されなかった。これとは対照的に、組み合わせプライマー４６７６／４４４８および４４１４／４４４８を使用した増幅の場合には、約６００ｂｐのフラグメント（図９）が産生され、この大きさは、細胞結合と細胞侵入に関与している、ウシ結核菌ＢＣＧ・タンパク質の遺伝子の配列から推定した通りの正確なものであった。さらに、臨床的に得たヒト結核菌の分離菌であるＴＢ２４３（米国で得たもの）由来のＤＮＡのＰＣＲ増幅を、ウシ結核菌ＢＣＧ由来のpBCGcepXに挿入したフラグメントの配列を基礎にして作製した組み合わせプライマーを使用して実施した。３３８３位での推定の終止コドンまでの3'側配列を基礎にしてプライマー４８７９を設計した（図１０の底部）。対になっているプライマー４８７９／４８６５を使用して、ＢＣＧのＤＮＡとヒト結核菌（ＴＢ２４３）のＤＮＡをＰＣＲ増幅させた場合には、予想した大きさ（約２．６ｋｂ）を有する単一の増幅産物が産生された。対になったプライマー４８７９／４８１２を使用したＰＣＲ増幅では、正確なサイズのバンドを産生したが、誤ったプライミングの場合には、サイズの小さい産物が産生されたのみである。次に、すでに説明したようなヒト結核菌であるＨ３７Ｒａ・ｍｃｅ遺伝子（文献４）のＯＲＦ１の終止コドンをスパンするためのプライマー４８８０を設計した。組み合わせたプライマー４８７９／４６６０では、約１．１ｋｂの増幅産物を産生することはなかった。このＰＣＲ増幅反応では、適切でないが、増幅産物が産生されはするけれども、ウシ結核菌ＢＣＧまたは臨床的に得たヒト結核菌の分離菌ＤＮＡを含んでいる１．１ｋｂ産物を産生するということはなかった。プラスミドpZX7（文献４）を使用したＰＣＲ増幅反応において、プライマーの組み合わせでは増幅産物は産生されなかった。このプラスミドでの挿入断片には、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしているウシ結核菌ＢＣＧ遺伝子で見られた 5'配列がなかったが、このことは予想されたことである。プラスミドpZX7とウシ結核菌ＢＣＧＤＮＡおよびヒト結核菌（ＴＢ２４３）ＤＮＡについて、４６７６／４８８０，４６７６／４６６１，４８７９／４８８２のような他のプライマー組み合わせを使用したＰＣＲ増幅を行った。対になったオリゴマー４６７６／４８８０（プライマー４８８０は、公表されているヒト結核菌ｍｃｅＯＲＦの終止コドンに隣接している配列をスパンする）を使用したpZX7の増幅では、予想した大きさのＤＮＡフラグメントを産出した。同じ対になったプライマーを使用した場合、ＢＣＧ遺伝子およびヒト結核菌の臨床的に得た分離菌からの遺伝子の増幅は可能であったが、そのことは、非特異的プライミングが原因ではなかった。ウシ結核菌ＢＣＧ遺伝子、ヒト結核菌遺伝子の、プライマー４６７６／４８８１を使用した増幅では、正確なサイズのバンドを産生したが、プラスミドpZX7を使用した場合には、増幅産物はなかった（図１０，レーンＮ、Ｑ、Ｋ）。再度、プライマー４８７９と４８８２（後者のプライマーは、ウシ結核菌ＢＣＧ配列の終止コドンをスパンする配列を構成する。）の対を使用したＰＣＲ増幅を行った場合、ＢＣＧ配列を基礎に予想された増幅産物が観察された。ウシ結核菌ＢＣＧのＤＮＡに対する、結核菌Ｈ３７Ｒａ（文献４）の配列を基礎にして作製したプライマーを使用した、これらのＰＣＲ増幅実験から、ウシ結核菌ＢＣＧ遺伝子は別であることは明白である。本発明が提供する細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている遺伝子は、ヒト結核菌から臨床的に得た多数の分離菌に存在しており、分子量が約５５ ,０００であるタンパク質をコードしている。このように、ヒト結核菌であるＨ３７Ｒａ（文献４）の細胞侵入の仲介に関与しているタンパク質をコードしている従来技術の遺伝子は、天然に存在しているものであり、細胞結合および細胞侵入に関与し、その分子量が４５，０００〜６０，０００であるミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている遺伝子の切断変種である。先行技術の遺伝子と本発明の遺伝子の出所が互いに異なっていることを反映しているかもしれない。診断的実施例においては、本発明の遺伝子は、ミコバクテリア菌を他の病原菌から識別・区別する場合に有益である。ヒト結核菌から臨床的に得た分離菌および百日咳菌、モラクセラ・カタラーリス、緑膿菌、インフルエンザ菌のような他の病原菌のＤＮＡに関するxhoＩ制限酵素消化物のサザンブロット分析に、pBCGc epxの４．７ｋｂ長さの挿入断片をプローブとして使用することにより、非ミコバクテリア細菌における同種配列の欠如を示すことができる。ヒト結核菌から得た分離菌の全部に、上記で説明した特別な５ｋｂフラグメントがあり、これにより、これらの分離菌と他の病原菌を区別することができる（図１１）。図１２は、細胞結合と細胞侵入に関与するミコバクテリア菌由来タンパク質を発現するための、発現プラスミドの構造を示したものである。ＡＴＧ開始コドンを有する完全な長さのｍｃｅｐ遺伝子とＧＴＧ開始コドンを有する5'切断断片を得るために、EcoRI-HindIII挿入断片を、適切なプライマーを使用した染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅法により用意した。このEcoRI-HindIII挿入断片をプラスミドp ET-23b(+)に挿入する。発現ベクターを大腸菌細胞に形質転換して、ミコバクテリア菌由来タンパク質を発現させる。タンパク質発現は、主に、封入体に起こることが判明している。ウエスタンブロット分析（図１３）の結果、多く切断された配列があれば、最も高い発現レベルが得られ、コード遺伝子の長さが増加するにつれて発現レベルは低下することが分かっている。図１４は、Ｈｅｌａ細胞を、ミコバクテリア菌由来タンパク質(mcep)と、無関係なタンパク質(BSA)との両方をコーティングしたラテックスビーズに接触させることで侵入比較分析を実施した結果を示したものである。電子顕微鏡写真には、ｍｃｅｐタンパク質を塗布したビーズで、ＨｅＬａ細胞の侵入が見られ、ＢＳＡを塗布したほうには侵入がないことを示している。本発明の種々の実施例を、ワクチン接種、診断、例えば、ミコバクテリア菌の感染の治療、免疫の誘導、その他の診断試薬の分野で広く応用できることは当業者には明白である。さらに、その使用に関して非制限の論議が以下に示される。