JP2001131202A - 抗トロンビン活性物質 - Google Patents
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Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 製造上の問題がない抗トロンビン活性物質と
して、従来より知られている褐藻類フコイダン由来の物
質等とは、全く別の新規な物質を提供する。 【解決手段】 硫酸基（２０．５％）及びウロン酸残基
（７．１％）を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フ
コース：キシロース：マンノース：ガラクトース：グル
コース＝１．００：０．３５：０．２８：０．２２：
０．１５の比率で含まれ、ゲル濾過クロマトグラフィー
によって測定された平均分子量が２２２ｋＤａである、
抗トロンビン活性物質。
して、従来より知られている褐藻類フコイダン由来の物
質等とは、全く別の新規な物質を提供する。 【解決手段】 硫酸基（２０．５％）及びウロン酸残基
（７．１％）を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フ
コース：キシロース：マンノース：ガラクトース：グル
コース＝１．００：０．３５：０．２８：０．２２：
０．１５の比率で含まれ、ゲル濾過クロマトグラフィー
によって測定された平均分子量が２２２ｋＤａである、
抗トロンビン活性物質。
Description
【０００１】
【０００２】本発明は、抗トロンビン活性物質に関し、
詳細には、血栓症等の阻害剤として有効な抗トロンビン
活性物質に関する。
詳細には、血栓症等の阻害剤として有効な抗トロンビン
活性物質に関する。
【０００３】
【０００４】抗トロンビン活性物質としては、ヘパリン
が最もよく知られている。該ヘパリンは、哺乳類の組
織、特に牛の肝、肺、豚や羊の腸粘膜から抽出し、分画
法で精製することで製造されているが、製造工程におい
て、不快な臭気が発生したり、残渣処理に手間がかかる
等の問題を有していた。そのため、製造上の問題がない
抗トロンビン活性物質を見つけ出す多くの試みがなされ
ている。従来、製造上の問題がない抗トロンビン活性物
質として、硫酸化多糖類が有効であることが知られてお
り、例えば、褐藻類フコイダン由来の物質等が知られて
いる。
が最もよく知られている。該ヘパリンは、哺乳類の組
織、特に牛の肝、肺、豚や羊の腸粘膜から抽出し、分画
法で精製することで製造されているが、製造工程におい
て、不快な臭気が発生したり、残渣処理に手間がかかる
等の問題を有していた。そのため、製造上の問題がない
抗トロンビン活性物質を見つけ出す多くの試みがなされ
ている。従来、製造上の問題がない抗トロンビン活性物
質として、硫酸化多糖類が有効であることが知られてお
り、例えば、褐藻類フコイダン由来の物質等が知られて
いる。
【０００５】
【０００６】本発明は、製造上の問題がない抗トロンビ
ン活性物質として、従来より知られている褐藻類フコイ
ダン由来の物質等とは、全く別の新規な物質を提供する
ことを目的とする。
ン活性物質として、従来より知られている褐藻類フコイ
ダン由来の物質等とは、全く別の新規な物質を提供する
ことを目的とする。
【０００７】
【０００８】本発明者らは、上記課題を解決するため鋭
意研究を行った結果、日本国の万田発酵株式会社製の万
田酵素（商品名）から精製した成分中の硫酸化ヘテロ多
糖体が、抗トロンビン活性物質であることを見出し、本
発明を完成するに至った。
意研究を行った結果、日本国の万田発酵株式会社製の万
田酵素（商品名）から精製した成分中の硫酸化ヘテロ多
糖体が、抗トロンビン活性物質であることを見出し、本
発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明の課題を解決するための
手段は、下記のとおりである。
手段は、下記のとおりである。
【００１０】第１に、硫酸基及びウロン酸残基を有する
硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコースと、フコース以
外の中性糖の組成が、フコース：フコース以外の中性糖
＝１．０：０．６〜１．４の比率である、抗トロンビン
活性物質。第２に、硫酸基及びウロン酸残基を有する硫
酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マ
ンノース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．
３０〜０．４０：０．２３〜０．３３：０．１７〜０．
２７：０．１０〜０．１０の比率で含まれる、抗トロン
ビン活性物質。第３に、硫酸基及びウロン酸残基を有す
る硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロー
ス：マンノース：ガラクトース：グルコース＝１．０
０：０．３５：０．２８：０．２２：０．１５の比率で
含まれる、抗トロンビン活性物質。第４に、硫酸基（１
８．０〜２３．０％）及びウロン酸残基（５．６〜８．
６％）を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコー
ス：キシロース：マンノース：ガラクトース：グルコー
ス＝１．００：０．３３〜０．３７：０．２６〜０．３
０：０．２０〜０．２４：０．１３〜０．１７の比率で
含まれ、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定され
た平均分子量が１９０〜２５０ｋＤａである、抗トロン
ビン活性物質。第５に、硫酸基（２０．５％）及びウロ
ン酸残基（７．１％）を有する硫酸化ヘテロ多糖体であ
って、フコース：キシロース：マンノース：ガラクトー
ス：グルコース＝１．００：０．３５：０．２８：０．
２２：０．１５の比率で含まれ、ゲル濾過クロマトグラ
フィーによって測定された平均分子量が２２２ｋＤａで
ある、抗トロンビン活性物質。
硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコースと、フコース以
外の中性糖の組成が、フコース：フコース以外の中性糖
＝１．０：０．６〜１．４の比率である、抗トロンビン
活性物質。第２に、硫酸基及びウロン酸残基を有する硫
酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マ
ンノース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．
３０〜０．４０：０．２３〜０．３３：０．１７〜０．
２７：０．１０〜０．１０の比率で含まれる、抗トロン
ビン活性物質。第３に、硫酸基及びウロン酸残基を有す
る硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロー
ス：マンノース：ガラクトース：グルコース＝１．０
０：０．３５：０．２８：０．２２：０．１５の比率で
含まれる、抗トロンビン活性物質。第４に、硫酸基（１
８．０〜２３．０％）及びウロン酸残基（５．６〜８．
