JP2001504354A - 鏡像異性体的に濃縮したｎ−誘導体形成ラクタムの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、式（IV） （式中、Ｐは活性化および保護基である）の実質的に鏡像異性体的に純粋なＮ−保護した中間体を、それらのラセミ体からBacillus sp. 由来のアシラーゼ酵素で混合物を処理することにより製造する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 鏡像異性体的に濃縮したＮ−誘導体形成ラクタムの製造法 本発明は、鏡像異性体的に濃縮したＮ−誘導体形成した（１Ｒ，４Ｓ）−２− アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−３−オンの製造法に関する。 ２−アミノプリンヌクレオシド類似体であり、下記の構造（Ｉ） を有し、ＥＰ０４３４４５０号明細書により知られているアバカビールは、ヒト 免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対して強力 な活性を有する。 臨床試験を目的とする多量のアバカビールを合成する必要がある。将来におい て、アバカビールが国立医薬品調整局(national medicine regulatory agencies )によって承認されたならば、多量のアバカビールがＨＩＶ感染症の治療用の処 方薬として発売することも必要になる。 アバカビールの製造における重要な段階は、鏡像異性体的に純粋な置換シクロ ペンタン環の調製である。現在用いられている方法は、式（II） のラクタムから開始する方法であることが知られている。 ＥＰ−Ａ−０４２４０６４号明細書には、シクロペンタをシアン化トシルとの 反応によって調製したラセミ体ラクタム（II）をラクタマーゼと反応させて、開 環化合物（III）単一のシス鏡像異性体、または鏡像異性体の一方が濃縮されたシス鏡像異性体と 、一方または他の鏡像異性体が鏡像異性的に濃縮された未反応ラクタムとの混合 物を生成することができる。 本発明者らは、式（IV） （式中、Ｐは活性化および保護基である）の鏡像異性体的に実質的に純粋な中間 体をそれらのラセミ体から製造するための高収率で費用効果のよい方法を開発し た。 本発明者らは、式（II）の化合物中のラクタム窒素原子の基Ｐによる誘導体形 成（下記の式（Ｖ）におけるのと同様）により、ラクタム結合を活性化して加水 分解することを見いだした。本発明者らは、意外なことにはＥＰ−Ａ−０４２４ ０６４号明細書に記載されているものより容易に得られ、通常の条件下ではＥＰ −Ａ−０４２４０６４号明細書に記載されている式（II）のラクタムに関して活 性を持たないと思われる酵素を用いて、式（IV）の化合物を生成させることがで きることを見いだした。 従って、本発明の一態様によれば、Ｎ−保護した（±）−２−アザビシクロ［ ２．２．１］ヘプタ−５−エン−３−オン（Ｖ） （式中、Ｐは活性化および保護基である）のラセミ混合物の鏡像異性体分割によ り、混合物をアシラーゼ酵素で処理することによって実質的に鏡像異性体的に純 粋なＮ−保護した（１Ｒ，４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５ −エン−３−オン（IV）を生成する方法が提供される。 本発明のもう一つの態様によれば、上記の式（IV）の実質的に鏡像異性体的に 純粋なＮ−保護した（１Ｒ，４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ− ５−エン−３−オン（式中、Ｐは活性化および保護基である）の製造法であって 、上記の式（Ｖ）のＮ−保護した（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプ タ−５−エン−３−オン（式中、Ｐは活性化および保護基である）のラセミ混合 物をアシラーゼ酵素で処理し、式（IV）の未反応鏡像異性体を通常の手法によっ て反応混合物から単離することを特徴とする方法が提供される。 活性化／保護基は、アシルまたは置換オキシドカルボニル基であるのが好まし い。好ましいアシル基としては、ホルミルまたは低級アルカノイル(例えば、ア ルキル部分に１〜４個の炭素原子を有する)、特にアセチル基が挙げられる。好 ましい置換オキシカルボニル基は、式ＲＯＣ（Ｏ）−（式中、Ｒはアルキルまた はアラールキル基であることができる）を有するものである。