1. ワクチン調剤とその使用ワクチンとして使用するのに適している免疫原性成分を、細胞結合と細胞侵入に関与している、核酸分子および本発明の核酸分子によりコードされている、免疫原性のミコバクテリア菌由来タンパク質から調製できる。このワクチンは免疫応答を誘起し、抗―細胞結合抗体および抗―細胞侵入タンパク質抗体を含む抗体の産生を誘起し、細胞性免疫応答を成立させる。ワクチンを含む上記免疫原性成分は、注射可能な製剤、液体、またはエマルションとしても調製できる。このタンパク質および核酸を、薬学的に受け入れ可能な医薬品添加物と混合してもよい。そのような医薬品添加物として水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびそれらを組み合わせたものがある。この免疫原性成分およびワクチンには、さらに湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ワクチンの有効性を強化するアジュバントのような補助物質を添加してもよい。免疫原性成分およびワクチンは、非経口で、あるいは注射により、皮下および皮内、筋肉内経由で投与してもよい。別の代替法として、本発明により作製された上記免疫原性成分を粘膜表面で免疫応答が誘起されるように調剤して投与してもよい。このように、この免疫原性成分を、例えば、経鼻または経口（胃内）で粘膜表面に投与してもよい。代替法として、坐薬および経口製剤を含む投与の他のモードでもよい。坐薬には、ポリアルカリングリコールやトリグリセリドなどの結合剤や担体を使用してもよい。経口製剤には、例えば、製薬用のサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムのような、通常使用されている医薬品添加物を使用してもかまわない。これらの成分を溶液、懸濁液、錠剤、ピル、徐放剤および／または核酸分子の形で使用してもよい。このワクチンを、製剤に合った方法で、治療上の観点から有効で、防御効果があり、かつ免疫原性を発揮すると考えられる用量を投与する。投与量は、治療対象である患者の身体状態、例えば、抗体を合成する患者本人の免疫系の機能、必要な場合には、細胞性免疫を誘起できる機能などにより違ってくる。投与が必要な有効成分の正確な用量は、担当医師の判断により決定する。しかし、この適切な投与量の範囲については、当業者には容易に決定可能なことであり、タンパク質およぼ／または核酸分子の量でのミクログラムのオーダである。最初の投与量とブースタ量は一定ではなく、適当な量を当初用量として、その後に適当な量を投与することになる。このワクチンの用量は投与経路と投与対象の体重により違ってくる。細胞結合と細胞侵入に関与するミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている核酸分子を、ＤＮＡの投与、例えば、遺伝子免疫注射や、サルモネラ菌、アデノウイルス、ポックスウイルス、ワクシニア、ポリオウイルスのような生きたベクターの構築法などの直接的な方法での免疫に使用してもかまわない。異種抗原を免疫系に運搬する生きたベクターに関する論議が、例えば、O'haganによりなされている（文献５）。遺伝子免疫のためにＤＮＡを患者に直接に注射するプロセスについて、例えば、Ulmerらにより報告されている（文献６）。抗原とアジュバントを一緒に投与することにより、免疫原性を大きく改善することができ、この場合、このアジュバントは、０．０５〜１．０％リン酸緩衝生理溶液の形で使用する。アジュバントは、抗原の免疫原性を強化させるが、それ自体が必ずしも免疫原性である訳ではない。つまり、アジュバントは、抗原をその投与部位近くに局所的に保持することで、免疫系の細胞にゆっくりと徐放をするための貯蔵効果を発揮させる役割をする。また、アジュバントは、免疫系の細胞を抗原貯蔵場所に引き寄せ、免疫細胞を刺激して免疫応答を誘起する役割をする。例えば、ワクチンなどによる宿主での免疫応答を改善するために、免疫刺激剤またはアジュバントが長年使用されている。リポポリサッカライドのような内因性アジュバントは、通常は、死菌ワクチンまたは弱毒化ワクチンの成分である。外因性アジュバントは、代表的には抗原と共有結合をした免疫調整剤であり、宿主免疫応答を強化するように調製されている。このように、アジュバントは、非経口的に投与された抗原に対する免疫応答を強化するものとして同定されている。これらのアジュバントの中には、有毒で、望ましくない副作用を引き起こし、ヒトおよび動物の使用には適さないものもある。実際、ヒトおよび動物用のアジュバントとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム（これらを総称してミョウバンと呼ぶ）だけが、通常使用されている。ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドに対する抗体応答を増加させるミョウバンの有効性はよく認識されており、HBsAGワクチンではミョウバンが常に同時投与されている。広い範囲の外因性アジュバントが、抗原に対して潜在的な免疫応答を誘起することが可能である。このようなアジュバントとして、膜タンパク抗原と複合しているサポニン、鉱物オイルを含むポリマー、死菌ミコバクテリアと鉱物オイル、完全フロイント・アジュバント、ムラミルペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）、リピドＡのような細菌産生物、リポソームがある。体液性免疫応答と細胞性免疫応答を効果的に誘起するために、免疫原をアジュバントの中で乳状化させて使用されている。2. ハイブリダイゼーション・プローブとしての配列の使用本発明にかかる、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしているヌクレオチド配列の同定と、ミコバクテイルウム属菌のどの菌種由来の遺伝子のクローン化も可能である。本発明にかかる、ヌクレオチド配列は、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来のタンパク質をコードしている他の遺伝子の相補的伸長部を有する複合体分子を選択的に形成させるために使用可能である。使用法にもよるが、これらの他の遺伝子に対するプローブの多様なハイブリダイゼーション条件を使用して、多様な選択性を実現することが可能である。選択性の範囲を広げるために、複合体を形成させる場合に、使用する塩類の濃度を低くする、つまり、０．０２Ｍ〜０．