JP2000516464A - 組織中の無酸素的運動能力を高めるための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト及び動物の体組織においてβ-アラニルヒスチジンジペプチドの合成と蓄積を増加させ、同時にクレアチンの蓄積を増加させる方法を記載する。これは、β-アラニン、β-アラニン及びクレアチン、またはβ-アラニン、L-ヒスチジン及びクレアチン、またはそれらの活性誘導体を含む組成物の摂取もしくは注入によりβ-アラニン及びクレアチンの血漿濃度、またはβ-アラニン、L-ヒスチジン及びクレアチンの血漿濃度を増加させることにより達成される。

Description

【発明の詳細な説明】 組織中の無酸素的運動能力を高めるための方法及び組成物 発明の背景 本発明は、筋肉及びその他の組織の無酸素的運動能力を高めるための方法及び 組成物に関する。 天然食品の補助物質(supplement)は、典型的には現代のヒト及び動物における 食餌の栄養素のレベル低下を補償するように設計される。特に、有用な補助物質 は摂取したとき組織の機能を高めるものである。とりわけ、特定の種類の動物の 食餌（その通常の食餌は肉や動物性食品のみから利用できる栄養素が不足する可 能性がある）を補給することは重要である(例えば、ヒト菜食主義者やその他の 動物は草食性食品を摂取する)。 例えば、スポーツ及び競技の社会においては、レジャーや労働の目的で身体的 頑強さを促進し強化する補助物質のような、特定的に運動能力を改善する自然食 品補助物質の重要性が高まっている。別の例としては、無酸素的(例えば乳酸生 成)ストレスが加齢とともに経験し得る疲労および不快感の発生を引き起し得る 。また無酸素的ストレスは、筋肉内圧力の増加により(例えばロッククライミン グ、フリーダイビング、シンクロナイズドスイミング等の間に)局所的な循環が 部分的あるいは完全に閉塞された場合の長時間の最大下の等尺運動からも起こり 得る。過剰な乳酸の生成は細胞内環境の酸性化を起こし得る。 クレアチン(すなわちN-(アミノイミノメチル)-N-グリシン、N-アミジノサルコ シン、N-メチル-N-グアニルグリシン、またはメチルグリコシアミン)は、骨格筋 及び高い可変的なエネルギー要求の能力を特徴とするその他の「励起可能な」組 織(例えば平滑筋、心筋、あるいは精子)において多量に見られる。クレアチンは 細胞内のエネルギー生成生化学的経路においてホスホリルクレアチンに変換され る。哺乳動物の骨格筋においては、典型的なクレアチンの合計含量(すなわちク レアチンとホスホリルクレアチン)は、新鮮な筋肉１キログラムあたり25mmol未 満から50mmol(すなわち筋肉１キログラムあたり3.2〜6.5グラム)まで変化し得る 。 クレアチンは肝臓で生成され、活性輸送系により例えば筋肉のような組織に取 り込まれる。体内でのクレアチン合成は食肉中に存在するクレアチンの摂取(例 えば平均的な肉食のヒトにおいては１日に体重１キログラムあたり5〜10ミリグ ラム、菜食主義者の食事においてはほぼゼロである)によっても増加される。 集中的な運動の継続、あるいは局所的な低酸素状態での運動の継続の間に、解 糖中に形成されたヒドロニウムイオンの蓄積および乳酸の蓄積(嫌気代謝)が細胞 内のpHを著しく低下させることがある。低下したpHはクレアチン-ホスホリルク レアチン系の機能を低下させ得る。細胞内pHの低下は、例えば筋繊維中の収縮タ ンパク質の機能のような、細胞内のその他の機能に影響し得る。 β-アラニンとヒスチジンのジペプチド及びそのメチル化類似体には、カルノ シン(β-アラニル-L-ヒスチジン)、アンセリン(β-アラニル-L-1-メチルヒスチ ジン)、あるいはバレニン(β-アラニル-L-3-メチルヒスチジン)が含まれる。こ れらのジペプチドはヒトやその他の脊椎動物の筋肉中に存在する。カルノシンは 例えばヒト及びウマ科の動物の筋肉中にかなりの量が見られる。アンセリン及び カルノシンは例えばイヌ、ラクダ、及び多くの鳥類の種の筋肉中に見られる。ア ンセリンは多くの魚類において見られる主要なβ-アラニルヒスチジンジペプチ ドである。バレニンは、水生哺乳動物及び爬虫類のいくつかの種に見られる主要 なβ-アラニルヒスチジンジペプチドである。ヒト、ウマ及びラクダでは、β-ア ラニルヒスチジンジペプチドの最大濃度は、激しい運動の間に集中的に使用され る急速収縮性解糖筋繊維(IIA及びIIB型)中に見られる。より低い濃度は、酸化的 緩徐収縮性筋繊維（Ｉ型）中に見られる。例えば、Dunnett，M．& Harris，R.C ．Equine Vet．J．Suppl．18，214-217(1995)を参照のこと。カルノシンは種々 の筋繊維型においてヒドロニウムイオン緩衝能に貢献していると推定され、ウマ II型繊維においては全体の最高50%である。 発明の概要 一般に、本発明は、筋肉及びその他の組織の無酸素的運動能力を高めるための 方法及び組成物に関する。前記方法は、体内の組織中でのクレアチン及びβ-ア ラニルヒスチジンジペプチド、あるいはβ-アラニン及びL-ヒスチジン類似体の 同時蓄積を含む。