JP2000516457A - ドパミン作動性ニューロンに対し生存促進活性を有するクロマフィン粒由来のｅｇｆ様因子および膠細胞由来の神経栄養因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ドパミン作動性ニューロンの生存促進に関連するクロマフィン粒由来のEGF様タンパク質、該タンパク質または機能的に活性なその誘導体またはその一部をコードするヌクレオチド配列、およびその調製方法に関する。本発明はさらに、ドパミン作動性ニューロンの生存を促進し得る膠細胞由来の神経栄養因子、該因子または機能的に活性なその誘導体またはその一部をコードするヌクレオチド配列、およびその調製方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ドパミン作動性ニューロンに対し生存促進活性を有するクロマフィン粒由来のＥ ＧＦ様因子および膠細胞由来の神経栄養因子 本発明は、ドパミン作動性(DAergic)ニューロンの生存促進に関連するクロマ フィン粒由来のEGF様タンパク質、該タンパク質または機能的に活性なその誘導 体またはその一部をコードするヌクレオチド配列、並びにそれらの調製方法に関 する。本発明はさらに、ドパミン作動性二ューロンの生存を促進し得る膠細胞由 来の神経栄養因子、該因子または機能的に活性なその誘導体またはその一部をコ ードするヌクレオチド配列、並びにそれらの調製方法に関する。 副腎髄質組織およびクロマフィン細胞を、パーキンソン病(PD)患者および該疾 患の動物モデルの線条に移植すると、顕著な治療効果を有し、伝達物質および運 動機能の回復をもたらす(概説として、Freed，1993;FisherおよびGage，1993を 参照)。これらの効果に対する一般的説明は、移植されたクロマフィン細胞が、 ドパミン(DA)を分泌することによって、PDでのこの黒質線条体伝達物質の実質的 な欠如を代償し得る（EhringerおよびHornykiew icz，1960)ということである。しかしながら、クロマフィン細胞で合成され放出 されるDAの量は少なく（成熟ラットでは総カテコールアミンの約１％；Coulter ら、1988)、線条DAの増加は、クロマフィン細胞移植の直後で非常にささやかで ある(BeckerおよびFreed，1988)。従って、DA以外の化学的伝達物質の放出は、 パーキンソン病の脳へのクロマフィン細胞移植の有利な効果の一因となり得るこ とが議論されてきた。病変化線条内に残った軸索の実質的な新芽形成(Bohnら、1 987；Kordowerら、1991)は、神経栄養分子またはサイトカイン誘発合成および神 経栄養分子の放出が、クロマフィン細胞移植の治療的効果の基礎となり得るとい う考察を生み出した。この認識は、クロマフィン細胞が、多数の神経栄養的に活 性な成長因子および神経ペプチドを合成し、貯蔵し、放出するという証拠の増加 から支持を受けている(Lachmundら、1994； びに概説としてUnsickerおよびKrieglstein，1996を参照)。コリン作動性アゴニ ストであるカルバコールによるクロマフィン細胞からの顆粒放出の刺激は、末梢 および中枢神経系の幾らかのニューロン・ポピュレーションに関する、神経栄養 因子活性の出現を増加することが示された(Lachmundら、1994)。脱分極に誘発さ れる神経栄養活性 物の分泌は、クロモグラニンA(chromogranin A)およびカテコールアミン類の増 加する放出によって並行にされ、クロマフィン粒からの共同放出を示唆する。 FGF-2は移植片の栄養効果を十分に模倣できる（OttoおよびUnsicker，1990，1 993a)ので、塩基性線維芽成長因子(FGF-2)は長い間、病変の黒質線条系に移植さ れたクロマフィン細胞の治療的作用の少なくとも幾つかに関連すると推測されて いた。しかしながら、FGF-2は、クロマフィン粒には局在せず、分泌の制御され た又は構成的経路を介して放出されない（Biegerら、1995；Stachowiakら、1994 )。 従って、本発明に横たわる技術的課題は、（中脳の）ドパミン作動性ニューロ ンの生存を促進し得、ヒトにおける末梢および／またはCNS-疾患の治療に使用さ れ得る、新しい化合物を提供することである。 これらの化合物は、クロマフィン粒由来のEGF様活性および／または膠細胞由 来の神経栄養因子、並びに機能的なその一部もしくは同じ機能を果たし、血液脳 関門を通ってその機能を果たすのに十分小さい化合物であり得る。 上記の技術的課題に対する解決は、請求の範囲に特徴付けられる実施態様によ って達成される。 特に、本発明は、ドパミン作動性ニューロン上で生存 促進活性を選択的に仲介するクロマフィン粒由来タンパク質に関する。用語「ク ロマフィン粒由来タンパク質」は、単独または組合せて適用されるとき、ドパミ ン作動性ニューロンに対して栄養性、生存性および分化促進性効果を発揮する、 単一の定義されたタンパタ質を指す。「ドパミン作動性ニューロンに対する選択 的生存促進活性」という表現は、それ自身またはクロマフィン粒に存在する他の 因子と組合せて、ドパミン作動性ニューロンに対して、ナノモル範囲以下で、生 存および分化を付与し得るタンパク質性活性を指す。 本発明の好ましい実施態様では、クロマフィン粒由来タンパク質は、表皮成長 因子レセプター(EGFR)-リガンドであり；即ち、クロマフィン粒由来タンパク質 は、ナノモル範囲の濃度で効果を発揮する。 本発明のさらに好ましい実施態様では、クロマフィン粒由来タンパク質は、大 膠細胞成熟を促進し得る。「大膠細胞成熟をし得る」という表現は、胚中脳細胞 の培養システム内で又は胚および成熟体の中脳において、タンパク質が、この細 胞タイプに特異的であるタンパク質の発現によって視覚化される大膠細胞の数を 増加させることを意味する。 本発明のさらに好ましい実施態様では、クロマフィン 粒由来タンパク質は、膠先祖細胞であると推定される非ドパミン作動性細胞の増 殖を誘発し得る。「非ドパミン作動性細胞の増殖をし得る」という表現は、大膠 先祖細胞と推定される数の拡大が、「クロマフィン粒由来タンパク質」により初 期に引き起こされる効果であることを意味する。この初期の効果は、拡大した数 の大膠細胞により分泌される因子による、生存促進の要件であると推定される。 本発明のさらなる主題は、上記のクロマフィン粒由来タンパク質の調製方法で あって、該方法は、クロマフィン細胞からクロマフィン粒を単離する工程、およ びクロマフィン粒由来タンパク質を含む水溶性タンパク質内容物を緩衝溶液中の クロマフィン粒から抽出する工程を包含する。「クロマフィン細胞からクロマフ ィン粒を単離する」という表現は、1.7Mショ糖の密度勾配遠心による、クロマフ ィン細胞オルガネラの細胞より小さい分画化を含む。「クロマフィン粒由来タン パク質を含む水溶性タンパク質内容物を抽出する」という表現は、10mMリン酸緩 衝液中、pH7.0中の1.7Mショ糖遠心のペレットとして得られるオルガネラの次の2 0分間-80℃での凍結の溶解を包含する。 本発明のさらなる主題は、ドパミン作動性ニューロン の生存を促進し得る神経栄養因子に関し、該因子は、 (a)単離されたクロマフィン粒から水溶性タンパク質内容物を抽出し、上述の クロマフィン粒由来タンパク質を得ること、および (b)培養された膠細胞をクロマフィン粒由来タンパク質で処理して、培養培地 中に神経栄養因子を得ること、 を包含する工程により得ることができる。 