JP2000516806A - シュート分裂組織特異的プロモーター配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 植物ＵＦＯ遺伝子の上流の非コード領域から単離された新規の組織特異的プロモーターが提供される。このプロモーターは、対象の産物を発現する核酸配列に作動可能なように結合されており、シュート分裂組織特異的組織において前記配列の転写を開始させ、調節する。

Description

【発明の詳細な説明】 シュート分裂組織特異的プロモーター配列 連邦政府支援の研究に関する陳述 本発明は、国立科学財団(National Science Foundation)によって授与された 補助金No.IBN-9406948に基づく政府の援助によりなされたものである。政府は、 本発明において一定の権利を有するものである。 発明の分野 本発明は、一般的には植物の遺伝子工学的操作に関し、具体的にはシュート分 裂組織(shoot meristem)特異的発現を指令することが可能な組織特異的プロモー ターに関する。 発明の背景 遺伝子は、誘導性の組織特異的様式または構成性様式で調節される。遺伝子発 現の調節に関与する構造エレメントには様々な種類が存在する。遺伝子の近傍ま たは遺伝子内に位置するシス作用エレメントは、配列特異的ＤＮＡ結合性タンパ ク質、すなわちトランス作用因子と結合するように働く。タンパク質がＤＮＡに 結合すると、遺伝子転写の開始、維持またはダウンレギュレーションが起こる。 遺伝子を調節するシス作用エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー およびサイレンサーが挙げられる。プロモーターは、転写開始部位の隣に位置し 、方向依存的に機能し、一方、エンハンサーおよびサイレンサーエレメントは、 プロモーターの活性をモジュレートするものであり、それらの向きおよび転写開 始部位からの距離に関しては変更可能である。 植物の遺伝子工学的操作において使用され得る種々のプロモーター配列が利用 可能である。そのようなプロモーターを利用することによってそのプロモーター 領域の3'末端に作動可能なように(operably)連結された対象の核酸配列の転写を 開始させることができる。プロモーターは、強度、組織特異性、発育段階特異性 などの転写特異的性質を有することが多い。 植物における遺伝子発現はいくつかのプロモーターによって誘導され得る。対 象の遺伝子の内因性プロモーターがその遺伝子の転写調節に利用され得るが、プ ロモーターは外来性の調節配列であってもよい。植物発現ベクターにおいて利用 されるウイルスプロモーターの例としては、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡおよび１９ ＳＲＮＡプロモーター(Brissonら，Nature，310:511，1984;Odellら，Nature，3 13:810，1985)；ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）の全長転写物プロモ ーター(Gowdaら，J．Cell Biochem.，13D:301，1989)ならびにＴＭＶのコートタ ンパク質プロモーター(Takamatsuら，EMBO J．6:307，1987)が挙げられる。また 、植物プロモーターとしては、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼの小サブ ユニット(ssRUBISCO)由来の光誘導性プロモーター（Coruzziら，EMBO J.，3:167 1，1984;Broglieら，Science，224:838，1984）；マンノピン(mannopine)シンタ ーゼプロモーター(Velterら，EMBO J.，3:2723，1984)、ノパリンシンターゼ（ ＮＯＳ）およびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリ ウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘導プラスミド上に 保持されている）および熱ショックプロモーター、例えば大豆hsp17.5-Eまたはh sp17.3-B(Gurleyら，Mol．Cell Biol.，6:559，1986;Severinら，Plant Mol．Bi ol.，15:827，1990)が挙げられる。 植物の遺伝子工学的操作において利用されるプロモーターとしては、構成性お よび誘導性天然プロモーターならびに遺伝子操作されたプロモーターが挙げられ る。ＣａＭＶプロモーターは構成性プロモーターの例である。有用であるために は、誘導性プロモーターは、１）誘導物質の不存在下で発現を低下させ：２）誘 導物質の存在下で発現を高め；３）植物の正常な生理機能を妨げない誘導スキー ムを使用するものであり；そして４）その他の遺伝子の発現に対して何の影響も 及ぼさないということが必要である。植物において有用な誘導性プロモーターの 例としては、銅イオンによって活性化される酵母メタロチオネインプロモーター (Mettら，Proc．Natl．Acad．Sci.，U.S.A.，90:4567，1993)：置換ベンゼンス ルホンアミド、例えば除草剤毒性緩和剤によって活性化されるIn2-1およびIn2-2 調節配列（Hersheyら，Plant Mol．Biol.，17:679，1991）；ならびにグルココ ルチコイドによって誘導されるＧＲＥ調節配列（Schenaら，Proc．Natl．Acad． Sci.，U.S.A.