JP2000517295A - マラリア用ワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 複数のマラリア由来の抗原とＴＨ１細胞応答の優先的刺激物質であるアジュバントを組み合わせて含むマラリアの予防または治療において有用なワクチン組成物。

Description

【発明の詳細な説明】 マラリア用ワクチン組成物 本発明は新規ワクチン組成物、および医学、特にマラリア感染症の予防におけ る使用に関する。 マラリアは、世界の大きな衛生問題のうちの一つであり、毎年２ないし４百万 人の人々がこの病気で亡くなっている。この病気の最も急性の形態は、原虫寄生 体である熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）によって起こり、マラ リアによる死亡のほとんどはこれが原因である。 熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）の生活環は複雑で、完結には人間および 蚊の２種の宿主を必要とする。人間への感染は、感染した蚊の唾液中にあるスポ ロゾイトの接種により始まる。スポロゾイトは肝臓に移動し、そこで肝細胞に侵 入し、赤血球外細胞内期を経てメロゾイト期に分化し、赤血球（ＲＢＣ）に侵入 して、無性血液期の循環的複製を開始する。その生活環は、ＲＢＣ中で多数のメ ロゾイトが有性期生殖母細胞に分化し、これが蚊により摂取され、中部栄養管の 一連の段階を経て発達し、スポロゾイトを産生し、これが唾液腺に移動すること により完了する。 熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト期はマラリアワクチンの標的となる可能性 があるとされている。スポロゾイトの主要な表面蛋白質は、サーカムスポロゾイ ト蛋白質（ＣＳ蛋白質）として知られる。この７Ｇ８株由来の蛋白質はクローン され、発現され、配列決定されている（Dameら、Science 225（1984）p593）。 ７Ｇ８株由来の蛋白質は、４個の副反復配列Asn−Val−Asp−Proが散在している が、テトラペプチドAsn−Ala−Asn−Proを３７回繰返して含む主要的免疫優性反 復領域を有することを特徴とする。他の菌株においては、主および副反復配列の 数ならびにその相対的位置が異なる。この主要部はＣＳ蛋白質の繰り返しのない 部分と称される非反復アミノ酸配列からなるＮおよびＣ末端部分をその側面に付 加している。 照射したスポロゾイトは、実験的なヒトマラリアに対して有意な防御作用を付 与しうることがわかっている（Am．J．Trop．Med．Hyg．24:297−402，1975）。 し かしながら、生産が困難なため、照射スポロゾイトの使用は、ワクチン製造の点 から実用的ではない。サーカムスポロゾイト蛋白質に基づくサブユニットワクチ ンを提案するグループもある。これらのうち、数種のワクチンは臨床試験が行わ れている。１つは合成ペプチドで、他は組換え蛋白質である（Ballouら、Lancet :i 1277（1987）およびHerringtonら、Nature 328:257(1987)）。 これらのワクチンは抗スポロゾイト応答を刺激することに成功した。しかし、 応答の大きさは期待はずれで、応答を全く起こさないワクチンもあった。さらに 、その後の注射に関して抗体レベルの「ブースター応答」がなく、インビトロで のリンパ球増殖検定の結果から、これらのボランティアの大部分のＴ細胞が免疫 優性反復配列を認識しないことが示唆された。それでも、各研究において一人の ワクチン接種者は寄生虫血症を発症しなかった。 国際特許出願ＷＯ93/10152（Smithkline Beecham Biologicals）は、実質的に すべてのＣＳ蛋白質のＣ−末端部、４またはそれ以上の免疫優性領域のタンデム 反復配列、およびＢ型肝炎ウイルス由来の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含むハイブ リッド蛋白質を記載している。