前記方法は組成物を体内に摂取させること、あるいは注入する ことを含む。前記組成物は、ヒトあるいは動物の筋肉において、β-アラニルヒ スチジンジペプチドの合成及び蓄積のためにクレアチン及び前駆体の利用可能性 及び吸収を増加させることができる化合物の混合物である。前記組成物は、それ が体内に導入されたときに、ヒトあるいは動物体内におけるβ-アラニルヒスチ ジンジペプチドの合成および蓄積を引き出すものである。 前記組成物は、クレアチン及びβ-アラニン、クレアチン、β-アラニン及びL- ヒスチジン、またはクレアチン及びβ-アラニンもしくはL-ヒスチジンの活性誘 導体の混合物を含む。β-アラニンまたはL-ヒスチジンのそれぞれは個々のアミ ノ酸であってもよく、あるいはジペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチド の成分であってもよい。β-アラニン及びL-ヒスチジンは活性誘導体であっても よい。活性誘導体は、体内でその物質と同じあるいは類似の方法で機能する物質 から誘導される化合物もしくはその前駆体、あるいはそのような物質にプロセシ ングされて体内に配置される化合物である。例としては、エステル及びアミドが 挙げられる。 一つの面において、本発明は、組織中のヒドロニウムイオン濃度を制御する方 法に関する。前記方法は、組織中のβ-アラニルヒスチジンジペプチド合成を増 加させるのに有効な量のβ-アラニンを血液あるいは血漿に供給し、組織をその 血液あるいは血漿にさらし、それによりβ-アラニルヒスチジンの濃度を前記組 織中で増加させるステップを含む。前記方法は、β-アラニルヒスチジンジペプ チド合成を増加させるのに有効な量のL-ヒスチジンを血液あるいは血漿に供給す るステップを含むことができる。 別の面においては、本発明は、組織の無酸素的運動能力を高める方法に関する 。前記方法は、組織中のβ-アラニルヒスチジンジペプチド合成を増加させるの に有効な量のβ-アラニンを血液あるいは血漿に供給し、組織中のβ-アラニルヒ スチジンジペプチド合成を増加させるのに有効な量のL-ヒスチジンを血液あるい は血漿に供給し、そして組織をその血液あるいは血漿にさらすステップを含む。 β-アラニルヒスチジンの濃度が前記組織中で増加する。 ある実施態様においては、前記方法は組織中のクレアチンの濃度を増加させる ステップを含む。この増加ステップは、組織中のクレアチン濃度を増加させるの に有効な量のクレアチンを血液あるいは血漿に供給する(例えば前記量のクレア チンを血液あるいは血漿に供給することによる)ことを含み得る。 前記方法の供給ステップは、前記量のβ-アラニンまたは前記量のβ-アラニン 及びL-ヒスチジンを含む組成物の摂取あるいは注入(例えば注射)、または摂取と 注入の組合せを含み得る。 前記方法は、血液あるいは血漿中のインスリン濃度を増加させることを含み得 る。インスリンの濃度は、例えばインスリンの注射により増加させることができ る。 前記組織は骨格筋であり得る。 別の面においては、本発明は、β-アラニンを含むペプチド源、約39〜約99重 量%の炭水化物、及び約60重量%までの水から実質的になる組成物に関する。前記 組成物は約1〜約20重量%のβ-アラニンを含む。前記ペプチド源はL-ヒスチジン を含むことができる。前記組成物は約1〜約20重量%のL-ヒスチジンを含むことが できる。 前記炭水化物は単純な炭水化物(例えばグルコース)であってよい。別の面にお いては、本発明は、β-アラニンを含むペプチド源、約1〜約98重量%のクレアチ ン源、及び約97重量%までの水から実質的になる組成物に関する。前記組成物は 約1〜約98重量%のβ-アラニンを含む。前記ペプチド源はL-ヒスチジンを含むこ とができ、前記組成物は約1〜約98重量%のL-ヒスチジンを含む。 前記ペプチド源はアミノ酸、ジペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、あ るいはそれらの活性誘導体の混合物であり得る。 前記組成物は食品補助物質とすることができる。前記クレアチン源はクレアチ ン一水和物であってよい。 血液または血漿中の成分の濃度は、血漿濃度の増加を起こすように機能できる 物質の注入(例えば注射)あるいは摂取により増加させることができる。前記組成 物は１日あたり約10グラム〜約800グラムの間の量で摂取させることができる。 この量は１日１回で、あるいは複数回に分けて投与することができる。 クレアチン及びβ-アラニルヒスチジンジペプチドの筋内含量が増加すること により、無酸素的運動に伴うヒドロニウムイオン生成の増加に対する細胞の許容 度が増加し、疲労が発生するまでの運動の持続期間を増加させることができる。 前記組成物及び方法は、調理あるいは加工中のβ-アラニン、L-ヒスチジンある いはクレアチンの分解または浸出(leaching)によるこれらの成分の損失を補充す るのに有用であり得る。また前記組成物及び方法は、菜食主義者の食事における これらの成分の欠損を補給するのにも有用であり得る。 