JP2001518902A - スワインソニンのハロゲン化アルカロイド塩およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、スワインソニンの結晶塩およびその使用方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 スワインソニンのハロゲン化アルカロイド塩およびその使用方法発明の分野 本発明は、スワインソニン(swainsonine)のハロゲン化物塩、およびその塩の 使用方法に関する。発明の背景 スワインソニン（ＳＷ）は、オーストラリア産スワインソニン・キャンセンズ （Colegateら著、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ケミストリー３２：２ ２５７〜２２６４頁、1979年）、ゲンゲ属およびオキシトロピス類の北米産の植 物（Molyneux R．J.およびJames L．F.、サイエンス２１５：１９０〜１９１頁 、1981年）、および真菌リゾクトニア属の菌糸型不完全菌類レグミニコラ（Schn eiderら著、テトラヘドロン３９：２９〜３１頁、1983年）から単離され得るイ ンドリジジン系アルカロイドである。スワインソニンは、α−マンノシダーゼII 活性を抑制する可能性に起因する、重要な免疫変調および癌抑制活性を有する。 スワインソニンは、マンノピラノシドの加水分解分裂中に発生するグリコシルカ チオン中間体によく似ていることから、酵素抑制剤として機能するものと考えら れる（Goss，P．E.ら著、クリン・カンサー・リサーチ１：９３５〜９４４頁、1 995年）。 α−マンノシダーゼIIのスワインソニン阻害は、ＧｌｃＮＡｃβ(1-6)分岐し たＮ結合炭化水素類の発生を予防する。スワインソニン処置されたマウスの腫瘍 細胞は、マウス内での有機コロニー形成および自発性転移アッセイの両者におい て転移が少ないことが分かった（Dennis J．W．著、カンサー・チサーチ４６： ５１３１〜５１３６頁、1986年およびHumphriesら著、プロシーディングズ・オ ブ・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー８３：１７ ５２〜１７５６頁、1986年）。スワインソニンは、生体外で細胞外基質を介して 腫瘍細胞の侵入をブロックすることも分かっている（Yegelら著、インターナシ ョナル・ジャーナル・オブ・カンサー４４：６８５〜６９０頁、1989年および Seftorら著、メラノーマ・リサーチ１：５３〜５４頁、1991年）。胸腺欠損のヌ ードマウスに経口投与または小さな浸透圧ポンプによって投与されたスワインソ ニンは、マウス内で、ヒトＭｅＷｏメラノーマとＨＴ２９ｍ大腸癌腫瘍の異種移 植の成長速度を抑制した（Goss rら著、カンサー・リサーチ.、５４：１４５０ 頁、1995年およびGossら著、クリニカル・カンサー・リサーチ、３：１０７７頁 、1997年）。 スワインソニンは、免疫刺激性効果を有する（Humphries M．J.およびOlden K ．著、ファーマコル・セル４４：８５〜１０５頁、1989年、およびOldenら著、 ファーマコル・セル５０：２８５〜２９０頁、1991年に概説されている。）。特 に、スワインソニンは、化学誘発系および腫瘍関連系の両者の免疫抑制を軽減し （ヒノら著、ジャーナル・アンチブロット（東京）３８：９２６〜９３５頁、19 85年）、ＮＫ細胞（Humphriesら著、カンサー・リサーチ．４８：１４１０〜１ ４１５頁、1988年）およびＬＡＫ細胞（Yahita M.およびSalsela E.著、スカン ジナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー３１：２７５〜２８２頁、1990年 ）の活性を高め、脾細胞および骨髄（ＢＭ）細胞増殖を高める（Whiteら著、バ イオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション１５ ０：６１５〜６２５頁、1988年；Bowlinら著、カンサー・リサーチ.４９、４１ ０９〜４１１３頁、1989年およびWhiteら著、カンサー・コム３：８３〜９１頁 、1991年）ことも分かっている。 スワインソニンは、血液回復／化学保護的な効果を有することも分かっている 。