JPH06509791A - 血管形成抑制のための方法と組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 米国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌ ｔｈ）からの譲渡により、合衆国政府が本発明の権利を有する。

新たな毛細血管形成のプロセスである血管形成は、正常、および異常両方の、多 くの生理学的事象で重要な役割を演じている。血管形成は、毛細血管内皮細胞に よって基底膜を浸潤し、刺激によりマトリックスを通して細胞が移動し、そして 細胞増殖することによって新たな毛細血管形成が行われることを特徴とする、複 雑な工程である。

多くのプロテアーゼが血管形成に主要因子として関連しているが、血管形成の３ つの要素、つまり、内皮細胞転移動、増殖および毛細血管の内部増殖の、すべて に対して単独で重要であるとわかった酵素は存在していなかった。たとえば、Ｍ ｉｇｎａｔｔｉら、堕１１４７．４８７−４９８　（１９８６）およびＲｉｆｋ ｉｎら、凪ａ、　８封旦ユｊゆ几−１犯」工４０．１２５９−１２６３　（１９ ８１）を参照されたい。

そこでは、血管形成を抑制するためには、プラスミノーゲン活性剤およびコラゲ ナーゼを含む、タンパク質分解カスケードにおける多（の酵素を抑制しなければ ならないと述べられている。プラスミノーゲン活性剤およびコラゲナーゼはプラ スミンと相互に作用するが、プラスミンはプラスミノーゲン活性剤によりプラス ミノーゲンから開裂し、コラゲナーゼの不活性形態を開裂して活性形態とする。

その結果、細胞毒性作用のない場合に、１つの酵素インヒビターで、血管形成を 抑制することができるとわかっているものはなかった。

通常、血管形成は、Ｆｏｌｋｍａｎら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３．１４９０− １４９３（１９８９）に述へられているように、傷の治癒、黄体形成および胚発 育などに伴う。しかし、Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ、　Ｒ ｅＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８５）；　Ｐａｔｚ、Ａｍ、　Ｊ、　 Ｏｔｈａｌｍｏｌ、　９４．７１５−７４３　（１９８２）；およびＦｏｌｋｍ ａｎら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２１．７１９−７２５　（１９８３）によって考 察されているように、腫瘍塊の形成および転移、ある種の眼疾患、およびリウマ チ様動脈炎を含む多くの重病でも、異常な血管新生が起こる。たとえば、多くの 眼疾患があるが、そのうちの多くは失明につながり、その場合には、疾病状態に 応じて眼の血管新生が起こる。このような眼疾患には、糖尿病性網膜炎、血管新 生緑内障、炎症性疾病および眼腫瘍（網膜芽細胞腫など）が含まれる。血管新生 を伴うその池の眼疾病も多くあり、その中には、水晶体後線維増殖、ブドウ膜炎 、絨毛膜様の血管新生を伴う約２０の眼疾病、および虹彩血管新生を伴う約４０ の眼疾病が含まれる。

これらの疾病の現在の治療は、特にいったん血管新生が起こってしまうと、不十 分なものであり、失明につながることが多い。研究によって、通常のｌｌＮ組織 （角膜およびガラス体）に存在する血管抑制因子が疾病状態において喪失すると いうことが示唆されてきた。血管新生が重要な役割を果たす疾病の制御において 、自然に発生する血管形成インヒビターが、治療上の利点を有する可能性がある ため、長期にわたって血管形成インヒビターの研究が行われてきた。血管形成の インヒビターは、これらの疾病の進行を緩和するのに治療上重要な役割を果たし 得ると共に、その原因の、貴重な研究手段をも提供し得る。

多くの研究者によって、体内の数少ない無血管組織の１つである、軟骨を抽出す ることで血管形成が抑制できるという報告がなされている：　Ｅｉｓｅｎｔｅｉ ｎら、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、　８１．１−９　（１９８７）　；　Ｐ ａｕｌｉら、Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、６７、　５５−７４　（ １９８１）　；　ＢｒｅｍおよびＦｏｌｋｍａｎ、　Ｊ、　ＥＸ　、　Ｍｅｄ、 １４１．４２７−４３９　（１９７５）　；　Ｌａｎｇｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ 　１９３．　７０−７２　（１９７６）ＨＬａｎｇｅｒら、Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７、４３１−４３５　（ １９８０）；並びにＬｅｅおよびＬａｎｇｅｒ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２１．　１ １８５−１１８７　（１９８３）。Ｌａｎｇｅｒらは、注入またはポリマー移植 片からの持続放出によって搬送した場合、コラゲナーゼインヒビターを含有する 軟骨の抽出物は、角膜および結膜で、腫瘍誘起の、および炎症誘起の血管新生を 抑制することを示している。

その他のインビトロでのコラゲナーゼインヒビターは、α２−マクログロブリン およびコラーゲン分解酵素阻害（ＴＩＭＰ）を含めて、インビボでのテストでは 血管形成を抑制しなかった。血管形成には、毛細血管内皮細胞の増殖、内皮細胞 の移動およびコラゲナーゼの生成を含む、いくつかの主要要素がある。血管形成 を抑制するためには、化合物が、単独で、または１つまたはそれ以上の他の要因 との組み合せで、毛細血管内皮細胞の増殖、内皮細腔の移動およびコラゲナーゼ を抑制しなければならない。テストした投与量では、ＴＩＭＰは毛細血管内皮細 胞増殖は抑制するが血管形成は抑制せず、プロタミンは血管内部増殖は抑制する が毛細血管内皮細胞の増殖は抑制しない。プロタミンは、血管形成を抑制するよ うに見える濃度では細胞毒性であった。

Ｄ’Ａｍｏｒｅ、　Ｐｒｏ　、　Ｃ１１ｎ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｓ、２２１．２ ６９−２８３　（１９８６）に考察されているように、その他のいくつかの組織 材料からの抽出物も、抗血管形成活性を有することを示した。細胞増殖または細 胞移動などの血管形成の様々な側面を抑制すると確認された分子がいくつかある が、１９８７年３月１８日出願のｆａｎｇｅｒらの米国特許出願Ｎｏ、　０７１ ０２７，３６４に記載されているように、出願人によって５ｃｉｅｎｃｅ　２４ ８．１４０８−１４１０　（１９９０）に報告されるまで、先行技術では、イン ビボで血管形成を抑制することのできる単一の分子は確認されていなかった。こ の出願は、血管形成活性を有する軟骨から単離された部分精製タンパク質抽出物 に関する、それより以前の出願の一部継続出願であり、コラーゲンを抑制し、か つ血管形成、腫瘍誘導血管新生、結合組織損傷および腫瘍細胞浸潤のインヒビタ ーでもあると思われるため、コラゲナーゼの抑制に基づいて、角膜潰瘍およびリ ウマチ様動脈炎および乾酊の治療に有効である、単−タンパク質の精製を開示し ている。

本発明の目的は、異常血管形成を含む疾病の治療のための、薬剤組成物お才びそ の使用方法を提供することである。

本発明の別の目的は、毛細血管内皮細胞増殖および移動を抑制するための、薬剤 組成物およびその使用方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、毛細血管内皮細胞増殖および移動を抑制すると共に 、コラゲナーゼまたはコラゲナーゼ活性を薬学的に有効な投与量で抑制するため の、薬剤組成物およびその使用方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、血管形成を抑制するための、局所的に制御放出され る薬剤組成物およびその使用方法を提供することである。