前記方法及び組成物は、例えば、スポーツマン、競技者、ボディビルダー、シ ンクロナイズドスイミングのスイマー、兵士、老年者、競争馬、作業犬及びレー ス犬、競技用の鳥等においてβ-アラニルヒスチジンジペプチドを増加させるの に使用し、筋肉疲労の発生を防止し、遅延させることができる。 本発明のその他の利点及び特徴は詳細な説明及び請求の範囲から明らかになる であろう。 図面の簡単な説明 図１は、β-アラニン及びL-ヒスチジンを30日間にわたって(それぞれ体重１キ ログラムあたり100ミリグラム及び体重１キログラムあたり12.5ミリグラム、１ 日３回)給餌した後の、５頭のウマの給餌前及び給餌後２時間おきの血漿中のβ- アラニンの濃度の変化を示すグラフである。 図２は、β-アラニン及びL-ヒスチジンを30日間にわたって(それぞれ体重１キ ログラムあたり100ミリグラム及び体重１キログラムあたり12.5ミリグラム、１ 日３回)給餌した後の、５頭のウマの給餌前及び給餌後2時間おきの血漿中のL-ヒ スチジンの濃度の変化を示すグラフである。 図3a及び3bは、β-アラニン及びL-ヒスチジンの30日間の食餌補給(それぞれ体 重１キログラムあたり100ミリグラム及び体重１キログラムあたり12.5ミリグラ ム、１日３回)の初日及び最終日の、６頭のウマの給餌前及び給餌後時間毎の血 漿中のβ-アラニンの濃度の変化を比較して示すグラフである。 図4a及び4bは、β-アラニン及びL-ヒスチジンの30日間の食餌補給(それぞれ体 重１キログラムあたり100ミリグラム及び体重１キログラムあたり12.5ミリグラ ム、１日３回)の初日及び最終日の、６頭のウマの給餌前及び給餌後時間毎の血 漿中のL-ヒスチジンの濃度の変化を比較して表すグラフである。 図５は、β-アラニン及びL-ヒスチジンの30日間の食餌補給(それぞれ体重１キ ログラムあたり100ミリグラム及び体重１キログラムあたり12.5ミリグラム、１ 日３回)の初日及び最終日の、給餌前及び給餌後時間毎のウマ血漿中のβ-アラニ ンの平均濃度(n=6)の変化を比較して示すグラフである。 図６は、β-アラニン及びL-ヒスチジンの30日間の食餌補給(それぞれ体重１キ ログラムあたり100ミリグラム及び体重１キログラムあたり12.5ミリグラム、１ 日３回)の初日及び最終日の、給餌前及び給餌後時間毎のウマ血漿中のL-ヒスチ ジンの平均濃度(n=6)の変化を比較して示すグラフである。 図７は、６頭の純血種ウマのII型骨格筋繊維におけるカルノシン濃度の増加(I IA及びIIB型繊維の合計の平均)と、補給の１日目と30日目の間の血漿β-アラニ ン濃度-時間曲線下の当日の最初の12時間にわたる面積(AUC_(0-12hr))の増加と、 の相関関係を示すグラフである。 図８は、β-アラニン、ブロス、あるいはカルノシンの被験者への投与の平均 の結果を示すグラフである。 図９は、９時間の処置にわたる血漿β-アラニンの平均変化を示すグラフであ る。 図10は、体重１キログラムあたり10ミリグラムのβ-アラニンの経口摂取後の ９時間にわたる血漿β-アラニンの平均変化を示すグラフである。 図11は、処置期間の１日目及び30日目の24時間にわたる平均(n=6)血漿β-アラ ニン濃度を示すグラフである。 好ましい実施態様の説明 カルノシン、アンセリン及びバレニン等のβ-アラニルヒスチジンジペプチド は約6.8〜7.1の間のpKa値を有し、筋収縮及び疲労発生中の細胞内pHの恒常性の 制御に関与している。ヒドロニウムイオンの緩衝に関与しているその他の物質、 例えばタンパク質中のアミノ酸残基、無機及び有機のリン酸及び炭酸水素塩等の 含量は、その他の細胞機能へのそれらの関与により拘束される。β-アラニルヒ スチジンジペプチドは、細胞中にpH感受性ヒスチジン残基を蓄積する有効な方法 を提供する。筋肉β-アラニルヒスチジンジペプチド濃度の変化は個々の競技者 の無酸素的運動能力に影響する。 β-アラニルヒスチジンジペプチドはβ-アラニンとL-ヒスチジンから体内で合 成される。これらの前駆体は体内で生成されたり、摂取されたβ-アラニルヒス チジンジペプチドの分解からのものを含め、食餌から利用できるようにされる。 体内のβ-アラニンは筋肉等の組織に輸送される。典型的な給餌状態では、ヒト 及びウマ血漿中のL-ヒスチジンの濃度と比較してβ-アラニンの濃度は低い。こ れらの濃度は、カルノシン合成酵素であるカルノシンシンテターゼの、ミカエリ ス-メンテン定数(Km)により決定される、その基質に対する親和性と関連付けて 考えなければならない。ヒスチジンについてのKmは約16.8μＭである。β-アラ ニンについてのKmは約1000〜2300μＭの間である。β-アラニンに対するカルノ シンシンテターゼの低い親和性、及び筋肉中のβ-アラニンの低い濃度は、筋肉 中のβ-アラニンの濃度によりβ-アラニルヒスチジンジペプチドの合成が制限さ れていることを示す。 筋肉内のβ-アラニルヒスチジンジペプチド量を増加させると、筋肉の性能及 びその筋肉により達成される運動量に好都合に影響する。