例えば、スワインソニンは、種々の化学療法剤の死亡率に対し保護することが 分かっている（Oredepeら著、1991年、ナトル・カンサー・インスト８３：１１ ４９〜１１５６頁、1991年）。これらの研究において、スワインソニン処置され たマウスの高い生存率は、マウスにおける骨髄増殖、骨髄細胞および移植効果の 刺激と相関関係にあった（Oredepeら著、1991年；Whiteら著、1991年）。 米国特許第４，８５７，３１５号には、癌転移および細胞増殖を抑制するため の医薬配合中にＳＷおよびＳＷの活性な類似体を含有する組成物、およびインタ ーフェロンまたはインターフェロン誘発剤の抗増殖性および抗ウィルス性効果を 高めるためのインターフェロンまたはインターフェロン誘発剤と組み合わせた組 成物が記載されている。発明の要旨 本発明は、安定で実質上精製された合成のスワインソニンのハロゲン化物塩に 関する。ハロゲン化物塩は、安定な形態で精製するのが非常に困難であることが あり、スワインソニン塩が、Ｘ線回折法で構造を決定するのに使用できる結晶を 形成するかどうかが不確かであった。特に、本発明は、安定で実質上精製された スワインソニンの結晶性塩化物および臭化物塩を得ることができ、また、Ｘ線結 晶学によりその構造を決定することができた。 本発明のスワインソニン塩は、生体外および生体内抗癌活性を共に有する。重 要なことには、本発明の特定の塩は、スワインソニンを含まない基剤と比べて高 い安定性を有し、スワインソニンよりも早く溶解しかつ標的にすることができる 特性を有する。すなわち、本発明の塩は、改良された医薬組成物を提供する。 本発明の一つの観点は、スワインソニンの特定のハロゲン化物塩を得ること、 特にＸ線回折法で化合物の立体（３次）構造を決定するのに十分な品質のスワイ ンソニン結晶性塩化物および臭化物塩を得ることにある。従って、本発明は、ス ワインソニンの塩化物および臭化物塩の立体構造の決定を高解像度で達成するの に十分な品質の結晶を提供する。 それにより、本発明は、スワインソニンの安定な結晶性塩化物および臭化物塩 を提供する。特に、本発明は、互いに水素結合相互作用で保持されたスワインソ ニン塩化物または臭化物塩の分子を単位セル内に含むスワインソニンの安定な結 晶性塩化物または臭化物塩に関する。一つの態様において、結晶性塩化物および 臭化物塩は、スワインソニン塩化物または臭化物塩の分子４個を単位セル内に含 んでいる。好ましくは、結晶性塩化物および臭化物塩は、スワインソニン塩酸ま たは臭化水素酸塩分子を含む。 本発明のスワインソニン塩化物および臭化物塩、特にスワインソニン塩酸また は臭化水素酸塩は、医薬組成物を調製するのに使用されてよい。従って、本発明 は、スワインソニン塩化物または臭化物塩、好ましくは結晶性スワインソニン塩 酸または臭化水素酸塩を選ばれた医薬ビヒクル、賦形剤または希釈液中に混合す ること、および場合により他の治療剤を添加することを含む医薬組成物の調製方 法を提供する。 本発明は、組成物、特に本発明のスワインソニン塩化物または臭化物塩、好ま しくは塩酸または臭化水素酸塩を含む医薬組成物も企図している。本発明の好ま しい態様において、結晶性スワインソニン塩酸または臭化水素酸塩を含む固形医 薬組成物（例えば、タブレット、カプセル、粉末または微紛状）が提供される。 生体外および生体内での研究により、本発明の塩、特に本発明のスワインソニ ン塩酸塩は、免疫変調および抗癌特性並びに血液回復／化学保護特性を有するこ とが分かった。例えば、本発明のスワインソニン塩酸塩による治療は、i.p.（腹 膜腔内）注入によりまたは飲料水により経口的に投与すると、免疫適格性マウス に注入されたＳＰ１.Ａ３ａ乳腺癌細胞の成長を低減した。生体外でのＳＰ１Ａ ３ａ細胞の成長は、ＴＧＦ−β１およびＴＮＦαによって刺激され、その効果は 、本発明のスワインソニン塩酸塩によって抑制された。さらに、本発明のスワイ ンソニン塩酸塩によるマウスの骨髄細胞の生体外処置は、赤血球および顆粒球マ クロファージコロニー形成細胞の両者（ＣＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭそれぞれ ）の増殖を刺激した。 従って、本発明は、免疫系を刺激する方法、造血性前駆体細胞の増殖を刺激す る方法、増殖性障害または微生物もしくは寄生虫感染を治療する方法、または本 発明のスワインソニン塩の有効量を投与することを含む対象に化学療法および放 射線療法に対する保護を与える方法にも関する。