，88:10421，1991）などの化学的手段によって誘導されるプロモー ターが挙げられる。 組織特異的プロモーターも植物における遺伝子の発現に利用され得る。トラン スジエニック植物において有用な組織特異的プロモーターとしては、cdc2aプロ モーターおよびcyc07プロモーターが挙げられる（Itoら，Plant Mol．Biol.，24 :863，1994;Martinezら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:7360，1992;Medford ら，Plant Cell，3:359，1991;Teradaら，Plant Journal，3:241，1993;Wissenb achら，Plant Journal，4:411，1993）。植物において利用されるさらなる組織 特異的プロモーターとしては、ヒストンプロモーター（Atanassovaら，Plant Jo urnal，2:291，1992）；シンナミル(cinnamyl)アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｃ ＡＤ）プロモーター(Feuilletら，Plant Mol．Biol.，27:651，1995)；マスター ドCHS1プロモーター（Kaiserら，Plant Mol．Biol.，28:231，1995）；マメgrpl .8プロモーター(Kellerら，Plant Mol．Biol.，26:747，1994)；PAL1プロモータ ー(Ohlら，Plant Cell，2:837，1990)；ならびにカルコンシンターゼＡプロモー ター（Plant Mol．Biol.，15:95-109，1990）が挙げられる。 発明の概要 本発明は、Unusual Floral Organ遺伝子（ＵＦＯ）から単離された新規の組織 特異的プロモーターを提供するものである。本発明のプロモーターが対象の産物 を発現する核酸配列に融合されているトランスジェニック植物は表現型を呈示し 、このことはそのプロモーターがシュート分裂組織において異種遺伝子の機能的 発現を誘導することができることを示す。 第１の実施態様においては、本発明は、植物のUnusual Floral Organ（ＵＦＯ ）遺伝子から単離された非コード調節配列および核酸配列を含む核酸構築物であ って、該核酸配列が対象のタンパク質またはアンチセンスＲＮＡから選択される 産物を発現し、そして該核酸配列が非コード配列に対して異種である前記核酸構 築物を提供する。この構築物は、シュート分裂組織特異的様式で対象の遺伝子を 発現するトランスジェニック植物を作出するのに有用である。 第２の実施態様においては、本発明は、本発明の核酸構築物を含むトランスジ ェニック植物細胞ならびにかかる細胞を含む植物を提供する。 さらなる実施態様においては、本発明は、対象のタンパク質またはアンチセン スＲＮＡから選択される産物を発現する核酸配列の転写を増大させる方法を提供 する。この方法は、植物のゲノム内に本発明の核酸構築物が組み込まれている植 物を得て、その植物を成長に適した条件下に置くことを含む。 図面の簡単な説明 図１Ａは、ＵＦＯ遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列ならびに 若干の5'および3'非コード配列である。 図１Ｂは、ＵＦＯプロモーターの3'末端2.6kbのヌクレオチド配列である。開 始コドンATGには下線が引かれている。 図２は、ＵＦＯおよびＦＩＭタンパク質配列の比較、ならびに対立遺伝子ufo- 2からufo-6と関連したufo突然変異の位置である。 図３は、ＵＦＯプロモーターの制限地図である。 図４は、初期心臓型ステージ中（パネルＡ）、魚雷型ステージ中（パネルＢ） 、幼苗中（パネルＣ）、および花誘導後（パネルＤ）におけるUFO::GUSトランス ジェニック植物におけるＧＵＳ活性の写真を示す。 好ましい実施態様の説明 本発明は、シュート分裂組織特異的遺伝子発現に有用な新規のプロモーター配 列を提供する。シュート頂端分裂組織（成長点）は一次植物体を形成し、しばし ば分化して花を形成する。本発明にしたがって、シュート分裂組織における所望 の遺伝子の発現に基づいて植物表現型を変更することができる核酸構築物が提供 される。核酸構築物は、表現型の変更をもたらす対象の配列を含み、この配列は 本発明のシュート特異的プロモーターの転写開始調節下でその下流に位置づけら れる。シュート分裂組織特異的プロモーターは、発育の調節に関与する遺伝子の シュート分裂組織における特異的発現に有用である。かかる遺伝子としは、開花 に関与する遺伝子、ならびに毒素をコードすることによって病原体から保護する 遺伝子が挙げられる。 第１の実施態様において、本発明は、植物Unusual Floral Organ（ＵＦＯ）遺 伝子の上流から単離された非コード調節配列を含む核酸構築物であって、この非 コード調節配列が対象のタンパク質またはアンチセンスＲＮＡから選択される産 物を発現する核酸配列に作動可能なように結合されており、該核酸配列が前記非 コード配列に対して異種である前記核酸構築物を提供する。この構築物は、植物 内で機能する転写／翻訳開始領域ならびに転写／翻訳終結領域を含む。構築物を 作製するにあたっては、適正な方向および適正なリーディングフレームの核酸配 列が得られるように、種々の成分核酸配列が操作され得る。ＵＦＯ遺伝子調節配 列、またはプロモーターは、遺伝子の非コード領域に位置しており、シュート頂 端分裂組織において強い発現を示す。約４キロベースの5'非コード配列を本明細 書の実施例に記載したようにしてコード配列の上流から単離した。