好ましいアルキル 基は、第三ブチルである。可能なアラールキル基は、ベンジルである。 これらのアシル保護した化合物の実質的な脱保護は、水性条件下で行うことが できるので、反応は有機溶媒と水との混合物中で行うのが好ましい。環状エーテ ル、例えばヒトラヒドロフランまたは１，４−ジオキサンのような水相溶性有機 溶媒を用いるのが好ましい。脱保護を最小限にするには、７０％未満の水を用い るのが好ましく、約５０（容積）％以下の水を用いるのが更に好ましい。ヒトラ ヒドロフランと水が約５０：５０（容積／容積）の混合物が、最も適当であるこ とが見いだされた。 上記と同様に用いると、反応は一般に単一相で行うことができる。しかしなが ら、二相系を創生する目的で、芳香族炭化水素のような有機溶媒の使用も成功し ない理由はない。 反応が完結したならば、未反応および本質的に鏡像異性体的に純粋な式（IV） のＮ−保護した（１Ｒ，４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５− エン−３−オンを、溶媒抽出のような通常の手法によって反応混合物から単離す ることができる。 ラクタムを鏡像異性体選択的に加水分解して、後に所望な異性体が残るように する多数のアシラーゼ酵素が見いだされている。本発明者らは、Bacillus sp.由 来の酵素が特に活性の正しいプロフィールを示すことを見いだした。例えば、Su btilisin carlsberg(ALTUS)は、ラセミ混合物（Ｖ）からＮ−保護した（１Ｒ， ４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−３−オン［(IV)， Ｐ＝第三ブチルオキシカルボニル］を７３％の鏡像異性体過剰量で生成する。他 の酵素としては、Bacillus sp.プロテアーゼ、Neutrase、Novozyme 243、Alcala seおよびSavinaseが挙げられ、ALTUSおよびNOVOから発売されている。ブタ肝臓 エステラーゼ(ALTUS)、ブタ膵臓リパーゼ(Biocatalysts)、Flavorpro-192(ペプ チダーゼ、Biocatalysts)、Flavorpro-373(グルタミナーゼ、Biocatalysts)、Pr omod-TP(エンドペプチダーゼ、Biocatalysts)、lipase-CE(Humicola lanuginosa ,Amano)、protease-M(Aspergillus sp.,Amano)、prozyme-6(Aspergilus sp.,Ama no)、lipase PGE（コウシ歯根および唾液腺,Amano)、およびAspergillus sp.ア シラーゼ(Sigma)の ような鏡像異性体選択的加水分解を示す他の供給源からの酵素を用いることもで きる。 好ましくは、特に工業的規模での用途に適当なＮ−保護した（１Ｒ，４Ｓ）− ２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−３−オンの生物学的転換速 度を示すことが見いだされているので、市販のアシラーゼ酵素であるSavinase(N OVO)が用いられる。Savinaseは、Bacillusの親アルカリ種の水中培養によって調 製されるタンパク質分解酵素である。これは、セリン型のエンドプロテアーゼで ある。本発明者らが行った試験において、この酵素は、通常の使用条件下では式 （II）のアシル化されていないラクタムのラセミ混合物を加水分解する能力を全 く示さなかった。 Ｎ−保護した（１Ｒ，４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５− エン−３−オンの生物学的転換は、６〜１１．好ましくは７〜９のｐＨ範囲内で 行うのが望ましい。２０〜５０℃の範囲内の温度を用いるのが好ましい。工程を 約８のｐＨおよび約３０℃の温度で行うのが最も好ましい。Savinase：基質の比 が１：１〜１０：１、例えば２：１〜５：１（重量／重量）の範囲であれば、完 全で速やかな反応が生じる。所定の酵素に対する最適比は、簡単な実験によって 容易に決定することができる。 式（Ｖ）（式中、Ｐは第三ブチルオキシカルボニルである）の出発化合物は、 式（II）の相当する保護されていないラセミラクタムからTayler et al.,Tet.As ymmetry,4,p.1117(1993)に記載の方法と同様な方法によって調製することができ る。