１５ＭのＮａＣＬを使用し、および／または、温度を高くする、つまり、約５０℃〜７０℃にするなどの比較的に厳しいハイブリダイゼーション条件を使用している。使用する塩の濃度を０．１５Ｍ〜０．９Ｍ、温度を約３０℃〜５５℃にするなどの緩やかなハイブリダイゼーション条件が必要である場合もある。また、ハイブリッド複合体を多様化させるために、ホルムアルデヒドを添加して、そのハイブリダイゼーション条件を厳しいものにしてもよい。このように、特定のハイブリダイゼーション条件を容易に操作することが可能であり、一般的に望む結果にあわせて自由に選択が可能である。一般的に、５０％ホルムアルデヒドの存在下でのハイブリダイゼーションのための温度は、ターゲットフラグメントに対して９６〜１００％の相同性のあるプローブでは４２℃、９０〜９５％であれば３７℃、８５〜９０％であれば、３２℃ということになる。臨床診断の例では、ハイブリダイゼーションの結果を確認するために、本発明にかかる遺伝子の核酸配列をラベルのような適当な指示物と組み合わせて使用してもよい。多様な指示物が知られており、例えば、検出シグナルを提供できる放射線、酵素またはアビジン／ビオチンのようなその他のリガンド、ジギトキシゲンなどがある。さらに別の診断の例では、ウレアーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはペルオキシダーゼなどの酵素タグも使用できる。遺伝子配列を含む試料との特定のハイブリダイゼーションを特定するために使用される酵素タグの場合に、ヒトの目に見える反応をするか、または蛍光分光光度計を使用した比色指示物質の使用が知られている。本発明の核酸配列は、溶液ハイブリダイゼーション法および固相手順を採用したハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用である。固相手順を使用する例では、例えば、臨床試料から得た浸出液、体液（血清、淡、気管支肺胞洗浄液）、組織からの試験用ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を選択したマトリックス表面に吸収させるか付着させる。固定した単鎖核酸を、適当な条件下で、本発明の遺伝子の核酸配列から成る選択したプローブと特異的にハイブリダイズさせる。選択条件は、Ｇ＋Ｃ含有量、標的核酸の種類、核酸の出所、ハイブリダイゼーションプローブの大きさにより要求される特定基準を基礎にした環境により異なってくる。非特異的に結合したプローブ分子を除去するためにハイブリダイゼーションをした表面の洗浄の後、ラベルまたは指示物により、特異的なハイブリダイゼーションが検出されるか、または定量化される。ミコバクテリウム属菌の多様な菌種の中で保存されている核酸配列部分を選択するのが好ましい。選択したプローブの長さは少なくとも１８ｂｐであり、約３０〜９０ｂｐ以上の範囲である。3. 遺伝子の発現宿主細胞に適合する菌種由来のレプリコンと制御配列を含むベクターを、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている遺伝子の発現のために使用できる。このベクターは通常複製部位を運搬すると同時に形質転換された細胞が表現型を選択することが可能な配列を作製する。例えば、大腸菌を、アンピシリンとテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を含み、それにより形質転換された細胞を同定する簡便な方法を提供するプラスミドpBR322を使用して形質転換させることができる。プラスミドpBR322またはその他の細菌性プラスミドまたはファージには、宿主が発現に使用できるプロモータを含ませてもよいし含むように修飾することができる。さらに、宿主に適合できるレプリコンと制御配列を含むファージベクターを、これらの宿主の形質転換ベクターとして使用してもよい。例えば、組み換えファージ・ベクターを作製する際に、大腸菌Ｋ１２株ＬＥ３９２のような宿主細胞の組み換えＤＮＡ構築に通常使用されているプロモータには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモータおよび米国特許第４，９５２，４９６で開示されているＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ系のような、その他の細菌性プロモータが含まれる。プロモータのヌクレオチド配列に関する詳細はすでに知られており、当業者はそれを機能的に遺伝子に結合させることが可能である。使用する特別なプロモータを望む結果次第でどのように選択してもよい。遺伝子の発現に適当である宿主として、大腸菌、ボルデテラ属菌、バチルス属菌、ヘモフィリス属菌、真菌のような細菌、酵母を含み、哺乳動物細胞またはバキュロウイルス発現系も使用可能である。本発明によれば、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質は、特に、天然に存在するタンパク質が、ミコバクテリア菌株の培養により精製された時のように、微量の有毒物質やその他の汚染物を含んでいる場合には、組み換え法により、作製することが好ましい。汚染を最小限にした方法で宿主から分離できる異種系での組み換え技術で作製したタンパク質を使用することにより、この問題を避けることができる。遺伝子発現のために特に望ましい宿主として、ＬＰＳを有している、つまり、エンドトキシンを含まないグラム陽性細菌がある。そのような宿主として、バチルス属菌がある、これは特に細胞結合と細胞侵入に関与し、分子量が約４５，０００〜６０，０００である、非発熱原性のミコバクテリア菌由来タンパク質の産生に有用である。微生物の寄託本発明にかかるウシ結核菌株ＢＣＧ由来で、細胞結合と細胞侵入に関与し、分子量が約４５，０００〜６０，０００である、ミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている遺伝子を含んでいるベクターを、ＡＴＣＣ（アメリカ培養コレクション、12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,USA、ブタベスト条約により。本出願日の前。）に寄託した。寄託したベクターのサンプルは、この米国特許が認められた後すぐに、一般に入手可能となり、そのときに、この寄託物に関する制限は取り払われる。この寄託所からの入手が困難な場合には、利用可能なサンプルは提供可能である。寄託した微生物に関する実施例は本発明のための単なる説明のためであり、ここで記載した発明が寄託された微生物に限定されることはない。