本発明は、免疫系を刺激するた め、造血性前駆体細胞の増殖を刺激するため、または対象に化学療法および放射 線療法に対する保護を与えるため、および／または増殖性障害および微生物また は寄生虫感染を治療するための薬剤の調製における本発明のスワインソニン塩の 使用にも関する。 スワインソニンの塩化物および臭化物塩に関して得られた知識は、関連する化 合物（すなわち、スワインソニンの類似体および誘導体その塩）の立体構造を設 計するのに使用することができる。また、スワインソニンの塩化物および臭化物 塩の構造の知識は、これらの化合物の体内での作用機序を評価する手段を提供す る。例えば、化合物のαマンノシダーゼII活性を抑制する可能性は、種々のコン ピューター設計によって予測され得る。スワインソニンの塩化物および臭化物塩 の原子配位座標および原子的詳細の知識は、スワインソニン並びにその類似体お よび誘導体の装飾因子を設計し、コンピューター評価し、合成しおよび使用する のに用いられ、スワインソニンの望ましくない物理的および薬理学的特性を予防 または処置することができる。すなわち、本発明のもう一つの観点は、スワイン ソニンのハロゲン化物塩の作用とよく似た薬剤の合理的な設計における出発物質 である材料を提供することである。この薬剤は、免疫および繁殖する疾病または 微生物もしくは寄生虫感染の治療に有益な治療剤として使用できる。 本発明の上記または他の観点は、以下の詳細な説明および添付した図面を参照 することよって明白となるであろう。さらに、ここで引用される様々な刊行物の 内容全てをここに挿入する。図面の簡単な説明 以下、図面を参照して本発明を説明すると、 図１は、スワインソニン塩酸塩の分子構造を示し、 図２は、スワインソニン臭化水素酸塩の分子構造を示し、 図３は、スワインソニン塩酸塩の結晶充填図であり、 図４は、スワインソニン臭化水素酸塩の結晶充填図であり、 図５は、本発明のスワインソニン塩酸塩の質量スペクトルであり、 図６は、本発明のスワインソニン塩酸塩の高性能液体クロマトグラフであり、 図７は、ＳＰ１.Ａ３ａ乳腺腫瘍細胞の生体外増殖の増加に対するスワインソニ ン塩酸塩の効果を示すグラフであり、 図８は、Alzetポンプを介してのスワインソニン塩酸塩による腫瘍成長の抑制を 示すグラフであり、 図９は、スワインソニン塩酸塩の経口投与による腫瘍成長の抑制を示すグラフで あり、 図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、スワインソニン塩酸塩が、ポリＩＣを含むＤ ＢＡ／２マウスの処置後の脾臓においてＳＴＡＴ１の活性を高めることを示すブ ロットであり、および 図１１は、異なるサイトカインの存在下におけるマウス骨髄ＣＦＵ−ＧＭにおけ るスワインソニン塩酸塩の生体外での効果を示すグラフである。発明の詳細な説明 本発明は、安定でかつ実質上精製されたスワインソニンのハロゲン化物塩を提 供する。「ハロゲン化物塩」は、塩化物、フッ化物、臭化物、ヨウ化物塩であり 、好ましくは塩化物または臭化物塩である。前記塩のカウンターカチオンは、ア ルカリ金属（例えば、Ｌｉ、ＮａまたはＫ）または好ましくは水素であり得る。 本発明の一態様では、スワインソニンを含まない基剤よりも熱安定性の高い（例 えば、約１０５℃で酸素または窒素雰囲気に約７日間露出させた場合、スワイン ソニンを含まない基剤よりも安定性が良い）スワインソニンの塩酸塩が提供され る。 別の態様において、本発明は、結晶性スワインソニン塩化物または臭化物塩を 提供する。結晶性スワインソニン塩化物または臭化物塩は、水素結合相互作用に より互いに保持される単位セル内にスワインソニン塩化物または臭化物塩の分子 を含み得る。特に、前記結晶性塩化物または臭化物塩は、単位セル内にスワイン ソニン塩化物または臭化物塩分子４個を含んで成る。好ましくは、結晶性塩化物 または臭化物塩は、スワインソニン塩酸または臭化水素酸塩４個を単位セル内に 含んで成る。 本発明の結晶性スワインソニン塩化物塩は、スワインソニン塩化物塩分子のプ ロトン化窒素およびヒドロキシル酸素原子から他のスワインソニン塩化物塩分子 の塩化物イオンへの水素結合相互作用によって互いに保持されていてよい。本発 明の結晶性スワインソニン臭化物塩は、スワインソニン臭化物塩分子の第１分子 のヒドロキシル酸素原子から他のスワインソニン臭化物塩分子の臭化物イオンへ の水素結合相互作用と、スワインソニン臭化物塩の第１分子のプロトン化窒素原 子からスワインソニン臭化物塩の第２分子の酸素原子への水素結合相互作用とに よって互いに保持されていてよい。 