図１Ｂにはプ ロモーターの約2.6kbの3'末端領域の配列が示されている。主な転写開始部位は 、下線が引かれているATG開始コドンに対して-225bpのところにある。転写開始 配列には、TATAAおよびCAATボックス配列などの転写調節領域ならびに転写産物 の組織特異性を調節する配列が含まれる。本発明の核酸構築物においては、ATG 開始コドンは、典型的には、対象の産物を発現する核酸配列によって提供される 。 ＵＦＯ遺伝子の5'非翻訳領域および対象の産物を発現する核酸配列の5'領域に ある便利な制限部位を同定して、その２つの配列を連結するアダプターを使用す ることができる。あるいはまた、対象の産物を発現する核酸配列を挿入するため にＵＦＯ非コード領域のすぐ下流にポリリンカーを導入することができる。 プロモーターまたは調節エレメントの調節制御下に対象の産物を発現する核酸 配列を置くということは、発現がそのプロモーターまたは調節エレメントによっ て調節されるようにその配列を位置づけることを意味する。一般的に、プロモー ターはそれらが制御する遺伝子の上流に配置される。したがって、プロモーター ／遺伝子の組み合わせの構築においては、プロモーターは、遺伝子の上流側で、 天然状態におけるプロモーターとそのプロモーターが制御する遺伝子の間の距離 に近い転写開始部位からの距離のところに配置されるのが好ましい。当技術分野 で公知のように、この距離の多少の変動はプロモーターの機能を損なうことなく 許容することができる。同様に、その制御下に置かれた遺伝子に対する調節エレ メントの好ましい位置づけは、そのエレメントが調節する構造遺伝子に対する天 然の位置を反映する。この場合も、当技術分野で公知のように、この距離の多少 の変動を順応させることができる。本発明の構築物に使用される5’非コード配 列は、約４kbp以下の長さである。 その調節制御下にある遺伝子の発現中のプロモーターの機能は、転写段階では ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイ（in sit uハイブリダイゼーション）を用いて、翻訳段階では合成されたタンパク質につ いての特異的機能アッセイを用いて（例えば、酵素活性またはタンパク質のイム ノアッセイによって）試験することができる。 本明細書で用いる場合、「核酸配列」という用語は、個々の断片の形をした、 または大きな構築物の１構成成分としのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌ クレオチドのポリマーを意味するものである。対象の産物を発現する核酸は、ｃ ＤＮＡ断片から、または組換え転写ユニットにおいて発現され得る合成遺伝子を 提供するオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。本発明のポリヌクレ オチドまたは核酸配列としては、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列が挙げられ る。 本発明で用いる核酸配列は、いくつかの方法によって得ることができる。例え ば、ＤＮＡは当技術分野で周知のハイブリダイゼーション法を用いて単離するこ とができる。このハイブリダイゼーション法には、限定するものではないが、１ ）共有のヌクレオチド配列を検出するためのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー へのプローブのハイブリダイゼーション；２）共有の構造特性を検出するための 発現ライブラリーの抗体スクリ−ニング；および３）ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）による合成が含まれる。特定の遺伝子の配列は、GenBank、National Inst itutes of Healthのコンピューターデータベースにも見いだせる。 「対象の産物を発現する核酸配列」という語句は、対象のタンパク質またはア ンチセンスＲＮＡから選択される産物を発現する構造遺伝子を意味する。「構造 遺伝子」という用語は、転写を誘導する非コード調節配列を除外するものである 。構造遺伝子は、植物、真菌、動物、細菌ゲノムもしくはエピソーム、真核細胞 、核もしくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたは化学的に合成 されたＤＮＡなどの当技術分野で公知のあらゆる起源から全体的にまたは部分的 に誘導され得る。構造遺伝子は、コード領域または非翻訳領域のいずれかにおい て、発現産物の生物活性もしくは化学構造、発現率または発現調節の様式に影響 を及ぼす１以上の改変を含み得る。そのような改変としては、限定するものでは ないが、１個以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失および置換が挙げられ る。構造遺伝子は、連続したコード配列を構成していても、適当なスプライス接 合部によって結合された１個以上のイントロンを含んでいてもよい。また、構造 遺伝子は融合タンパク質もコードし得る。本発明の核酸構築物の植物組織への導 入には、構造遺伝子とそのプロモーター、例えばＵＦＯプロモーターがそれぞれ 異なる植物種から誘導される構築が含まれるものである。 「異種核酸配列」という用語は、本明細書で用いる場合、本発明の調節配列ま たはプロモーターに作動可能なように結合された少なくとも１つの構造遺伝子を 意味するものである。この核酸配列は、外来種に、またはそのもとの状態から実 質的に変更されている場合には同一種に由来するものである。