６％）を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フコー
ス：キシロース：マンノース：ガラクトース：グルコー
ス＝１．００：０．３３〜０．３７：０．２６〜０．３
０：０．２０〜０．２４：０．１３〜０．１７の比率で
含まれ、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定され
た平均分子量が１９０〜２５０ｋＤａである、抗トロン
ビン活性物質。第５に、硫酸基（２０．５％）及びウロ
ン酸残基（７．１％）を有する硫酸化ヘテロ多糖体であ
って、フコース：キシロース：マンノース：ガラクトー
ス：グルコース＝１．００：０．３５：０．２８：０．
２２：０．１５の比率で含まれ、ゲル濾過クロマトグラ
フィーによって測定された平均分子量が２２２ｋＤａで
ある、抗トロンビン活性物質。
【００１１】
【００１２】以下に、本発明の実施例及び試験例につい
て説明する。なお、実施例や試験例で用いたものは、以
下のように入手した。ブタ腸粘膜由来のヘパリン、Ｆｕ
ｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ（ヒバマタ目の褐藻
類）由来のフコイダン、ヒトトロンビン、ウシフィブリ
ノーゲンは、シグマケミカル社（セントルイス、ミズー
リー州）より購入した。クエン酸処理したヒト保存血
漿、アクチン活性化セファロプラスチン試薬、トロンボ
プラスチンＣプラスは、デイドインターナショナル社
（マイアミ、フロリダ州）から入手した。ＤＥＡＥ−セ
ファロースＣＬ−６Ｂ及びセファロースＣＬ−６Ｂは、
ファルマシアバイオテック社（ウップザラ、スウェーデ
ン）から入手した。クロモチームＴＨ（トシル−グリシ
ル−プロリル−アルギニル−パラニトロソアニリド）
は、ベーリンガーマンハイム社（バスレ、スイス）から
入手した。セルロースアセテート膜は、ヘレナラボラト
リーズ社（ビューモント、テキサス州）から入手した。
て説明する。なお、実施例や試験例で用いたものは、以
下のように入手した。ブタ腸粘膜由来のヘパリン、Ｆｕ
ｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ（ヒバマタ目の褐藻
類）由来のフコイダン、ヒトトロンビン、ウシフィブリ
ノーゲンは、シグマケミカル社（セントルイス、ミズー
リー州）より購入した。クエン酸処理したヒト保存血
漿、アクチン活性化セファロプラスチン試薬、トロンボ
プラスチンＣプラスは、デイドインターナショナル社
（マイアミ、フロリダ州）から入手した。ＤＥＡＥ−セ
ファロースＣＬ−６Ｂ及びセファロースＣＬ−６Ｂは、
ファルマシアバイオテック社（ウップザラ、スウェーデ
ン）から入手した。クロモチームＴＨ（トシル−グリシ
ル−プロリル−アルギニル−パラニトロソアニリド）
は、ベーリンガーマンハイム社（バスレ、スイス）から
入手した。セルロースアセテート膜は、ヘレナラボラト
リーズ社（ビューモント、テキサス州）から入手した。
【００１３】（ａ）工程［抽出及びエタノール分画工
程］
程］
【００１４】日本国の万田発酵株式会社製の万田酵素
（１５０ｇ湿重量）を、３００ｍｌの蒸留水中に懸濁
し、室温で２時間撹拌した後、３層からなる布地で濾過
した。濾過後の溶液を１１０００Ｇで２０分間遠心した
後に、上清に冷エタノールを加え、エタノール濃度が１
０％になるように調整した。調整後の溶液を、室温で２
０分間撹拌した後に、１１０００Ｇで２０分間遠心し沈
殿物を除いた後に、上清に冷エタノールを加え、エタノ
ール濃度が５５％になるように調整した。調整後の溶液
を、更に、１１０００Ｇで２０分間遠心し、今度は沈殿
物を採取した。該沈殿物を窒素気流中で乾燥させ、０．
３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）４００ｍｌ中に溶解させた。その溶液を、１１
０００Ｇで２０分間遠心し、沈殿物を取り除き、窒素気
流中で乾燥させ可溶性の多糖体を得た。
（１５０ｇ湿重量）を、３００ｍｌの蒸留水中に懸濁
し、室温で２時間撹拌した後、３層からなる布地で濾過
した。濾過後の溶液を１１０００Ｇで２０分間遠心した
後に、上清に冷エタノールを加え、エタノール濃度が１
０％になるように調整した。調整後の溶液を、室温で２
０分間撹拌した後に、１１０００Ｇで２０分間遠心し沈
殿物を除いた後に、上清に冷エタノールを加え、エタノ
ール濃度が５５％になるように調整した。調整後の溶液
を、更に、１１０００Ｇで２０分間遠心し、今度は沈殿
物を採取した。該沈殿物を窒素気流中で乾燥させ、０．
３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）４００ｍｌ中に溶解させた。その溶液を、１１
０００Ｇで２０分間遠心し、沈殿物を取り除き、窒素気
流中で乾燥させ可溶性の多糖体を得た。
【００１５】（ｂ）工程［ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ
−６Ｂクロマトグラフィー］
−６Ｂクロマトグラフィー］
【００１６】０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セフ
ァロースカラム（６．７ｃｍ×２．５ｃｍ）に、可溶性
の多糖体（１．５ｇ）を充填した。充填後、０．３Ｍ塩
化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
５）を４００ｍｌ流した。ここで、５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）中の塩化ナトリウムの濃度（０．３Ｍ
〜２．０Ｍ）を直線的に変化させ、６０ｍｌ／ｈの流速
で溶出した。溶出した画分について、フィブリン凝集時
間の延長によって、抗トロンビン活性を評価し、図１に
示した。図１によると、抗トロンビン活性物質は二つの
画分に分かれ、少ない方の画分は活性も非常に弱かった
ので、抗トロンビン活性が多い画分（フラクション番号
４０〜７０）を集めて部分精製し、水で透析した後、凍
結乾燥により、多糖体標品を得た。
リス緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セフ
ァロースカラム（６．７ｃｍ×２．５ｃｍ）に、可溶性
の多糖体（１．５ｇ）を充填した。充填後、０．３Ｍ塩
化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
５）を４００ｍｌ流した。ここで、５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）中の塩化ナトリウムの濃度（０．３Ｍ
〜２．０Ｍ）を直線的に変化させ、６０ｍｌ／ｈの流速
で溶出した。溶出した画分について、フィブリン凝集時
間の延長によって、抗トロンビン活性を評価し、図１に
示した。図１によると、抗トロンビン活性物質は二つの
画分に分かれ、少ない方の画分は活性も非常に弱かった
ので、抗トロンビン活性が多い画分（フラクション番号
４０〜７０）を集めて部分精製し、水で透析した後、凍
結乾燥により、多糖体標品を得た。