本出願書で開示している抗原と同等で類似している抗原をコードしている、同等で類似しているすべてのベクターは、本発明の範囲内にある。寄託の概要例上述した開示は本発明の一般的説明である。下記の例を参照することにより、本発明をより完全に理解できるであろう。これらの例は、単に例示のために記載したもので、発明の範囲を制限するものではない。形態の変形および他の同等物との入れ替えは、環境の変化で発生するが、それは考慮の範囲内である。また特別な用語が使用されているが、そのような用語は説明的意味をもつのみであり特別な制限的な意味を有するものではない例１この例は、組み換えＤＮＡ法を説明するものである。制限酵素とクローンベクターは、New England biolabs社、Gibco/BRL Life Techonologies社、Boehringe r Mannheim and Stratagene社などの会社から入手した。ＤＮＡ分離プロトコルに使用した試薬は、Sigma Biochemical社から購入した。組み換えＤＮＡ操作の大部分は、標準のプロトコルに従って実施した（文献７）。塩基配列決定は、ジデオキシターミネータ化学を使用して、キットに試薬を入れてApplied Biosyste ms社の自動シーケンサー(370A)で、メーカーが提供したプロトコルに従って実施した。プライマーとして使用したオリゴヌクレオチドの合成をApplied Biosyste ms社の合成機で実施した。合成ポリヌクレオチドをApplied Biosystems社のＯＰＣカートリッジにより、メーカのプロトコルに従って精製した。例２この例は、ウシ結核菌ＢＣＧ・ＤＮＡの分離について記載している。ウシ結核菌ＢＣＧ・ＤＮＡの分離は、文献（文献８）で記載されている技術を改良して使用した。ウシ結核菌ＢＣＧ（コンノート社）の接種菌培養物（Ａ₆₀₀で３．４，１０ｍＬ）を、ＡＤＣとTween８０(Sigma社、０．０５％)で強化した１００ｍＬのMiddlebrook７Ｈ９培地(Difco Lab社)に接種した。この培養物をローラボトル内で１４日間３7℃でインキュベートし、その後、細胞をぺレット化するために、その培養物の５０ｍＬを遠心分離（６，０００ｇで１０分間）した。そのペレットを、２００μｇ／ｍＬのプロテナーゼＫ(Gibco/BRL社)と１０ｍｇ／ｍＬの鶏卵白色リゾチーム(Sigma社)を含む１ｍＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス− ＨＣＬ、ｐＨ７．５，１ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁させた。その懸濁液を３７℃ で６０分間インキュベートし、遠心分離を行い（１２，０００g、１分）、ラスビード付き２ｍＬネジ蓋チューブに、その容量が４分の１になるまで移し、１０分間強く混ぜた。その後、そのビーズを静置し、その上清を新鮮なチューブに移した後、１０分間室温で遠心分離した。その結果生じたリゼートを新しいチューブに移し、０．５ｍＬの１００％エタノールを添加した。そのチューブを数回逆さにして混合し、その混合物を室温で３〜５分間インキュベートした。その後、ＤＮＡをペレット化するために遠心分離した（１，０００ｇ、２分間）。その上清は廃棄した。そのペレットを１ｍＬの９５％エタノールで洗浄して、その後、室温で１５分間空気乾燥させた。最後にそのペレットを０．２ｍＬのＴＥ緩衝液で溶解させ、ＤＮＡの波長２６０ｎｍでの光学的濃度を分光光度計で測定した。このプロトコルにより約８０μｇのＤＮＡを得た。例３この例は、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしているウシ結核菌ＢＣＧ遺伝子のＰＣＲ増幅を記載したものである。ウシ結核菌ＢＣＧ染色体ＤＮＡと、Riley博士提供（文献４）のヒト結核菌Ｈ３７Ｒａ由来の１５３５ｂｐの挿入断片を含むpZX7プラスミド(Stratagene社のp Bluescript[+])のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーとその塩基配列を表１に示す。これらのプライマーの、ヒト結核菌（文献４に記載）のｍｃｅ遺伝子をコードしているＯＲＦ１を基準とした対応位置を図１において、濃い太線で示した。増幅を「ホットスタート手順」を使用して行った。本質的には、dNTP（最終容量１００μｌ中０．２ｍＭ）、緩衝液、１対のプライマー（それぞれ１００ｐＭ）を含んでいる４０μｌ反応混合液を薄壁チューブ内で調製しーブを７０℃で５分間加熱した。その後、そのチューブを５分間室温まで冷やし、緩衝液（１０倍の濃度のものをメーカより提供された）、酵素１ユニットｇまたはプラスミドの５０ｎｇ）を含んでいる反応混合液（６０μｌ）を添加した。チューブをパーキンエルマ・シータス(Perkin-Elmer Cetus)熱サイクラーに入れて、下記のパラメータを基礎にしてサイクルシーケンスを開始した。ステップ１：９３℃で１分間ステップ２：９３℃で１分間、６０℃で１分間；７２℃で１分間；１０サイクル反復。ステップ３：９３℃で１分間、６０℃で１分間；６０℃で１分間（自動延長、５秒）２０サイクル反復ステップ４：７２℃で１分間、およびステップ５：４℃で保持。このチューブを４℃に保温して、その１０μｌアリコットを０．８％アガロースゲルに載せ、そのバンドを目で観察して写真を取った。例４この例は、ウシ結核菌ＢＣＧライブラリの構築について記載している。ウシ結核菌ＢＣＧ・ＤＮＡの制限酵素消化とその後のＰＣＲ法で増幅した産物（対にしたプライマー４４１４／４４４８；レーン２；パネルＡ、図２）をプローブとして使用したサザンブロット法により、１．５ｋｂおよび５ｋｂフラグメントのSalＩおよびXhoＩによる消化物（図３）上での遺伝子の存在が示された。対応するバンドを切り取り、消化産物pUC18とpBluescript II sk(+)にそれぞれ連結させた。これらのプラスミドのコンピテント大腸菌細胞への形質転換の後に得たライブラリを、ハイブリダイゼーションによる遺伝子のプローブに使用して、２つの陽性クローンを同定した。２つのクローンを作製するために、これらを増殖させ、分離し分析した。プラスミドpBCGcepXには、推定の遺伝子を含んでいる約５ｋｂのＤＮＡ挿入断片が含まれ、もう一方のプラスミドpBCGcepには、約１．５ｋｂのSalＩ挿入断片に（これもｍｃｅ遺伝子特異的プローブとハイブリダイズされる）が含まれていた（図４のパネルＡ，Ｂでの濃い太線）。