式（Ｖ）（式中、Ｐはホルミルまたは低級アルカノイルである）の化合物は 、式（II）の相当する保護されていないラセミラクタムからT.W.Greene，「有機 合成における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)」,Wiley，ニュ ーヨーク，１９８１年，２１８〜２８７頁、およびJ.F.W.McOmie，「有機化学に おける保護基(Protective Groups in Organic Chemistry)」,Plenum Press，ニ ューヨーク，１９７３年， ４３〜９３頁に記載の方法によって、または同様な方法によって調製することが できる。 式（IV）の化合物は、加水分解によって相当するＮ−保護アミノ酸に容易に転 換することができる。Ｎ−保護アミノ酸は、カルボン酸をアルコールに転換する ことができる試薬、例えば水素化アルミニウムリチウムまたはボランによって、 式（VI）の相当するアミノアルコールに容易に転換することができる。 あるいは、式（IV）の化合物は、Tet.Asymm.,4,p．1117(1993)に記載されている ような方法によって水素化ホウ素ナトリウムを用いて式（VI）の相当する開環し たアミノアルコールに直接転換することができる。 下記の実施例は、例示のためだけのものであり、本発明の範囲の限定を意図す るものではない。 実施例１ 数種類の加水分解酵素を、ラセミ体の（±）第三ブチル＝３−オキソ−２−ア ザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−カルボキシレート［(Ｖ)，Ｐ ＝第三ブチルオキシカルボニル］のラクタム結合を鏡像異性体選択的に加水分解 する能力についてスクリーニングした。反応は、５０％ヒトラヒドロフラン：５ ０％リン酸緩衝液（容積／容積）(５０ｍＭ，ｐＨ７)中にラセミ化合物１ｍｇ／ ｍｌを含む磁気攪拌したガラスバイアル(４ｍｌ作業容積)中、室温にて行った。 それぞれの酵素を加えて、最終濃度を２５ｍｇ／ｍｌとした。これは、スクリー ニング目的には、あらゆる可能な加水分解活性が検出される酵素対基質の比が２ ５：１（重量：重量）であることを表している。酵素を含まないフラスコは、コ ントロールとして用いた。定期的に、試料を取出して、水で１：２に希釈した後 、 ｈｐｌｃ分析を行った。 ｈｐｌｃ条件： カラム：Spherisorb C6(15×0.46cm)。 室温にて１ｍｌ／分のイソクラティック溶離。 移動相：０．１％（容積／容積）ギ酸を含む３０％（容積／容積）アセトニトリ ル。 検出波長２００ｎｍ。 （±）第三ブチル＝３−オキソ−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５ −エン−２−カルボキシレートの化学加水分解は、反応条件下では無視し得る程 度であることが示された。数種類の酵素は、ラセミ体化合物を鏡像異性体的に加 水分解して、キラライザー(chiralyser)（ＨＰＬＣによる旋光度検出器）による 旋光度が負の値を示すことから明らかなように、（−）−（１Ｒ，４Ｓ）−第三 ブチル＝３−オキソ−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２− カルボキシレートを生成すると思われた。Savinaseを選択して、更に検討を行っ た。出発材料約５０％を含む反応混合物をキラルｈｐｌｃによって分析し、残り のラクタムが９６．３％の鏡像異性体過剰量を有することを示した。 更に、残りの基質は、アバカビールの合成について正確な絶対配置のものであ った。 キラルｈｐｌｃ カラム：Chiralcel OD-H（２５×０．４６ｃｍ）。 ５℃にて０．５ｍｌ／分のイソクラティック溶離。 移動相：２％（容積／容積）イソプロピルアルコール／ヘプタン。 検出波長２０５ｎｍ。 比較例１ ラセミ体ラクタム（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン −３−オン（II）を１ｍｇ／ｍｌ含む溶液（４ｍｌ作業容積）を、５０％ヒトラ ヒドロフラン：５０％リン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７）中Savinase(NOVOから 入手可能)（２５ｍｇ／ｍｌ）で処理した。酵素を含まないフラスコを、コント ロールとして用いた。定期的に、試料を取出して、水で１：２に希釈した後、ｈ ｐｌｃ分析を行った。 