【００１７】（ｃ）工程［セファロースＣＬ−６Ｂゲル
濾過クロマトグラフィー］
濾過クロマトグラフィー］
【００１８】部分精製した多糖体標品（６１ｍｇ）を、
セファロースＣＬ−６Ｂカラム（１１５ｃｍ×１．２８
ｃｍ）に重層した。重層後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを
含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）により、３０
ｍｌ／ｈの流速で溶出した。溶出した画分について、フ
ィブリン凝集時間の延長によって、抗トロンビン活性を
評価し、図２に示した。ここで、糖含量はフェノール硫
酸法によって測定した。なお、図２で「○−○」は抗ト
ロンビン活性を示し、「●−●」は糖含量を示す。図２
に示す、抗トロンビン活性が多い画分（０．３９〜０．
６２）を集めて、水で透析した後、凍結乾燥し、本発明
に係る抗トロンビン活性物質（２４ｍｇ）を得た。図２
のグラフを考察すると、本発明に係る抗トロンビン活性
物質は、クロマトグラム上で実質的に単一で対照的なピ
ークを与える抗トロンビン活性を持つ多糖体であること
が確認できる。
セファロースＣＬ−６Ｂカラム（１１５ｃｍ×１．２８
ｃｍ）に重層した。重層後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを
含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）により、３０
ｍｌ／ｈの流速で溶出した。溶出した画分について、フ
ィブリン凝集時間の延長によって、抗トロンビン活性を
評価し、図２に示した。ここで、糖含量はフェノール硫
酸法によって測定した。なお、図２で「○−○」は抗ト
ロンビン活性を示し、「●−●」は糖含量を示す。図２
に示す、抗トロンビン活性が多い画分（０．３９〜０．
６２）を集めて、水で透析した後、凍結乾燥し、本発明
に係る抗トロンビン活性物質（２４ｍｇ）を得た。図２
のグラフを考察すると、本発明に係る抗トロンビン活性
物質は、クロマトグラム上で実質的に単一で対照的なピ
ークを与える抗トロンビン活性を持つ多糖体であること
が確認できる。
【００１９】
【試験例１】 ［電気泳動］
【００２０】上記実施例で得た抗トロンビン活性物質に
ついて、精製純度を確認するために、電気泳動を行っ
た。電気泳動は、Ｎａｒｄｅｌｌａらの方法［Ｎａｒｄ
ｅｌｌａ，Ａ．，Ｃｈａｕｂｅｔ，Ｆ．，Ｂｏｉｓｓｏ
ｎ−Ｖｉｄａｌ，Ｃ．，Ｂｌｏｎｄｉｎ，Ｃ．，Ｄｕｒ
ａｎｄ，Ｐ．，ａｎｄ Ｊｏｚｅｆｏｎｖｉｃｚ，
Ｊ．，Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｌｏｗ ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆｕｃａｎｓ ｐｒｏｄｕ
ｃｅｄ ｂｙ ｒａｄｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎ
ｄ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
ａｐｈｙ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅ
ｉｇｈｔ ｆｕｃａｎｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ
ｔｈｅ ｂｒｏｗｎ ｓｅａｗｅｅｄ Ａｓｃｏｐｈｙ
ｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅ
ｓ．，２８９，２０１−２０８（１９９６）］と同様の
方法によりセルロースアセテート膜上で行った。すなわ
ち、０．３Ｍの酢酸カルシウム（ｐＨ７．５）中で、
１．５時間、１．５ｍＡ／ｃｍの条件で電気泳動を行っ
た後、膜を０．１％トルイジンブルーを含む３％酢酸で
染色し、３％酢酸で脱染色し、図３中にレーン２として
示した。ここで、市販のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏ
ｓｕｓ（ヒバマタ目の褐藻類）由来のフコイダンを標準
物質として用い、図３中にレーン１として示した。図３
の結果を考察すると、本発明の抗トロンビン活性物質
は、セルロースアセテート膜電気泳動で単一のバンドを
示すことが確認できた。
ついて、精製純度を確認するために、電気泳動を行っ
た。電気泳動は、Ｎａｒｄｅｌｌａらの方法［Ｎａｒｄ
ｅｌｌａ，Ａ．，Ｃｈａｕｂｅｔ，Ｆ．，Ｂｏｉｓｓｏ
ｎ−Ｖｉｄａｌ，Ｃ．，Ｂｌｏｎｄｉｎ，Ｃ．，Ｄｕｒ
ａｎｄ，Ｐ．，ａｎｄ Ｊｏｚｅｆｏｎｖｉｃｚ，
Ｊ．，Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｌｏｗ ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆｕｃａｎｓ ｐｒｏｄｕ
ｃｅｄ ｂｙ ｒａｄｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎ
ｄ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
ａｐｈｙ ｏｆ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅ
ｉｇｈｔ ｆｕｃａｎｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ
ｔｈｅ ｂｒｏｗｎ ｓｅａｗｅｅｄ Ａｓｃｏｐｈｙ
ｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅ
ｓ．，２８９，２０１−２０８（１９９６）］と同様の
方法によりセルロースアセテート膜上で行った。すなわ
ち、０．３Ｍの酢酸カルシウム（ｐＨ７．５）中で、
１．５時間、１．５ｍＡ／ｃｍの条件で電気泳動を行っ
た後、膜を０．１％トルイジンブルーを含む３％酢酸で
染色し、３％酢酸で脱染色し、図３中にレーン２として
示した。ここで、市販のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏ
ｓｕｓ（ヒバマタ目の褐藻類）由来のフコイダンを標準
物質として用い、図３中にレーン１として示した。図３
の結果を考察すると、本発明の抗トロンビン活性物質
は、セルロースアセテート膜電気泳動で単一のバンドを
示すことが確認できた。
【００２１】
【試験例２】 ［サイズ排除ＨＰＬＣ］
【００２２】上記実施例で得た抗トロンビン活性物質に
ついて、精製純度を確認するために、電気泳動に加え、
サイズ排除ＨＰＬＣを行った。サイズ排除ＨＰＬＣは、
約１０から２０００ｋＤａの分子量のデキストランを分
離するＳｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｃｋ ＫＢ−８０５（昭
和電工製）を用い、０．２Ｍ塩化ナトリウムにより１．
０ｍｌの流速で行ない、示差屈折計により検出した。そ
の結果を図４に示した。図４の結果を考察すると、本発
明の抗トロンビン活性物質は、鋭く対称なピークを示