発明の要約 有効投与量では細胞毒性ではないコラゲナーゼインヒビターからなり、コラゲナ ーゼに対して高度に特異的である血管形成インヒビターの有効投与量を所望の部 位に搬送するための薬剤組成物。これらの組成物は、インヒビターの濃度が十分 であり、かつ有効濃度が正常細胞に毒性ではない場合には、フラゲナーゼ単独に より血管形成を抑制することができるという発見に基づいている。インビボでの 血管成長、並びにインビボでの毛細血管内皮細胞増殖および移動を抑制するため に有効なインヒビターの例としては、軟骨または軟骨細胞に分化する細胞に由来 のタンパク質、またはそのタンパク質ホモログが挙げられる。該タンパク質は、 ウシ肩甲骨軟骨から２ＭのＮａＣ１を用い、その後一連の沈降工程およびカラム クロマトグラフィ工程によって抽出することがてき；または、Ｎ１（２末Ｄ’Ａ （１）９ンバク質配列に基づいたプローブを用いて単離した、タンパク質をコー トするヌクレオチド配列から発現させることができる。池のインヒビターとして は、活性部位または２価のイオンを用いるために必要な領域に結合したコラゲナ ーゼの断片、プロ、キング抗体、および、プラスミノーゲン活性剤インヒビター およびプラスミンインヒビタ−などの、直接に、またはコラゲナーゼの活性化に 必要な酵素の抑制によって、前駆体コラゲナーゼを活性化コラゲナーゼへ活性化 することを抑制する化合物が挙げられる。抑制されるタン１＜り質の例としては 、ストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）、トランシン（ｔｒａｎｓｉｎ） 　、中性プロテイナーゼおよびサーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）が挙げ られる。コラゲナーゼは、中性ｐＨでのみ活性であるため、酵素の微環境のｐＨ を変化させることによっても抑制することができる。

毛細血管内皮細胞増殖および移動並びに血管内部増殖の抑制どして特定される、 インビボにおける血管形成の抑制のための有効投与量は、インビトロでの抑制ア ッセイから外挿される。インビトロでの有効投与量は、毛細血管内皮細胞移動の 抑制のためのｌｎＭから、毛細血管内皮細胞増殖の抑制のための１１００ｎまで の範囲にわたる。インビボでの好適な投与量は、１６ｎＭから、軟骨由来インヒ ビターに関する５０〜７５ｎＭまでの間である。有効投与量は、特定のインヒビ ターによるばかりか、搬送の方法および手段にもよるが、この搬送は局所的でも 全身的でもよい。たとえば、乾釘または糖尿病性網膜症の治療におけるように、 インヒビターを局所的眼キャリアによって搬送する場合もある。また、腫瘍塊の 治療のように、インヒビターを生分解性ポリマー移植片を用いて搬送する場合も ある。

インビトロのアッセイは、インビボでの［ｌ１ｌＬ管形成インヒビターとして有 効な化合物を選別するために発展してきた。これらのアッセイは、血管形成に必 要な主要な事象を示しており、アッセイの抑制は、インビボでの血管形成の抑制 を表していることになる。テストされた事象には、細胞外マトリックスおよび／ または基底膜のタンパク質分解；内皮細胞の増殖、内皮細胞の移動および毛細血 管形成がある。

発明の詳細な説明 文献における数多くの報告とは対照的に、血管形成の様々な重要因子：つまり、 内皮細胞の増殖および移動、血管の管形成および内部増殖は、コラゲナーゼを特 異的に抑制することによってのみ抑制し得るということが、発見された。血管形 成に包含される多くの様々な経路および酵素を考えると、これは非常に驚くべき ことである。細胞毒性のない場合に、血管形成を特異的に抑制するほどに重要な 共通要素を見つけられるとは予想されていなかった。

インビボでの１２≦プイノヒビターの郊。・および　六　庶を渭−するためのイ ンビトロアッセイ （１）血管形成のインヒビターとしてのインビボでの潜在的有効性、および（２ ）有効濃度を測定するために、アッセイを用いて、コラゲナーゼ活性、細胞外マ トリックスまたは基底膜のタンパク質分解、内皮細胞の移動、および毛細血管形 成の抑制のための化合物を選別する。上述したように、有効な組成物は、これら の血管形成の要素をすべて、インビボで抑制しなければならない。コラゲナーゼ インヒビターは、適切なキャリアおよび濃度で用いれば、これらのアッセイすへ てにおいて有効であることがわかった。そこで、まず、化合物がコラゲナーゼイ ンヒビターかどうか、そして他のアッセイでも活性かどうか、その投与量はどう か、を測定するためにアッセイを用いる。

これらのアッセイの主要要素には、アッセイ標的として内皮細胞を用いること、 および、刺激されていない内皮細胞に対する推定上のインヒビターの効果を、刺 激された細胞に対する効果と比較するために、公知の血管形成因子を有する内皮 細胞を刺激して用いることが含まれる。使用可能な内皮細胞としては、毛細血管 内皮細胞および特静脈内皮細胞が挙げられる。内皮細胞を刺激するために使用可 能な因子としては、酸性または塩基性線維芽細胞成長因子が挙げられる。

以下のアッセイは、インビボでの血管形成の抑制のための、コラゲナーゼインヒ ビターを選別する目的で改変された、先行技術で述へられたアッセイに基つくも のである。

コラゲナーゼ活性化抑制のためのアッセイコラゲナーゼ活性化の単位は、角膜コ ラゲナーゼの１単位を５０％抑制するのに必要なタンパク質の量と定義する。１ 単位のコラゲナーゼは、３７°Ｃ，２，５時間でコラーゲンの１０％を開裂させ るものである。コラゲナーゼ活性は、Ｊｏｈｎｓｏｎｉｉｎｔ。

Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　６８．７０　（１９８０）によって開発された アッセイを用いて測定される。Ｉ型コラーゲンを、０．５Ｍの酢酸中で可溶化す ることによってラットの尾の腿から精製し、リン酸ナトリウムで繰り返し沈殿さ せ、その後、［”Ｃ］無水酢酸を用いてアセチル化する。この放射標識コラーゲ ンを、十分な、非標識の精製■型コラーゲンと共に０．５Ｍの酢酸中に溶解し、 約３５０、　ＯＯＯｃｐｍ／ｍｌの特異的活性を有する２ｍｇ／ｍｌの溶液を作 る。該コラーゲン溶液を、４℃で、０．１５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７，６を２回交換して透析する。９６ウエルの組織培養プレートを、４５°の角 度で置いて、透析した溶液の一定ｊｌ　（２５μｌ、８．７５（ｌｃｐｍ）を各 ウェルの下半分に加える。プレートを１時間、３７℃でインキュベーションして 、フィブリルを形成させる。

プレートを水に１時間浸漬した後、１晩乾燥させる。

コラゲナーゼは、つ／角膜の移植片の培地から得られる。

角膜をウシの眼から切除し、クツニシン（ｃｌｉｎｉｄｉｎｅ）溶液で洗浄し、 次いて２％のベニンリ／−ストレプトマイシンを含有するハンクスの平衡塩類溶 液で洗浄する。それらを４ｍＷ１２片に切り分け、Ｔｌ　５０組織培養フラスコ 中に置く。このフラスコは、タルベ、コ改変イーグル培地、５％のラン胎児血清 、および２％のペニンジンーストレプトマイシン溶液を含有する。次いで、０５ ｍ１のサイトカランンＢ（ジメチルスルホキシド中１ｍｇ／ｍｌ）を１００ｍ１ の培地に加える。１つのフラスコは、５０ｍ１の培地当り約１０個の角膜を含有 する。これらのフラスコを９５％の加湿された空気および５％の６０２を含むイ ンキュベータ中で、３５°Ｃでインキュベートする。角膜を体外培養し、７日後 にこの培地を採取して、４°Ｃて保存する。新しい培地をこの角膜に加えて、１ ４日目に第二の採取を行う。コラゲナーゼを含有する培地を４°Ｃで２ケ月以内 の間、無菌状態で保存する。使用前に、この培地に存在する不活性コラゲナーゼ をトリブ／ン処理により活性化する。すなわち、ｌ／１０容量の１＋ｎｇ／ｍ　 ｌのトリプシンを用いて、この培地を３７°Ｃて７分間インキュベートすること により活性化する。活性化に続いて、１／１０容量の大豆トリプシンインヒビタ ー　（５ｍｇ／ｍｌ）を加えて、このトリプシンを不活性化する。