「培養されたドパミン作動性ニューロンをクロマフィン粒由来タンパク質で処 理する」という表現は、組織の酵素的および機械的解離を含む慣用されている細 胞単離工程による、例えば齧歯類胚中脳から単離されたドパミン作動性ニューロ ンを指す。用語「培養培地」は、ドパミン作動性ニューロンの培養に好適な任意 の培地を指す。その例は、インシュリン、プロゲステロン、プトレシン(putresc ine)、およびトランフェリン(tranferrin)のような明確な添加剤で補足されたDM EMおよび他の培養培地である。 本発明のさらなる主題は、上記クロマフィン粒由来タンパク質または上記の神 経栄養因子または機能的に活性なその誘導体もしくはその一部の一次アミノ酸配 列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。用語「機能的に活性な誘 導体」および「機能的に活性な一部」 は、(i)ドパミン作動性ニューロンに対する選択的生存促進活性、(ii)大膠細胞 成熟の能力、(iii)非ドパミン作動性細胞の増殖能力、および(iv)ドパミン作動 性ニューロンの生存促進能力から選択される少なくとも１種の機能を発揮するタ ンパク質性化合物を指し、または該タンパク質性化合物はEGFR-リガンドである 。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、実質的にデオキシリボヌクレオ チドおよび／またはリボヌクレオチドを含む、内因性に発現された、半合成性の 、合成性の又は化学的に修飾された核酸分子を指す。さらに、用語「ヌクレオチ ド配列」は、そのヌクレオチド配列が一次アミノ酸配列をコードし、遺伝暗号に 基づいて同義性であり得るエクソンを含み得る。用語「一次アミノ酸配列」は、 三次および四次のタンパク質構造に無関係に、アミノ酸の配列を指す。 本発明の好ましい実施熊様では、上述の核酸は、実質的にデオキシリボヌクレ オチドからなる。 本発明の他の実施態様は、上記の核酸を含むDNAおよび／またはRNAベクターに 関する。用語「ベクター」は、上記のヌクレオチド配列の増幅および／または発 現に使用され得るDNAおよび／またはRNAレプリコンを指す。該ベクターは、配列 の３つの主要な領域内に、その発現制御 に役割を果たすプロモーター、エンハンサー、または配列の他のストレッチのよ うな任意の有用な制御ユニットを含み得る。 本発明の他の実施態様は、上記定義されたような核酸またはベタターを含む宿 主生物に関する。用語「宿主生物」は、ウイルス、細菌、真菌、植物または哺乳 動物もしくはその細胞のような部分を含む。 本発明のさらなる主題は、上記定義されたクロマフィン粒由来タンパク質また は上記の神経成長因子の調製方法であって、該方法は、上述のようなそれぞれの 宿主生物を適切な条件下で培養し、当分野で公知の手順に従って培養細胞および ／または培地から所望の産物を単離することを包含する。 本発明のさらなる主題は、上記のクロマフィン粒由来タンパク質および／また は上記の神経栄養因子を、必要に応じて薬学的に許容される担体および／または 希釈剤とともに含む、薬学的組成物に関する。該薬学的組成物は、ヒトにおける パーキンソン病、アルツハイマー病または他の痴呆のような末梢および／または CNS疾患、他の中枢神経系の神経変性疾患および糖尿病、シスプラチニウム(cisp latinium)あるいは他の遺伝性もしくは後天性末梢神経疾患を含む末梢神経障害 の処置に使用され得る。 本発明のさらなる主題は、クロマフィン粒由来の上記の因子を、ニューロトロ フィン(neurotrophin)、TGF-βのメンバー、線維芽細胞成長因子、およびニュー ロポイエティック・サイトカイン・スーパーファミリーのような既に発見された 神経栄養分子と組合せた適用を含む。 図面は、以下を示す： 図１． ウシクロマフィン粒の代表的調製物の電子顕微鏡写真。棒=1μｍ。 図２． THに対するモノクローナル抗体で染色した培養物中の８日後の、ラッ トE14腹側中脳細胞の解離培養物の光学顕微鏡写真。培養物は、コントロール培 養物および、1:20希釈のクロマフィン粒由来タンパタ質(VP)、FGF-2(10ng/ml)、 またはTGF-α(20ng/ml)で処理された培養物であった。棒=25μｍ。 図３． クロマフィン粒由来活性の生存促進効果は、タンパタ質による。培養 物は、クロマフィン粒由来タンパク質(VP)を1:20の希釈で播いた後24に開始し、 ７日間処理した。姉妹培養物を、同量の熱不活化クロマフィン粒由来タンパク質 (VP熱)またはトリプシン消化クロマフィン粒由来タンパク質(VPトリプシン)で処 理した。各棒は、２つの実験からの三重培養物+/-SEMでカウントされたTH陽性細 胞の平均数を示す。グループ間の差異は、^{** *} P＜0.001で有意と考えられた。 図４． コリン作動性刺激により、ウシクロマフィン細胞は、ドパミン作動性 ニューロンに関する生存促進活性を培地中に放出する。ラットE14腹側中脳細胞 から確立された培養物を、播いた後24に開始し、カルバコール刺激クロマフィン 細胞からの馴化培地、またはカルバコールを含まない非刺激クロマフィン細胞か らの馴化培地(コントロール)、またはカルバコール(10^-5M)含有培養培地で、７ 日間処理した。各棒は、２つの実験からの四重培養物+/-SEMでカウントされたTH 陽性細胞の平均数を示す。^*P＜0.05。 図５． ８日間培養の終わりでの、中脳培養物(E14)のTH免疫応答性ニューロ ンの生存に対するクロマフィン粒由来活性(VP)の用量依存曲線。培養物を、VPに より、1:10、1:20、1:50および1:200の希釈で、またはFGF-2(10ng/ml)で処理し た。結果は、２つの繰り返し実験からの三重測定の平均+/-SEMである。^*P＜0.05 、^***P＜0.001。 図６． クロマフィン粒由来活性の生存促進効果は、エンケファリンまたは神 経ペプチドYによるものではない。培養物は、Leu-エンケファリン(Leu-ENK)、Me t-エンケファリン(Met-ENK)、神経ペプチドＹ(NPY)を100ng/mlで、またはクロマ フィン粒由来タンパク質(VP)を1:20の希釈で 播いた後24に開始し、７日間処理した。各棒は、２つの実験からの三重培養物+/ -SEMでカウントされたTH陽性細胞の平均数を示す。 図７． ³H-DA、³H-GABA-、および³H-セロトニン取込み(A)並びにセロトニン 免疫応答性ニューロン(B)の生存を、８日間培養の終わりに、中脳培養物(E14)に 関して示す。1:20の希釈における、クロマフィン粒由来タンパク質(VP)の効果を 記録する。取込み研究のコントロールを、100パーセントにセットした。結果は 、２つの実験からの三重測定の平均+/-S.E.M.である。^*P＜0.05、^**P＜0.01。 図８． ラットE14腹側中脳床の解離培養物の培養８日後の顕微鏡写真。上部 パネルは、GFAPに対するモノクローナル抗体での染色を示す；中間のパネルは、 BrdUに対するモノクローナル抗体を用いたBrdU取込みの視覚化を示す。下部のパ ネルは、TH(赤)およびBrdU(緑)に関して、ヨウ化プロピジウム（左）および（右 ）二重標識を用いた、核染色を示す。左側に示される培養物は、コントロール培 養物を示す；右側のパネルは、1:10希釈でVP処理された培養物である。棒=25μ ｍ。 図９． 中脳培養物(E14)の生存TH免疫応答性ニューロンの、８日間培養の終 わりでの数。