し、図３の結果と併せて考慮すると、単一に近い状態で
精製されたことが確認できた。
ついて、精製純度を確認するために、電気泳動に加え、
サイズ排除ＨＰＬＣを行った。サイズ排除ＨＰＬＣは、
約１０から２０００ｋＤａの分子量のデキストランを分
離するＳｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｃｋ ＫＢ−８０５（昭
和電工製）を用い、０．２Ｍ塩化ナトリウムにより１．
０ｍｌの流速で行ない、示差屈折計により検出した。そ
の結果を図４に示した。図４の結果を考察すると、本発
明の抗トロンビン活性物質は、鋭く対称なピークを示
し、図３の結果と併せて考慮すると、単一に近い状態で
精製されたことが確認できた。
【００２３】
【試験例３】 ［分子量の決定］
【００２４】平均分子量は、Ｚｈｕａｎｇらの方法［Ｚ
ｈａｕｎｇ，Ｃ．，Ｉｔｏｈ，Ｈ．，Ｍｉｚｕｎｏ，
Ｔ．ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｈ．，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃ
ｉｔｖｅ ｆｕｃｏｉｄａｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｒ
ｏｗｎ ｓｅａｗｅｅｄ，Ｕｍｉｔｏｒａｎｏｏ（Ｓａ
ｒｇａｓｓｕｍ ｔｈｎｂｅｒｇｉｉ）．Ｂｉｏｓｃ
ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，５６３
−５６７（１９９５）］により、０．３Ｍ塩化ナトリウ
ムで平衡化したセファロースＣＬ−６Ｂゲル濾過カラム
により測定した。ここで、較正曲線は分子量マーカーと
してデキストラン（分子量６７，１４８，２８２，４６
４）を用いて作成した。その結果に加え、後の試験例で
測定した硫酸含量、中性糖の組成、活性の結果と共に、
表１に示す。なお、表１では、他の起源の硫酸化多糖体
についての測定結果も示した。
ｈａｕｎｇ，Ｃ．，Ｉｔｏｈ，Ｈ．，Ｍｉｚｕｎｏ，
Ｔ．ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｈ．，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃ
ｉｔｖｅ ｆｕｃｏｉｄａｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂｒ
ｏｗｎ ｓｅａｗｅｅｄ，Ｕｍｉｔｏｒａｎｏｏ（Ｓａ
ｒｇａｓｓｕｍ ｔｈｎｂｅｒｇｉｉ）．Ｂｉｏｓｃ
ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，５６３
−５６７（１９９５）］により、０．３Ｍ塩化ナトリウ
ムで平衡化したセファロースＣＬ−６Ｂゲル濾過カラム
により測定した。ここで、較正曲線は分子量マーカーと
してデキストラン（分子量６７，１４８，２８２，４６
４）を用いて作成した。その結果に加え、後の試験例で
測定した硫酸含量、中性糖の組成、活性の結果と共に、
表１に示す。なお、表１では、他の起源の硫酸化多糖体
についての測定結果も示した。
【００２５】
【表１】
【００２６】表１に示すように、本発明の抗トロンビン
活性物質は、平均分子量が２２２ｋＤａと推定され、褐
藻類及びきのこの一種であるカワラタケからの活性な硫
酸化多糖体のものとは異なることが確認された。
活性物質は、平均分子量が２２２ｋＤａと推定され、褐
藻類及びきのこの一種であるカワラタケからの活性な硫
酸化多糖体のものとは異なることが確認された。
【００２７】
【試験例４】［化学分析］
【００２８】糖分の総量は、Ｄｕｂｉｏｓらの方法［Ｄ
ｕｂｉｏｓ，Ｍ．Ｋ．Ａ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｔ．
Ｋ．，Ｒｅｂｅｒｓ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｏｎｉｓｔ
ｈ，Ｆ．，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａ
ｒ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．
Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２８，３５０−３５８（１９５
６）］により、フコースを標準としてフェノール−硫酸
法で測定した。ウロン酸含量は、Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎ
ｔｚとＡｓｂｏｅ−Ｈａｎｓｅｎ［Ｂｌｕｍｅｎｋｒａ
ｎｔｚ，Ｎ．ａｎｄ Ａｓｂｏｅ−Ｈａｎｓｅｎ，
Ｇ．，Ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔ
ａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒ
ｏｎｉｃ ａｃｉｄｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
５４（２），４８４−４８９（１９７３）］のメタヒド
ロキシジフェニル硫酸法変法によりＤ−グルクロン酸を
標準として用いて測定した。硫酸含量は、Ｄｏｇｓｏｎ
とＰｒｉｃｅの比濁法［Ｄｏｇｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．ａｎｄ
Ｐｒｉｃｅ，Ｒ．Ｇ．，Ａ ｎｏｔｅ ｏｎ ｔｈｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｓｔ
ｅｒ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｃｏｎｔｅｎｔｏｆ ｓｕｌ
ｐｈａｔｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｊ．，８４，１０６−１１０（１９６
２）］により、硫酸カリウムを標準として定量した。赤
外線スペクトルは、バイオラッドＦＴＳ−６０スペクト
ロメーター（ヘラクレス、カリフォルニア州）により測
定した。中性糖は、以下に記述するＪｏｎｅｓとＡｌｂ
ｅｒｓｈｅｉｍの方法［Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．ａｎｄ
Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ，Ｐ．，Ａ ｇａｓ ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｄｏｓｅ
ａｎｄ ｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅ
ｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｐｏ
ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．，４９，９２６−９３６（１９７２）］により分