例えば、「異種核 酸配列」という用語には、同一種に由来する核酸が含まれ、そのような配列は天 然または野生型プロモーター（例えばＵＦＯプロモーター）とは異なるプロモー ターに作動可能なように連結される。 「作動可能なように結合された」という用語は、プロモータ一配列とプロモー ター配列によって調節される構造遺伝子との間の機能的な連結を意味する。作動 可能なように連結されたプロモーターは、構造遺伝子によって発現される産物の 発現を調節する。 本発明で用いることのできる構造遺伝子の例としては、バチルス・ツリンギエ ンシス(Bacillus thuringiensis)毒素遺伝子（有害生物／病原体を防御する）お よびLEAFY遺伝子（植物の開花を調節する）が挙げられる。本発明のプロモータ ーに作動可能なように連結することができる対象の構造遺伝子は種々利用可能で ある。例えば、殺虫剤に対する耐性の向上に関連する種々の配列が用いられ得る 。そのような配列により、例えば、バチルス・ツリンギエンシス由来のタンパク 質毒素の発現がもたらされる。さらに、除草剤に関連する配列も使用され得る。 そのような配列によって、突然変異5-エノールピルビル-2-ホスホシキミ酸シン ターゼの発現がもたらされ、グリフォセート(glyphosate)に対する感受性が低減 され得る。かかる配列によって、ブロモキシニルの解毒に関与する遺伝子産物の 発現ももたらされ得る。ストレス（スーパーオキシドジスムターゼに対する遺伝 子によってもたらされるものなど）、温度変化、浸透圧変化、塩分（プロリンの 過剰産生に関連する遺伝子など）などに対する抵抗性の増大に関連する配列も使 用され得る。シュート分裂組織の成長は、特定の要求に応じて高めたり、低下さ せたりとモジュレートされ得る。アンチセンス配列を用いることにより、成長ま たはその他の表現型特性を低減し得る。 「遺伝子改変」または「遺伝子改変された」という用語は、本明細書で用いら れる場合、１以上の異種核酸配列を１以上の植物細胞（この細胞は性的に受容能 のある(sexually competent)、生存可能な全植物体を形成することができる）に 導入することを意味する。「遺伝子改変された」という用語は、本明細書で用い られる場合、上記のプロセスによって作出された植物を意味する。本発明の遺伝 子改変された植物は、生殖細胞系列内に保持された外来遺伝子が農業的に有用な 植物品種に挿入され得るか、農業的に有用な植物品種に改良され得るように、自 家受粉または同一種のその他の植物との他家受粉することができる。「植物細胞 」という用語は、本明細書で用いられる場合、プロトプラスト、配偶子産生細胞 、および全植物に再生する細胞を意味する。植物細胞としては、植物内の細胞な らびに培養物中のプロトプラストが挙げられる。したがって、全植物に再生可能 な多様な植物細胞を含む種子は、「植物細胞」の定義に含まれるものである。植 物組織としては、根、シュート、花粉、種子、クラウンゴールなどの腫瘍組織、 ならびに胚、カルスなどの培養物中の種々の形態の植物細胞の集合物から誘導さ れた分化または未分化組織が挙げられる。 本明細書で用いられる場合、「植物」という用語は、全植物、植物の部分、植 物細胞または例えば植物組織などの植物細胞の１群のいずれかを意味する。苗木 も「植物」の意味に含まれる。本発明に含まれる植物は、被子植物、裸子植物、 単子葉植物、双子葉植物などの形質転換技術に適用可能なあらゆる植物である。 単子葉植物の例としては、限定するものではないが、アスパラガス、トウモロ コシ(field corn)、スイートコーン、大麦、小麦、米、モロコシ、タマネギ、パ ールミレット、ライ麦、およびカラスムギが挙げられる。双子葉植物の例として は、限定するものではないが、トマト、タバコ、綿、菜種、フィールドビーン(f ield beans)、大豆、コショウ、レタス、エンドウ、アルファルファ、クローバ ー、アブラナ属作物もしくはアブラナ・オレラセア(Brassica oleracea)（例え ば、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、ラディッシュ、ニ ンジン、ビート、ナス、ホウレンソウ、キュウリ、カボチャ、メロン、カンタロ ープ、ヒマワリ、ならびに種々の観葉植物が挙げられる。木種としては、ポプラ 、マツ、セコイア、ヒマラヤスギ、オークなどが挙げられる。 本発明の遺伝子改変された植物は、植物細胞を上記のような本発明の核酸構築 物と接触させることによって作出される。この構築物は好ましくはベクター内に 含まれる。本発明においてシュート分裂組織発現のための植物細胞の形質転換に 用いられるベクターは、本発明のプロモーターに作動可能なように結合された、 対象の産物を発現する少なくとも１つの構造遺伝子を含む核酸配列を含む。異種 核酸配列を有するベクターは、本明細書に記載したように、形質転換された細胞 を培養物中の非形質転換細胞から選択することができるように１以上の選択マー カー遺伝子も含むのが好ましい。 本明細書で用いる場合、「マーカー」という用語は、マーカーを含む植物また は植物細胞の選択またはスクリーニングを可能にする特性または表現型をコード する遺伝子を意味する。好ましくは、マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であ り、それによって適当な抗生物質を用いることにより形質転換細胞を形質転換さ れていない細胞から選択することができる。適当な選択可能なマーカーの例とし ては、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン −β−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチングアニンホス ホーリボシルトランスフェラーゼおよびアミノグリコシド3'-O-ホスホトランス フェラーゼIIが挙げられる。