サザンブロット分析のために、ウシ結核菌ＢＣＧ・ＤＮＡ（１．２μｇ）を、エンドヌクレアーゼであるEco RI、Hind III、Nde I、Bgl II、Dra III、Sac I 、Sal I、XhoＩ（それぞれに５〜１０ユニットを使用）で消化させた。標準の緩衝液と条件で、４時間、合計容量２０μｌについて、酵素消化を行った。消化物をローディング緩衝液と混合して、０．８％のアガロースゲルに入れた（図２，パネルＡ）。このゲルを標準試薬とプロコルを使用してナイロン膜に移し、ＤＮＡをその膜に固定させた。プライマーである４４１４および４４４８（図１，レーン４，パネルＡ）を使用して実施したＢＣＧ・ＤＮＡのＰＣＲ反応による増幅産物を対応バンドをゲルから切り取り、ＤＮＡを抽出することで分離した。分離したＤＮＡを、ハイブリダイゼーションのプローブとして使うために、「ランダムプライミングシステムＩ」キットを使用して、３２ｐで標識した。膜で事前ハイブリダイゼーションをさせ、標識したプローブとのハイブリダイゼーションを１夜５５℃で起こさせ、その後洗浄した。そのブロットをフィルムに室温で１夜曝露させ、オートラジオグラフを作製した（図２，パネルＢ）。制限酵素であるSalＩとXhoＩを使用してウシ結核菌ＢＣＧ・ＤＮＡの酵素消化を行い、その消化物を０．８％アガロースゲルに移した。１．５ｋｂと５ｋｂのバンド（図２，パネルＢ）を切除した。ＤＮＡを、これらのアガローススライスから分離し、T4・ＤＮＡリガーゼを使用して、SalＩで消化したpUC18またはXho Ｉで消化したpBluescript II sk(+)に結合させた。コンピタント大腸菌Ｋ１２株（ＴＧ１）細胞を形質転換させるために結合反応を使用し、コロニーをアンピシリンを入れたＬＢ寒天で平板培養した。この培養物をニトロセルロース膜(Schleicher & Schuell)に移し、上記のサザンブロット手順で使用した標識したポリヌクレオチドでのプローブした。陽性コロニーを同定、分離、増殖させ、プラスミドを精製し、SalＩとXhoＩによる消化の後、挿入されたＤＮＡの分析を実施した。２つのクローン（その１つには、約５ｋｂのXh oＩ挿入断片［pBCGcepX]を含み、他方には１.５ｋｂのSalＩ挿入断片[pBCGcepS] を含む）が同定された。これらのクローンを増殖させ、プラスミドを高い精度の精製が可能なキット(Qiagen)を使用して分離し、遺伝子の配列決定を実施した。例５この例は、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている遺伝子を使用したサザンハイブリダイゼーションによる、結核菌の他の病原菌からの特異的な識別同定について記載している。細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしており、分子量が約４５〜６０ｋＤａである、分離した核酸分子は、ミコバクテリア菌を他の病原菌から特異的に識別する場合に有益である。ウシ結核菌ＢＣＧ（Connaught社）由来の染色体ＤＮＡ（１μｇ）、結核菌の臨床的に得た分離菌であるＴＢ１９９（米国），ＴＢ４２１（ウガンダ）、ＴＢ４５８（ブラジル）、百日咳菌(B.pertussis)、モラクセラ・カタラーリス、緑膿菌、インフルエンザ菌(Eagan株)を、制限酵素XhoＩを使用して消化させた。この消化物を消化させていない染色体ＢＣＧ・ＤＮＡと一緒に０．８％アガロースゲルで電気泳動にかけ、そのブロットをナイロン膜に移した。プラスミドpBCGce pXの５ｋｂ・XhoＩ挿入断片を³²Ｐで標識して分離して、サザンブロット分析のためのプローブとして使用した。このブロットを洗浄してフィルムに曝露させた。そのゲルと４８時間の曝露後のラジオグラフを図１１に示した。例６この例は、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質を発現させる発現ベクターの構築について記載している。プライマーを使用して、ウシ結核菌染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅を実施し、例３で概略した手順を使用して、EcoRIとHinndIIIの制限酵素部位への取り入れを行い、発現ベクターへのクローン化を促進させた。3'末端には、普通のプライマーを使用したが、5'末端の配列は挿入断片の分子の長さにより異なった。このプライマーについては、下記の表３に記載した。全長のミコバクテリア菌タンパク質（ＡＴＧ開始コドン）と全長の5'端部切断部配列（ＧＴＧ開始コドン）をコードした１連のEcoRI-HindIII挿入断片を作製した。挿入断片をNovagen社から得たpET-23b(+)ベクターのEcoRI-HindIIIにクローン化した（図１２）。このベクターには、挿入断片のすぐ上流に１１アミノ酸Ｔ７標識を有しているので、Ｔ７標識抗体アルカリホスファターゼ接合体(Novagen社 )を使用して、ウエスタンブロットにより産生されたミコバクテリア菌由来のタンパク質を容易に検出することができる。例７この例は、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来のタンパク質の発現について記載している。例６に記載された方法で調製した多様なプラスミドをコンピテント大腸菌 BL21(DE3)pLysS細菌細胞に形質転換した。発現構造を含んでいる細菌の１夜培養物を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含む１００ｍｌ新鮮ＬＢブイヨン内で３時間増殖させ、１ｍＭ・ＩＰＴＧで誘導した。５時間の誘導の後、細胞をペレット化して、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームの５０ｍＭトリスｐＨ８／１ｍＭＥＤＴＡ溶液での処理により溶解させ、その後、０．１％デオキシコール酸を追加した。その溶解物を１０ｍｇ／ｍｌＤＮＡｓｅで消化させることで、染色体ＤＮＡを脱離させた。リゼートをペレット化して、１％NonidetP-40を含む５０ｍＭトリスｐＨ８／１ｍＭＥＤＴＡ／１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液と０．１％トリトンＸ−１００で数回洗浄した。侵入タンパク質の大部分を含んでいるこのペレットを５０ｍＭトリスｐＨ８／１ｍＭＥＤＴＡ中で保存した。この産物を回転タンパク質ゲル分析とウエスタンブロット法により分析した。