析した。その結果を、上記の表１に示す。表１に示すよ
うに、本発明の抗トロンビン活性物質の中性糖は、フコ
ース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコ
ースから構成されており、中でもフコースが最も多量に
含まれ、全中性糖の中の５０％を占めることが確認でき
た。また、抗凝固及び抗トロンビン活性を持つフコース
含有多糖体が種々の起源、特に褐藻類から単離されてい
るが、本発明の抗トロンビン活性物質の硫酸含量と糖組
成は、他のフコイダン硫酸と明らかに異なっていること
が確認できた。そして、本発明の抗トロンビン活性物質
は、相当量の硫酸基（２０．５％）を含む硫酸化ヘテロ
多糖体であり、その他にウロン酸（７．１％）も含んで
いた。
ｕｂｉｏｓ，Ｍ．Ｋ．Ａ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｔ．
Ｋ．，Ｒｅｂｅｒｓ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｏｎｉｓｔ
ｈ，Ｆ．，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａ
ｒ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．
Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２８，３５０−３５８（１９５
６）］により、フコースを標準としてフェノール−硫酸
法で測定した。ウロン酸含量は、Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎ
ｔｚとＡｓｂｏｅ−Ｈａｎｓｅｎ［Ｂｌｕｍｅｎｋｒａ
ｎｔｚ，Ｎ．ａｎｄ Ａｓｂｏｅ−Ｈａｎｓｅｎ，
Ｇ．，Ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔ
ａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒ
ｏｎｉｃ ａｃｉｄｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
５４（２），４８４−４８９（１９７３）］のメタヒド
ロキシジフェニル硫酸法変法によりＤ−グルクロン酸を
標準として用いて測定した。硫酸含量は、Ｄｏｇｓｏｎ
とＰｒｉｃｅの比濁法［Ｄｏｇｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．ａｎｄ
Ｐｒｉｃｅ，Ｒ．Ｇ．，Ａ ｎｏｔｅ ｏｎ ｔｈｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｓｔ
ｅｒ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｃｏｎｔｅｎｔｏｆ ｓｕｌ
ｐｈａｔｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｊ．，８４，１０６−１１０（１９６
２）］により、硫酸カリウムを標準として定量した。赤
外線スペクトルは、バイオラッドＦＴＳ−６０スペクト
ロメーター（ヘラクレス、カリフォルニア州）により測
定した。中性糖は、以下に記述するＪｏｎｅｓとＡｌｂ
ｅｒｓｈｅｉｍの方法［Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．ａｎｄ
Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ，Ｐ．，Ａ ｇａｓ ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｄｏｓｅ
ａｎｄ ｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅ
ｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｐｏ
ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．，４９，９２６−９３６（１９７２）］により分
析した。その結果を、上記の表１に示す。表１に示すよ
うに、本発明の抗トロンビン活性物質の中性糖は、フコ
ース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコ
ースから構成されており、中でもフコースが最も多量に
含まれ、全中性糖の中の５０％を占めることが確認でき
た。また、抗凝固及び抗トロンビン活性を持つフコース
含有多糖体が種々の起源、特に褐藻類から単離されてい
るが、本発明の抗トロンビン活性物質の硫酸含量と糖組
成は、他のフコイダン硫酸と明らかに異なっていること
が確認できた。そして、本発明の抗トロンビン活性物質
は、相当量の硫酸基（２０．５％）を含む硫酸化ヘテロ
多糖体であり、その他にウロン酸（７．１％）も含んで
いた。
【００２９】上記実施例で得た抗トロンビン活性物質
（２ｍｇ）を、２．０Ｍトリフルオロ酢酸により１２１
℃で６時間加水分解し、ミオイノシトールを内部標準と
して生成した糖のアルジトールアセテート誘導体をスペ
ルコＳＰ−２３８０カラム（スペルコ社、ベルフォン
テ、ペンシルベニア州）を備えたＹｏｕｎｇ Ｌｉｎ
Ｍ６００Ｄ型ガスクロマトグラフにて測定し、図５のＢ
に赤外線スペクトルを示した。なお、図５のＡは、市販
のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来のフコイダ
ンの測定結果を示す。図５の結果を考察すると、本発明
の抗トロンビン活性物質の赤外線スペクトルの吸収特性
は、糖に結合した硫酸基に由来する少なくとも二つの吸
収バンドを示している。そして、図５に見られるように
Ｓ＝Ｏ伸縮振動に基ずく１２５７ｃｍ−１の強い吸収に
加え、８４７ｃｍ−１付近に現れるＣ−Ｏ−Ｓに基ずく
吸収ピークは、Ｃ１配座のフコピラノースのアキシアル
Ｃ−４位に結合する硫酸基の指標であることが知られて
いる。すなわち、本発明の抗トロンビン活性物質の赤外
線スペクトルは、Ｆｕｃｕｓｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ
（ヒバマタ目の褐藻類）由来の抗凝固フコイダン硫酸の
ものと各ピークの位置や全体的な形状が酷似しているこ
とが確認できた。
（２ｍｇ）を、２．０Ｍトリフルオロ酢酸により１２１
℃で６時間加水分解し、ミオイノシトールを内部標準と
して生成した糖のアルジトールアセテート誘導体をスペ
ルコＳＰ−２３８０カラム（スペルコ社、ベルフォン
テ、ペンシルベニア州）を備えたＹｏｕｎｇ Ｌｉｎ
Ｍ６００Ｄ型ガスクロマトグラフにて測定し、図５のＢ
に赤外線スペクトルを示した。なお、図５のＡは、市販
のＦｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来のフコイダ
ンの測定結果を示す。図５の結果を考察すると、本発明
の抗トロンビン活性物質の赤外線スペクトルの吸収特性
は、糖に結合した硫酸基に由来する少なくとも二つの吸
収バンドを示している。そして、図５に見られるように