従って、β-アラニル ヒスチジンジペプチドの合成及び蓄積がヒトあるいは動物体内の組織において増 加される。 ヒトあるいは動物体内におけるβ-アラニルヒスチジンジペプチドの合成及び 蓄積は、β-アラニンの血液もしくは血漿濃度の増加、β-アラニン及びクレアチ ンの血液もしくは血漿濃度の増加、あるいはβ-アラニン、L-ヒスチジン及びク レアチンの血液もしくは血漿濃度の増加により、体内のクレアチン含量の増加と ともに増加させることができる。ジペプチドの増加は、β-アラニン濃度の増加 と同時に起こり得る。 β-アラニン、L-ヒスチジン及びクレアチンの血漿濃度は、β-アラニン、L-ヒ スチジン及びクレアチンあるいはそれらの活性誘導体の摂取または注入により増 加させることができる。前記組成物は、経口、経腸、あるいは非経口的に投与す ることができる。β-アラニン及びクレアチン、あるいはβ-アラニン、L-ヒスチ ジン及びクレアチンは好ましくは経口的に摂取される。 前記組成物は炭水化物(例えば単純な炭水化物)、インスリン、またはインスリ ンの生成を刺激する物質を含んでもよい。 前記組成物は食品の補助物質として摂取させることができる。好ましくは前記 組成物は１日に１回以上投与される。β-アラニンの投与量は体重１キログラム あたり約５ミリグラムから約200ミリグラムの間とすることができる。クレアチ ン(例えばクレアチン一水和物)の投与量は体重１キログラムあたり約５ミリグラ ムから200ミリグラムの間とすることができる。L-ヒスチジンの投与量は体重１ キログラムあたり約１ミリグラムから100ミリグラムの間とすることができる。 単純な炭水化物(例えばグルコース)の投与量は体重１キログラムあたり約0.5グ ラムから2.0グラムの間とすることができる。 80キログラムのヒトにおいては、１日あたりの適当な投与量は、0.4グラム〜1 6.0グラムのβ-アラニン、0.4グラム〜16.0グラムのクレアチン一水和物、0.08 グラム〜8.0グラムのL-ヒスチジン、あるいは40グラム〜160グラムのグルコース もしくはその他の単純な炭水化物とすることができる。前記組成物は摂取するた めの固体もしくは液体の剤形、あるいは懸濁体の剤形、あるいは体内に注入する ための液体もしくは懸濁体の剤形とすることができる。前記組成物は、１日あた り２グラム〜1000グラムの間の量(例えば10グラム〜800グラムの間の量)でヒト に摂取させるが、これは１日のうちに小分けして摂取させることができる。動物 における１日の摂取量は体重に関して調整されるだろう。 ヒト及び動物について、前記組成物は、 (a) 1重量%〜99重量%のβ-アラニン、 1重量%〜99重量%のクレアチン一水和物、及び 0重量%〜98重量%の水; (b) 1重量%〜98重量%のβ-アラニン、 1重量%〜98重量%のL-ヒスチジン、 1重量%〜98重量%のクレアチン一水和物、及び 0重量%〜97重量%の水; (c) 1重量%〜20重量%のβ-アラニン、 39重量%〜99重量%のグルコースまたはその他の単純な炭水化物、及び 0重量%〜60重量%の水、あるいは (d) 1重量%〜20重量%のβ-アラニン、 1重量%〜20重量%のL-ヒスチジン、 39重量%〜99重量%のグルコースまたはその他の単純な炭水化物、及び 0重量%〜60重量%の水、 とすることができる。 以下は、筋肉及びその他の組織の無酸素的運動能力を高めるための方法及び組 成物の方法の具体例である。実施例1 標準飼料への１日複数回のβ-アラニンとL-ヒスチジンの補給が純血種のウマ のＩ、IIAおよびIIB型の骨格筋繊維中のカルノシン濃度に及ぼす効果を評価した 。普通の健康状態の４〜９歳の実験用純血種ウマ（若い雌ウマ３頭と去勢したウ マ３頭）に、補給期間の開始に先立って１ヵ月（30日）（補給前期間）の給餌コ ンディショニングをおこなった。給餌コンディショニング期間中、各ウマに、複 合および単純炭水化物の供給源として１キログラムの成形飼料（Spillers競争馬 キューブ）と１キログラムの浸潰したサトウダイコンパルプを含む飼料を１日３ 回（それぞれ08:30、12:30および16:30）与えた。浸潰した干し草（乾燥重量で ３キログラム）も１日２回（09:00および17:00に）与えた。水は自由に飲めるよ うにした。 補給期間中は同一の給餌レジメを実施した。しかし、硬質飼料を与える際には β-アラニンとL-ヒスチジン（遊離塩基）を補給した。β-アラニンとL-ヒスチジ ンを標準飼料に直接混合した。β-アラニンとL-ヒスチジンの個々の投与量は体 重に応じて算出した。β-アラニンは体重１キログラムにつき100ミリグラムを、 L-ヒスチジンは体重１キログラムにつき12.5ミリグラムを投与した。餌の補給は このプロトコールの１日目に開始し、30日目に終わらせた。１、６、18、24およ び30日目に血液サンプル（５ミリリットル）を採取し、ヘパリンを添加した。１ 日目と30日目には、１回目の給餌前と合計12時間にわたり１時間おきに血液サン プルを採取した。残りの３日の採血日には、１回目の給餌前とその後の各給餌の ２時間後に血液を集めた。