抗分裂剤FDURおよびグリオトキシンAAを、コントロール培養物、ま たは1:50 希釈でVP処理した培養物中で、それぞれ30μＭ濃度で使用した。結果は、２つの 実験の三重測定の平均+/-S.E.M.である。 図１０． 中脳培養物(E14)の生存TH免疫応答性ニューロンの、８日間培養の 終わりでの数。培養物は、DIV1-DIV8(VP)からの1:20希釈でのクロマフィン粒由 来タンパク質、または次いでDIVI-DIV4(VP/DIV1-4)培養培地のみで処理、または VP馴化培地(VP-CM)での処理のいずれかで処理された。結果は、２つの実験の三 重測定の平均+/-S.E.M.である。^**P＜0.01、^***P＜0.001。 図１１． クロマフィン粒由来タンパク質(VP)のドパミン作動性ニューロンに 対する生存促進効果は、EGFRシグナル化経路のインヒビターであるDAPHを用いる と、廃され得る。E14ラット腹側中脳由来の培養物を、10μＭのDAPHの不存在下 または存在下に、1:50希釈のVPで処理した。非処理培養物は、コントロールとし ての役割を果たした。DIV6に、培養物を固定し、GFAPまたはTH免疫応答性のため に処理した。TH陽性細胞白棒の数は、２つの繰り返し実験の三重測定の平均+/-S .E.M.で示され、GFAP陽性細胞の数は、２つの繰り返し実験の２つの測定の平均 で示される。 図１２． クロマフィン粒由来タンパク質、またはTG F-αに誘発されるがFGF-2に誘発されないGFAP陽性大膠細胞の出現は、EGFRシグ ナル化経路インヒビターであるDAPHによって阻害され得る。E14ラット腹側中脳 由来の培養物を、10μＭのDAPHまたはチルホスチンB56(Tyrphostin B56)(右パネ ル)の不存在下(左パネル)または存在下に、1:50希釈でのVP、10ng/mlのFGF-2ま たは2Ong/mlのTGF-αで処理した。DIV6に、培養物を固定し、TH(上部パネル)ま たはGFAP免疫応答性のために処理して、その後DAB視覚化した。棒=25μｍ。 図１３． RT-PCRによって検出された中脳細胞培養物(DIV8)中のGDNFの発現。 -レーンは、トータルRNAが転写されなかったコントロールを示し、+レーンは、c DNAを示す。GDNF(700塩基対)に関する陽性シグナルは、B49神経膠腫細胞から得 られるが、VP処理した若しくは非処理の中脳細胞培養物からは得られない。 図１４． クロマフィン粒由来タンパク質は、MPP+毒性に対して保護する。MP P+(1μＭ)、またはVP１:20と組合せたMPP+で処理後の生存TH+ニューロンのパー センテージを示す。コントロールを、100%としてセットした。結果は、２つの繰 り返し実験の三重測定の平均+/-S.E.M.である。^*P＜0.05。 図１５． ヘパリン・セファロース上での、クロマフ ィン粒タンパク質の精製のクロマトグラム。 図１６． ヘパリン・セファロースのクロマトグラフィー後のタンパク質分画 を用いた、中脳培養物(E14)の生存TH免疫応答性ニューロンの、８日間培養の終 わりでの数。 図１７． RP-HPLCを用いた、クロマフィン粒タンパク質の精製のクロマトグ ラム。 下記の実施例は、本発明を例示する： 培養培地、成長因子および化学物貰。使用された血清を含まない培地は、ダル ベッコ変法イーグル培地およびHam's F-12(DMEM/F-12、BioWhittaker)からなり 、N1補足物(Bottensteinら、1980)アポトランスフェリン、インシュリン、L-チ ロキシン、亜セレン酸ナトリウムおよびプロゲステロン(Sigma、ダイデショーヘ ン、ドイツ)、および2.5mMグルタミン(GIBCO、エッゲンシュタイン、ドイツ)、2 .5mg/mlウシ血清アルブミン(Sigma)、100U/mlペニシリン、100μｇ/mlストレプ トマイシン、および0.25μｇ/mlフンギゾン(BioWhittaker、ハイデルベルク、ド イツ)を含む。カルシウム-マグネシウムを含まないハンクス平衡塩類溶液(CMF) 、ウマ血清、トリプシン、5-フルオロデオキシウリジン(FDUR)、およびα-アミ ノアジピン酸(AA)はシ グマから、DNAseはベーリンガーからのものであった。4,5-ジアニリノフタルイ ミド(DAPH)およびチルホスチンB56(Calbiochem、バートソーデン、ドイツ)を、D MSOに溶解し、最終濃度10mMとし、光から保護し、使用するまで4℃で貯蔵した。 FDURおよびAAを、PBSに溶解し、最終濃度1mMとし、アリコート中-20℃で貯蔵し た。 カットオフMW3,500を有するSpectrapor透析チューブ(Roth、カールスルーエ、 ドイツ)を使用した。成長因子：rh EGF-2、rh TGF-α、rh EGF(IC Chemikalien 、イスマニンゲン、ドイツ)。凍結乾燥した成長因子を、0.25% BSAおよびペニシ リン、ストレプトマイシン、およびフンギゾン(fungizone)を所与の濃度で含むD MEMに再懸濁し、最終濃度1μｇ/mlとした。100μｌのアリコートを、使用するま で-70℃で維持した。 可溶住クロマフィン粒内容物の単離。単離手順は、本質的に、WinklerおよびS mith(1975)のプロトコールに従う。簡単に述べると、ドイツ、マンハイムの屠殺 場から得た約60個のウシ副腎を、切開し、髄質を0.3Mショ糖、10mMリン酸緩衝液 、pH7.0にプールし、ホモジナイズし、15分間380gで遠心分離し、その後8,720g で20分間上清の遠心分離をした。ペレットは、全オルガネラを含むことが公知で あり、それらは更にショ糖勾配で分画され得る。 大きい密なコアの小胞であるクロマフィン粒を精製するために、再懸濁ペレット (0.3Mショ糖、10mMリン酸、pH7.0)を1.7Mショ糖クッションにロードした。クロ マフィン粒を、100,000gで90分間遠心した後、沈降物として得た。沈降物を、10 mMリン酸pH7.0に再懸濁し、液体窒素中で凍結し、続いて解凍して、小胞を溶解 し可溶性タンパク質内容物を抽出した。膜フラグメントを、100,000gで30分間遠 心して集めた。クロマフィン粒からの可溶性タンパク質混合物を含む上清を、10 0倍過剰の10mMリン酸緩衝液pH7.0の幾つかのバッチに対して終夜透析し(カット オフ3,500MW)、タンパク質からカテコールアミン類および他の低分子量成分を分 離した。タンパク質濃度を定量するために、ウシガンマグロブリン(Bio-Rad)を 標準として用いるブラドフォード(Bio-Rad)タンパク質アッセイを行なった。タ ンパク質溶液を希釈して、最終タンパク質濃度20mg/mlを得た。続いて、このタ ンパク質溶液を、滅菌濾過(0.22μＭ)し、アリコート中で-70℃で貯蔵した。ヘ パリンーセファロース(Econo-Pac Heparin Cartridge、5ml BioRad)上クロマト グラフィーのために、精製した顆粒を、100mM NaCl、10mM Tris、0.1% Chaps pH 7.3にロードした。同じ緩衝液で洗浄した後、10mM Tris、0.1% Chaps pH7.3中、 100mM NaCl〜1M NaClの勾配を用いて溶出 した。集められた分画を、ランニング緩衝液A(0.1TFA)およびランニング緩衝液B (0.1% TFA/90%アセトニトリル)を用いて、Aquapore RP-300カラム、7ミクロン、 Applied Biosystems上の逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)により脱塩した。