Ｓ＝Ｏ伸縮振動に基ずく１２５７ｃｍ−１の強い吸収に
加え、８４７ｃｍ−１付近に現れるＣ−Ｏ−Ｓに基ずく
吸収ピークは、Ｃ１配座のフコピラノースのアキシアル
Ｃ−４位に結合する硫酸基の指標であることが知られて
いる。すなわち、本発明の抗トロンビン活性物質の赤外
線スペクトルは、Ｆｕｃｕｓｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ
（ヒバマタ目の褐藻類）由来の抗凝固フコイダン硫酸の
ものと各ピークの位置や全体的な形状が酷似しているこ
とが確認できた。
【００３０】
【試験例５】 ［抗凝固活性の測定］
【００３１】活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰ
ＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、トロンビン時間
（ＴＴ）は、血液凝固測定装置（型式：Ｃｏａｇ−Ｓｔ
ａｔ、（株）京都第一科学製）を用いてＦｏｘらの方法
［Ｆｏｘ，Ｉ．，Ｄａｗｓｏｎ Ａ．，Ｌｏｎｄｓ，
Ｐ．，Ｅｉｓｎｅｒ，Ｊ．，．Ｆｉｎｄｌｅｎ，Ｋ．，
Ｌｅｖｉｎ，Ｅ．，Ｈａｎｓｏｎ，Ｄ．，Ｍａｎｔ，
Ｔ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ Ｍａｒａｇａｎｏ
ｒｅ，Ｊ．，Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ ｏｆ ＨｉｒｕｌｏｇＴＭ，ａ ｄｉｒｅｃｔ
ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎ ｈｕ
ｍａｎｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｃｍｏｓｔ．，６９
（２），１５７−１６３（１９９３）．］に準じ、測定
した。すなわち、実施例で得た抗トロンビン活性物質を
溶かした溶液（１５μｌ）、クエン酸処理したヒト保存
血漿（１００μｌ）を３７℃で３分間培養した。培養
後、それぞれ２００μｌのトロンボプラスチンＣ試薬を
添加した後にＰＴ及びＴＴを測定した。また、培養後、
それぞれ１００μｌのトロンビン溶液（５Ｕ／ｍｌ）添
加した後にも、ＰＴ及びＴＴを測定した。さらに、培養
後、それぞれ２０ｍＭ塩化カルシウムを１００μｌ添加
し、ａＰＴＴを測定した。
ＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、トロンビン時間
（ＴＴ）は、血液凝固測定装置（型式：Ｃｏａｇ−Ｓｔ
ａｔ、（株）京都第一科学製）を用いてＦｏｘらの方法
［Ｆｏｘ，Ｉ．，Ｄａｗｓｏｎ Ａ．，Ｌｏｎｄｓ，
Ｐ．，Ｅｉｓｎｅｒ，Ｊ．，．Ｆｉｎｄｌｅｎ，Ｋ．，
Ｌｅｖｉｎ，Ｅ．，Ｈａｎｓｏｎ，Ｄ．，Ｍａｎｔ，
Ｔ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ Ｍａｒａｇａｎｏ
ｒｅ，Ｊ．，Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ ｏｆ ＨｉｒｕｌｏｇＴＭ，ａ ｄｉｒｅｃｔ
ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎ ｈｕ
ｍａｎｓ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｃｍｏｓｔ．，６９
（２），１５７−１６３（１９９３）．］に準じ、測定
した。すなわち、実施例で得た抗トロンビン活性物質を
溶かした溶液（１５μｌ）、クエン酸処理したヒト保存
血漿（１００μｌ）を３７℃で３分間培養した。培養
後、それぞれ２００μｌのトロンボプラスチンＣ試薬を
添加した後にＰＴ及びＴＴを測定した。また、培養後、
それぞれ１００μｌのトロンビン溶液（５Ｕ／ｍｌ）添
加した後にも、ＰＴ及びＴＴを測定した。さらに、培養
後、それぞれ２０ｍＭ塩化カルシウムを１００μｌ添加
し、ａＰＴＴを測定した。
【００３２】
【試験例６】 ［抗トロンビン活性の検定］
【００３３】Ｃａｐｐｉｅｌｌｏらの方法［Ｃａｐｐｉ
ｅｌｌｏ，Ｍ．，Ｖｉｌａｒｄｏ，Ｐ．Ｇ．，Ｌｉｐｐ
ｉ，Ａ．，Ｃｒｉｓｃｕｏｌｉ，Ｍ．，Ｃｏｒｓｏ，
Ａ．Ｄ．，ａｎｄ Ｍｕｒａ，Ｕ．，Ｋｉｎｅｔｉｃｓ
ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｈｉｂｉ
ｔｉｏｎ ｂｙ ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｈｉｒｎｏｒｍ ＩＶ ａｎｄ
ＨｉｒｕｎｏｒｍＶ）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．，５２，１１４１−１１４６（１９９６）］
により、フィブリノーゲン凝集活性及びアミド分解活性
を測定した。
ｅｌｌｏ，Ｍ．，Ｖｉｌａｒｄｏ，Ｐ．Ｇ．，Ｌｉｐｐ
ｉ，Ａ．，Ｃｒｉｓｃｕｏｌｉ，Ｍ．，Ｃｏｒｓｏ，
Ａ．Ｄ．，ａｎｄ Ｍｕｒａ，Ｕ．，Ｋｉｎｅｔｉｃｓ
ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｈｉｂｉ
ｔｉｏｎ ｂｙ ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｈｉｒｎｏｒｍ ＩＶ ａｎｄ
ＨｉｒｕｎｏｒｍＶ）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．，５２，１１４１−１１４６（１９９６）］
により、フィブリノーゲン凝集活性及びアミド分解活性
を測定した。
【００３４】（ａ）フィブリノーゲン凝集活性
【００３５】ヒト血漿トロンビン及びウシ血漿フィブリ
ノーゲンは、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化
カルシウム、０．１％ＰＥＧ６０００を含む１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ／１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ７．４）に
溶解した。実施例で得た抗トロンビン活性物質を、蒸留
水に溶解して種々の濃度に調整し、各濃度の多糖体標品
（１０μｌ）と０．１２５％のフィブリノーゲン溶液
（２００μｌ）を混合し、３７℃で３分間前培養した。
培養後の混合液に、トロンビン溶液（５Ｕ／ｍｌ，１０
０μｌ）を加え、凝集塊の形成される時間を血液凝固測
定装置（型式：Ｃｏａｇ−Ｓｔａｔ、（株）京都第一科
学製）を用いて測定し、凝集時間の延長により抗凝固作
用を調べた。その結果を図６に示した。なお、図６にお
いて、相対的抗凝固活性とは、対照の凝集時間に対する
活性の％を示したもので、データーは平均値±標準偏差
により表示し、「○−○」は活性化部分トロンボプラス
チン時間を示し、「●−●」はプロトロンビン時間を示
し、「□−□」はトロンビン時間を示す。図６の結果を
考察すると、本発明の抗トロンビン活性物質は、活性化
部分トロンボプラスチン時間及びトロンビン時間におい
て濃度依存的な抗凝固作用が認められたが、プロトロン