好ましくは、スワインソニン塩化物塩分子のプロトン化窒素およびヒドロキシ ル酸素原子から他のスワインソニン塩化物塩分子の塩化物イオンへの水素結合相 互作用によって互いに保持されるスワインソニン塩酸塩分子を単位セル内に含ん で成る結晶性スワインソニン塩酸塩が提供される。さらに、スワインソニン臭化 物塩分子の第１分子のヒドロキシル酸素原子から他のスワインソニン臭化物塩分 子の臭化物イオンへの水素結合相互作用と、第１分子のプロトン化窒素原子から 第２分子の酸素原子への水素結合相互作用とによって互いに保持されるスワイン ソニン臭化水素酸塩分子を単位セル内に含んで成る結晶性スワインソニン臭化水 素酸塩が提供される。 前記結晶は、ハロゲン化物塩分子、水素結合相互作用、および／または空間群 の種類にもとづく結晶シンメトリー形態であればどのようなものであってもよい 。シンメトリー形態は、結晶格子を形成する各方向に繰り返される、基本的に平 行六面体の「単位セル」で表される。「空間群」という用語は、結晶のシンメト リー要素の配置をいう。本発明の一態様では、結晶性スワインソニン塩酸または 臭化水素酸塩は、空間群Ｐ２₁２₁２₁を有する。本発明の好ましい態様では、ス ワインソニン塩化物または臭化物塩の結晶は、斜方晶の単位セルを含んで成る。 Ｘ線結晶学から得られる回折データは、結晶の繰り返し単位の電子密度図を計 算するのに使用される。電子密度図は、結晶の単位セル内での個々の原子の位置 を確定するのに使用される。単位セルの軸方向の長さは、（ａｂｃ）で表される 。ただし、ａはｘ軸、ｂはｙ軸およびｃはｚ軸である。（ｘｙｚ）は、配座軸ａ 、ｂおよびｃに沿った原点からの距離として測定される各原子の配位座標も表す 。当該分野の熟練者は、Ｘ線結晶学によって決定される一組の原子配位座標には 、標準誤差を含まないことがないことを知っている。 本発明のスワインソニン塩酸塩結晶についての単位セルは、単位セル長：ａ＝ ８．０９±０．０１Å、ｂ＝９．３９±０．０１Åおよびｃ＝１３．６２±０． ０１Åを有していてよい。本発明の好ましい態様において、スワインソニン塩酸 塩の結晶中の原子は、表１に示す原子配位座標で表される。本発明のもう一つの 好ましい態様において、スワインソニン臭化水素酸塩の結晶中の原子は、表２に 示す原子配位座標で表される。 ｘ、ｙおよびｚ配位座標を用いて表されるスワインソニンの塩酸および臭化水 素酸塩の立体構造を図１および２にそれぞれ示す。結晶性スワインソニン塩酸お よび臭化水素酸塩についての結晶充填図を図３および４にそれぞれ示す。 本発明のスワインソニン塩の調製 本発明の結晶性塩は、スワインソニンアセトニドを酸で処理し、結晶法によっ て前記塩を精製することによって調製され得る。スワインソニンアセトニドは、 BebbettらおよびChaら（ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテ ィ１１１：２５８０〜２５８２頁、１９８９年および米国特許第５，１８７，２ ７９号のそれぞれ）に記載の通り入手することができる。前記アセトニドを加水 分解して、本発明の実質状純粋な結晶性塩を形成することができる。例えば、実 質上純粋な結晶性塩酸塩は、実施例１に記載の如く、スワインソニンアセトニド を加水分解することにより形成され得る。 本発明の化合物を調製する場合、通常の保護基を使用して、反応基をブロック してよい。適切なブロッキングおよび脱ブロッキングスキームは、当業者には既 知である（T．W．GreeneおよびP．G．M．Wuts著、第２版、有機合成における保 護基、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ発行、ニューヨーク、１９９１年を参 照のこと）。通常、当該反応基をその後の合成工程中、好適に保護し、かつ所望 の生成物の劣化を起さない条件下で容易に取り外せる特定の保護基が選択される 。生体内では、いくつかの保護基は、（例えば、加水分解または酸化を介して） 活性な官能基に分裂または代謝転換される。代謝分解された保護基は、場合によ り、好ましい。使用され得る保護基の例としては、ヒドロキシル保護基、カルボ ン酸塩保護基およびカルボニル保護基が挙げられる。 使用され得る代表的なヒドロキシル保護基としては、以下のものが挙げられる 。