好ましくは、該ハイブリッド蛋白質は、ＣＳ蛋白 質のＣ末端部と実質的に相応する少なくとも１６０個のアミノ酸を含む配列を有 する。ＣＳ蛋白質はＣ末端から最後の１２個のアミノ酸が欠けていてもよい。 特に、ＨＢｓＡｇのＮ−末端と線状リンカーを介してフレーム中に融合された 熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８のアミノ酸２１０ないし３９８に実質的に対応する熱 帯熱マラリア原虫のＣＳ蛋白質の一部を含む蛋白質が記載されている。該リンカ ーはＨＢｓＡｇ由来のｐｒｅＳ２の一部を含んでもよい。 ＷＯ93/10152に記載されている具体例は、ＲＴＳと称されるハイブリッド蛋白 質である。このハイブリッドは： °Sacchromyes cerevisiae TDH3遺伝子配列（この解読フレーム中のヌクレオチ ド１−１０５８はＴＤＨ３プロモーター自身を構成する）より由来の、ヌクレオ チド１０５９ないし１０６１によりコードされるメチオニン残基（Musti A.M.ら 、Gene 1983 25 133-143）； °ハイブリッド遺伝子を構築するのに用いられるクローニング操作により構成さ れ る、ヌクレオチド配列（１０６２ないし１０７０）より由来の、3個のアミノ酸 、Met Ala Pro； °熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８株（Dameら、前掲）のサーカムスプロゾイト蛋白質 (ＣＳＰ)のアミノ酸２１０ないし３９８を示すヌクレオチド１０７１ないし１６ ３７によりコードされる１８９個のアミノ酸鎖； °ハイブリッド遺伝子を構築するのに用いられるクローニング操作により構成さ れる、ヌクレオチド(１６３８ないし１６４０)によりコードされる、アミノ酸(A rg)； °ヌクレオチド１６４１ないし１６５２によりコードされ、Ｂ型肝炎ウイルス（ ａｄｗ血清型）ｐｒｅＳ２蛋白質（９）の４個のカルボキシ末端残基を示す、４ 個のアミノ酸、Pro Val Thr Asn； °ヌクレオチド１６５３ないし２３３０によりコードされ、Ｂ型肝炎ウイルス（ ａｄｗ血清型）のＳ蛋白質を特定する２２６個のアミノ酸鎖 を有してなる。 ＷＯ93/10152はさらに、そのゲノム中にＢ型肝炎Ｓ発現カセットが数個組み込 まれたコピーを既に有する受容酵母株におけるハイブリッド蛋白の発現を記載す る。得られた株は、２種のポリペプチド、すなわち、ＳとＲＴＳ（または本発明 の他のハイブリッド蛋白質）を合成し、これは自発的に共同して混合（例えば、 ＲＴＳ，Ｓ）リポタンパク粒子を構築する。これらの粒子は、有利には、その表 面でハイブリッドのＣＳＰ配列を提供する。 本発明の目的の一つは、複数の抗原を、ＴＨ１細胞応答の優先的刺激因子であ るアジュバントと組み合わせて含む組成物を用いて免疫化することにより、熱帯 熱マラリア原虫および／または三日熱マラリア原虫（P.vivax）侵入に対する免 疫を提供することである。 したがって、本発明はマラリアを予防または治療するために用いるワクチン組 成物であって、複数のマラリア由来の抗原と、ＴＨ１細胞応答の優先的刺激因子 であるアジュバントとを組み合わせて含むワクチン組成物を提供する。 好ましくは、少なくとも１つの抗原は、ＲＴＳなどの前記定義したハイブリッ ド蛋白質であり、より好ましくは、ＲＴＳ,Ｓなどの前記定義の混合粒子の形態 であ る。 本発明のさらに別の態様は、マラリアを予防または治療するために用いるワク チン組成物であって、複数のマラリア由来の抗原を含み、少なくとも一つの抗原 が、ＲＴＳなどの前記定義したハイブリッド蛋白質であり、より好ましくは、Ｒ ＴＳ，Ｓなどの前記定義した混合粒子の形態であることを特徴とするワクチン組 成物を提供する。 各ワクチン中に配合される抗原の量は、典型的なワクチンにおいて有意で有害 な副作用無しに免疫防御応答を誘発する量として選択される。このような量は、 使用する特定の免疫原に応じて変わる。