次いて、コラケナーセア、セイ緩衝液（ＣＡＢ）　（０，２Ｍ　ＮａＣ１゜０、 ＯＯＩＭ　ＣａＣｌ２．および０．０１％のアノ化ナトリウムを含有する、ｐ） １７．６の０．（１５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ＣＡＢ）を用いて、この酵素を希 釈する。これにより１００μｌのコラゲナーゼ溶液は、３７°Ｃで２．５時間以 内に１０％（５μｇ）か分解する。

コラゲナーゼ抑制活性についてテストする試料を、ＣＡＢ中に溶解させるか、ま たはＣＡＢに対して透析する。１００μｌの試料および１００μｍの希釈酵素溶 液を一緒にｌ昆合腰　コラーゲンを含有するウェルに加える。これを、３７°Ｃ で２．５時間インキュベータする。溶解性の放射標識分解生成物を含有する上清 を、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＭｏｄｅｌＬＳ　１８００　７ンチレーンヨンスヘクトロ メータ中でカウントする。

毛細血管内皮細胞の増殖の抑制についてのアッセイＡｕ５ｐｒｕｎｋおよびＦｏ ｌｋｍａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ、　Ｒｅｓ、１４．１５３−６５（１ ９７７）に記載されたように、血管形成刺激による毛細血管内皮細胞の増殖は、 新血管新生の重要な要素である。血管形成に関与する特定の細胞を用い、これら の細胞を公知の血管形成因子を用いて刺激する。この場合、酸性繊維芽細胞増殖 因子（ａＦＧＦ）を用いる。このことにより、Ｄ’　ＡｍｏｒｅおよびＫｌａｇ ｓｂｒｕｎ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　９９．　１５４５−１５４９　（ １９８４）に記載のように、この血管形成過程をインビトロで模擬的に行い得る 。Ｓｈｉｎｇら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２３．１２９６−１２９８　（１９８４ ）に記載のように、このタイプのアッセイは、様々な血管形成因子による毛細血 管内皮細胞の増殖の刺激を示すための好適なアッセイである。

Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、Ｊ、　Ａｎａｌ、　ｂｉｏｃｈｅｍ、１５２．　１３６− １４０　（１９８６）に記載のように、培養中の内皮細胞の数は、細胞の酸性ホ スファターゼ活性の比色定量により即座に測定し得る。第１日目に、毛細血管内 皮細胞（２ｘ　１０３１０．２＋ｎｌ）を、ゼラチンを塗布した９６−ウェル組 織培養皿上に置（。第２日目に、５％の仔つン血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）　（ＤＭ ＥＭ１５）およびａＦＧＦ　（２μｇ／＋１）　（ＦＧＦ　Ｃｏ、）を含有する タルへノコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）を再び加えた。

これに、濃度を高めなから化合物を加える。この化合物は、最終容量の１０％以 下の量で加える。ウェルはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）　（Ｇｉｂｃｏ）の みを含有する。ＰＢＳおよびａＦＧＦを対照として含有される。第５白目に、培 地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄する。次いて、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐ Ｈ５，５）　、０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００”および１００ｍＭのｐ− ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ　１０４ホスフアターゼ基質）を含有 する１００μｌの緩衝液中に溶解する。３７°Ｃで２時間インキュベートした後 、１０μｌのＩＮのＮａＯＨを加えて、この反応を止める。発色はラビッドマイ クロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）を用いて、４０５ｎｍで測定する。

Ｃｏｎｎｏｌｌｙらによると、酸性ホスファターゼ活性と１０．０００までの内 皮細胞の数（細胞、′ウェル）との間に直線関係が得られる。酸性ホスファター ゼ活性についての標準曲線は、既知の細胞数からも作成され、酵素レベルが実際 の内皮細胞の数を反映することが確認される。刺激にさらされるウェルの細胞数 と、刺激およびインヒビターにさらされるウェルの細胞数とを比較することによ り、抑制の割合が測定される。各点は、コントロールウェル４回分とインヒビタ ーウェル３回分トの平均値を示す。ＳＥＭは、この平均値の７％未満である。電 気抵抗式細胞計数アッセイによりこのデータの正確性を確認する。

この化合物がＤＮＡによる毛細血管内皮細胞の合成に与える効果は、ａＦＧＦに 応じて毛細血管内皮細胞により放射性チミジンの取り込みの抑制によっても、測 定され得る。

毛細血管内皮細胞移動の抑制アッセイ 修正したＢｏｙｄｅｎ　ｃｈａｍｂｅｒ法、Ｆａｌｋら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 貝１，２３９−２４７　（＋９８０＞を用いて、毛細血管内皮細胞移動に対する ＣＤＩ効果を調へる。Ｌユ庄−凱虹１１５．４５３−４５６　（１９６２）に記 載されるように、ブラインドウェルのＢｏｙｄｅｎ　ｃｈａｍｂｅｒは、多孔膜 で（上下に）分離された２つのウェルより成る。既知の濃度の成長因子を下方の ウェルに入れ、所定数の細胞および試験を行う化合物を上方のウェルに入れる。

膜の上面に付着した細胞は、膜を通って移動し、膜の下面に付着する。次いで、 Ｇｌａｓｅｒら、ｉｎ　Ｎａｔｕｒｅ　２８８．４８３−４８４　（１９８０） の方法を用いて、膜を固定し、染色して計数し得る。

ブラインドウェルｃｈａｍｂｅｒ　（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、　ｎｏ、　０２５ −１８７）およびフィフ゛口不りチン（ＰＢＳにおいて６．６７μｓ／ｍｌ）　 （ヒト、クーパー）で予め塗布した８−μｍの孔（核孔）を持つポリカーボネー ト膜を用いて、移動量を測定する。１％の仔ウシ血清を有するＤＭＥＭ　（ＤＭ ＥＭ／ｌ）で希釈した塩基性ＦＧＦ　（タケダ（株））を、１０ｎｇ／ｍｌの濃 度で下方ウェルに添加する。上方ウェルに、１Ｉ１１１当り５×１０５の毛細血 管内皮細胞を入れ、試験を行う化合物の１度を上げる。対照のウェルには、ｂＦ ＧＦを含むもしくは含まないＤＭＥＭ／ｌを入れる。マイグレーンヨンチャンバ ーを１０％の００２において３７℃で４時間インキュベートする。そして、膜を ワイパーブレード（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）でぬくうことにより、膜の上面の細 胞を取り去る。膜を通って下面に移動した細胞を、２％のグルタルアルデヒド、 続いてメタノール（４°Ｃ）により固定し、ヘマトキンリンで染色した。１６油 浸視野（ＯＩＦ）中の下面の細胞の数を計数することにより移動量を測定する。

各ポイントは、４ウエルの平均＋／−３ＥＭを表す。ｂＦＧＦを含まないコント ロールのウェルでは、移動した毛細血管内皮細胞の数は、６１十／−７細胞であ る。

インビトロでの新生血管形成の抑制アッセイＴａｙ　ｌｏｒおよびＦｏｌｋｍａ ｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　Ｌｏｎｄｏｎ　２９７．　３０７−３１２　（１９８２） に記載のニワトリ漿尿膜アッセイ（ＣＡＭ）を用いて、化合物がインビボで新生 血管形成を抑制し得るか否かを判定する。

化合物の胚管成長に対する効果を、毛細血管が４８時間で卵黄包に出現し、続く ６〜８日間で急速に成長する、ニワトリの胚を用いて調へる。

成長３日目に、受精したニワトリ胚を殻から取り除き、プラスチック製ペトリ皿 （１００５、Ｆａｌｃｏ口）に入れる。それらを、加湿した５％Ｃ０２の中、３ ７℃で保持する。６日目、精製ＣＤＩの４μｇ試料をメチルセルロースディスク に混合し、濃厚な副外胚上に成長するＣＡＭの表面に塗布する。ＣＡＭをＣＤＩ に４８時間さらした後、毛細血管および小管を含まない無血管領域を、双眼解剖 顕微鏡を用いて、×７−ＩＩＩ倍率で観察する。前述のＴａｙｌｏｒおよびＦｏ ｌｋｍａｎ（１９８２）記載通りに、ＣＡＭを、インダイアインク／リボジン（ Ｌｉｐｏｓｙｎ）を用いて餌管内に注入する。