タンパク質ゲル分析とウエスタンブロット分析により、ミコバクテリア菌由来タンパク質の発現が、最も多くの端部切断のコード配列を含んでいるプラスミド構築物を使用した時に最良であることが判明した。このコード配列がpET-23b発現構築物に使用されるにつれて、発現レベルが確実に減少した。全長のコード配列を有している構築物は、他に較べて非常に弱い発現であった。例８この例は、発現ミコバクテリア菌由来タンパク質によるＨｅＬａ細胞の侵入について記載している。全長ｍｃｅ遺伝子を発現している大腸菌を、アンピシリンとクロラムフェニコールを含んだ１００ｍｌの新鮮LＢブイヨン中で、類似した細胞の１夜培養物１０ｍｌを接種物として使用して、３時間増殖させた。細胞を、例７で記載した方法により、ＩＰＴＧで誘導し、遠心分離をした後、集めた。ペレットを、例７の方法で処理した。ペレット化させた封入体を、５０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）と１ｍ・ＭＥＤＴＡの溶液に入れた。ペレットを混ぜながら再懸濁し、７０℃で１０分間インキュベートし、その後、再度かき混ぜた。その懸濁液を遠心分離し、澄んだ上清を５０μｌの再懸濁させたビーズ（ポリビーズ・ポリスチレンミクロスフィア、平均サイズは１ミクロン、Polyscience社）に添加し、１ｍＭ・ＤＴＴを含む５０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）で洗浄した。そのビーズと上清を室温で１夜ゆっくりかき混ぜながらインキュベートした。その後、そのビーズを遠心分離により分離し、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む１ｍｌのトリス緩衝液（５０ｍＭ）に懸濁させた。インキュベーションを室温で３０分間続行した後、同じ緩衝液でそのビーズを２回洗浄した。最終的に、そのビーズを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。上記の手順の間に、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭに入れたＨｅＬａ細胞を、６個のウオール付きのプレート（１ウエル当たり４ｘ１０５細胞）に植菌した。これらを１夜、５％炭酸ガスを入れたインキュベータ内で３７℃で増殖させた。その細胞を新鮮培地で洗浄した、１００μｌの懸濁ラテックスビーズを各ウエルに添加して、３７℃で４時間インキュベートした。その中の培地を取り除いて、細胞をＰＢＳで洗浄した。その細胞を固定し、標準のプロトコルを使用して、トロント大学ＥＭ施設部のＥＭオペレータが電子顕微鏡観察を行った。ビーズ（パネルＡ）を含んだ、あるいは、含んでない（対照：パネルＢ）個々の細胞の電子顕微鏡写真を図１４で示した。無関係なタンパク質を塗布したビーズを対照として使用した。上述したように、溶液にしたミコバクテリア菌由来タンパク質を塗布したビーズをインキュベートする当初のステップ以外を例外として、その他のビーズは正確に調製した。開示の概要開示の概要として、本発明は細胞結合と細胞侵入に関与し、分子量が約４５〜６０ｋＤａである、ミコバクテリア菌のタンパク質をコードした分離した核酸分子およびその核酸分子によりコードされる分離・精製タンパク質、およびそのフラグメントを提供することである。本発明の範囲内で、修正は可能である。

【手続補正書】【提出日】平成１１年５月１４日（１９９９．５．１４）【補正内容】（１）特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。（２）明細書第１頁第８行にある「同時係属出願」の記載を、「同時係属米国出願」に訂正する。（３）明細書第１頁第１５行にある「結核菌複合体」の記載を、「結核菌複合体（tuberculosis complex）」に変更する。（４）図７Ａ〜図７Ｅを別紙のとおり補正する。特許請求の範囲１．ミコバクテリウム(Mycobacterium)属の菌株の、細胞結合及び細胞侵入に関与し、４５〜６０ｋＤａの分子量を有するミコバクテリアタンパク質をコードすることを特徴とする単離された核酸分子。２．前記ミコバクテリウム属菌株が、結核菌複合体中の菌種に属する請求項１に記載の核酸分子。３.前記ミコバクテリウム属菌株が、ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis )またはウシ結核菌(Mycobacterium bovis)に属する菌株である請求項２に記載の核酸分子。４．前記ミコバクテリアタンパク質が実質的に下記のアミノ酸組成を有する請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子。アミノ酸残基数ロイシン５３アルギニン３２トレオニン４５アラニン６０バリン４０セリン４３プロリン３８アスパラギン酸２９イソロイシン２４アスパラギン２３チロシン１６グリシン４５フェニルアラニン１４グルタミン酸１５リシン１５グルタミン１２トリプトファン７メチオニン７システイン６ヒスチジン３５．実質的に図５に示したような、ウシ結核菌ＢＣＧ株の制限酵素地図、あるいは結核菌複合体由来の他のミコバクテリア菌の細胞結合及び細胞侵入に関与するミコバクテリアタンパク質をコードする対応する遺伝子の対応する制限酵素地図を有する請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子。６．配列番号：２(SEQ.ID.No2)のウシ結核菌ＢＣＧ株のＤＮＡ配列、あるいは結核菌複合体由来のその他のミコバクテリアの細胞結合及び細胞侵入に関与するミコバクテリアタンパク質をコードする対応する遺伝子のＤＮＡ配列を有する請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子。７．配列番号：３(SEQ.ID.No.3)のウシ結核菌ＢＣＧ株のアミノ酸配列、あるいは結核菌複合体由来の他のミコバクテリアの細胞結合及び細胞侵入に関与する対応するアミノ配列をコードしている請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子。８．