その他の適当なマーカーは当業者には公知であろう 。 本発明にしたがって形質転換プロセスを開始するためには、まず、適当なベク ターを構築し、それを植物細胞に適正に導入することが必要である。その際、本 明細書で利用されるベクターの構築についての詳細は、植物遺伝子工学分野の当 業者には公知である。 例えば、本発明で利用される核酸配列は、Tiプラスミド、根誘導（Ri）プラス ミドおよび植物ウイルスベクターを用いることにより植物細胞に導入することが できる（かかる技術の概略については、例えば、Weissbach & Weissbach，1988, Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，ニューヨーク，第V III節，第421-463頁；およびGrierson & Corey，1988，Plant Molecular Biolog y,第２版，Blackie,ロンドン，第7-9章、およびHorschら，Science，227:1229， 1985を参照されたい。これらはいずれも参考として本明細書に組み入れるものと する）。 当業者であれば、比較的無傷の状態で本発明の核酸構築物を導入するのに適し たベクターを選択することができるであろう。こうして、導入された核酸構築物 を有する植物をもたらす任意のベクターで十分であろう。裸の核酸片を使用した 場合でさえ低効率ではあるが本発明の特性を付与することができると予想される 。ベクターの選択、またはベクターを使用するかどうかは、典型的には、選択さ れる形質転換方法によって導き出される。 本発明による植物の形質転換は、本質的に、植物分子生物学の分野の当業者に 公知の種々の方法のいずれかにおいて行い得る（例えば、Methods of Enzymolog y,第153巻，1987，WuおよびGrossman編，Academic Pressを参照されたい。これ は参考として本明細書に組み入れるものとする）。本明細書で用いる場合、「形 質転換」という用語は、本明細書に記載した核酸構築物の導入による宿主植物の 遺伝子型の変更を意味する。 例えば、本発明の構築物は、Tiプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメフ ァシエンスを利用することによって植物細胞に導入することができる。形質転換 運搬体としてA.ツメファシエンス培養物を用いる場合、形質転換された組織の正 常な非がん遺伝子分化が可能であるようにアグロバクテリウムの非がん遺伝子株 をベクター担体として用いることが最も都合がよい。また、アグロバクテリウム は、バイナリー(binary)Tiプラスミド系を有することも好ましい。そのようなバ イナリー系は、１）転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の植物への導入に必須の毒性(vir ulence)領域を有する第１のTiプラスミド、および２）キメラプラスミドを含む 。このキメラプラスミドは転移される核酸に隣接する野生型TiプラスミドのＴ− ＤＮＡ領域の少なくとも１つのボーダー(border)領域を含む。バイナリーTiプラ スミド系は、植物細胞の形質転換において有効であることが示されている（De F ramond，Biotechnology，1:262，1983;Hoekemaら，Nature，303:179，1983）。 そのようなバイナリー系は、アグロバクテリウム中のTiプラスミドへの組込みを 必要としないので好ましい。 アグロバクテリウムの使用を含む方法は、限定するものではないが、１）アグ ロバクテリウムと、培養され単離されたプロトプラストとの共培養；２）アグロ バクテリウムを用いた植物細胞または組織の形質転換；または３）アグロバクテ リウムを用いた種子、頂端または分裂組織の形質転換を含む。 さらに、遺伝子導入は、Bechtoldら(C.R．Acad．Sci．Paris，316:1194，1993 )によって記載され、本明細書の実施例において説明されているように、アグロ バクテリウムによるin situ形質転換によって行うことができる。このアプロー チはアグロバクテリウム細胞の懸濁液の減圧浸透に基づくものである。 本発明の核酸構築物を植物細胞に導入する好ましい方法は、そのような植物細 胞、外植体、分裂組織または種子に上記のような形質転換されたアグロバクテリ ウムを感染させることである。当技術分野で公知の適当な条件下で、形質転換さ れた植物細胞を成長させることによりシュート、根を形成させ、さらに植物体に 発育させる。 あるいはまた、本発明の核酸構築物を機械的または化学的手段を用いて植物細 胞と接触させることによって植物細胞に導入することができる。例えば、核酸を マイクロピペットを用いて植物細胞に直接マイクロインジェクトすることによっ て機械的に導入することができる。また、核酸を、細胞に取り込まれる遺伝物質 と沈降複合体を形成するポリエチレングリコールを用いることによって植物細胞 に導入することが可能である。 また、本発明の核酸構築物をエレクトロポレーションによって植物細胞に導入 することもできる（Frommら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，82:5824，1985 、これは参考として本明細書に組み入れるものとする）。この技術において、植 物プロトプラストは、関連核酸配列を含むベクターまたは核酸の存在下でエレク トロポレートされる。