組織標本を室温でホルマリンで固定して、０．ＩＭのカコジル酸緩衝液、ｐＨ７ ，４で洗浄した。標本を４°Ｃて、ＪＢ−４プラスチ・ツク（Ｐｏ１ｙｓｃｉｅ ｎｃｅｓ）に包埋して、ライヘルド（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ）　２０５０ミクロトー ムを用いて、３μｍの切片標本に切断する。切片標本をトルイ／ンブルーで染色 して、ＫｏｄａｋＴＭＸ　１００および緑色フィルターを用いて、ノアイス（Ｚ ｅｉｓｓ）写真機付顕微鏡て顕微鏡写真を取る。

毛細血管形成の抑制アッセイ 毛細血管形成は、血管形成の重要な一要素である。毛細血管形成活性を調へるア ッセイは、化合物をコラーゲンゲルに、もしくはその間に塗布し、培養されたＢ ＣＥ細胞によって毛細血管様管が形成されるかどうかを判定することにより行わ れる。

インヒビターで処理されなかった対象のコラーゲンゲルでは、毛細血管床のよう な内皮細胞の分岐を形成し吻合する索の網のように、ＢＣＥ細胞の単層かインビ ボに出現する。対照的に、インヒビターで処理されたコラーゲンゲルでは、ＢＣ Ｅ細胞再構築が大きく妨げられたことが示され、毛細血管様管を形成するすべて の組織化が妨げられているように見える。

インビトロアッセイに基づいた、軟　由来インヒビターの、インビボにおける　 ２≦　を確呟　る“軟骨由来の精製タンパク質（ＣＤＩ）を単離し、血管形成抑 制において重要な、少なくとも３つの特有な活性を有することを特徴づけた。こ れらの活性に基づいて、タンパク質は、毛細血管内皮細胞の増殖、移動および血 管内植を局部的に抑制することによって、インビボにおける血管形成を抑制する 投与量で、薬学的に容認可能なキャリヤ中で運搬され得る。

本願で使用する用語に、ｒｃＤＩＪは、軟骨からもしくは軟骨細胞または繊維芽 細胞培養液から、下記のように単離されたインヒビタータンパク質をコードする ヌクレオチド配列に標準条件下でハイブリタイズする、ヌクレオチド配列によっ てコードされる真核生物コラゲナーゼを特異的に抑制する全てのタンパク質を指 す。ＣＤＩは、種に特異的ではないので、非ヒト材料から単離されたＣＤＩをヒ トの治療に使用することが可能である。特異的にコラゲナーゼを抑制するＣＤＩ 様のタンパク質は、多数の異なる組織によって生産される。その結果、ＣＤＩタ ンパク質は、軟骨細胞または繊維芽細胞等の軟骨組織に分化し得る他の細胞、ま たは池の哺乳類細胞から調製されるライブラリーからも、プローブとして軟骨か ら単離されたＣＤＩの部分をコードする、標識された合成オリゴヌクレオチドを 使用して、標準技術によって単離され遺伝子的に操作された配列から発現され得 る。これらのプローブは、商業的に入手可能な装置を使用して、または契約に基 づいて合成を行う企業によって合成され得る。標識されたプローブまたは精製タ ンパク質に対する抗体を使用してライブラリーをスクリーニングするための方法 は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ、　ＮＹ　１９８９）によって教示されているように、当業者に公知である。

タンパク質の部分精製およびコラゲナーゼ抑制活性の特徴付けは、１９８７年３ 月１８日に提出の米国特許第０７７０２７．３６４号に詳述されている。軟骨由 来インヒビター（ＣＤＩ）を２Ｍ　ＮａＣ１抽出、次いで塩酸による沈澱および ２回の硫酸アンモニウム沈澱（２５％、６０％）で、つ／の軟骨から単離する。

インヒビターをＡ−１，５ｍのケル濾過カラムにかける。イオン交換クロマトグ ラフィー、第２ケル濾過工程および逆相高性能液体クロマトグラフィーによって さらに精製を行う。

ＣＤＩは、軟骨から単離され得る。仔つンの肩甲骨を屠殺後２４時間以内に屠殺 場から得る。骨から最も離れた場所の軟骨の半分を切除し、まず骨膜封子（Ａｒ ｉｓｔａ）　、次いで小カプレート（Ｎｏ、　ｔｏ、Ｂａｒｄ−Ｐａｒｋｅｒ） で、結合組織がきれいになるまでこする。軟骨の一部分を、使用するまで２０　 ’Ｃで保管する。

凍結した軟骨を解凍し、Ｃｕ１ｓｉｎａｒｔ　Ｍｏｄｅｌ　ＤＬＣ１０で切り刻 み、１７８　ｉｎ３の断片にする。切り刻んだ断片（バッチ当り１ｋｇ）を、２ Ｍ　ＮａＣ１，３ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．０２％のアジ化ナトリウムを含む、 ｐＨ７，６の０．０１　Ｍ　４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエ タンスルホン酸の８Ｌ中で、４°Ｃて４８時間抽出する。この抽出物をＮ１ｔｅ ｘ　ｆｉｌｔｅｒ　（１５３１，ｔメｙ　’ｌ　ｓ、Ｔｅｔｋｏ）で濾過し、１ ２゜５００　ｘ　ｇ、　４°Ｃて１時間遠心分離にかけ、次いでＮ１ｔｅｘと多 層の薄地の綿布とで濾過する。約７．４Ｌの濾過された抽出物を、１つのＰＴＣ Ｇカセット（分子量カットオフ、Ｍ、　１０．０００）を備えたＰｅ１ｌｉｃｏ ｎ　Ｃａ５ｓｅｔｔｅ　Ｓｙｓｒｅｍ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、５ ００　ｍｌに濃縮する。この濃縮物を、０．１５のＮａＣｌおよび０．０２％の アジ化ナトリウムを含む、ｐ）１１６の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩに対して透 析し、＝２０°Ｃで保管する。

インヒビターの不純物を酸沈澱するために、ｐＨが２．０になるまで、濃縮した 抽出物にｌＮのＨＣＩを一滴ずつ加える。抽出物を２５，０００　ｘ　ｇで３０ 分間遠心分離にかけ、ペレットを除去する。

ｐＨか７６になるまて、上清にＩＮ　ＮａＯＨをｌａずつ加える。抽出物を２５ ．０００　Ｘ　ｇで３０分間遠心分離にかけ、ペレットを除去して、インヒビタ ーを含む、＠液から、すへての酸不溶性不純物を取り除く。

（ＮＨ４）２ＳＯ，ｌを抽出物に加え２５％飽和にし、遠心分離後、沈澱物を除 去する。６０％飽和か得られるまで、さらに（ＮＨ４）２ｓＯａを加える。６０ ％飽和溶液を遠心分離にかけ、インヒビターを含むペレットを一２０°Ｃて保管 する。