以下の配列のプライマーの組合せ：プライマー４８７９（配列配列番号：１２(SEQ.ID.No:12)）とプライマー４８８２（配列番号：１５(SEQ.ID.No:15)）の組合せ；プライマー４８７９（配列番号：１２(SEQ.ID.No:12)）とプライマー４８６５（配列番号：１１(SEQ.ID.No:11)）の組合せ；プライマー４８７９（配列番号：１２(SEQ.ID.No.12)）とプライマー４８１２（配列番号：１０(SEQ.ID.No:10)）の組合せ； 5'プライマー（配列番号：１９(SEQ.ID.No:19)）と3'プライマー（配列番号：１８(SEQ.ID.No:18)）の組合せ； 5'プライマー（配列番号：２０(SEQ.ID.No:20)）と3'プライマー（配列番号：１８(SEQ.ID.No:18)）の組合せ； 5'プライマー（配列番号；２１(SEQ.ID.No:21)）と3'プライマー（配列番号：１８(SEQ.ID.No:18)）の組合せ；及び 5'プライマー（配列番号：２２(SEQ.ID.No:22)）と3'プライマー（配列番号：１８(SEQ.ID.No:18)）の組合せ；のいずれかを有する１対のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅可能な単離ＤＮＡ分子。９．結核菌複合体からのミコバクテリウム属菌株に由来する請求項８に記載のＤＮＡ分子。１０．ヒト結核菌の菌株またはウシ結核菌の菌株に由来する請求項８に記載のＤＮＡ分子。１１．請求項１〜７の何れかに記載の核酸分子または請求項８〜１０のいずれかに記載のＤＮＡ分子を有することを特徴とする宿主の形質転換のためのベクター。１２．前記タンパク質を前記宿主に発現させるためのＤＮＡ配列を更に有する請求項１１に記載のベクター。１３．請求項１２に記載の発現ベクターを含む形質転換された宿主。１４．請求項１３に記載の形質転換宿主により製造され得る細胞結合及び細胞侵入に関与する組換えミコバクテリアタンパク質。１５．ＡＴＣＣ寄託番号が９７５１１であるプラスミドpBCGcepXにより特定される特性を有し、細胞結合と細胞侵入に関与するミコバクテリウム属菌株からのミコバクテリアタンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とするプラスミド。１6．組織または体液中のミコバクテリウム属菌株を検出する方法において、プライマー４８７９（配列配列番号：１２）とプライマー４８８２（配列番号：１５）の組合せ；プライマー４８７９（配列番号：１２）とプライマー４８６５（配列番号：１１）の組合せ；またはプライマー４８７９（配列番号：１２）とプライマー４８１２（配列番号：１０）の組合せからなる１対のプライマーを供与する工程、プローブと試料とを接触させる工程、細胞結合及び細胞侵入に関与するミコバクテリアタンパク質をコードする核酸配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する工程、及び試料中のミコバクテリウム菌株の存在を示す増幅されたＤＮＡ配列を検出する工程を有することを特徴とする検出方法。１７．プライマー４８７９（配列番号：１２）、４８８２（配列番号：１５）、４８６５（配列番号：１１）及び４８１２（配列番号：１０）;並びに配列番号１８、配列番号１９、配列番号：２０、配列番号：２１及び配列番号：２２のいずれかの配列を有するプライマーからなる群から選択されたオリゴヌクレオチドプライマー。１８．細胞結合及び細胞侵入に関与し、４５〜６０ｋＤａの分子量を有する実質的に純粋なミコバクテリアタンパク質またはその断片の製造方法であって、請求項１２に記載のベクターによって宿主を形質転換する工程、形質転換された宿主を培養し、前記タンパク質またはその断片を発現させる工程、及び他のタンパク質性及び細胞性物質を含まない前記タンパク質またはその断片を単離精製する工程を有することを特徴とする製造方法。１９．前記断片が開始コドンに対して5'端部欠失を有する遺伝子を含むベクターから発現する請求項１８に記載の製造方法。２０．細胞結合及び細胞侵入に関与し、４５〜６０ｋＤａの分子量を有するミコバクテリアタンパク質及びその免疫原性断片。２１．結核菌複合体中のミコバクテリウム属菌株のものである請求項２０に記載のタンパク質及びその免疫原性断片。２２．前記ミコバクテリウム属菌株が、ヒト結核菌の菌株またはウシ結核菌の菌株である請求項２１に記載のタンパク質及びその免疫原性断片。２３．下記のアミノ酸組成：アミノ酸残基数ロイシン５３アルギニン３２トレオニン４５アラニン６０バリン４０セリン４３プロリン３８アスパラギン酸２９イソロイシン２４アスパラギン２３チロシン１６グリシン４５フェニルアラニン１４グルタミン酸１５リシン１５グルタミン１２トリプトファン７メチオニン７システイン６ヒスチジン３を実質的に有する請求項２０〜２２のいずれかに記載のタンパク質。２４．免疫原性の組成物であって、有効成分として、請求項１〜７のいずれかに記載の単離核酸分子の少なくとも１つ、請求項８〜１０のいずれかに記載の単離ＤＮＡ分子の少なくとも１つ、請求項１４に記載の組換えミコバクテリアタンパク質の少なくとも１つ、並びに請求項２０〜２３のいずれかに記載のタンパク質及びその免疫原性断片の少なくとも１つからなる群から選択された少なくとも１つの成分と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする免疫原性組成物。【図７】【図７】【図７】【図７】【図７】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 Ｍ 33/569 Ｆ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．ミコバクテリウム属菌(Mycobaterium)の細胞結合と細胞侵入に関与しており、そのフラグメントの分子量が約４５〜６０ｋＤａであるミコバクテリア由来タンパク質(mycobaterial protein)をコードしている分離した核酸分子。２．上記ミコバクテリウム属菌が結核菌複合体(tuberculosis complex)である請求項１に記載の核酸分子。３．上記ミコバクテリウム属菌がヒト結核菌(Mycobaterium tuberculosis)である請求項２に記載の核酸分子。４．上記ミコバクテリウム属菌がウシ結核菌(Mycobaterium bovis)である請求項２に記載の核酸分子。５．上記ミコバクテリア菌由来タンパク質が実質的に下記のアミノ酸構成である請求項１に記載の核酸分子。アミノ酸残基数ロイシン５３アルギニン３２トレオニン４５アラニン６０バリン４０セリン４３プロリン３８アスパラギン酸２９イソロイシン２４アスパラギン２３チロシン１６グリシン４５フェニルアラニン１４グルタミン酸１５リシン１５グルタミン１２トリプトファン７メチオニン７システイン６ヒスチジン３６．