一般に、各用量は、合計１−１０００μ ｇの蛋白質、好ましくは１−２００μｇ、最も好ましくは１０−１００μｇの蛋 白質を含むと考えられる。特定のワクチンに関する最適量は、対象における免疫 応答の観察を含む標準的研究により確認できる。初回接種後、対象者は好ましく は約４週間で追加抗原刺激を受け、つづいて感染の危険性が存在する限り、６ヶ 月毎に追加抗原刺激を繰り返す。 本発明のさらに別の態様は、前記した有効量のワクチンを投与することによる 、プラスモジウム感染症感受性患者の治療法にある。 ＴＨ１細胞応答の優先的刺激能を有するアジュバントは、国際特許出願ＷＯ94 /00153およびＷＯ95/17209に記載されている。 特に好ましいアジュバントは、所望により水中油型エマルジョンを一緒に含ん でいてもよい、ＱＳ２１、Quillaja Saponaria Molinaの樹皮由来のＨＰＬＣ精 製した非毒性フラクション、および３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ ３Ｄ−ＭＰＬ）を有してなる。 ３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質ＡはＧＢ2220211（Ribi）から公知で ある。化学的には、これは３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの、４、５ または６アシル化鎖との混合物であり、Ribi Immunochem Montanaから市販され ている。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい形態は、国際特許 出願第９２／１１６５５６号に開示されている。 ＱＳ２１は南米の樹木Quillaja Saponaria Molinaの樹皮からのサポニンのＨ Ｐ ＬＣ精製した非毒性フラクションであり、その製法は（ＱＡ２１として）米国特 許第5057540号に開示されている。 好ましい水中油型エマルジョンは、代謝可能な油、例えばスクアレン、α−ト コフェロールおよびTween80を含む。加えて、水中油型エマルジョンは、Span85 および／またはレシチンを含有してもよい。 ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比は典型的には１：１０〜１０：１のオーダーであ り；好ましくは１：５〜５：１であり、実質的にはしばしば１：１である。最適 相乗効果についての好ましい範囲は、２．５：１〜１：１の３Ｄ ＭＰＬ：ＱＳ ２１である。ヒト投与に関して典型的には、ＱＳ２１および３Ｄ ＭＰＬはワク チン中、１μｇ−２００μｇ、例えば１−１００μｇ、好ましくは１０μｇ−５ ０μｇの範囲で存在する。典型的には、水中油型エマルジョンは、２〜１０％の スクアレン、２〜１０％のα−トコフェロールおよび０.３％〜３％のTween80を 含む。好ましくは、スクアレン：α−トコフェロールの比は、より安定なエマル ジョンが得られるように、１以下である。Span85はさらに１％のレベルで存在し てもよい。場合によっては、本発明のワクチンはさらに安定剤を含むのが有利で ある。 ワクチン製剤は、一般に、New Trends and Developments in Vaccines（Volle rら編）、University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A．1978に記載さ れている。リポソーム中への封入は、例えば、Fullerton、米国特許第4235877号 に記載されている。蛋白質の巨大分子への接合は、例えば、Likhite(米国特許第 4372945号)およびArmorら、米国特許第4474757号に開示されている。 本発明において有用なマラリア由来の抗原は、以下のものから選択される： １．ＲＴＳなどの前記定義のハイブリッド蛋白質、特に、ＲＴＳ，Ｓなどの前 記定義した混合粒子の形態であるハイブリッド蛋白質。 ２．