ビン時間においては認められなかった。したがって、本
発明の抗トロンビン活性物質の活性は、内因性の凝固作
用及び血漿の凝固の第三相に関与していると考えられ
る。ここで、トロンビン時間の著しい上昇は、トロンビ
ンによるフィブリンの形成が関わる凝固の第三相が強力
に阻害されているということを示している。また、活性
化部分トロンボプラスチン時間及びトロンビン時間にお
ける凝集時間を２倍に延長するのに要する本発明の抗ト
ロンビン活性物質の濃度は、それぞれ１４．３及び２．
４μｇ／ｍｌであったが、その濃度は生体内での作用に
匹敵するものである。
ノーゲンは、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化
カルシウム、０．１％ＰＥＧ６０００を含む１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ／１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ７．４）に
溶解した。実施例で得た抗トロンビン活性物質を、蒸留
水に溶解して種々の濃度に調整し、各濃度の多糖体標品
（１０μｌ）と０．１２５％のフィブリノーゲン溶液
（２００μｌ）を混合し、３７℃で３分間前培養した。
培養後の混合液に、トロンビン溶液（５Ｕ／ｍｌ，１０
０μｌ）を加え、凝集塊の形成される時間を血液凝固測
定装置（型式：Ｃｏａｇ−Ｓｔａｔ、（株）京都第一科
学製）を用いて測定し、凝集時間の延長により抗凝固作
用を調べた。その結果を図６に示した。なお、図６にお
いて、相対的抗凝固活性とは、対照の凝集時間に対する
活性の％を示したもので、データーは平均値±標準偏差
により表示し、「○−○」は活性化部分トロンボプラス
チン時間を示し、「●−●」はプロトロンビン時間を示
し、「□−□」はトロンビン時間を示す。図６の結果を
考察すると、本発明の抗トロンビン活性物質は、活性化
部分トロンボプラスチン時間及びトロンビン時間におい
て濃度依存的な抗凝固作用が認められたが、プロトロン
ビン時間においては認められなかった。したがって、本
発明の抗トロンビン活性物質の活性は、内因性の凝固作
用及び血漿の凝固の第三相に関与していると考えられ
る。ここで、トロンビン時間の著しい上昇は、トロンビ
ンによるフィブリンの形成が関わる凝固の第三相が強力
に阻害されているということを示している。また、活性
化部分トロンボプラスチン時間及びトロンビン時間にお
ける凝集時間を２倍に延長するのに要する本発明の抗ト
ロンビン活性物質の濃度は、それぞれ１４．３及び２．
４μｇ／ｍｌであったが、その濃度は生体内での作用に
匹敵するものである。
【００３６】（ｂ）アミド分解活性
【００３７】上述のフィブリノーゲン凝集活性の測定の
場合と同様に、緩衝液に溶解したヒト血漿トロンビンと
種々の濃度の多糖体標品とを混合し、２５℃で３分間前
培養した。培養後の混合液に、クロモチームＴＨ（１．
９ｍＭ）を添加し、アミド分解反応を開始し、４０５ｎ
ｍの吸光度の分光光学的測光によりパラニトロアニリン
の遊離を測り、トロンビンによるクロモチームＴＨの加
水分解を測定した。その結果を図７に示した。なお、図
７は、各濃度の抗トロンビン活性物質について、「○−
○」は抗トロンビン活性をフィブリン凝集時間の延長を
示し、「●−●」はパラニトロソアニリンの遊離を示
す。本発明の抗トロンビン活性物質は、ヘパリンコファ
クターＩＩ及び抗トロンビンＩＩＩのようなプロテアー
ゼ阻害剤の非存在下にトロンビンによるフィブリノーゲ
ンの分解を有意に阻害するものである。凝集を５０％阻
害する本発明の抗トロンビン活性物質の濃度は、０．２
９μｇ／ｍｌであった。しかしながら、本発明の抗トロ
ンビン活性物質は、５μｇ／ｍｌの濃度までトロンビン
のアミド分解活性を阻害しなかった。より高濃度（５０
μｇ／ｍｌ）でさえ、本発明の抗トロンビン活性物質に
よるアミド分解活性はほんのわずかで７％までであっ
た。同様の効果がヒルジン様合成ペプチドでも報告され
ており、トロビンのフィブリノーゲン凝集活性は阻害す
るが、クロモチームＴＨのアミド分解活性には何ら影響
しない。抗トロンビンのフィブリノーゲン−トロンビン
相互作用に対して二つの有力な説明がなされている。即
ち、抗トロンビン物質がトロンビンの触媒部位の近傍に
結合し、フィブリノーゲンのトロンビンへの接触を阻害
するという説と、もう一つは、抗トロンビン物質がフィ
ブリノーゲン側のトロンビン結合部位の近傍に結合し、
トロンビンのフィブリノーゲンへの接触を阻害するとい
う説である。フコイダンのフィブリノーゲン−トロンビ
ン相互作用に対する阻害活性は、後者の説によりこの多
糖体がフィブリノーゲンへ結合することによって生じる
立体障害によるものとされ、本発明の抗トロンビン活性
物質も抗トロンビン物質がフィブリノーゲン側のトロン
ビン結合部位の近傍に結合し、トロンビンのフィブリノ
ーゲンへの接触を阻害するものであることが確認でき
た。結論として、本発明の抗トロンビン活性物質は、こ
れまで報告されているその他の活性なフコイダン硫酸と
分子量及び糖組成の点で、はっきりとは異なる抗凝固及
び抗トロンビン活性をもつ新規多糖体であることが確認
できた。
場合と同様に、緩衝液に溶解したヒト血漿トロンビンと
種々の濃度の多糖体標品とを混合し、２５℃で３分間前
培養した。培養後の混合液に、クロモチームＴＨ（１．
９ｍＭ）を添加し、アミド分解反応を開始し、４０５ｎ
ｍの吸光度の分光光学的測光によりパラニトロアニリン
の遊離を測り、トロンビンによるクロモチームＴＨの加
水分解を測定した。その結果を図７に示した。なお、図
７は、各濃度の抗トロンビン活性物質について、「○−
○」は抗トロンビン活性をフィブリン凝集時間の延長を
示し、「●−●」はパラニトロソアニリンの遊離を示
す。本発明の抗トロンビン活性物質は、ヘパリンコファ
クターＩＩ及び抗トロンビンＩＩＩのようなプロテアー
ゼ阻害剤の非存在下にトロンビンによるフィブリノーゲ
ンの分解を有意に阻害するものである。凝集を５０％阻
害する本発明の抗トロンビン活性物質の濃度は、０．２
９μｇ／ｍｌであった。しかしながら、本発明の抗トロ
ンビン活性物質は、５μｇ／ｍｌの濃度までトロンビン
のアミド分解活性を阻害しなかった。より高濃度（５０
μｇ／ｍｌ）でさえ、本発明の抗トロンビン活性物質に
よるアミド分解活性はほんのわずかで７％までであっ
た。同様の効果がヒルジン様合成ペプチドでも報告され
ており、トロビンのフィブリノーゲン凝集活性は阻害す
るが、クロモチームＴＨのアミド分解活性には何ら影響
しない。抗トロンビンのフィブリノーゲン−トロンビン
相互作用に対して二つの有力な説明がなされている。即
ち、抗トロンビン物質がトロンビンの触媒部位の近傍に
結合し、フィブリノーゲンのトロンビンへの接触を阻害
するという説と、もう一つは、抗トロンビン物質がフィ
ブリノーゲン側のトロンビン結合部位の近傍に結合し、
トロンビンのフィブリノーゲンへの接触を阻害するとい
う説である。フコイダンのフィブリノーゲン−トロンビ
ン相互作用に対する阻害活性は、後者の説によりこの多
糖体がフィブリノーゲンへ結合することによって生じる
立体障害によるものとされ、本発明の抗トロンビン活性