実質的に図５に示したような、ウシ結核菌株ＢＣＧの制限酵素地図または結核菌複合体由来の他のミコバクテリア菌に対応する制限酵素地図を有している請求項１に記載の核酸分子。７．図６に示したような、ウシ結核菌株ＢＣＧのＤＮＡ配列(SEQ.ID.No.2)または結核菌複合体由来のその他のミコバクテリアにおける対応遺伝子の配列を有する請求項１に記載の核酸分子。８．図７に示したようなウシ結核菌株ＢＣＧのアミノ酸配列(SEQ.ID.No.3)または結核菌複合体由来の他のミコバクテリアにおける対応配列をコードしている請求項１に記載の核酸分子。９．対のプライマーである４８７９(SEQ.ID.No:12)と４８８２(SEQ.ID.No:15)の１組、または４８７９(SEQ.ID.No:12)と４８６５(SEQ.ID.No:11)の１組,または４８７９(SEQ.ID.No:12)と４８１２(SEQ.ID.No:10)の１組、または、5'プライマー(SEQ.ID.No:19)と3'プライマー(SEQ.ID.No:18)の１組,または、5'プライマー( SEQ.ID.No:20)と3'プライマー(SEQ.ID.No:18)の１組，または5'プライマー(SEQ. ID.No:21)と3'プライマー(SEQ.ID.No:18)の１組、または、5'プライマー(SEQ.ID .No:22)と3'プライマー(SEQ.ID.No:18)の１組の配列を有する対になったプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅可能な分離ＤＮＡ分子。１０．結核菌複合体のミコバクテリウム株由来の請求項９に記載のＤＮＡ分子。１１．ヒト結核菌のミコバクテリア菌由来の請求項９のＤＮＡ分子。１２．ウシ結核菌のミコバクテリア菌由来の請求項９のＤＮＡ分子。１３．請求項１の核酸分子または請求項９のＤＮＡ分子から成る、宿主の形質転換のためのベクター。１４．上記タンパク質を上記宿主に発現させるＤＮＡ配列から成る請求項１３に記載のベクター。１５．請求項１４に記載の発現ベクターを含む形質転換された宿主。１６．請求項１５に記載の形質転換宿主により作製することができる細胞結合と細胞侵入に関与している組み換えミコバクテリアタンパク質または上記タンパク質のフラグメント。１７．ＡＴＣＣ寄託番号が９７５１１であるプラスミドpBCGcepX同定特性を有するミコバクテリウム属菌の細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア由来タンパク質をコードしている遺伝子を含むプラスミド。１８．（ａ）核酸分子またはＤＮＡ分子および試料中に存在するタンパク質をコードし、そのタンパク質と特異的にハイブリダイゼーションを起こすすべての核酸分子から成る複合体を作製するために、請求項１の核酸分子または請求項９のＤＮＡ分子を試料と接触させること、（ｂ）その複合体の産生を測定するステップから成り、試料中に、細胞結合と細胞侵入に関与しており、分子量が約４５〜６０ｋＤａであるミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている核酸が存在するかどうかを決定する方法。１９．（ａ）請求項１の核酸分子または請求項９のＤＮＡ分子、（ｂ）核酸分子またはＤＮＡ分子およびその試料の中に存在しているタンパク質をコードしており、その核酸分子またはＤＮＡ分子とハイブルダイゼーションを起こすことができるタンパク質から構成される複合体を作製するために、その核酸分子を試料と接触させる手段および（ｃ）その複合体の産生を測定し同定する手段から成る、試料中に、細胞結合と細胞侵入に関与しており、その分子量が約４５〜６０ｋＤａであるミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている核酸が存在するかどうかを決定する診断キット。２０．対になっているプライマーである４８７９(SEQ.ID.No.12)と４８８２(SEQ .ID.No.15)の１組、４８７９(SEQ.ID.No12)と４８６５(SEQ.ID.No.11)の１組、４８７９(SEQ.ID.No.12)と４８１２(SEQ.ID.No.10)の１組を提供すること、その試料をプローブと接触させること、細胞結合と細胞侵入に関与しているミコバクテリア菌由来タンパク質をコードしている増幅可能な核酸配列を増幅させるためにＰＣＲ増幅を実施すること、試料中のミコバクテリウム属菌の存在を示す増幅されたＤＮＡ配列を検出することから成る、組織や体液中のミコバクテリウム属菌を検出する方法。２１．請求項１４に記載のベクターで宿主を形質転換する請求項１４に記載の方法。２２．請求項１４に記載のベクターで宿主を形質転換すること、形質転換させた宿主を増殖してタンパク質とそのフラグメントを発現させること、タンパク質を他のタンパク質様の物質および細胞性物質から分離し精製することから成る、細胞結合と細胞侵入に関与しており、分子量が約４５〜６０ｋＤａである、実質的に純粋な組み換えミコバクテリア菌由来タンパク質を作製する方法。２３．開始コドンに5'端部切断部を有するベクターから上記フラグメントが発現される請求項２２に記載の方法。２４．分子量が約４５〜６０ｋＤａである、細胞結合と細胞侵入に関与している分離・精製したミコバクテリア菌由来タンパク質またはそのフラグメント。２５．結核菌複合体であるミコバクテリウム属菌株由来である請求項２４に記載のタンパク質。２６．ヒト結核菌である菌株由来である請求項２４に記載のタンパク質。２７．ウシ結核菌である菌株由来である請求項２４に記載のタンパク質。２８．請求項２２の手順により作製される請求項２４のタンパク質。２９．成分が実質的に下記のアミノ酸である請求項２４に記載のタンパク質。アミノ酸残基数ロイシン５３アルギニン３２トレオニン４５アラニン６０バリン４０セリン４３プロリン３８アスパラギン酸２９イソロイシン２４アスパラギン２３チロシン１６グリシン４５フェニルアラニン１４グルタミン酸１５リシン１５グルタミン１２トリプトフアン７メチオニン７システイン６ヒスチジン３３０．有効成分として、請求項１で記載された少なくとも１つの分離核酸分子、請求項９に記載された少なくとも１つのＤＮＡ分子、請求項１６に記載の少なくとも１個の組み換えミコバクテリア菌由来タンパク質および請求項２４に記載の少なくとも１つのタンパク質で構成されるグループから選択された少なくとも１つの成分と薬学的に受け入れ可能な担体から成る免疫原性成分。３１．宿主に、請求項３０に記載された免疫的に有効な量の免疫原性成分を投与する手段から成る宿主内に免疫応答を起こさせる方法。