メチルエーテル類は、メトキシメチル；メチルチオメチル、t-ブチルチオメチ ル；（フェニルジメチルジイル）メトキシメチル；ベンジロキシメチル；p-メト キシベンジロキシメチル；（４−メトキシフェノキシ）メチル；グアヤコールメ チル；t-ブトキシメチル；４−ペンテニロキシメチル；シロキシメチル；２−メ トキシエトキシメチル；２，２，２−トリクロロブロモテトラヒドロピラン−２ −イル；１−メトキシシクロヘキシル；４−メトキシーテトラヒドロピラン−２ −イル；４−メトキシテトラヒドロチオピラン−２−イル；４−メトキシテトラ ヒドロチオ−２−イル−Ｓ，Ｓ−ジオキサイド；１−[(２−クロロ−４−メチル ）フェニル]−４−メトキシピペリジン−４−イル；１，４−ジオキサン−２− イル；テトラヒドロフラニル；テトラヒドロチオフラニル；および２，３，３ａ ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メ タノベンゾフラン−２−イルを包含する。 エチルエーテル類は、１−エトキシエチル；１−（２−クロロエトキシ）エチ ル；１−メチル−１−メトキシエチル；１−メチル−１−ベンジロキシ−２−フ ルオロエチル；２，２，２−トリクロロエチル；２−トリメチルシリルエチル； ２−（フェニルセレニル）エチル；t-ブチル；アリル；p-クロロフェニル；p-メ トキシフェニル；および２，４−ジニトロフェニルを包含する。 ベンジルエーテル類は、ベンジル；p-メトキシベンジル；３，４−ジメトキシ ベンジル；o-ニトロベンジル；p-ニトロベンジル;p-ハロベンジル；２，６−ジ クロロベンジル；p-シアノベンジル；p-フェニルベンジル；２−および４−ピコ リル；３−円散る−２−ピコリル−Ｎ−オキサイド；ジフェニルメチル；ｐ，ｐ ’−ジニトロベンズヒドリル；５−ジベンゾスベリル；トリフェニルメチル；α −ナフチルジフェニルメチル；p-メトキシフェニルジフェニルメチル；ジ（p-メ トキシフェニル）フェニルメチル；トリ（p-メトキｓフェニル）メチル；４−（ ４’−ブロモ−フェナシロキシ）フェニルジフェニルメチル；４，４'，４"−ト リス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル；４，４'，４"−トリス −（レブリノイロキシフェニル）メチル；４，４'，４"−トリス（ベンゾイロキ シフェニル）メチル；３−（イミダゾール−１−イルメチル）ビス（４'，４"− ジメトキシフェニル）−メチル；１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１' −ピレニルメチル；９−アントリル；９−（９−フェニル）キサンテニル；９− （９−フェニル−１０−オキソ）アントリル；１，３−ベンゾジチオラン−２− イル；およびベンズイソタゾリル−Ｓ，Ｓ−ジオキサイドを包含する。 シリルエーテル類は、トリメチルシリル；トリエチルシリル；トリイソプロピ ルシリル；ジメチルイソプロピルシリル；ジエチルイソプロピル−シリル；ジメ チルテキシルシリル；t-ブチルジメチルシリル；t-ブチル−ジフェニルシリル； トリベンジルシリル；トリ−p-キシリルシリル；トリフェニル−シリル；ジフェ ニルメチルシリル；およびt-ブチルメトキシフェニルシリルを包含する。 エステル類は、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート；クロロアセ テート；トリクロロアセテート；メトキシアセテート；トリフェニルメトキシア セテート；フェノキシアセテート；p-クロロフェノキシアセテート；p-（ホスフ ェート）フェニルアセテート；３−フェニルプロピオネート；４−オキソペンタ ノエート；４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート；ピバレート；アダマン トエート；クロトネート；４−メトキシクロトネート；ベンゾエート；p-フェニ ルベンゾエート；および２，４，６−トリメチルベンゾエートを包含する。 カーボネート類は、メチルカーボネート；９−フルオレニル−メチルカーボネ ート；エチルカーボネート；２，２，２−トリクロロエチルカーボネート；２− （トリメチルシリル）エチルカーボネート；２−（フェニル−スルホニル）エチ ルカーボネート；２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート；イソブ チルカーボネート；ビニルカーボネート；アリルカーボネート；p-ニトロフェニ ルカーボネート；ベンジルカーボネート；p-メトキシベンジルカーボネート；３ ，４−ジメトキシベンジルカーボネート；o-ニトロベンジルカーボネート；p-ニ トロベンジルカーボネート；Ｓ−ベンジルチオカーボネート；４−エトキシ−１ −ナフチルカーボネート；およびメチルジチオカーボネートを包含する。 