生 物学的活性の測定のために、凍結乾燥されたサンプルを、20μlの50%アセトニト リルに再懸濁し、それぞれの培地交換のときに2ml培地当り5μｌで培地に加えた 。加熱不活化は、タンパク質サンプルを90℃に30秒間、3回加熱して達成した。 アリコートを、0.1%トリプシンで、37℃で１時間消化した。消化は、50μｌPBS に溶解した100μｇダイズトリプシンインヒビターを加えて止めた。 電子顕微鏡写真。単離されたクロマフィン粒をペレット化し、リン酸緩衝液(p H7.4)中1.5%ホルムアルデヒおよび1.5%グルタルアルデヒドで、その後1.5％ヘキ サシアノ鉄(II)酸カリウム中1%四酸化オスミウムで固定した。1%酢酸ウラニル水 溶液中でブロック染色し、エタノール中の脱水後、ペレットをEpon中に包埋し、 LKBウルトラトームIII上で切片化し、Zeiss EM10電子顕微鏡で観察した。 組織培養。中脳細胞培養物を、本質的にKrieglsteinおよびUnsicker(1994)に 記載されるように確立した。簡単に述べると、腹側中脳床を、２同腹子(20-25胚 )の胚日 (E)14 Wistarラット胎児から切除し、CMF中で集めた。組織片を、CMF中0.25%ト リプシン(BioWhittaker)を15分間37℃で用いて、酵素的に解離した。等量の氷冷 ウマ血清および1mg DNAseを添加した後、細胞を、炎研磨しシリコン化(siliconi zed)したパスツールピペットで粉砕し、その後DMEM/F12で洗浄した。単一細胞懸 濁液(100μｌ)を、ポリオルニチン（15mMホウ酸緩衝液pH8.4、シグマ、中0.1mg/ ml)-ラミニン(5μｇ/ml；シグマ)でコートしたガラス製カバースリップ上に、密 度200.000細胞/cm²で播いた。カバースリップを、湿潤化5% CO₂/95%空気雰囲気 中でインキュベートし、細胞を接着させる。２時間後、カバースリップを、750 μｌ培地を含む24ウェルプレート(Falcon)に移した。翌日、およびその後は３日 毎に、500μｌの培地を交換し、神経栄養因子を同時に所与の濃度で加えた。 ウシクロマフィン細胞を、既に記載されたようにコラゲナーゼ灌流および消化 によって単離し、パーコール勾配遠心(Unsickerら、1980；Biegerら、1995)を用 いて＞95%純度に濃縮した。クロマフィン細胞を、プラスチック培養フラスコ(Fa lcon；25cm²当り5×10⁶)上に200,000細胞/cm²で播き、5mlのN1補足物を含むDMEM 中で40時間維持した。予め温めてあった培地で細胞を洗浄した後、コリ ン作動性アゴニストであるカルバコール(10^-5M)を含む2ｍl DMEM/N1に細胞を15 分間曝し、他方で、コントロール培地をセタレタゴグ(secretagogue)(Lachmund ら、1994と比較)を含まない以外は同様にして処理した。刺激した細胞および非 刺激細胞からの馴化培地を、アリコート中で-80℃で貯蔵して、凍結と解凍の繰 返しを回避し、中脳ドパミン作動性ニューロンの培養物に1:4希釈で適用した。 免疫細胞化学。ドパミン作動性またはセロトニン作動性ニューロンを同定する ために、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、またはセロトニンそれぞれに対する抗 体を用いて、細胞を視覚化した。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で緩衝 化された4%パラホルムアルデヒドで、10分間室温で固定し、アセトンで-20℃で1 0分間透過性にし、(PBS)で洗浄した。PBS中1% H₂O₂で、その後1%ウマ血清でブロ ックした後、ラットTH(1:200；Boehringer Mannheim；1%ウマ血清に希釈)に対す るモノクローナル抗体またはセロトニンに対する抗体(1:50；DAKO)を用いて、カ バースリップを1時間37℃で染色した。特異的染色を、抗マウスVectastain ABC キットをDAB(Camon、ドイツ)と組合せて用いて視覚化した。膠細胞の繊維性酸性 タンパク質(GFAP)免疫細胞化学のために、細胞を固定し、アセトンを-20℃で20 分間用いて透過性にし、その後PBSで洗 浄し、GFAP(1:100；Sigma)に対するモノクローナル抗体とともに37℃で１時間イ ンキュベートした。二次抗体として、TRITC抗マウス-IgGを使用した。細胞増殖 をモニターするために、ブロモデソキシウリジン(BrdU)を、固定より24時間前に 、最終濃度10μＭで培養物に加えた。細胞を、PBSで２回洗浄し、50mMグリシン 、pH2.0で緩衝化された70%エタノールで、20分間-20℃で固定した。取込まれたB rdUを、抗BrdU検出キットＩ(ベーリンガー、マンハイム)を用いて同定した。Brd U/TH二重検出は、先ずBrdUのプロトコールを適用し、その後、さらに５回PBS洗 浄した後に、TRITC抗マウスIgGを二次抗体として用いるTH染色の手順により達成 された。核は、ヨウ化プロピジウム(20秒、0.1μｇ/ml)で染色した。カバースリ ップを、Aquatex(Merck、ダームシュタット)を用いてマウントした。 伝達物質の取込み研究。³H-DA、³H-GABAおよび³H-セロトニン(Amersham)の高 アフィニティ取込みを、AlexiおよびHefti(1993)に記載される修飾法に従い測定 した。細胞を、インキュベーション溶液（PBS中5mMグルコースおよび1mMアスコ ルビン酸、pH7.4)で３回洗浄し、0.5mlのインキュベーション溶液で15分間37℃ でプレートインキュベートし、50nM ³H-GABAまたは³H-セロトニンを加える前に 更に15分間インキュベートした。細胞を4℃でインキュベ ーションして、ブランクを得た。インキュベーション混合物を取り除いて取込み を停止させ、その後に氷冷PBSで３回迅速に洗浄した。続いて、300μｌの蒸留水 を加え、培養物を２時間-80℃で凍結し、解凍し、そして細胞をさらに200μｌの 蒸留水で２回擦り取った。10mlのシンチレーション・カクテルを各バイアルに加 えた後、抽出された放射能を液体シンチレーション・スペクトロメトリーで測定 した。 MPP⁺,5-フルオロデオキシウリジン、およびα-アミノアジピン酸による培養物 の処理。N-メチル-4-フェニルピリジニウムイオン(MPP⁺；RBI)を、４日目に中脳 細胞培養物に最終濃度１μＭで48時間加えた。続いて、毒素を、新鮮な培養培地 で最後の48時間置き換えた。クロマフィン粒タンパク質による処理は、毒素添加 より24時間前に開始し、実験が終わる（８日目）まで続いた。 5-フルオロデオキシウリジン(FDUR、Sigma)、またはα-アミノアジピン酸(AA 、Sigma)は、それぞれの培地の交換と組合せて最終濃度30μＭで培地に加えた(0 'Malleyら、1994)。 細胞数の評価。ドパミン作動性ニューロンの生存を、カバースリップの対角ス トリップ中で100倍の倍率で、全TH陽性ニューロンをカウントして評価した。こ の領域は、 全領域の12%に対応した。定量は、少なくとも２つの独立した実験で、三重で為 された。GFAP陽性細胞の数を、同様に評価した。 RT-PCR。