補給開始の前日（０日目）には、皮膚の局所麻酔後に Bergstrom-Stille経皮生検針を使って各ウマの右側の中間臀部筋(m．gluteusmed ius)から筋肉の生検材料を採取した。その後の筋生検材料はもとの採取部位に可 能なかぎり接近させて補給期間の終了直後（31日目）に採取した。ウマの臨床的 監視を毎日おこなった。この監視は肉眼による検査と体重測定、直腸温度の１日 ２回の測定、それに臨床生化学および血液学のための週１度の採血を含んでいた 。実験期間中、ウマには正式な訓練や運動を施さなかったが、毎日１時間自由に 運動させた。 凍結乾燥した筋生検材料から切り裂いた個々の筋繊維の断片は、Kaiserおよび Brcok，Arch．Neurol.，23:369-379（1970）に記載される方法の変法により、pH 4.50でプレインキュベートした後にpH9.6でミオシンATPアーゼ活性を組織化学的 に染色することで、Ｉ、IIAまたはIIB型のいずれかであると特性づけられた。 ヘパリン添加血漿サンプルを抽出し、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)で β-アラニンとL-ヒスチジンの濃度を分析した。計量した個々の筋繊維を抽出し 、DunnettおよびHarris，「筋肉および個々の筋繊維中のイミダゾールジペプチド 、ヒスチジン、1-メチルヒスチジン、3-メチルヒスチジンの高性能液体クロマト グラフィー測定」，J．Chromatogr．B．Biomed．Appl.，688:47-55（1997）に記 載される方法に従ってHPLCでカルノシンを分析した。 補給前後の繊維型に含まれるカルノシン濃度の差は、一方向分散分析(ANOVA) を用いてウマにおいて決定した。差が認められた場合には、多重比較検定（Fish er's PLSD）により有意差を求めた。 飼料にβ-アラニンとL-ヒスチジンを添加しても味覚上の問題はまったく生起 しなかった。30日の補給期間中、補給餌の有害な生理または行動作用はいずれの ウマにも観察されなかった。体重の顕著な変化は記録されず、直腸温度も正常範 囲内にとどまった。臨床生化学または血液学においても急性または慢性の変化が 認められなかった。補給開始前のウマの血漿中にはβ-アラニンは検出されなか った。用いたアッセイによる血漿中のβ-アラニンの定量の下限は３マイクロモ ル(μＭ)であった。補給開始前の６頭のウマの血漿L-ヒスチジン濃度は36.6〜54 .4μＭであった。 すべての採血日にわたる血漿β-アラニンおよびL-ヒスチジン濃度の個々の変 化を、６頭のウマのうち５頭についてそれぞれ図１および２に示す。補給期間が 増すにつれて、血漿β-アラニンおよびL-ヒスチジンの給餌前濃度は増加する傾 向にあった。さらに、30日の補給期間にわたって、補給に対する血漿濃度応答も 増加した。この応答はβ-アラニンの場合に、より大きかった。 最初の補給の前日と、その後補給期間の初日と最終日の時間ごとの血漿β-ア ラニンおよびL-ヒスチジン濃度の変化の比較を、６頭の各ウマについてそれぞれ 図3aと3b、および図4aと4bに示す。補給期間の初日（１日目）と最終日（30日 目）の24時間にわたる経時的血漿β-アラニン濃度の平均（±SD）変化（ｎ＝６ ）を図５に対比して示す。24時間にわたる時間曲線に対する平均血漿β-アラニ ン濃度下の面積(AUC_(0-24hr))は補給30日目に一層大きかった。 補給期間の初日（１日目）と最終日（30日目）の24時間にわたる経時的血漿L- ヒスチジン濃度の平均（±SD）変化（ｎ＝６）を図６に対比して示す。24時間に わたる時間曲線に対する平均血漿β-アラニン濃度下の面積(AUC_(0-24hr))は補給 30日目により大きかった。補給初日（１日目）に対比させたときの補給最終日(3 0日目）の血漿β-アラニンのより大きいAUCは、補給が進行するにつれてウマの 胃腸管からのβ-アラニンの吸収が増加することを示唆している。同様の効果が 補給期間中の血漿L-ヒスチジン濃度の変化に関しても認められた。β-アラニン およびL-ヒスチジンの最大血漿濃度はそれぞれの場合に給餌の約１〜２時間後に 出現した。 ６頭のウマから合計397本の骨格筋繊維（補給前 192本；補給後 205本）を切 除し、カルノシンについて分析した。６頭の各ウマから得られた補給前および補 給後のＩ、IIAおよびIIB型骨格筋繊維中の平均（±SD）カルノシン濃度（乾燥重 量１キログラムあたりのミリモル数(mmol kg^-1dw)で表す）を表１に示してある が、ここでｎは分析した個々の筋繊維の数である。β-アラニンおよびL-ヒスチ ジンの補給30日後に、６頭すべてのウマにおいてIIAおよびIIB型の繊維中の平均 カルノシン濃度が増加していた。これらの増加は７つの事例において統計的に有 意であった。IIB型骨格筋繊維中の平均カルノシン濃度の増加は６頭のウマのう ち５頭において統計的に有意であった。IIA型骨格筋繊維中の平均カルノシン濃 度の増加は６頭のウマのうち２頭において統計的に有意であった。 