解凍したペレットを、４Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、Ｏ，ＯＯＩＭ　ＣａＣｌ２お よび００２％のアン化ナトリウムを含む、ｐＨ７，６の０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ− ）ＨＣＩ中で溶解し、４°Ｃで３０ｍ１／ｈの流量で、Ａ１．５ｍセファロース Ｔ″分子量排除のカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ Ｊ）　（２，５Ｘ　９０　ａｍ）にかける。カラム流出物を、２８０または２２ ０　ｎｍで分光光度計によりモニターする。２８，０００　Ｄａの見かけ分子量 で、インヒビターは溶出する。コラゲナーゼ活性のアッセイによって、インヒビ ターを含有するすべての両分をプールし、ＹＭｌＯ膜を備えたＡｍ１ｃｏｎで攪 拌したセル中で濃縮する。濃縮液を、０．０５Ｍ　ＣａＣｌ２および０．０５％ のアジ化ナトリウムを含む、Ｉ）Ｈ７，６の０．０５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩに 対して透析し、次いで、７０ｍ１／ｈの流量で、Ｂｉｏ−Ｒｅｘ　７０”″カチ オン交換カラム（２００−４００メツシユ、２．６Ｘ７．５ｃｍ）にかける。こ のカラムを、０．０５Ｍ　ＣａＣｌ２および０．０５％のアジ化ナトリウムを含 む、ｐＨ７，６の０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩの１０倍カラム容量で洗浄し、 非吸着タンパク質を溶出する。結合物質ヲ、０．００１Ｍ　ＣａＣｌ２および０ ．０１％のアシ化ナトリムを含む、ｐＨ７，６の０．０５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ Ｉ中００５から０．７５Ｍ　ＮａＣ１の塩勾配で溶出する。インヒビターは、０ ．０５Ｍ　ＮａＣ１の低塩て、カラムに結合し、約０．２Ｍ　ＮａＣ１に溶出さ れる。インヒビターを含む画分を攪拌したセル中で濃縮し、フラゲナーゼアノセ イ緩衝液、ＣＡＢ。

０．２Ｍ　ＮａＣ１，Ｏ，ＯＯＩＭ　ＣａＣｌ２および０．０１％のアジ化ナト リウムを含む、ｐＨ７，６の０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩに対して透析する。

この透析物を、ＣＡＢて平衡化したセファデックスＧ−７５”　（ｓｕｐｅｒｆ ｉｎｅ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　（１，６ｘ　５０　ｃｍ）カラムにｌｏｍｌ ／ｈの流量でかける。

Ａ２８１１吸収物質の第１ピーク後、インヒビターを含む画分が溶出し、そして プールし、攪拌したセル中で濃縮して１ｍｌの容量にした。同容積の、水中０． ０５％のトリフルオロ酢酸を試料に加える。次いで、０４カラムで、逆相高性能 液体クロマトグラフィーを行う。水中０．０５％のトリフクロオロ酢酸からアセ トニトリル中０．０５％のトリフルオロ酢酸のりニア−な勾配を使用して、結合 タンパク質を溶出する。１００μｌの分別部分を移し、コラゲナーゼ活性をアッ セイするために、ＣＡＢに対してすばやく透析する。

逆相高性能液体クロマトグラフィーによって、コラゲナーゼインヒビターは、見 かけ上均−になるよう精製された。各工程における、全タンパク質、全ユニット 、比活性の回収率および精製度を表Ｉに示す。

（以下余白） 表１：ウン軟骨由来のコラゲナーゼインヒビターの精製工程　総タノバり質　全 １ニブト８ （ｍｇ）　比活性　回収率　精製度 （ユニット／ｍｇ）　（％）（ｘ　倍）濃縮抽出物 ２５．９００　３９８，４６２　１５．４酸および（ＮＨ４）　２ＳＯ４ｐｐｔ ｌ、５２０　８４，４４４　５５．６　２１．２　３．６Ａ、　１．５ｍ １９２　４２．６６７　２２２．２　１０．７　１４．４８ｉｏ−Ｒｅｘ　７０ ２８．５　２５，０００　８７７．２　６．３　５７．０セプＴテ゛ブクス　Ｇ ７５ ４．５　１２．７＋２　２．８２４．９　３．２　１８３．４ＲＨＰ　Ｌ　Ｃ Ｏ，１５３，０００２０，０００，００，７５１，２９８，５ａ　１ユニツトは 、１ユニツトの角膜コラゲナーゼを５０％阻害するのに必要なタン／　（り質の 量として定義される。１ユニツトのコラゲナーゼは、３７°Ｃ２，５時間で、コ ラーゲンの１０％を開裂する。

ＣＤＩ様タンパク質を、馴化培地（アスコルビン酸を補った、血清を含まないＨ ＡＭのＦ１２培地、Ｇｉｂｃｏ）から単離する。この培地中では、蒸留水で培地 を完全に透析し、次いでこの透析物を、１０ｍ１／ｈの流量て、０．２Ｍ　Ｎａ Ｃｌ、０．００１Ｍ　ＣａＣｌ２、および００１％ノアジ化ナトリウムを含む、 ｐＨ７，６の０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中のセフ７デノク７、　Ｇ７５ケル Ｔ″（ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ、　Ｐｂａｒｉｌａｃｉａ）　濾過カラム（１，６ｘ 　５０　ａｍ）にかけた後に、ランの肩甲骨からの軟骨細胞を培養した。画分を 集め、還元条件下で、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって、約３４゜０００の分子量の単 一ノ＼／ドとして特徴付けた。これらの両分は、上記で測定したように、コラゲ ナーゼを抑制した。

これら画分はまた、増殖および移動アッセイ、ならびにＣＡＭ血管形成抑制アッ セイにおいて、４ミクログラムで８０％の抑制で、活性であった。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、のＭｏｄｅｌ　４７７Ａプロ テインシークエンサーで、製造業者の標準プログラムＮＯＲＭＡＬ−１を用いて 、ＣＤＩの自動エドマン分解を行った。次いで、得られたフェニルチオーヒタン トイノーアミノ酸画分をオンライン（ＡＢＩ）　Ｍｏｄｅ１１２０Ａ　ＨＰＬＣ を用いて同定した。ＮＢＲＦ−ＰＩＲタンパク配列のデータベース、Ｎａｔｉｏ ｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｄ ｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ　Ｎａｔｉｏｎ ａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ 、ｌＤ＃　Ａ２０５９５（１９８９）のサーチは、このタンパクがヒトの羊水か ら単離されたコラゲナーゼインヒビター（それ自身は実際、１つの残基の相違以 外は、ヒトの皮膚の繊維芽細胞インヒビターのタンパクと同一である）とは、Ｄ ｏｃｈｅＮｙらにより、Ｎａｔｕｒｅ　３１８．６６−６９（１９８５）にお（ １て報告されている、２８個のＮ末端残基に対して１７位（ロイシンの代わり（ こハリノ）および２７泣（ブロリノの代わりにアラニン）の２つのアミノ酸だけ か異なることを示した。試料は還元も、アルキル化ら行っていないため、（−− −）は以前に報告されたコラゲナーゼインヒビターの予期されるンステイン残基 と相同性を一致させた場合の真のブランクを示して′、）る。Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ら（１９８５）；　Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、ＵＳＡ　８３．　２４０７−２４１１（１９８６）によると、３つの残 基金で（ま、一致して０る。

ＣＤＩは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析、次いて銀染色（こよって決定されるように、 ２７．５５０の分子量の見かけ上１本の帯として現れる（こも力１かわらず、こ のコラゲナーゼインヒビターと、例えＩｆ、　ＭｕｒｒａｙらのＪ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ、　２６１．４１５４−４１５９（１９８６Ｈこよって、以前に報 告されたものとの間の配列の相違は、同じ組織内のこのタンパクの種間変動およ び／または変化し得る形態（こ起因する。

ＣＤＩのＮ末端を表ＩＩに示す。

表　エエ、　鼻た￥、ｂｌのインヒし′ターのＮｆｈ　Ｌ肖ｐｖｔＱｆＪ乙チリ 池のコラゲナーゼインヒビターもまた用０得る。コラゲナーゼ活性部位に相補的 な、およびコラゲナーゼ活性部位に結合するペプチドと同程度単純な物質、また はコラゲナーゼによる二価のイオンの利用を抑制する物質、コラゲナーゼ活性を ブロックする抗体およびコラゲナーゼ前駆物質の活性コラゲナーゼへの活性化を 抑制する化合物を、直接またはコラゲナーゼの活性化に必要な酵素を抑制するこ とにより用い得る。