Ｔ／９／９６として知られるタイから入手した熱帯熱マラリア原虫のクロ ーンされた単離体のＴＲＡＰ、これと少なくとも８０％の相同性を有する蛋白質 およびそのフラグメントを含む免疫原性誘導体(国際特許出願ＷＯ90/01496およ びＷＯ91/11516（3i Exploitation Limited）、およびＷＯ92/11868（米国海軍 ）に記載されている)。 ３．国際特許出願ＷＯ91/18922に記載されている１６ｋＤ蛋白質、これと少な くとも８０％相同性を有する蛋白質、およびそのフラグメントを含む免疫原性誘 導体。 ４．熱帯熱マラリア原虫または三日熱マラリア原虫の尖端膜抗原−１（ＡＭＡ −１）、これと少なくとも８０％相同性を有する蛋白質、およびそのフラグメン トを含む免疫原性誘導体。 ５．熱帯熱マラリア原虫または三日熱マラリア原虫のサーカムスポロゾイト蛋 白質（ｃｓｐ）、これと少なくとも８０％相同性を有する蛋白質、およびそのフ ラグメントを含む免疫原性誘導体。 ６．熱帯熱マラリア原虫または三日熱マラリア原虫のＭＳＰ−１（米国特許第 4837016号）、これと少なくとも８０％相同性を有する蛋白質、およびそのフラ グメントを含む免疫原性誘導体。 ７．他の赤血球外期蛋白質およびそのフラグメントを含む免疫原性誘導体。 ８．所望により、血液期蛋白質およびそのフラグメントを含んでもよい免疫原 性誘導体。 「免疫原性誘導体」なる用語は、ヒトに内部投与した後に蛋白質に対する免疫 応答を誘発する能力を保持する蛋白質の末端切断された、または他の誘導体など の分子を包含する。このような他の誘導体は、アミノ酸の付加、欠失、置換、ま たは転位あるいはその化学的修飾により調製できる。 サブユニットワクチンの調製において有用な蛋白質の免疫原性フラグメントは 、適当な遺伝子フラグメントの発現によるかまたは、例えばMerrifield合成（Th e Peptides，Vol 2.，Academic Press，NY，３頁）を用いるペプチド合成により 調製される。 免疫原性誘導体は、ハイブリッド、すなわち、他のプラスモジウム免疫原、ま たは他の非プラスモジウム免疫原に対する１またはそれ以上のエピトープを有し うる付加的な配列を含有する融合ポリペプチドであり得る。別法として、本発明 の免疫原性誘導体は、Ｂ型肝炎表面またはコア抗原などのキャリアポリペプチド またはアジュバントの場合免疫刺激性を有するか、またはそうでない場合、蛋白 質またはその誘導体に対する免疫応答を向上させるか、または蛋白質またはその 誘導体の発現、 精製または調製において有用である他のキャリアと融合しうる。 本発明において有用である蛋白質またはその免疫原性誘導体を、グルタルアル デヒドなどの通常の結合剤を用いて巨大分子に化学的に接合させてもよい(Geerl ingsら、（1988）J，Immunol．Methods，106，239−244)。 以下の実施例を用いて本発明を説明する： 実施例 組換えＴＲＡＰの構築と発現 これはＷＯ90/01496に記載されているようにして調製した。 ＲＴＳ,Ｓの構築と発現 これはＷＯ93/10152に記載されているようにして調製した。 アジュバント添加 ２つのアジュバント処方をそれぞれが以下の水中油型エマルジョン成分を含む ように調製した。 ＳＢ２６：５％スクアレン ５％トコフェロール ０.４％Tween80；粒径５０ ０ｎｍ ＳＢ６２：５％スクアレン ５％トコフェロール ２.０％Tween80；粒度１８ ０ｎｍ エマルジョンＳＢ６２の調製（２倍濃縮物） Tween80をリン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）に溶解させて、ＰＢＳ中２％溶液 を得る。１００ｍｌの２倍濃縮エマルジョンを得るために、５ｇのＤＬ−α−ト コフェロールと５ｍｌスクアレンを攪拌して十分に混合する。９０ｍｌのＰＢＳ ／Tween溶液を添加して、十分に混合する。得られたエマルジョンを次にシリン ジに通し、Ｍ１１０Ｓ微流動化装置を用いて最終的に微流動化する。得られた油 滴は約１８０ｎｍの大きさである。 