ｈｐｌｃ条件： カラム：Spherisorb C6(１５×０．４６ｃｍ)。 室温にて１ｍｌ／分のイソクラティック溶離。 移動相：０．１％（容積／容積）ギ酸を含む４％（容積／容積）アセトニトリル 。 検出波長２００ｎｍ。 室温で４日間インキュベーションを行ったところ、反応は見られなかった。 実施例２ Savinase（３０ｇ、NOVO）を、５０：５０（容積／容積）ヒトラヒドロフラン ／５０ｍＭリン酸，ｐＨ８．０，３０℃中にラセミ体の（±）−第三ブチル＝３ −オキソ−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−カルボキシ レート［(Ｖ)、Ｐ＝第三ブチルオキシカルボニル］１０ｇを含む溶液（５００ｍ ｌ）に加えた。反応を、キラルＨＰＬＣによって２日間まで観察した。 反応が完結したならば（約５１％転換、（−）−（１Ｒ，４Ｓ）−第三ブチル ＝３−オキソ−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−カルボ キシレートの鏡像異性体過剰量＞９９．８％）、酵素を濾過して、透明になった 溶液のｐＨを重炭酸ナトリウム溶液で９に上げた。次いで、これをシクロヘキサ ン３×２００ｍｌで抽出した。合わせた有機相を重炭酸ナトリウム溶液１００ｍ ｌで逆抽出した後、塩水１００mlで洗浄した。蒸発および乾燥により、自由流動 性の白色固形物を得た(４．２ｇ、８４％理論単離収率)。これを、ＮＭＲにより （−）−（１Ｒ，４Ｓ）−第三ブチル＝３−オキソ−２−アザビシクロ［２．２ ．１］ ヘプタ−５−エン−２−カルボキシレートと確認し、鏡像異性体過剰量は、キラ ルＨＰＬＣによれば、＞９９．８％であった。 キラルｈｐｌｃ： カラム：Chiralcel OD-H(２５×０．４６ｃｍ)。 ０．５ｍｌ／分でイソクラティック溶離。 移動相：２％（容積／容積）イソプロピルアルコール／ヘプタン。 検出波長２０５ｎｍ。 温度５℃。 実施例３ 上記の（−）−（１Ｒ，４Ｓ）−第三ブチル＝３−オキソ−２−アザビシクロ ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−２−カルボキシレート（３．５ｇ）をヒトラ ヒドロフラン（１０ml）に溶解したものを、水素化ホウ素ナトリウム（１．２７ ｇ）をメタノール（１０ml）の懸濁液に加え、混合物を約２０℃で約１８時間攪 拌した。追加量のヒトラヒドロフラン（１０ml）および水素化ホウ素ナトリウム （１．２７ｇ）を加え、攪拌を更に約２時間継続した。２モル塩酸（３０ｍｌ） を慎重に加えた後、トルエン（２０ｍｌ）を加えた。２層を分離し、水層をトル エン（２×２５ｍｌ）で更に抽出した。合わせた有機抽出物を塩水（２０ｍｌ） で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させて、１Ｒ，４Ｓ）−（４−ヒド ロキシメチル）−シクロペンタ−２−エン−１−イルカルバミン酸第三ブチルエ ステル（３．２３ｇ）をキラルｈｐｌｃによれば９９．２％の鏡像異性体過剰量 で淡黄色ガム状生成物として得て、これは、分光分析およびクロマトグラフィ的 に真正試料と同一であった。 キラルｈｐｌｃ： カラム：Chiralcel OD-H(２５×０．４６ｃｍ)。 流速：１．０ｍｌ／分。 移動相：３％（容積／容積）イソプロピルアルコール／ヘプタン。 検出波長２０５ｎｍ。 温度３５℃。 実施例４ Savinaseを、ラセミ体のシス−２−アセチル−２−アザビシクロ［２．２．１ ］ヘプタ−５−エン−３−オンのラクタム結合を鏡像異性体選択的に加水分解す る能力について試験した。反応は、５０％ヒトラヒドロフラン：５０％リン酸緩 衝液（容積／容積）(５０ｍＭ，ｐＨ７)中に基質１ｍｇ／ｍｌを含む磁気攪拌し たガラスバイアル（４ｍｌ作業容積）中で、室温にて行った。反応は、Savinase を最終濃度２５ｍｇ／ｍｌまで加えることによって開始した。酵素を含まないフ ラスコは、コントロールとして用いた。定期的に、試料を取出して、水で１：２ に希釈した後、ｈｐｌｃ分析を行った。 ｈｐｌｃ条件： カラム：Spherisorb C6(１５×０．４６ｃｍ)。 ２０℃にて１ｍｌ／分のイソクラティック溶離。 移動相：０．１％（容積／容積）ギ酸を含む５％（容積／容積）アセトニトリル 。 検出波長２１０ｎｍ。 キラルｈｐｌｃ： カラム：Chiralpak AD(２５×０．４６ｃｍ)。 ２０℃にて１ｍｌ／分のイソクラティック溶離。 移動相：２％（容積／容積）エタノール／ヘプタン。 検出波長２１５ｎｍ。 酵素が含まれていなければ、基質の化学加水分解は、反応条件下では無視し得 る程度であることが示された。しかしながら、ヒトラヒドロフランを反応混合物 から除くと、基質の有意な非酵素的加水分解が見られた。Savinaseは、キラライ ザーによる旋光度が負の値を示すことおよびキラルｈｐｌｃ分析から明らかなよ うに、シス−２−アセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン −３−オンを鏡像異性体選択的に加水分解して、（−）−（１Ｒ，４Ｓ）−２− アセチル−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−３−オンを生成 した。出発材料約５０％を含む反応混合物を２日後にキラルｈｐｌｃによって分 析し、残りのラクタムが真正試料と比較して＞９９．８％の鏡像異性体過剰量を 有し、アバカビールの合成について正確な絶対配置を有するものであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 クリストファー、ジョン、ウォリス イギリス国ハートフォードシャー、スティ ーブニッジ、ガネルス、ウッド、ロード グラクソ、ウェルカム、ピーエルシー内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式（IV） （式中、Ｐは活性化および保護基である）の実質的に鏡像異性体的に純粋なＮ− 保護した（１Ｒ，４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン− ３−オンの製造法であって、 Ｎ−保護した（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−３ −オン（Ｖ） （式中、Ｐは活性化および保護基である）のラセミ混合物をアシラーゼ酵素で処 理し、式（IV）の未反応鏡像異性体を慣用方法によって反応混合物から単離する ことを特徴とする、方法。 ２． Ｎ−保護した（±）−２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−５−エ ン−３−オン（Ｖ） （式中、Ｐは活性化および保護基である）のラセミ混合物を鏡像異性体分割する 方法であって、混合物をアシラーゼ酵素で処理することによって実質的に鏡像異 性体的に純粋なＮ−保護した（１Ｒ，４Ｓ）−２−アザビシクロ［２．２．１］ ヘプタ−５−エン−３−オン（IV）を生成する、方法。 ３． Ｐがアシルまたはオキシカルボニル基である、請求項１または２に記載 の方法。 ４． Ｐがホルミルであるか、または１〜４個の炭素原子を有するアルカノイ ル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５． Ｐがアルキルオキシカルボニルまたはアラールキルオキシカルボニル基 である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ６． Ｐが第三ブチルオキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニル基で ある、請求項５に記載の方法。 ７． アシラーゼ酵素がBacillus sp.由来のものである、請求項１〜６のいず れか１項に記載の方法。 ８． アシラーゼ酵素がSavinaseである、請求項７に記載の方法。 ９． 反応を有機溶媒と水との混合物中で行う、請求項１〜８のいずれか１項 に記載の方法。 １０． 有機溶媒が水相溶性溶媒であり、７０容積％未満の水を用いる、請求 項９に記載の方法。 １１． 水相溶性の有機溶媒がヒトラヒドロフランまたは１，４−ジオキサン である、請求項１０に記載の方法。 １２． 反応を、６〜１１のｐＨ範囲内および２０〜５０℃の温度で行う、請 求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。 １３． 反応を、ｐＨが約８および約３０℃の温度で行う、請求項１２に記載 の方法。 １４． 式（IV）の未反応のＮ−保護した（１Ｒ，４Ｓ）−２−アザビシクロ ［２．２．１］ヘプタ−５−エン−３−オンを溶媒抽出によって単離する、請求 項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。