それらの特異性によってこれらの化合物は細胞毒性がない。

他のタンパクとしては、血小板ファクター４および組織インヒビターメタロプロ テイナーセ（ＴＩＭＰ）があり、両者ともコラゲナーゼインヒビターであり、そ して抗コラゲナーゼおよび抗血管形成活性を有するペプチド配列もまた含有し得 る。

以下はＣＤＩを特徴付けるさらなる活性の発見と、そしてインビトロでコラゲナ ーゼ活性の抑制と比較した血管形成を抑制するＣＤＩの有効量を示す。ＣＤＩは 上述のように軟骨から精製される。

実施例１　二ＣＤＩによる毛細血管の内皮細胞の増殖の抑制インビトロでＣＤＩ について行った最初の研究は、血管形成、毛細血管の内皮細胞（ＢＣＥ）増殖の 重要な要素の１つに関し、この因子の効果に焦点を合わせた。

Ａ、　の比　による　生ホスファターゼ“　および電気氏抗式細胞計数によりホ １定した　細　殖の凱 細胞の酸性ホスファターゼ活性の比色分析による測定は、Ｃｏｎｎｏｌｌｙらの Ｊ、　Ａｎａｌ、　ｂｉｏｃｈｅｍ、１５２．１３６−１４０（１９８６）に述 べられており、色を測定するので、毛細血管の内皮細胞の増殖の抑制の精製法に おいて全カラムから少量の画分を迅速に、そして感度よく分離するために用いら れる。

このアッセイを用いて各連続的なカラム工程をスクリーニングすることによって 、２つの明確な生物学的な活性、すなわち、抗コラケナーセおよび抗増殖活性が 、この精製法においてともに精製されることが測定された。電気抵抗式細胞計数 によってＢＣＥ増殖を研究する第二のアッセイを用いて、同様の結果がまた得ら れた。これらの研究において、この精製法における各クロマトグラフィーの工程 由来のコラゲナーゼ抑制活性に豊む画分の、ＢＣＥ増殖の酸性繊維芽細胞増殖因 子（ａＦＧＦ）刺激に対する抑制力を試験した。ＣＤＩは、顕著に投与量に依存 してこの増殖を抑制することがわかった。精製されたＣＤＩは、５０〜７５μＭ のＩＣ５１Ｉ（増殖の５０％抑制が得られるインヒビターの濃度）でａＦＧＦで 刺激された毛細血管内皮細胞増殖を抑制する。細胞計数アッセイによって測定さ れたように、連続的な４つの工程由来のＣＤＩのＩＣ５８値（増殖因子で誘発さ れる刺激の５０％抑制が見られる抑制濃度）の比較は、コラゲナーゼインヒビタ ーが精製されるにつれ抗増殖活性の増加することを反映する。ＩＣ５６値：Ａ− １，５ｍ活性１４μｇ／ｍｌ　Ｂｉｏ−Ｒｅｘ　７０活性：９μｇ／ｍｌ、５ｅ ｐｈａｓｅｘ　Ｇ−７５活性４ｕ　ｇ／ｍｌ　Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈａｓｅ　Ｈ ＰＬＣ活性：０．８　ｕ　ｇ／ｍ　ｌ。

Ｂ、ＤＮＡ”　によって、ｌ１ｌ＝された　勺の　の毛細血管内皮細胞のＤＮＡ 合成に対するＣＤＩの効果を測定する研究で、ＣＤＩは、約３００ｎＭのＩＣ５ ，を示す、投与量依存の様式でａＦＧＦに応じて毛細血管内皮細胞による放射活 性チミジンの取り込みを抑制した。

Ｃ９内　細胞の　殖のＣＤＩによる　智と文・照との比較インヒビターの抗増殖 効果の特異性を試験するために、多くの他の物質、特に調節因子として重要な物 質を、毛細血管内皮細胞の増殖を抑制する能力に関して試験した。他の酵素イン ヒビター、例えば、トリプンンオポインヒビター、膵！トリプシンインヒビター およびＣ２−マクログロブリン、比較的非特異的なコラゲナーゼインヒビター、 および硫酸コンドロイチンＡ、軟骨中に見いだされたグリコサミノグリカンは、 ５０μｇ／ｍｌの濃度で試験したときでさえ、増殖因子で刺激した毛細血管内皮 細胞増殖に対して、顕著な効果を有さなかった（試験した全投与量で、２０％未 満の抑制または刺激）。これらの因子はまた、インビトロでの血管形成を抑制し なかった。

さらに、このインヒビターは大動脈の内皮細胞（ＡＥ）を、毛細血管の内皮細胞 （ＩＣ５８・１４μｇ／ｍりに対するａＷよりかなり高い（ＩＣａｌｌ＝４０μ ｇ／ｍｌ＞有効濃度で抑制するが、このインヒビターは、非内皮細胞タイプ、例 えば、つ／の大動脈の平滑筋細胞およびＢａ１ｂ／ｃ３Ｔ３細胞の増殖てくは検 知し得る抑制効果を有さなかった。

実施例２　：　ＣＤＩによる毛細血管の内皮細胞の移動の抑制面管形成プロセス の他の重要な要素は、Ａｕ５ｐｒｕｎｋらのし」１ｃｒｏｖａｓｃ、　Ｒｅｓ、 １４．５３−６５（１９７７）に総説されているように、血管形成性刺激に反応 する毛細血管内皮細胞の移動である。

内皮細胞の移動のインヒビターは、精製工程を通じ、コラゲナーゼインヒビター とともに精製される。Ｉｃ５．値は、Ａ−１゜５ｍ、　Ｂｉｏ−Ｒｅｘ　７０お よび５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５クロマトグラフイ一工程でそれぞれ、１４３． ３８および８μｇ／ｍｌであった。精製されたＣＤＩは、９６ｎＭのＩＣ５θて 毛細血管の内皮細胞の移動を抑制する。

実施例３：インビボでのＣＤＩによる新生血管形成の抑制Ｔａｙ　ｌｏｒおよび Ｆｏｌｋｍａｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　Ｌｏｎｄｏｎ　２９７．　３０？−３１２（ １９８２）に記載されているニワトリの（ｃｈｉｃｋ）漿尿膜アツセイ（ＣＡＭ ）を、第３のバイオアッセイとして用い、ＣＤＩがインビボで新生血管形成を抑 制し得るかどうかを測定した。胚の血管の成長に対するＣＤＩの効果を、ニワト リの胚を用いて観察した。毛細血管が４８時間後の卵黄の膜に現れ、そして次の ６−８日間（こわたって急速に成長した。

発育の３日目に、受精したニワトリの胚をカラから取り除き、プラスチック製の ベトリ皿（１００５，Ｆａｌｃｏｎ）に置ｌ−λた。これらを加湿した５％ＣＯ ２下、３７°Ｃに維持した。６日目（こ、４μｇの精製ＣＤＩ試料をメチルセル ロースディスク中で混合し、そして高密度の外胚葉下部の網状構造の上の成長し て（ＳるＣＡＭの表面（こ塗布した。ＣＡＭをＣＤＩに４８時時間上た後、無血 管領域、毛糸出血管および小さい管のない部分を、７−１０倍の拡大倍率で両口 艮用の解剖顕微鏡を用いて観察した。ＴａｙｌｏｒおよびＦｏｌｋｍａｎ（１９ ８２）に記載されているＩｎｄｉａ　ｉｎｋ／Ｌｉｐｏｓｙｎで、このＣＡＭを 血管内に、主人した。

この結果は、大きい無血管領域によって明らかなように、普通に発育した漿尿膜 にメチルセルロースディスクに局所的に塗布したＩ製ＣＤｍ４５μＭ）４μｇに より、インヒビターに４８時間以下曝すことにより引き起こされた顕著な抑制を 示した。