クロマフィン粒タンパク質で処理した又は非処理の中脳細胞培養物の DIV 8に、酸グアニジウムチオシアネート/フェノール/クロロホルム抽出により1 0個のウェルからトータルRNAを単離し、プールした(2×10⁶個の細胞に対応する) 。次の成分：2.5μｇのトータルRNA、50mM Tris-HCl(8.3)、75mM KCl、3mM MgCl 2、10mMジチオスレイトール、5mM dNTPs、25mMオリゴ(dT)プライマー(Gibco)、2 0単位のRNaseインヒビター(Boehringer)、および200単位のSuperScript RNase H^- 逆転写酵素(Gibco)を用いて、cDNAを最終体積20μｌ中で合成した。混合物を、 37℃で60分間インキュベートした。PCRを、cDNA(625ngのトータルRNAから作製さ れた)、10mM Tris-HCl(pH8.8)、10mMKCl、2.5mM MgCl₂、0.002% Tween 20、0.2m M dNTPs、1μＭ 5'プライマー、1μＭ 3'プライマー、および1.5単位のUITma DN Aポリメラーゼ(Perkin Elmer)を含む全体積25μｌ中で、製造者の指示に従いPer kin Elmer GeneAmp PCRシステム9600で、ホットスタート技術を用いて行なった 。増幅工程は、94℃で１分間変性、GDNFプライマーで2分間60℃でアニーリング 、および72℃で3分間伸長を包含 した。PCR混合物のサンプル(5μｌ)を、臭化エチジウムの存在下に、2%アガロー スゲル中で電気泳動して分析した。GDNFプライマーを、Schaarら(1993)に記載さ れるように使用し、PCR産物の予想サイズは700塩基対であった。B49細胞から単 離されたRNA、膠細胞系GDNFは最初に(Linら、1993)から単離され、GDNF増幅の陽 性コントロールとして使用された。 統計。データを、一方向ANOVAで分析し、グループ間較差の有意性をStudent式 t検定を適用して決定した。較差は、^*P＜0.05、^**P＜0.01、^***P＜0.001で有意 と考えられた。 クロマフィン粒の精製および純度の評価 ウシのクロマフィン粒を、本質的にWinklerおよびSmith(1975)のプロトコール に従って調製した。顆粒分画を示す得られたペレットを、電子顕微鏡で分析して 、他のオルガネラの混入を検出した。クロマフィン粒調製物の代表的な顕微鏡写 真を、図１に示す。電子顕微鏡写真による分析は、それらの密度および約280nm のサイズから同定して、これらの調製物が本質的に、大きい密なコアの顆粒から なることを明らかにした。顆粒を、低塩緩衝液を用いて破裂させ、可溶性タンパ ク質のみを溶出すると、 それらは膜結合していなかった。カテコールアミン類および他の小さな成分を希 釈して出すために、広範囲な透析を行ない、Winklerら(1986)によって注意深く 分析されたタンパク質混合物を生じた。クロマフィン粒の顕著なタンパク質成分 は、クロモグラニンAおよびB、エンケファリン、神経ペプチドY、およびドパミ ン-β-ヒドロキシラーゼであった(示されていない)。 可溶性クロマフィン粒タンパク質はインビトロでドパミン作動性ニューロンの生 存を促進する ドパミン作動性ニューロンに対するクロマフィン粒タンパク質の可能性のある 生存促進効果を評価するために、1:20希釈のこの混合物で培養物を処理し、１日 目にインビトロで(DIV 1)処理を開始した。図２は、クロマフィン粒由来のタン パク質が、コントロール培養物と比較して、培養８日後に、より多くのTH陽性ニ ューロンを明確に維持することを示す。この効果は、飽和濃度のFGF-2(10ng/ml) またはTGF-α(2Ong/ml)で培養物を処理して見られるものに比肩し得る。 この生存促進効果が、実際にタンパク質成分によるものであることを証明する ために、タンパク質サンプルを熱およびトリプシンとともにインキュベートした 。２つの手順のいずれかは、生存促進効果を廃し（図３）、クロ マフィン粒から単離された神経栄養活性がタンパク質であることを示す。 ドパミン作動性活性はカルバコールでの刺激によってクロマフィン細胞から放出 される ドパミン作動性活性はクロマフィン粒に貯蔵され放出されるという証拠を示す ために、ウシのクロマフィン細胞で馴化された培地を、E14中脳ドパミン作動性 ニューロンの培養物に適用した。コリン作動性アゴニストであるカルバコール(1 0^-5M)で刺激された細胞からの馴化培地は、TH陽性ニューロンの生存を、DIV 8に 、コントロール値(非刺激細胞の馴化培地)の141.9+/-13.5%に増加させた(n=4； 図４)。カルバコールを含む培養培地は、有効ではなかった(図４)。従って、ク ロマフィン粒は、中脳のドパミン作動性ニューロンを支持する神経栄養活性物を 貯蔵し放出する。 ドパミン作動性ニューロンのクロマフィン粒タンパク質に仲介される生存の用量 依存性 クロマフィン粒タンパク質の神経栄養効果の定量は、1:20希釈で最大の生存促 進効果を示し、1:10希釈を用いると更に増加され得なかった。1:50希釈で、IC₅₀ に到達した(図５)。 クロマフィン粒タンパク質の栄養効果はクロマフィン粒 に含まれる神経活性の神経ペプチドによるものではない 幾つかの栄養活性を有することが公知（Unsickerおよび 観察された効果を模倣し得るかどうか調べるために、神経ペプチドY、Leu-およ びMet-エンケファリンを、中脳ドパミン作動性ニューロンの生存促進能力につい て分析した。しかしながら、100ng/mlまでの濃度を用いると、これらの神経ペプ チドは、いかなる生存促進活性も有しなかった(図６)。 クロマフィン粒タンパク質の栄養効果はドパミン作動性ニューロンに選択的であ る ドパミン作動性ニューロンは、使用された細胞培養システム並びにインビボの 中脳において、ニューロン・ポピュレーションの5-10%の割合を占める。非ドパ ミン作動性ニューロンは主としてGABA作動性であるが、セロトニン作動性ニュー ロンも殆どない。クロマフィン粒タンパク質の生存促進効果の選択性を分析する ために、DA、GABAおよびセロトニンの取込みに対するその効果を、ドパミン作動 性ニューロンに関するGDNFの選択性を立証するのに使用される確立されたプロト コール(Linら、1993)に従って調べた。図７ａに示されるように、³H-GABA取込み ではなく、³H-DAおよび³H-セロトニン取込みが、クロマ フィン粒タンパク質を含む培養物の処理によって影響された。セロトニン陽性ニ ューロンの数は、有意に変化しなかったので(図７ｂ)、セロトニン取込みの増加 は、クロマフィン粒タンパク質の生存促進効果によるものではなかった。 クロマフィン粒タンパク質の栄養効果は大膠細胞成熟および非ドパミン作動性細 胞の増殖を伴う 培養されたドパミン作動性ニューロンの生存を支持すると報告された分子は、 ２グループに属するように見える。１つのカテゴリーは、大膠細胞の数を拡大す ることによってその効果を発揮し、他のグループは明らかに、ドパミン作動性ニ ューロンに対してより直接的に作用する(Unsickerら、1996)。ドパミン作動性ニ ューロンのクロマフィン粒タンパク質に仲介される生存のメカニズムを明確にす るために、細胞増殖および膠細胞分化を研究した。最初に、大膠細胞の存在を、 培養期間の終わりに、GFAPに対するモノクローナル抗体を用いて分析した。任意 の大膠細胞が、非処理コントロール培養物中にDIV8に検出されたとしても、非常 に少数であった(図８)。