高電圧の電気インパルスを可逆的に膜に透過させて核酸を 導入させる。エレクトロポレートされた植物プロトプラストは細胞壁を改修し、 分裂し、植物カルスを形成する。形質転換遺伝子を有する形質転換植物細胞の選 択は、本明細書に記載したように表現型マーカーを用いて行うことができる。 核酸を植物細胞に導入するための別の方法は、そのマトリックスの内部または 表面上のどちらかに導入される核酸を含んだ小ビーズまたは粒子による高速弾道 透過(high velocity ballistic penetration)である（Kleinら，Nature 327:70 ，1987）。典型的には、新規核酸配列の１つのみの導入が要求されるが、この方 法は、特に複数導入を与えるものである。 カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）も本発明の核酸構築物を植物細胞 に導入するためのベクターとして使用し得る（米国特許第4,407,956号）。Ｃａ ＭＶウイルスのＤＮＡゲノムを、細菌中で増殖することができる組換えＤＮＡ分 子を作り出す親細菌プラスミドに挿入する。クローニング後、組換えプラスミド を再度クローニングして所望の核酸配列の導入によってさらに改変してもよい。 次いで、組換えプラスミドの改変されたウイルス部分を親細菌プラスミドから切 り出して、植物細胞または植物に接種するのに用いる。 別の実施態様においては、本発明は、シュート分裂組織において対象の産物を 発現する核酸配列の転写を増大させる方法を提供する。この方法は、本発明の核 酸構築物がゲノム内に組み込まれている植物を取得し、その植物を成長に適した 条件下に置くことを含み、それによって核酸配列の転写がシュート分裂組織内で 増大されるというものである。 典型的には、核酸構築物は、植物細胞をプロモーターと対象のタンパク質をコ ードする核酸配列との構築物を含むベクターに接触させることによってその細胞 内に導入される。本明細書で用いる場合、「接触させる」という用語は、上記の ような化学的および物理的手段などの、ベクターを植物細胞に導入するあらゆる 手段を意味する。好ましくは、接触させるとは、核酸またはベクターを上記のよ うな異種核酸で形質転換されたアグロベクテリウムツメファシエンスによって植 物細胞（外植体、分裂組織、種子など）に導人することを意味する。 通常、形質転換プロセスから植物細胞を再生させて全植物体を得る。形質転換 の即時産物は「トランスジノート(transgenote)」と称する。「成長」または「 再生」という用語は、本明細書で用いる場合、植物細胞、植物細胞の１群、植物 の部分（種子など）または植物の１片（例えばプロトプラストカルスまたは組織 部分由来のもの）から全植物体に成長することを意味する。 プロトプラストからの再生は植物の種によって様々であるが、まず、一般的に プロトプラストの懸濁液が調製される。ある種においては、次いでプロトプラス ト懸濁液から天然の胚として成熟し発芽する段階まで胚形成を誘導することがで きる。培養培地には、一般的に、成長および再生に必要な種々のアミノ酸および ホルモンが含まれる。利用されるホルモンの例としては、オーキシンおよびサイ トカイニンが挙げられる。特にトウモロコシやアルファルファなどの種に対して は、培地にグルタミン酸およびプロリンを加えることが都合がよい場合がある。 効率的な再生は培地、遺伝子型、および培養の履歴に依存する。これらの変動要 素を制御した場合、再生が再現可能である。 また、再生は、植物カルス、外植体、器官または部分からも生じる。形質転換 は、器官または植物部分の再生に関連して行うことができる（Methods in Enzym ology,第118巻およびKleeら，Annual Review of Plant Physiology，38:467，19 87を参照されたい）。Horschら，Science，227:1229，1985の葉ディスク(disk) −形質転換−再生法を利用することによってディスクを選択培地で培養すると、 その後約２〜４週間のうちにシュートが形成される。発育したシュートをカルス から切り出し、適当な根誘導選択培地に移植する。根が伸びた苗木を、根が現れ たらできるだけはやく土壌に移植する。苗木は、必要に応じて成熟するまで別の 大きな鉢に植え替えることができる。 栄養繁殖した作物においては、成熟トランスジェニック植物を、挿木または同 一植物を多数産生させるための組織培養技術を利用することによって繁殖させる 。所望のトランスジノートの選択を行って、新しい品種を得て、商業用途のため に栄養繁殖させる。 種子繁殖作物においては、成熟トランスジェニック植物は自己交配してホモ接 合性近交植物を産生することができる。この近交植物は、新たに導入された外来 遺伝子を含む種子を作る。これらの種子を成長させることにより、選択された表 現型、例えば早期開花をもたらす植物を作出することができる。 花、種子、葉、枝、果実などの再生された植物から得られる部分は、これらの 部分が記載したような形質転換された植物細胞を含む場合、本発明に含まれるも のである。再生された植物の後代および変種、ならびに突然変異体も、これらの 部分が導入された核酸配列を含む場合、本発明の範囲に含まれるものである。 本発明は、遺伝子改変された植物から誘導される植物組織、種子およびその他 の植物細胞などの、本発明の方法によって作出された植物を含む。 上記の開示は本発明を一般的に記載するものである。下記の具体例を参照する ことによってより完全な理解を得ることができる。この具体例は単に説明のため に本明細書に記載されているもので、本発明の範囲を限定するものではない。 