表1 * 補給前と有意に異なる、p<0.05 ** 補給前と有意に異なる、p<0.01 *** 補給前と有意に異なる、p<0.005 ６頭のウマから得られたIIAおよびIIB型骨格筋繊維中の平均カルノシン濃度の 絶対増加(例えば、mmol kg^-1dw)および増加パーセントを表２に示す。 表2 30日の補給後に筋カルノシン濃度のより大きい増加を示したウマはまた、補給 期間の１日目と30日目の間で血漿β-アラニンAUCのより大きい増加を示したこと が観察された。図７を参照すると、IIAおよびIIB型骨格筋繊維間で平均した平均 カルノシン濃度の増加と、補給１日目と30日目との最初の12時間にわたる血漿β -アラニンAUC(AUC_(0-12hr))の増加と、の間には有意な相関関係(r=0.986,p=0.00 5)が６頭のウマのうち５頭について認められた。回帰線を求めるために５頭のウ マだけを使用した。ウマ６（黒丸）は、１日目に観察された血漿β-アラニン濃 度の増加より高い、評価できる増加を補給最終日まで示さなかった。このウマは それぞれの採血日について漸増的増加を示した他の５頭のウマと相違していた。 こうした理由のため、回帰方程式を求めることからウマ６を除外した。 β-アラニンおよびL-ヒスチジンを30日間補給した後の筋カルノシン濃度の増 加は全体的な筋緩衝能の直接的増加を引き起こすだろう。この増加はHenderson- Hasselbach式を使って計算することができる。６頭の純血種ウマにおけるIIAお よびIIB型骨格筋繊維の筋緩衝能の増加に関する計算値を表３に示す。 表3 実施例2 常食への１日複数回のβ-アラニンとL-ヒスチジンの補給がヒトのＩ、IIAおよ びIIB型の骨格筋繊維のカルノシン含量に及ぼす効果を評価した。約40mg/kg(体 重)のβ-アラニンを供給するブロスを摂取した後の６人の正常被験者におけるβ -アラニンの血漿濃度をモニターした。10および20mg/kg(体重)の用量のβ-アラ ニンも投与した。 ブロスは次のように調製した。新鮮な鶏むね肉（皮と骨を取ったもの）を細か く切り刻み、水（鶏肉1.5kgにつき１リットル）と共に15分間ボイルした。残存 する鶏肉を目の粗い濾過にかけて取り除いた。濾液にニンジン、タマネギ、セロ リ、塩、コショウ、バジル、パセリ、トマトピューレを加えて味付けし、さらに 15分間再ボイルし、冷ました後に４℃で微細なモスリンに通して最終濾過にかけ た。1.5kgの鶏肉と１Lの水から870mLのブロスが得られた。このストックの一部 について、その全β-アラニル-ジペプチド含量（例えば、カルノシンおよびアン セリン）およびβ-アラニンをアッセイした。典型的な分析は以下のとおりであ った。 総β-アラニル-ジペプチド 74.5mM 遊離β-アラニン 5.7mM ６人の男性被験者は普通の健康状態にあり、表４に示すとおり年齢は25歳から 53歳であった。実験を一夜の絶食（例えば、肉を含む最後の食事をとった後最低 12時間）後に開始した。被験者には実験開始前に少量の温水を飲む自由が与えら れた。カテーテル法を08:30に始め、実験を09:00に開始した。 対照として、８mL/kg(体重)の水(例えば、体重が75kgの被験者では600mL)を摂 取させた。 一つのセッションでは、約40mg/kg(体重)のβ-アラニン（例えば、アンセリン およびカルノシンの形のもの）を含む８mL/kg(体重)のブロスを摂取させた。体 重が75kgの被験者において、これは３gのβ-アラニンを含むブロスを600mL摂取 することに相当する。別のセッションでは、試験量のβ-アラニンを含む３mL/kg (体重)の液体を追加の５mL/kg(体重)の水と共に摂取させた。すべてのセッショ ンにおいて、被験者は摂取後１〜２時間のうちにさらに８mL/kg(体重)の 水（50mLずつ）を飲んだ。６時間後に菜食主義者用のピザを与えた。８時間後に 常食に戻った。 2.5mLの静脈血サンプルを、最初の90分間は10分おきに、その後は120、180、2 40および360分後に留置カテーテルから採取した。抗凝固剤としてリチウム-ヘパ リンを含むチューブ中に血液サンプルを分配した。カテーテルは食塩水で洗い流 すことで維持した。Jones & Gilligan（1983）J．Chromatogr．266:471-482（19 83）に記載される方法に従ってHPLCで血漿サンプルを分析した。 表４にはβ-アラニン吸収実験中の処置の割当てがまとめてある。概算された 等量のβ-アラニンを表３に示す。 表4 それぞれの処置後の血漿濃度曲線を図８にグラフで示す。表４の処置計画に従 うβ-アラニン、ブロスまたはカルノシンの投与の平均結果。鶏肉ブロスの摂取 後にまたは他の処置後にカルノシンもアンセリンも血漿中に検出されなかった。 ブロスの摂取は最大血漿濃度427.9(SD 161.8)μＭをもたらした。一人の被験者 に20mg/kg(体重)のβ-アラニンに等しいカルノシンを投与すると、血漿β-アラ ニン濃度が同様に増加した。 対照を除く全ての処置の投与は血漿タウリン濃度を増加させた。タウリン濃度 の変化はβ-アラニンの濃度変化を密に反映していた。