クロマフィン粒タンパク質処理した培養物は、GFAP陽性 細胞の劇的な増加を示した(図８)。細胞増殖をモニターするために、BrdUを培養 物に適用し、細胞サイクルのS期の間 に取込まれるようにし、BrdUに対するモノクローナル抗体を用いて検出した。コ ントロール培養物は、非常に少量の細胞の核中にBrdUの取込みを示したが、クロ マフィン粒タンパク質で処理された培養物は、豊富な標識された核を示した（図 ８）。BrdUおよびTHに対する抗体による二重標識は、TH⁺細胞がBrdUを決して取 込まないことを示した（図８）。これらのデータは、クロマフィン粒からの活性 が、膠芽細胞に対して(恐らく、培養物中に存在する他の細胞に対しても)分裂促 進性であり、GFAP陽性大膠細胞になる膠芽細胞の成熟を誘発することを示す。 クロマフィン粒タンパク質の栄養効果は細胞増殖および大膠細胞の誘発によって 仲介される 抗分裂剤5-フルオロデオキシウリジン(FDUR)、および膠細胞毒素アミノアジピ ン酸(AA)の濃度30μＭによる処理は、同様の細胞培養システム(O'Malleyら、199 4)を用いると、細胞増殖および大膠細胞成熟を効率的に阻害することが既に示さ れていた。増殖をブロックし、クロマフィン粒由来活性の生存促進効果を恐らく 廃するために、抗分裂処理を使用した。クロマフィン粒タンパク質(1:50)の半最 大濃度は、30μＭ FDUR、またはAAそれぞれと組合せて使用された。処理はDIV1 に開始し、DIV8に培養物をTHおよびGFAP免疫細胞化学のために処理した。図９に 示されるように、両方の処理は、基本的生存に影響することなしにクロマフィン 粒タンパク質の生存促進効果を廃し、毒性の副作用を除外した。これらのデータ は明らかに、クロマフィン粒タンパク質の生存促進効果が、この培養物中で細胞 ポピュレーションの数的拡大を要求することを示し、最も確からしくは、その後 にGFAP陽性大膠細胞に成熟する膠芽細胞である。 クロマフィン粒タンパク質の栄養効果は培養システムに存在する細胞タイプによ って合成される神経栄養分子（「神経栄養因子」）によって仲介される。 中脳ドパミン作動性ニューロン培養物を通常のようにセットアップし、クロマ フィン粒タンパク質(1:20)による処理は、播いた24時間後に開始し、72時間(DIV 1-DIV4)であった。この時点で、全培養培地を取り除き、血清を含まない培地で 置き換えた、該培地は集められ、48時間毎に交換された(DIV6およびDIV8)。これ らの培地(4℃で貯蔵)を、プールし、「クロマフィン粒タンパク質馴化培地(VP-C M)」と名付けた。次に、新らしく確立されたドパミン作動性ニューロン培養物を VP-CMで処理し、DIV1に開始し、２つの更なる培養培地の交換がDIV4とDIV6にあ り、最後にTHおよびGFAP免疫細胞化学のためにDIV8に処理した。図10に示される ように、７日間ではなく３日間クロ マフィン粒タンパク質で培養物を処理すると、それでもDIV8で有意な生存促進効 果を引き起こした。より重要なこととして、クロマフィン粒馴化培地(VP-CM)で 処理した培養物からの馴化培地は、ドパミン作動性ニューロンに対する比肩し得 る生存促進効果を生じた。この効果は、大膠細胞の増加を伴わなかった。従って 、クロマフィン粒タンパク質は、第１段階で、大膠細胞成熟を引き出し、神経栄 養因子の産生および／または放出をもたらし、該因子は第２段階でドパミン作動 性ニューロン生存を支持する。 生存促進および栄養効果はクロマトグラフィー法によるクロマフィン粒タンパク 質の精製後でもまだ検出し得る 図15は、ヘパリンセファロース上での精製のクロマトグラムを示す。分画は、 THおよびGFAP免疫細胞化学のために処理された。図16に示されるように、ヘパリ ンセファロース上での精製後、分画４および７は、有意な生存促進効果を生じた 。さらに、分画４は、GFAP陽性大膠細胞になる膠芽細胞の成熟を誘発し得た。分 画４に含まれるタンパク質は、RP-HPLCを用いて更に精製された。図17は、精製 のクロマトグラムを示す。分画を、GFAP免疫細胞化学のために処理した。表１に 示されるように、分画７〜９は、GFAP陽性大膠細胞になる膠芽細胞の成熟を誘 発し得た。 表 １： 図16に示されるようなTH⁺測定、並びにヘパリンセファロース上での クロマフィン粒タンパク質精製後の分画のGFAP⁺誘発活性の測定の結果表 ２： RP-HPLCを用いたクロマフィン粒タンパク質の精製後の分画のGFAP⁺誘 発活性の測定の結果 表１および２において、表示"+"は、GFAP活性が検出し得ることを意味し、表 示"-"は、GFAP活性が検出し得ないことを意味する。 EGFレセプター・スーパーファミリーの阻害は大膠細胞成熟、結果として、クロ マフィン粒タンパク質の生存促進効果をブロックする FGF-2、EGF、およびTGF-αは、ドパミン作動性ニューロン生存を促進し、中脳 細胞培養物での細胞増殖を増加することの両方が示されていた（OottoおよびUns icker,19 の最初のシリーズで、クロマフィン粒由来作用は、その推定レセプター経路を特 異的にブロックすることによって分析される。EGFレセプター(EGFR)シグナル導 入経路に関する選択性を有する特殊なタンパク質-チロシンキナーゼ・インヒビ ターを適用する(Buchdungerら1994)。AAおよびFDUR実験によってクロマフィン粒 タンパク質の神経栄養効果が大膠細胞によって仲介されることを示した(図９と 比較)ので、それを大膠細胞数の抑制についてスクリーニングした。使用される プロトコールは次のようであった：中脳細胞を播いて24時間後、および３日後に 再び、クロマフィン粒タンパク質を1:50の濃度で、様々な濃度 のEGFRシグナル化ブロッカーDAPHと混合し、新鮮な培地とともに適用した。全６ 日後、培養物を固定し、GFAP免疫細胞化学のために処理した。図11および12に示 されるように、10μＭ濃度のDAPHは、ドパミン作動性ニューロンの生存(図12、 上部パネル)およびクロマフィン粒活性に誘発される大膠細胞の出現の両方を阻 害した。予測されたように、大膠細胞のFGF-2仲介誘発は、このインヒビターに は影響され得なかった(図12)。培養物をTGF-α、CNS中の生理学的EGFRリガンド 、またはEGF(10ng/ml)で処理したとき、僅かな数のGFAP陽性大膠細胞が検出でき た(図12)。それらの出現は、DAPH処理によって効果的にブロックできた(図12)。 これらのデータは明らかに、大膠細胞のクロマフィン粒タンパク質誘発出現が、 EGFRシグナル化経路の選択的インヒビターであるDAPHによって特異的に阻害され 得、またリガンドTGF-αおよびEGFが、クロマフィン粒タンパク質に仲介される 効果を十分に説明しないことを示す。FGF-2またはPDGFに誘発されるシグナル化 のシグナル導入に影響しないことが示されたので、インヒビターDAPHが選択され た。しかしながら、化合物DAPHは、EGFRのみでなく、p185^c-erbB2自己リン酸化 もまた阻害する(Buchdungerら、1994)。２つのタンパク質キナーゼのどちらがク ロマフィン粒タンパク質誘発効果に関連 するかテストするために、EGFRキナーゼ自己リン酸化(Gazitら、1989)を選択的 に阻害するチルホスチンB56を使用した。10μＭで、チルホスチンB56は、大膠細 胞のクロマフィン粒タンパク質に誘発される出現を、成功裏に阻害した(図12)。 この発見は更に、クロマフィン粒由来タンパク質がEGFRリガンドであることを示 す。 