実施例 植物の気中部分の分裂組織は、２つの別の発生運命(fates)、シュート分裂組 織または花分裂組織を選択しなければならず、これは一連の分裂組織一同一性遺 伝子によって調節される決定である（Weigel，D.，Annu．Rev．Genetics，29:19 ，1995）。かかる遺伝子としては、キンギョソウ遺伝子FIMBRIATA（ＦＩＭ）が 挙げられ、この遺伝子の不活性化により花がシュートに部分的に変換されること になる（Simonら，Cell，78:99，1994）。ＦＩＭ遺伝子をクローニングすると幼 花において特に発現することがわかった（Simonら、前掲）。ＦＩＭとの有意な 配列類似性を有する遺伝子がシロイヌナズナ・タリアナ(Arabidopsis thaliana) から単離され、これはＵＦＯ遺伝子と一致することがわかっており、その突然変 異は、ＦＩＭにおける突然変異の表現型と同様の表現型を引き起こす（Ingraham ら，Plant Cell，7:1501，1995;LevinおよびMeyerowitz，Plant Cell，7:529，1 995;Wilkinson an Haughn，Plant Cell，7:1485，1995）。 本発明は、ＵＦＯコード核酸配列および非コード核酸配列の単離を記載するも のである。ＵＦＯＲＮＡは、以前に報告されている（Ingramら、前掲）花だけで なく、シュート分裂組織においても発現することがわかった。ＵＦＯプロモータ ーが異種遺伝子の発現を誘導するのに十分であるかどうかを試験するために、プ ロモーターを構造遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）に融合した。ＵＦＯプ ロモーターとβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするレポーター遺伝子と の融合物を有するトランスジェニックシロイヌナズナおよびタバコ植物を構築し た。ＧＵＳ基質X-gluc（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルβ-D-グルクロニド） による組織化学的染色によって測定すると、これらの植物はシュート分裂組織に おいて高レベルのＧＵＳを発現する。シュート分裂組織におけるＵＦＯプロモー ターの機能的活性を、ＵＦＯプロモーターがLEAFY（ＬＦＹ）遺伝子産物をコー ドする対象のタンパク質をコードする核酸配列に融合されているトランスジェニ ックシロイヌナズナ植物を作製することによって確認した。高レベルのＬＦＹ発 現は通常幼花に限られ（Weigelら，Cell，69:843，1992）、ＬＦＹが構成的に発 現しているトランスジェニック植物は、明らかにシュート分裂組織におけるＬＦ Ｙの異所性発現により、シュートの花への転換を示す（WeigelおよびNilsson，N ature，377:495，1995）。同様の表現型がUFO::LFY植物において観察され、これ はＵＦＯプロモーターがシュート分裂組織において異種遺伝子の機能的発現を誘 導し得ることを示すものである。 実施例１ ＵＦＯ遺伝子の単離および同定 ＵＦＯ遺伝子をキンギョソウＦＩＭ遺伝子に対するプローブを用いて単離した 。当地で購入したキンギョソウからゲノムＤＮＡを抽出し、ＦＩＭコード領域の ２つの隣接部分をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した（Saikiら ，Science，239:487，1988;Simonら、前掲）。ＰＣＲ産物を放射能標識し、シロ イヌナズナゲノムＤＮＡのλベクターライブラリーのスクリ−ニングに用いた。 二重フィルターを非オーバーラップＦＩＭプローブを用いてハイブリダイズし、 両プローブにハイブリダイズしたクローンを精製した（Sambrookら，Molecular Cloning,第２版，Cold Spring Harbor:Cold Spring Habor Laboratory，1989） 。ＦＩＭ交差ハイブリッド形成領域をプラスミドベクター(pBluescript，Strata gene)にサブクローニングし、ＤＮＡ配列をSanger法によって決定した（Sambroo kら、前掲）（図１Ａ）。ゲノム配列の分析によって、ＦＩＭタンパク質と有意 な類似性を共有する442アミノ酸長タンパク質に対するコード可能性を有する132 6塩基対の連続オープンリーディングフレームが同定された（図２）。 この遺伝子がＵＦＯと一致していることを確認するために、ＣＡＰＳマーカー （KoniecznyおよびAusubel，Plant J.，4:403，1993）を作り、以前に特性付け された一連の組換え近交系に対してマッピングすることによってこの遺伝子の地 図上の位置を決定した（ListerおよびDean，Plant J.，4:745，1993）。導き出 された染色体Ｉ上の68cMにおける地図位置は、染色体Ｉ上のCAL遺伝子座へのufo 突然変異の遺伝連鎖と一致する（LevinおよびMeyerowitz、前掲）。ゲノムＤＮ Ａを５個のufo突然変異体対立遺伝子ufo-2〜ufo6から抽出し（LevinおよびMeyer owitz、前掲）、ＵＦＯコード領域をＰＣＲによって増幅した(Saikiら、前掲)。 配列決定によって５個の対立遺伝子すべてにおいてアミノ酸が１個変化している ことがわかった（図２）。４つの強対立遺伝子ufo-2〜ufo-5はすべてＵＦＯタン パク質の先端切断(truncation)を引き起こすものと予想されるナンセンス突然変 異に関連している。弱対立遺伝子ufo-6はミスセンス突然変異を有する。