対象的に、空のメチルセルロースディスクに植え付けた対照のＣＡＭでは、無血 管領域はできなかった。ＣＤＩ処理したＣＡＭの組織学的観察は、通常の血管の 成長を示す対照と比較すると、正常より細い中胚葉、および対照よりも無血管で あることがわかった。

無血管領域の中心には、Ｉｎｄｉａ−ｉｎｋて満たされた毛細血管は全くなかっ た。その領域の中心にはメチルセルロースディスクを含んでいる。この効果は軟 骨の出発物質のいくつかの異なるバッチを用いた少なくとも２つの独立したセッ トのＣＡＭアッセイで試験された卵の３３％に見られた。８日目のＣＡＭの組織 切片（８００倍）では、未処理対照および、空のメチルセルロースディスクを含 む対照で、通常の毛細血管の成長を示した。対象的に、毛細血管は４μｇのＣＤ Ｉで処理された試験用ＣＡＭには存在しなかった。ＣＤＩの抗血管形成活性を、 このＣＡＭアッセイを用いてその全精製期間にわたってモニターし、均質になる までの連続的な各精製工程でのインヒビターの投与量希釈曲線を得た。精製ＣＤ Ｉは、４μｇでＣＡＭに１００％の無血管領域を作り出す、　Ｇ−７５クロマト グラフイ一工程由来のＣＤＩの２５μｇは、ＣＡＭに１００％の無血管領域を作 り出す；　Ｂｉｏ−Ｒｅｘ　７０カラム由来のＣＤＩの５０μｇは、８０％の無 血管領域を作り出す；そしてＡ−１，５ｍ＋工程由来のＣＤＩは、ＣＡＭに対し て血管新生の抑制を示さなかった。

軟骨由来のインヒビターは、血管形成の強力なインヒビターである。なぜなら、 抑制がわずか４μｇで見られたからである。比較のために、ＣＡＭアッセイで単 独で試験された血管形成インヒビターに対する以前に報告された最少用量は、Ｔ ａｙｌｏｒおよびＦｏｌｋｍａｎ（１９８２＞により報告されている、プロタミ ンの５０％ｇ（この濃度では細胞毒性もある）　ＨＬｕｔｔｙらのＩｎｖｅｓｔ 、　０日、ｈａｌｎ巴土−Δ土り一部ｃｉ、　２４．５３−５６　（１９８３） で報告されている、ランの硝子液の抽出物の２００μｇ；および、Ｔａｙｌｏｒ およびＦｏｌｋｍａｎ　（１９８２）により報告されている、血小板因子４の１ ０μｇである。比較により、軟骨由来のインヒビターは、インビボでの血管形成 の極めて強力なインヒビターである。組み合わせて有効な血管形成インヒビター の報告された最少量には、ヘパリン＜５０μｇ）およびヒドロコルチゾン（６０ μｇ）；および、Ｂ−シクロデキストリンテトラデカスルフェート（１４μｇ） およびヒドロコルチゾン（６０μｇ）がある。これらはＥｉｓｅｎｓｔｅｉｎら の穂工Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、　８１．　１−９　（１９８７）に報告された。

実施例４：ＣＤＩによる毛細血管形成の抑制培養されたＢＣＥ細胞からコラ−ケ ンゲルへ、毛細血管内皮細胞が制御された移動を行なうかどうかを調べ、および 毛細血管様の管が培養されたＢＣＥ細胞によって形成されるかどうかを測定する アッセイを用いた結果、ＣＤＩが血管形の有効なインヒビターであることが示さ れた。ＣＤＩで処理していない対照コラーゲンケルでは、ＢＣＥ細胞の単層は、 インビボの毛細血管床に似た内皮細胞のフードが分枝がネットワークを形成し、 吻合していた。反対に、ＣＤＩで処理したコラーゲンゲルでは、毛細血管様の管 へのいかなる組織化も妨げられており、ＢＣＥ細胞再組織化の殆んどが防害され ていることを示した。

実施例５：ウサギ角膜簡易アッセイを用いた、腫瘍誘起血管形成の抑制 前述の実施例でウシ肩甲骨軟骨または肩甲骨軟骨細胞の馴化借地から精製したＣ ＤＩは、ナノモル濃度でテストした時に、毛細管内皮細胞のインビトロでの増殖 の増殖因子に刺激された増殖および移動を抑制することが示された。腫瘍成長は 血管の新生に依存しているため、ウサギ角膜簡易アッセイを用いて、腫瘍誘起血 管形成に関してＣＤＩをテストした。正常な無血管の角膜に新生血管応答を起こ すために、ｖ２腫瘍の移植片を用いた。エチレンのエチレン−ビニル酢酸共重合 体の、持続放出ポリマーベレｙ　）　（Ｅｌｖａｘ）を、それぞれ４０μｇのＣ ＤＩで含浸し、腫瘍と角膜の端部との間に移動した。

腫瘍は、移動後４から６日後に、血管を発芽させた。最高血管長の平均を計測す ると、未処理の眼に対して処理した眼ては、ＣＤＩが毛細血管成長を有意に抑制 することがわかった（４５から６５％の抑制）。

実施例６：活性成分としてＣＤＩを含む薬学的組成物の調製実施例１から３は、 単一の、部位由来のマクロ分子ＣＤＩが血管形成の強力なインヒビターであるこ とを示している。

このインヒビターを用いたインビトロの研究は、少なくとも３つの血管形成プロ セスの主要な要素、即ち、毛細血管内皮細胞の増殖および移動、および管形成を ネガティブに調節することを示している。このＣＡＭ研究はまた、インビボのモ デルでも血管形成を抑制することを示している。

毛細血管内皮細胞の増殖および移動の抑制を試験することにより、軟骨細胞由来 のインヒビターでも同様の結果が得られた。血管形成の抑制の比較では、酸沈澱 を用いた分離の後にグリコリル化していない軟骨細胞由来の物質は、軟骨由来の ＣＤＩよりも、強い活性を示した。この軟骨細胞物質をグリコリル化した。天然 に発現しグリコリル化されている物質は、脱グリコリル化物質または組み換え配 列から発現された物質よりも活性が大きいことが知られている。しかし、これら すへては薬学的使用に適切な薬学的媒体中に入れて、搬送し得る。

薬学的組成物は、ＣＤＩを活性物質として用い、特異的な塗布に基づいて血管形 成を抑制するために調製される。投与は、局所的または局部的のいずれかである 。局所投与用（こ（ま、精製したＣＤＩをキャリアと結合して、所望の活性に基 づき、搬送される。（即ち、有効投与量の範囲で；例えば、局部的な血管形成の 抑制、および毛細血管内皮細胞移動を抑制するための１４．５μＭから４μｇか ら、毛細血管内皮細胞の増殖の抑制のための１００μＭまでである。局所的ＣＤ Ｉ組成物は、乾薊のような疾病の処置のために皮膚に塗布される。キャリアは、 軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、泡末、エアロゾル、坐剤、バッドまたはゲル 状スティックの形態であり得る。

上記で論じられた一部の眼疾患の処置のための局所的ＣＤＩ組成物は、緩衝生理 食塩水、ミネラルオイル、コーン油または落花生油のような植物油、ワセリン、 Ｍｉｇｌｙｏｌ　１８２、アルコール溶液、または、リポソームまたはリポソー ム様の生成物のような、受容可能な眼用の賦形剤中の有効量のＣＤＩから成る。

これらの組成物のいずれも、ＣＤＩに有害な効果を与えない、防腐剤、酸化防止 剤、抗生物質、免疫抑制剤および、その他の生物学的または薬学的に有効な物質 を含み得る。

局部的または部分的な投与（例えば腫瘍中への投与）用のＣＤＩ組成物は、一般 に不活性な希釈剤を含む。非経口、内皮、皮下または局所投与に使用される溶液 または懸濁液は、下記の成分を含み得る：注射用の水、生理塩溶液、不揮発性油 、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコールまたは池の合 成溶媒のような無菌の希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのよう な抗ｍ　剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような酸化防止剤； エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤；アセテート、サイトレートま たはホスフェートのような緩衝剤および、塩化ナトリウムまたはデキストロース のような浸透圧の調製のための物質。これらの非経口親（Ｐａｒｅｎｔａｌ）調 合剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、デイスポーザブルンリンンま たは多数回投与用のバイアルに封入し得る。