クロマフィン粒タンパク質に誘発される分子はGDNFではない 中脳細胞培養物中のクロマフィン粒タンパク質に誘発される栄養活性をさらに 明確にするために、クロマフィン粒タンパク質で処理されたDIV8に、中脳培養物 からのRNAを用いて、RT-PCRを行なった。図13に示されるように、GDNF mRNAは、 B49神経膠腫細胞系からのRNAサンプル中に明らかに検出され得、該細胞系からは タンパク質が単離され、クローン化された（Linら、1993)。対照的に、クロマフ ィン粒タンパク質で処理された培養物ではシグナルは検出され得なかった、これ はGDNFがクロマフィン粒タンパク質に誘発されるドパミン栄養(dopaminotrophic )因子ではないらしいことを示す。 クロマフィン粒タンパク質はMPP+毒性に対してドパミン作動性ニューロンを保護 する ドパミン作動性ニューロンおよびそれらの黒質線条系 の末端のMPTP-およびMPP+に誘発される変性は、パーキンソン病に見られるもの と似ている(KopinおよびMarkey、1988)。クロマフィン粒からのタンパク質が、M PP+に誘発される死から中脳ドパミン作動性ニューロンを保護する能力を有した かどうかを評価するために、MPP+(1μＭ)をDIV4で中脳細胞培養物に添加し、24 時間後にVP(1:20)で処理した。DIV8での生存ドパミン作動性ニューロンのカウン トは、VPによる処理が、MPP+毒性に対して有意に保護することを示した(図14)。 要約 クロマフィン粒から単離され放出され得るタンパク質は、中脳ドパミン作動性 ニューロンのインビトロでの生存を促進し、それらをMPP+毒性から保護する。神 経栄養効果を、２段階で回復させる。第１に、クロマフィン粒タンパク質は、細 胞増殖およびEGFRリガンドに関連する大膠細胞成熟を引き出す。第２に、GDNFと は異なる膠細胞由来因子は、中脳ドパミン作動性ニューロンの生存を促進する。 特に、ウシのクロマフィン粒の可溶性内容物のタンパク質成分は、ラット胚中 脳床から培養されるドパミン作動性ニューロンの生存強化をもたらすメカニズム をトリガーする。従って、病変化黒質線条系に移植されたクロ マフィン細胞は、生体アミンとは異なる生物学的活性分子の分泌を介して、それ らの有利な機能を発揮する。クロマフィン細胞は、神経栄養因子を合成し、貯蔵 し、エキソサイトーシス経路を介して放出することが公知である(Lachmundら、1 994；Unsicker，1993)。それらの数もそれらの分子同定も、今だ確立されていな い。FGF-2は、クロマフィン細胞中の恐らく最も綿密に研究された成長因子分子( Stachowiakら、1994；Biegerら、1995)であり、発生ならびにインビトロおよび インビボで毒物で損傷されたドパミン作動性ニューロンのための強力な栄養因子 (Ferrariら、1989；OttoおよびUbsicker、1990；1993a,b)であり、顆粒からは放 出されない(Stachowiakら、1994；Biegerら、1995)。従って、FGF-2は、本発明 の因子の候補として考えてはならない。脳へのクロマフィン移植は、新たに機能 性のシナプス連結を受ける(Jousselin-Hosajaら、1994；Ortegaら、1992)。さら に、移植されたクロマフィン細胞は、エキソサイトーシスによって、それらの顆 粒内容物を放出することが示された(Ortegaら、1992)。エキソサイトーシス活性 は、脳の他の移植部位と比較して、線条への移植に最も頻繁であると報告されて いた。従って、DAを含むカテコールアミンおよび栄養効果を生じる分子は、共同 放出されるであろうし、移植部 位近くで同時にそれらの作用を発揮し得たであろう。 胚ドパミン作動性ニューロンに対するクロマフィン粒由来生存促進効果の作用 メカニズムに関しては、２段階、(i)細胞増殖の誘発およびGFAP陽性大膠細胞の 増大するポピュレーションの成熟、および(ii)膠細胞からのドパミン栄養因子の 産生および／または放出の刺激、が関連し得る。従って、本発明によるクロマフ ィン粒由来タンパク質は、膠細胞成熟および分裂促進因子である。しかしながら 、それは、非ドパミン作動性ニューロンを介して更に作用し得る。FGF-2、EGFお よびTGF-α(Knuselら、1990；Casperら、1991；EngeleおよびBohn,1991；Alexi およびHefti、1993)のような幾つかの分裂促進成長因子は、大膠細胞を含む細胞 数の増加を伴う中脳ドパミン作動性ニューロンに対して栄養効果を有する。クロ マフィン細胞は、FGF-2を合成できる。 EGFRスーパーファミリーの阻害は、大膠細胞の増加と生存促進効果の両方をブ ロックする。使用されるEGFRインヒビターであるDAPHは、インビトロでEGFRタン パク質-チロシンキナーゼを高い選択性で阻害し、インビボで強力な抗腫瘍活性 を有することも示された(Buchdungerら、1994)。従って、クロマフィン粒由来の 因子は、EGFRに対するリガンドである。EGFおよびTGF-αは、インビボ成熟 に対する顆粒因子の効果および中脳大膠祖先の増殖を模倣し得なかったので、別 のEGFRリガンドがクロマフィン細胞に貯蔵されることが理解される。EGFおよびT GF-αに加えて、アムフィレグリン(amphiregulin)(Shoyabら、1988、1989)、ヘ パリン結合EGF(Higashiyamaら、1991)、ベタセルリン(betacellulin)(Sasadaら 、1993；Shingら、1993)、および最も最近同定されたエピレグリン(epiregulin) (Toyodaら、1995)を含むEGFRリガンドの拡大するリストがある。他の強力なメン バーは、神経線維腫由来成長因子(Kimuraら、1990)であり、これはアムフィレグ リンと相同である(概説として、Lee DYら、1995を参照)。さらに、EGFスーパー ファミリー、dlk、pG2、およびPref-1(Lee YLら、1995)に属する関連するタンパ ク質をコードする幾つかのmRNAがある。さらに、多くのウイルス遺伝子産物、例 えば、Poxファミリーにより産生されるVGF、およびショープ線維腫および粘液腫 ウイルスにコードされるタンパク質(概説として、CarpenterおよびWahl、1990を 参照)がEGFRのリガンドである。今だ知られていないリガンドと相互作用する新 規なEGFRsの導入メカニズムは、DAPHおよびチルホスチンB56によっても影響され 得る。しかしながら、HER1-2-キナーゼ自己リン酸化(IC50＞500μＭ；Gazitら、 1989)ではなく、EGFRキナーゼ(IC50 5.0μ Ｍ)を選択的に阻害するチルホスチンB56が中脳膠細胞に対して顆粒タンパク質の 効果を十分にブロックするので、例えば、ニューレグリン(neuregulin)のような p185c-erbB2/HER2/neuプロトオンコジーンリガンド、膠細胞成長因子/ヘレグリ ン(heregulin)(Marchionniら、1993)は、因子候補として排除し得る。 本発明に関連する別の要点は、特にニューロンにおける成長因子の選別および 放出メカニズムに関する。成長因子は、分泌の構成的経路を介して放出されるこ とが、広く仮定されたが、今だ証明されていない。現在、これは専ら真実ではな いという証拠が出てきている。