地図位 置ならびに突然変異体配列から、このクローンがＵＦＯ遺伝子由来のものである ことがわかった。ＵＦＯコード領域がカリフラワーモザイクウイルス由来の３５ Ｓプロモーターの調節下にある導入遺伝子によるufo-2突然変異の相補性により 、さらなる確認が得られた。このプロモーターはOdellら，Nature，313:810,198 5に記載されている。これらの結果は、Ingrahamらによって報告された結果（199 5コード領域：GenBankデータベース、受け入れ番号X89224）と一致する。 実施例２ ＵＦＯ発現およびプロモーター配列の分析 シロイヌナズナ植物の切片(sections)へのin situハイブリダイゼーションを 用いることにより、ＵＦＯ遺伝子がシュート分裂組織ならびに幼花において発現 していることがわかった。ＵＦＯプロモーターの活性を調べるために、約４kbの 上流配列をＧＵＳレポーターに融合した(Jeffersonら、前掲)。簡単に言うと、B amHI制限部位を開始コドンの下流に導入し、配列ATGGATcC（太字で示したのは開 始コドン、小文字で示したのは突然変異ヌクレオチド）を得た。使用した5'断片 はEcoRI部位からこの人工的なBamHI部位まで伸びている（図３）。このフラグメ ントをpCGN1547Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクターのバックボーンにあるＧＵＳコード 領域の上流のHindIII/BamHI断片としてクー−ニングして（McBrideおよびSummer felt，Plant Mol．Biol.，14:269，1990）、アグロバクテリウムツメファシエン ス株ＡＳＥ（Fraleyら，Biotechnology，3:629，1985）に形質転換されたpDW228 を得て、減圧浸潤法(Bechtoldら，C.R．Acad．Sci.，316:1194，1993)によって シロイヌナズナタリアナ生態型コロンビア植物に導入した。トランスジエニック 植物をカナマイシンで選択し、種子を採取して、後代を発育中の様々な時間に X-gluc基質を用いてＧＵＳ活性について分析した（Jeffersonら，EMBOJ.，6:390 1，1987）。 まず、ＧＵＳの強い発現は初期心臓型ステージ中に胚の頂端部分において最初 に検出された（図４、パネルＡ）。シュート頂端分裂組織は魚雷型ステージ中に 形成されるので、ＧＵＳ活性はシュート頂端分裂組織に限定されるようになる（ 図４、パネルＢ）。花に誘導されない幼苗において、同様のパターンが検出され た（図４、パネルＣ）。花への誘導が生じた後は、ＧＵＳ活性はシュート頂端分 裂組織および幼花において検出される（図４、パネルＤ）。ＧＵＳ活性は、座葉 (rosette leaves)の葉腋に生ずる葉腋性シュート分裂組織においても検出される 。 前述の記載は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない 。実際、当業者は、本明細書の教示に基づいて過度の実験を行うことなくさらな る実施態様を容易に想像し、作り出すことができるであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物Unusual Floral Organs（ＵＦＯ）遺伝子の上流から単離された非コー ド調節配列を含む核酸構築物であって、該非コード調節配列が対象のタンパク 質またはアンチセンスＲＮＡから選択される産物を発現する核酸配列に作動可 能なように結合されており、該核酸配列が前記非コード配列に対して異種であ る、前記核酸構築物。 ２．前記非コード配列が図１Ｂに示したヌクレオチド配列から誘導される、請求 項１に記載の核酸構築物。 ３．前記非コード配列が転写および翻訳開始領域を含む、請求項１に記載の核酸 構築物。 ４．植物細胞内で機能する転写終結領域をさらに含む、請求項３に記載の核酸構 築物。 ５．前記核酸配列がバチルス・ツリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)毒素 をコードするものである、請求項１に記載の核酸構築物。 ６．請求項１に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック植物細胞。 ７．選択マーカーをさらに含む、請求項６に記載のトランスジェニック植物細胞 。 ８．請求項６に記載のトランスジェニック植物細胞を含む植物。 ９．植物Unusual Floral Organs（ＵＦＯ）遺伝子の上流から単離された非コー ド調節配列を含む単離された核酸。 １０．植物のシュート分裂組織において核酸配列の転写を増大させる方法であっ て、遺伝子操作された植物を成長に適した条件下に置くことを含み、ここで、 該植物にはそのゲノムにUnusual Floral Organs（ＵＦＯ）遺伝子の上流から 単離された非コード調節配列を含む核酸構築物が組み込まれており、該非コー ド調節配列は対象のタンパク質またはアンチセンスＲＮＡから選択される産物 を発現する核酸配列に作動可能なように結合されており、そして該核酸配列は 前記非コード配列に対して異種であり、それによって前記核酸配列の転写が前 記分裂組織内で増大するものである、前記方法。 １１．前記非コード領域が転写および翻訳開始領域を含む、請求項１０に記載の 方法。 １２．前記核酸配列がバチルス・ツリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)毒 素をコードするものである、請求項１０に記載の方法。 １３．図１Ｂの核酸配列から誘導される核酸配列。