体内部局所的投与（例えば、潰瘍または痔の処置、または、その他の粘膜の外傷 のための投与）の目的には、このＣＤＩ組成物は、錠剤またはカプセルの形態で あり得、以下のいずれの成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：微結 晶性セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチンのようなバインダー；スター チまたはラクトースのような賦形剤；アルギン酸、ブリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅ ｌ）またはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはス テロート（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）のような潤滑剤：またはコロイド状二酸化ケイ素 などの滑剤。投与ユニット形態がカプセルである場合、上記のタイプの物質に加 えて、脂肪油のような液体キャリアを含み得る。さらに、投与ユニット形態は、 投与ユニ、７トの物理的形態を変える種々の他の物質（例えば、糖のコーティン グ、ンエラノクまたはその他の整腸剤）を含み得る。

好ましい形態で、このＣＤＩは、制御された期間の間選択された部位でＣＤＩを 放出する、生分解可能で生体適合性のポリマーの移植片と組み合わせて投与され る。好ましいポリマー物質に、ポリ無水物、ポリオルジエステル、ポリグリコー ル酸、ポリ乳酸、ポリエチレンビニルアセテート、および、それらのコポリマー およびそれらの混合物が含まれる。ＣＤＩは、例えば、インシュリンの搬送に使 用されるタイプまたは特定の部位または腫瘍に対する化学療法などに使用される 点滴ポンプによって局部部位へも投与され得る。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法１８４条の８）平成４年７月２４日

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．コラゲナーゼ特異インヒビターの有効量を、薬学的に受容可能なキャリア中 に含み、その部位の正常細胞に対して細胞毒性を示さない、選択された部位で血 管形成を抑制し、血管形成を抑制する組成物。
2. ２．前記血管形成の抑制が、毛細血管内皮細胞移動の抑制として測定される、請 求項１に記載の組成物。
3. ３．前記血管形成の抑制が、毛細血管形成の抑制として測定される、請求項１に 記載の組成物。
4. ４．前記血管形成の抑制が、内皮細胞増殖の抑制として測定される、請求項１に 記載の組成物。
5. ５．前記インヒビターが、精製された軟骨由来のインヒビターである、請求項１ に記載の組成物。
6. ６．前記インヒビターが、軟骨から抽出される、請求項５に記載の組成物。
7. ７．前記インヒビターが、軟骨由来のインヒビターに対するプローブまたは抗体 を用いて、哺乳類細胞ライブラリー由来の、組み換えで作成された配列から発現 された、請求項５に記載の組成物。
8. ８．前記有効投与量が、血管形成が抑制される部位で、約１ｎＭから１００ｎＭ の間の濃度となる、請求項５に記載の組成物。
9. ９．前記コラゲナーゼインヒビターが、眼球への局所的投与用の受容可能な眼用 のキャリア中に存在する、請求項１に記載の組成物。
10. １０．前記コラゲナーゼインヒビターが、皮膚への局所的投与用の薬学的に受容 可能なキャリア中に存在する、請求項１に記載の組成物。
11. １１．前記コラゲナーゼインヒビターが、生分解可能で、生体適合性のポリマー 搬送素子中に存在する、請求項１に記載の組成物。
12. １２．前記コラゲナーゼインヒビターが、粘膜への局所的投与用の薬学的なキャ リア中に存在する、請求項１に記載の組成物。
13. １３．前記コラゲナーゼインヒビターが、コラゲナーゼの活性部位または二価金 属イオン結合部位に結合するペプチドである、請求項１に記載の組成物。
14. １４．前記コラゲナーゼインヒビターが、コラゲナーゼに対する抗体であり、該 抗体がコラゲナーゼ活性をブロックする、請求項１に記載の組成物。
15. １５．前記コラゲナーゼインヒビターが、前駆体コラゲナーゼの活性コラゲナー ゼヘの活性化を抑制する、請求項１に記載の組成物。
16. １６．前記コラゲナーゼインヒビターが、プラスミノーゲン活性化インヒビター およびプラスミンインヒビターからなる群から選択される、請求項１５に記載の 組成物。
17. １７．血管形成を抑制するための方法であって、薬学的に受容可能なキャリア中 のコラゲナーゼ特異的インヒビターの有効量を、血管内部増殖の抑制が血管形成 を抑制するために望ましい部位へ、その部位の正常細胞に対しては細胞毒性を示 さずに、投与する工程、を含む方法。
18. １８．前記量が、毛細血管内皮細胞移動の抑制に有効である、請求項１７に記載 の方法。
19. １９．前記重が、毛細血管内皮細胞増殖の抑制に有効である、請求項１７に記載 の方法。
20. ２０．前記量が、毛細血管形成の抑制に有効である、請求項１７に記載の方法。
21. ２１．前記部位が、腫瘍である、請求項１７に記載の方法。
22. ２２．さらに、皮膚への局所的投与に適した薬学媒体中のコラゲナーゼインヒビ ターを投与する工程、を包含する請求項１７に記載の方法。
23. ２３．さらに、生分解可能で、生体適合性のあるポリマー搬送素子中に存在する 前記コラゲナーゼインヒビターを与える工程、を包含する請求項１７に記載の方 法。
24. ２４．さらに、注射に適した薬学的媒体中に存在する前記コラゲナーゼインヒビ ターを与える工程、を包含する請求項１７に記載の方法。
25. ２５．さらに、眼球への局所的投与に適した薬学的媒体中に存在する前記コラゲ ナーゼインヒビターを投与する工程、を包含する請求項１７に記載の方法。
26. ２６．前記インヒビターが、精製された軟骨由来のインヒビターであり、有効投 与量が、血管形成が抑制される部位で、約１ｎＭから１００ｎＭの間の濃度とな る、請求項１７に記載の方法。
27. ２７．前記有効投与量が、乾癬症状の緩和に有効な投与量である、請求項２２に 記載の方法。
28. ２８．前記有効投与量が、腫瘍中へ成長する血管の数の減少に有効な投与量であ る、請求項１７に記載の方法。
29. ２９．前記有効投与量が、異常な血管の新生で特徴付けられる眼疾患の症状の緩 和に有効な投与量である、請求項２５に記載の方法。
30. ３０．前記コラゲナーゼインヒビターが、コラゲナーゼの活性部位または二価金 属イオン結合部位に結合するペプチドである、請求項１７に記載の方法。
31. ３１．前記コラゲナーゼインヒビターが、コラゲナーゼに対する抗体であり、該 抗体がコラゲナーゼ活性をブロックする、請求項１７に記載の方法。
32. ３２．前記コラゲナーゼインヒビターが、前駆体コラゲナーゼの活性コラゲナー ゼヘの活性化を抑制する、請求項１７に記載の方法。
33. ３３．インビボでの血管形成の抑制用の化合物の効果を決定するための方法であ って、 毛細血管内皮細胞移動の抑制の有効投与量を決定する工程； 毛細血管内皮細胞増殖の抑制の有効投与量を決定する工程；血管の内部増殖およ び管形成の抑制の有効投与量を決定する工程；を包含する方法。
34. ３４．内皮細胞に対する化合物の前記効果を測定する、請求項３３に記載の方法 。
35. ３５．前記内皮細胞が、活性化内皮細胞および未刺激の細胞からなる群から選択 される、請求項３３に記載の方法。
36. ３６．さらに、細胞外マトリックスまたは基底膜のタンパク質の分解に対する化 合物の前記効果を決定することにより決定する、請求項３３に記載の方法。