自然食品であるブロスの 投与は血漿タウリンの同様の増加を引き起こし、このことは、こうした応答がほ とんどの食事の摂取後に普通に起こっていることを示している。実施例3 10mg/kg（体重）のβ−アラニンを１日３回(すなわち、朝、昼、及び夜)、７ 日間投与した場合に、β−アラニン及びタウリンの血漿濃度プロフィールにどの ような影響があるかを調べた。３人の被験者に、10mg/kg（体重）のβ−アラニ ンを１日３回、７日間投与し、この７日間の最初と最後における血漿濃度プロフ ィールを調べた。 被験者は、年齢33〜53歳の正常健康体の３人の男性とした。被験者に、10mg/k g（体重）のβ−アラニンを１日３回、８日間投与した。被験者のうちの２人に は、これに続けて、20mg/kg（体重）のβ−アラニンを１日３回、さらに７日間 （９日目から15日目まで）投与した。被験者は、一晩絶食させた後、１日目(い かなる処置も施す前)、８日目、及び15日目の午前８時に血液採取室に出向かせ た。被験者には、この試験の前12時間にはいかなる肉を含んだ食事もとらないよ うに頼んでおいた。これらの３つの各試験日において、被験者にカテーテルをい れ、午前９時、正午及び午後３時ちようど又はその近くにβ−アラニンを投与し たとき、最初の血液サンプルを採取した。血液サンプルを、30分、60分、120分 及び180分後に採取し、β−アラニン及びタウリンの血漿濃度の変化を分析した 。各試験日に24時間尿サンプルを採取し、HPLCで分析してβ−アラニン及びタウ リンの排泄量を測定した。処置の概要を表５に示す。 表5 血漿β−アラニン濃度は、図９に要約する。各回の投与により、投与後1/2時 間又は１時間で最大β−アラニン濃度に達し、その後、３時間（すなわち、次回 の投与直前）で0−10μＭの基底レベルまで減少した。血漿濃度曲線下面積（AUC ）によって示されるように、処置８日目の応答は、１日目よりも低下する傾向に あった。実施例4 40mg/kg（体重）のβ−アラニンを１日３回(すなわち、朝、昼、及び夜)、２ 週間投与した場合に、筋肉のカルノシン含量及び最大随意収縮力の66％における 等尺性持久力にどのような影響があるかを調べた。 被験者として、代謝又は筋肉疾患の形跡のない、年齢25〜32歳の正常な６人の 男性を募集した。被験者には、最近の食事及び補給物質の摂取習慣に関して質問 した。被験者の中には、最近、クレアチンを含有する補給物質（supplement）を 摂取した者はおらず、また最近の試験的補給法でそのようにした者もいなかった 。被験者の身体的特徴を表６に要約する。 表6 処置の２日前に、座らせた状態における被験者の膝伸筋の最大随意（等尺性） 収縮力（MVC）を予備測定した。MVC出力を即時にディスプレイ表示することによ り被験者を誘導しながら、Macflexシステムを用いてMVCを測定した。各被験者に おいて、２回の試行を実施し、声援に関わらずもはや標的の力を維持することが できなくなるまで66％MVCを持続させて、66％MVCにおける持久力を測定した。こ の最初の収縮の後、被験者を等尺性椅子に座らせたまま、60秒間の休憩時間を与 えた。休憩時間の後、第２の収縮を疲労するまで継続させた。第２の休憩を60秒 間与えた後、第３の収縮を疲労するまで継続させた。 処置の１日前に、被験者を午前８〜10時の間に等尺性試験室に出向かせた。MV Cを測定するとともに、上記のように60秒間の休憩間隔をとりながら３回の収縮 を実施し、66％MVCにおける持久力を測定した。測定は被験者の利き足を用いて 実施した。外側広筋の外側部分の生検材料を再度利き足から採取した。 一晩絶食させるとともに最後にとった肉を含んだ食事から少なくとも12時間経 過させた後、処置の１日目に、被験者を午前８時に血液採取室に出向かせた。各 被験者にカテーテルを入れて最初の血液サンプルを採取した後、実施例３に記載 する補給及び血液採取プロトコールを実施した。10mg/kg(体重)のβ−アラニン を０時間目(午前９時)、３時間目及び６時間目に投与した。 2−15日目では、被験者に10mg/kg（体重）のβ−アラニンを３回投与し続けた 。 14日目の朝に、処置後における等尺性運動試験を利き足において実施し、MVC を測定するとともに、処置前に測定した66％MVCに対する相対66％MVCにおける持 久力を測定した。その日の午後に、処置前に生検材料を採取した部位の近辺から 外側広筋の生検材料を採取した。 15日目に、１日目に実施した手順を繰り返し、補給15日間にわたるβ−アラニ ン及びタウリンの血漿濃度プロフィールの全体的な変化を求めた。10mg/kg（体 重）量を１日３回投与した１日目及び15日目の０、３及び６時間目に10mg/kg（ 体重）のβ−アラニンを経口投与した後、９時間にわたる血漿β−アラニンの平 均変化を図10に示す。 １人の追加被験者（No.7）には、10mg/kg（体重）の用量を３回、７日間投与 した後、20mg/kg（体重）の用量を３回、７日間投与する試験を実施した。この 被験者からは、筋肉生検材料を採取しなかった。 ６人の被験者から採取した筋肉生検材料中の筋肉カルノシン含量には、明らか な変化はなかった。実施例２で述べたように、６人の被験者における血漿タウリ ン濃度の変化は、血漿β−アラニン濃度を反映していた。 10mg/kg（体重）のβ−アラニンを３回投与する１日前及び投与した14日後に おけるMVC及び66％MVCにおける持久力の測定値を表７に示す。66％MVCにおける 平均持久時間は、６人の被験者のうち５人で増加した。また、より多くの用量を 投与した被験者７においても増加が見られた。 表7その他の実施態様は請求の範囲内のものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 ジョハンソン，ケニー スウェーデン国 エス―112 39 ストッ クホルム，エスティー エリクスゲーテン 16，フェアリング スポート ニュート リッション (72)発明者 ドゥネット，マーク イギリス国 シービー８ ８アールジェイ サフォーク，ニューマーケット，ガゼリ ー，ハイウッド ロード 78 (72)発明者 ジョハンソン，ケニー スウェーデン国 エス―112 39 ストッ クホルム，エスティー エリクスゲーテン 16，フェアリング スポート ニュート リッション

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．組織中におけるβ-アラニルヒスチジンジペプチド合成を増加させるのに有 効な量のβ-アラニンを血液または血漿に供給し、 組織を前記血液または血漿にさらし、それによりβ-アラニルヒスチジンの 濃度を前記組織中で増加させる、 ことを含んでなる、組織中のヒドロニウムイオン濃度を制御する方法。 ２．組織中のβ-アラニルヒスチジンジペプチド合成を増加させるのに有効な量 のL-ヒスチジンを血液または血漿に供給することをさらに含む、請求項１に記 載の方法。 ３．組織中のクレアチンの濃度を増加させることをさらに含む、請求項１に記載 の方法。 ４．組織中のβ-アラニルヒスチジンジペプチド合成を増加させるのに有効な量 のL-ヒスチジンを血液または血漿に供給することをさらに含む、請求項３に記 載の方法。 ５．組織中のクレアチンの濃度を増加させることが、組織中のクレアチン濃度を 増加させるのに有効な量のクレアチンを血液または血漿に供給することを含む 、請求項３に記載の方法。 ６．組織中のβ-アラニルヒスチジンジペプチド合成を増加させるのに有効な量 のL-ヒスチジンを血液または血漿に供給することをさらに含む、請求項５に記 載の方法。 ７．供給段階が前記量のβ-アラニンを含有する組成物の摂取を含んでなる、請 求項１に記載の方法。 ８．供給段階が前記量のβ-アラニンを含有する組成物の注入を含んでなる、請 求項１に記載の方法。 ９．血液または血漿中のインスリンの濃度を増加させることをさらに含む、請求 項１に記載の方法。 10．組織中のβ-アラニルヒスチジンジペプチド合成を増加させるのに有効な量 のL-ヒスチジンを血液または血漿に供給することをさらに含む、請求項９に記 載の方法。 11．組織が骨格筋である、請求項１に記載の方法。 12．組織がヒト組織である、請求項１に記載の方法。 13．組織が動物組織である、請求項１に記載の方法。 14．組織中におけるβ-アラニルヒスチジンジペプチド合成を増加させるのに有 効な量のβ-アラニンを血液または血漿に供給し、 β-アラニルヒスチジンジペプチド合成を増加させるのに有効な量のL-ヒス チジンを血液または血漿に供給し、 組織を前記血液または血漿にさらし、それによりβ-アラニルヒスチジンの 濃度を前記組織中で増加させる、 ことを含んでなる、組織の無酸素的運動能力を高める方法。 15．組織中のクレアチンの濃度を増加させることをさらに含む、請求項14に記載 の方法。 16．供給段階が前記量のβ-アラニン及び前記量のL-ヒスチジンを含有する組成 物の摂取を含む、請求項14に記載の方法。 17．供給段階が前記量のβ-アラニン及び前記量のL-ヒスチジンを含有する組成 物の注入を含む、請求項14に記載の方法。 18．血液または血漿中のインスリンの濃度を増加させることをさらに含む、請求 項14に記載の方法。 19．組織が骨格筋である、請求項14に記載の方法。 20．組織がヒト組織である、請求項14に記載の方法。 21．組織が動物組織である、請求項14に記載の方法。 22．β-アラニンを含むペプチド源、 約39〜約99重量%の炭水化物、及び 約60重量%までの水、 から実質的になる組成物であって、約1〜約20重量%のβ-アラニンを含むこと を特徴とする前記組成物。 23．ペプチド源がL-ヒスチジンを含み、前記組成物が約1〜約20重量%のL-ヒスチ ジンを含む、請求項22に記載の組成物。 24．β-アラニンを含むペプチド源、 約1〜約98重量%のクレアチン源、及び 約97重量%までの水、 から実質的になる組成物であって、約1〜約98重量%のβ-アラニンを含むこと を特徴とする前記組成物。 25．ペプチド源がL-ヒスチジンを含み、前記組成物が約1〜約98重量%のL-ヒスチ ジンを含む、請求項24に記載の組成物。