エマルジョンＳＢ６２の調製 このエマルジョンは、０.４％のTween80を用い、同様にして調製した。 表に列挙した他の乳液も同様にして調製した。 各１００ｍｌのエマルジョンに、２種の抗原（各抗原１０ｍｇ、５０μｇ／用 量 に相当）を添加し、混合した。これを１００μｇ／ｍｌの３Ｄ−ＭＰＬおよび１ ００μｇ／ｍｌのＱＳ２１と合し、最終処方を得た。緩衝液は塩含量とｐＨで調 整した。 表 ２倍濃縮のビヒクル 参考例 ＲＴＳ,Ｓの種々の処方 ＲＴＳ,Ｓは国際特許出願ＷＯ93/10152に記載されており、balb/ｃマウスの予 防接種用に処方された。一群５匹の動物を用いた。７群の動物に以下の処方を投 与した。 群１ ＲＴＳ,Ｓ ＳＢ６２ 群２ ＲＴＳ,Ｓ ＱＳ２１ ３Ｄ−ＭＰＬ 群３ ＲＴＳ,Ｓ ＱＳ２１ ３Ｄ−ＭＰＬ ＳＢ６２ 群４ ＲＴＳ,Ｓ ３Ｄ−ＭＰＬ Ａｌ(ＯＨ)₃ 群５ ＲＴＳ,Ｓ Ａｌ(ＯＨ)₃ 群６ 無添加 群７ 負の対照 （ＲＴＳ,Ｓ−５μｇ／用量、３Ｄ−ＭＰＬ ５μｇ／用量 ＱＳ２１ ５μｇ ／用量） 動物を接種し、一次免疫化後１５日および二次免疫化後７日および１５日に採 血し、抗ＨＢＳＡｇ抗体サブタイプについて分析した。エマルジョンＳＢ６２は ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬと配合した場合に、ＳＢ６２単独と比較して、優先 的かつ相乗的に、ＩｇＧ２ａ抗体応答を向上させた。 マウスにおけるＩｇＧ２ａ抗体応答の向上は、ＴＨ１型応答を刺激するアジュ バント系の能力の尺度である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．マラリアの予防または治療に用いるためのワクチン組成物であって、複数 のマラリア由来の抗原を、ＴＨ１細胞応答の優先的な刺激物質であるアジュバン トと組み合わせてなるワクチン組成物。 ２．アジュバントがＭＰＬを含んでなる請求項１記載のワクチン組成物。 ３．アジュバントがＱＳ２１を含んでなる請求項１または２記載のワクチン組 成物。 ４．アジュバントが水中油型エマルジョンを含んでなる前記した請求項のいず れか１つに記載のワクチン組成物。 ５．マラリア抗原が： ・実質的にすべてのＣＳ蛋白質のＣ−末端部、免疫優性領域の４またはそれ以 上のタンデム反復配列、およびＢ型肝炎ウイルス由来の表面抗原（ＨＢｓＡｇ） を含むハイブリッド蛋白質； ・T/9/96として公知のタイから入手した熱帯熱マラリア原虫のクローンされた 単離体のＴＲＡＰ、これと少なくとも８０％の相同性を有する蛋白質およびその フラグメントを含む免疫原性誘導体； ・国際特許出願ＷＯ91/18922に記載されている１６ｋＤ蛋白質、これと少なく とも８０％相同性を有する蛋白質およびそのフラグメントを含む免疫原性誘導体 ； ・熱帯熱マラリア原虫または三日熱マラリア原虫の尖端膜抗原−１(ＡＭＡ− １)、これと少なくとも８０％相同性を有する蛋白質およびそのフラグメントを 含む免疫原性誘導体； ・熱帯熱マラリア原虫または三日熱マラリア原虫のサーカムスポロゾイト蛋白 質（ｃｓｐ）、これと少なくとも８０％相同性を有する蛋白質およびそのフラグ メントを含む免疫原性誘導体； ・熱帯熱マラリア原虫または三日熱マラリア原虫のＭＳＰ−１（米国特許第48 37016号）、これと少なくとも８０％相同性を有する蛋白質およびそのフラグメ ントを含む免疫原性誘導体； ・他の赤血球外期蛋白質およびそのフラグメントを含む免疫原性誘導体； ・任意の血液期蛋白質およびそのフラグメントを含む免疫原性誘導体 からなる群より選択される、前記した請求項のいずれか１つに記載のワクチン組 成物。 ６．治療において用いるための前記した請求項のいずれか１つに記載のワクチ ン組成物。 ７．マラリアの治療または予防において用いるための医薬の製造における請求 項１〜５のいずれか１つに記載のワクチン組成物の使用。 ８．請求項１〜５のいずれか１つに記載の有効量のワクチン組成物を、これを 必要とする患者に投与することからなるマラリアの治療または予防法。