多くの点でクロマフィン細胞に似ているPC12褐色 細胞腫細胞系では、トランスフェクトされたBDNFおよびNT-4は、主として調節さ れた分泌経路を介して分泌されるように見える(GoodmanおよびHefti、1994)。対 照的に、海馬ニューロンは、非慣用的メカニズムでトランスフェクトされたNGF を分泌し、そのメカニズムは脱分極およびカリウム流 lおよびThoenen、1995)。従って、クロマフィン粒における成長因子の局在およ びその調節された分泌は、成長因子に関する通常モードの遊離を構成し得ない。 本発明に従いクロマフィン粒タンパク質により誘発さ れる膠細胞由来ドパミン栄養因子の同定に関して、最も強力なドパミン栄養分子 であるGDNFは排除される。クロマフィン粒タンパク質のドパミン栄養効果は大膠 細胞の数的拡大および成熟に関連するという本発明の結果に一致するのは、クロ マフィン移植片のインプラント部位が線維性大膠細胞の顕著な蓄積を発揮するこ とである(Hansenら、1988)。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１０月２８日（１９９８．１０．２８） 【補正内容】 請求の範囲 １． EGFRリガンドであり、大膠細胞成熟を刺激し得、ドパミン作動性ニューロ ンに対する選択的生存促進活性を有する、クロマフィン粒由来タンパク質。 ２． 非ドパミン作動性細胞の増殖を刺激し得る、請求項１に記載のクロマフィ ン粒由来タンパク質。 ３． 請求項１または２に記載のクロマフィン粒由来タンパク質の調製方法であ って、細胞からクロマフィン粒を単離する工程およびクロマフィン粒由来タンパ ク質を含む水溶性タンパク質内容物を緩衝液中のクロマフィン粒から抽出する工 程を包含する方法。 ４． (a)単離されたクロマフィン粒から水溶性タンパク質内容物を抽出し、請 求項１または２に記載のクロマフィン粒由来タンパク質を得ること、および (b)培養された膠細胞を(a)のクロマフィン粒由来タンパク質で処理して、 培養培地中に神経栄養因子を得ること、 を包含する工程によって得ることができる、ドパミン作動性ニューロンの生存 を促進し得る神経栄養因子。 ５． 請求項１または２に記載のクロマフィン粒由来タンパク質の一次アミノ酸 配列または機能的に活性なその誘導体またはその一部をコードするヌクレオチド 配列を 含む核酸。 ６． 請求項４に記載の神経栄養因子の一次アミノ酸配列または機能的に活性な その誘導体またはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。 ７． 実質的にデオキシリボヌクレオチドからなる、請求項５または６に記載の 核酸。 ８． 請求項５〜７のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列を含むベクター。 ９． 請求項５〜７のいずれか１つに記載の核酸および／または請求項８に記載 のベクターを含む宿主生物、但し宿主生物はヒトでない。 １０． 請求項１または２に記載のクロマフィン粒由来タンパク質または請求項 ４に記載の神経栄養因子の調製方法であって、請求項９に記載のそれぞれの宿主 生物を適切な条件下で培養すること及び所望の産物を培養細胞および／または培 地から単離することを包含する方法。 １１． 請求項１または２に記載のクロマフィン粒由来タンパク質および／また は請求項４に記載の神経栄養因子、並びに必要に応じて薬学的に許容される担体 および／または希釈剤を含む薬学的組成物。 １２． ヒトの末梢および／またはCNS疾患を処置するための請求項１１に記載 の薬学的組成物。 １３． CNS疾患がパーキンソン病またはアルツハイマー病であり、末梢神経障 害が糖尿病およびシスプラチニウム(cisplatinium)神経傷害を含む、請求項１２ に記載の薬学的組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/16 Ｃ０７Ｋ 14/47 25/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/24 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ポール イェンス ドイツ国 ディー―76707 ハムブリュッ ケン ケラースヴィーゼン ３ (72)発明者 ベヒトルド ロルフ ドイツ国 ディー―69126 ハイデルベル ク カール―ツックメイヤー―シュトラー セ 21

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ドパミン作動性ニューロンに対する選択的生存促進活性を有するクロマフ ィン粒由来タンパク質。 ２． EGFRリガンドである、請求項１に記載のクロマフィン粒由来タンパク質。 ３． 大膠細胞成熟が可能である、請求項１または２に記載のタロマフィン粒由 来タンパク質。 ４． 非ドパミン作動性細胞の増殖が可能である、請求項１〜３のいずれかに記 載のクロマフィン粒由来タンパク質。 ５． 請求項１〜４のいずれかに記載のクロマフィン粒由来タンパク質の調製方 法であって、クロマフィン細胞からクロマフィン粒を単離する工程およびクロマ フィン粒由来タンパク質を含む水溶性タンパク質内容物を緩衝液中のクロマフィ ン粒から抽出する工程を包含する方法。 ６． (a)単離されたクロマフィン粒から水溶性タンパク質内容物を抽出し、請 求項１〜４のいずれかに記載のクロマフィン粒由来タンパク質を得ること、およ び (b)培養された膠細胞をクロマフィン粒由来タンパク質で処理して、培養 培地中に神経栄養因子を得ること、 を包含する工程によって得ることができるドパミン作動性ニューロンの生存を 促進し得る神経栄養因子。 ７． 請求項１〜４のいずれかに記載のクロマフィン粒由来タンパク質の一次ア ミノ酸配列または機能的に活性なその誘導体またはその一部をコードするヌクレ オチド配列を含む核酸。 ８． 請求項６に記載の神経栄養因子の一次アミノ酸配列または機能的に活性な その誘導体またはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。 ９． 実質的にデオキシリボヌクレオチドからなる、請求項７または８に記載の 核酸。 １０． 請求項７〜９のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含むベクター。 １１． 請求項７〜９のいずれか１つに記載の核酸および／または請求項１０に 記載のベタターを含む宿主生物。 １２． 請求項１〜４のいずれかに記載のクロマフィン粒由来タンパク質または 請求項６に記載の神経栄養因子の調製方法であって、請求項１１に記載のそれぞ れの宿主生物を適切な条件下で培養すること及び所望の産物を培養細胞および／ または培地から単離することを包含する方法。 １３． 請求項１〜４のいずれかに記載のクロマフィン粒由来タンパク質および ／または請求項６に記載の神経栄養因子、並びに必要に応じて薬学的に許容され る担体 および／または希釈剤を含む薬学的組成物。 １４． ヒトの末梢および／またはCNS疾患を処置するための請求項１３に記載 の薬学的組成物。 １５． CNS疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病または他の痴呆、他の中 枢神経系の神経変性疾患および糖尿病、シスプラチニウム(cisplatinium)あるい は他の遺伝性もしくは後天性末梢神経疾患を含む末梢神経障害である、請求項１ ４に記載の薬学的組成物。