物質も抗トロンビン物質がフィブリノーゲン側のトロン
ビン結合部位の近傍に結合し、トロンビンのフィブリノ
ーゲンへの接触を阻害するものであることが確認でき
た。結論として、本発明の抗トロンビン活性物質は、こ
れまで報告されているその他の活性なフコイダン硫酸と
分子量及び糖組成の点で、はっきりとは異なる抗凝固及
び抗トロンビン活性をもつ新規多糖体であることが確認
できた。
【００３８】
【００３９】本発明の抗トロンビン活性物質は、製造上
の問題がない抗トロンビン活性物質として従来より知ら
れている褐藻類フコイダン由来の物質等とは、全く別の
新規な物質であり、優れた抗トロンビン活性を有してい
る。
の問題がない抗トロンビン活性物質として従来より知ら
れている褐藻類フコイダン由来の物質等とは、全く別の
新規な物質であり、優れた抗トロンビン活性を有してい
る。
【図１】（Ｂ）工程のクロマトグラフィーにおける各画
分の抗トロンビン活性をフィブリン凝集時間の延長によ
って評価したグラフ
分の抗トロンビン活性をフィブリン凝集時間の延長によ
って評価したグラフ
【図２】（ｃ）工程のゲル濾過クロマトグラフィーにお
ける各画分の抗トロンビン活性をフィブリン凝集時間の
延長によって評価したグラフ
ける各画分の抗トロンビン活性をフィブリン凝集時間の
延長によって評価したグラフ
【図３】電気泳動の結果を示す写真
【図４】サイズ排除ＨＰＬＣの結果を示すグラフ
【図５】本発明の抗トロンビン活性物質及び市販のＦｕ
ｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来のフコイダンの赤
外線スペクトルを示すグラフ
ｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ由来のフコイダンの赤
外線スペクトルを示すグラフ
【図６】各濃度の抗トロンビン活性物質について、凝集
時間の延長により抗凝固作用を示すグラフ
時間の延長により抗凝固作用を示すグラフ
【図７】各濃度の抗トロンビン活性物質について、凝集
時間の延長により抗トロンビン活性を示すグラフ
時間の延長により抗トロンビン活性を示すグラフ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松浦 新吾郎 広島県因島市中庄町605番地 Ｆターム(参考） 4C090 AA01 BA64 BA97 BB10 BB11 BB12 BB13 BB14 BB21 BB27 BB63 BD37 DA09 DA23
Claims (5)
- 【請求項１】 硫酸基及びウロン酸残基を有する硫酸化
ヘテロ多糖体であって、フコースと、フコース以外の中
性糖の組成が、フコース：フコース以外の中性糖＝１．
０：０．６〜１．４の比率である、抗トロンビン活性物
質。 - 【請求項２】 硫酸基及びウロン酸残基を有する硫酸化
ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マンノ
ース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．３０
〜０．４０：０．２３〜０．３３：０．１７〜０．２
７：０．１０〜０．１０の比率で含まれる、抗トロンビ
ン活性物質。 - 【請求項３】 硫酸基及びウロン酸残基を有する硫酸化
ヘテロ多糖体であって、フコース：キシロース：マンノ
ース：ガラクトース：グルコース＝１．００：０．３
５：０．２８：０．２２：０．１５の比率で含まれる、
抗トロンビン活性物質。 - 【請求項４】 硫酸基（１８．０〜２３．０％）及びウ
ロン酸残基（５．６〜８．６％）を有する硫酸化ヘテロ
多糖体であって、フコース：キシロース：マンノース：
ガラクトース：グルコース＝１．００：０．３３〜０．
３７：０．２６〜０．３０：０．２０〜０．２４：０．
１３〜０．１７の比率で含まれ、ゲル濾過クロマトグラ
フィーによって測定された平均分子量が１９０〜２５０
ｋＤａである、抗トロンビン活性物質。 - 【請求項５】 硫酸基（２０．５％）及びウロン酸残基
（７．１％）を有する硫酸化ヘテロ多糖体であって、フ
コース：キシロース：マンノース：ガラクトース：グル
コース＝１．００：０．３５：０．２８：０．２２：
０．１５の比率で含まれ、ゲル濾過クロマトグラフィー
によって測定された平均分子量が２２２ｋＤａである、
抗トロンビン活性物質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34793299A JP4505056B2 (ja) | 1999-11-02 | 1999-11-02 | 抗トロンビン活性物質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34793299A JP4505056B2 (ja) | 1999-11-02 | 1999-11-02 | 抗トロンビン活性物質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001131202A true JP2001131202A (ja) | 2001-05-15 |
| JP4505056B2 JP4505056B2 (ja) | 2010-07-14 |
Family
ID=18393590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34793299A Expired - Lifetime JP4505056B2 (ja) | 1999-11-02 | 1999-11-02 | 抗トロンビン活性物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4505056B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017148414A1 (zh) * | 2016-03-03 | 2017-09-08 | 中国科学院上海药物研究所 | 褐藻多糖及其制备方法和用途 |
-
1999
- 1999-11-02 JP JP34793299A patent/JP4505056B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6010001641, 基礎と臨床, 1994, ２８（２）, ３９３−３９７ * |
| JPN6010001643, Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ, 199907, １３，７, ８０５−８０９ * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017148414A1 (zh) * | 2016-03-03 | 2017-09-08 | 中国科学院上海药物研究所 | 褐藻多糖及其制备方法和用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4505056B2 (ja) | 2010-07-14 |
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