分裂に関する保護基としては、２−ヨードベンゾエート；４−アジドブチレー ト；４−ニトロ−４−メチルペンタノエート；o-（ジブロモメチル）ベンゾエー ト；２−ホルミルベンゼンスルホネート；２−（メチルチオメトキシ）エチルカ ーボネート；４−（メチルチオメトキシ）−ブチレート；および２−（メチルチ オメトキシメチル）ベンゾエートが挙げられる。 種々雑多なエステル類は、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテー ト；２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチル−ブチル）フェノ キシアセテート；２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）−フェノキシアセ テート；クロロジフェニルアセテート；イソブチレート；モノスＯＨＣシノエー ト；（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート（tigloate）；o-（メトキシカルボ ニル）ベンゾエート；p-ベンゾエート；α−ナフトエート、ニトレート；アルキ ル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルホスホロジアミデート；Ｎ−フェニルカル バメート；ボレート；ジメチルホスフィノチオイル；および２，４−ジニトロフ ェニルースルホネートを包含する。 スルホネート類は、メタンスルホネート（メシレート）；ベンジルスルホネー ト；およびトシレートを包含する。 環状アセタール類およびケタール類は、メチリデン；１−t-ブチルエチリデ ン；１−フェニルエチリデン；４−（メトキシフェニル）エチリデン；２，２， ２−トリクロロエチリデン；アセトニド（イソプロピリデン）；シクロペンチリ デン；シクロヘキシリデン；シクロヘプチリデン；ベンジリデン；p-エｍトキシ ベンジリデン；２，４−ジメトキシベンジリデン；３，４−ジメトキシベンジリ デン；および２−、３−または４−ニトロベンジリデンを包含する。 環状オルトエステル類は、メトキシメチレン；エトキシメチレン；ジメトキシ メチレン；１−メトキシエチリデン；１−エトキシエチリデン；１，２−ジメト キシ−エチリデン；α−メトキシベンジリデン；１−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ ）エチリデン誘導体；α−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ベンジリデン誘導体；お よび２−オキサシクロペンチリデンを包含する。 隣接する置換基対についての上述の２価の有機部位のようなこれらの環状オル トエステル類は、隣接しないヒドロキシル部位と反応することがある。例えば、 隣接する置換基対について前段または先に引用した２価の有機部位が、同一分子 上の隣接しない置換基２個かまたは２つの別々の分子上のいずれか２個の置換基 に選ばれることがある。２つの別々の分子は、同一または異なっていてよく、こ こで開示した化合物から選択される。 シリル誘導体は、ジ−t-ブチルシリレン基；１，３−（１，１，３，３−テト ライソプロピルジシロキサニリデン）誘導体、テトラ−t-ブトキシジシロキサン −１，３−ジイリデン誘導体；環状炭酸エステル類；環状ホウ酸エステル類；ホ ウ酸エチル；およびホウ酸フェニルを包含する。 カテコール類のための好ましい保護基としては、メチレン、アセトニド、シク ロヘキシリデンおよびジフェニルメチリデンのような環状アセタール類およびケ タール類；および環状ホウ酸エステルおよび環状炭酸エステルのような環状エス テル類が挙げられる。 本発明は、１個以上の通常既知の保護基（例えば、ここで記載したヒドロキシ ル保護基、カルボキシレート保護基およびカルボニル保護基）が使用されること 以外は、本発明のスワインソニン塩と同一の化合物も包含する。 本発明は、医薬的に入手可能であって上記とそれぞれ同一ではなく、場合によ り、新陳代謝されてここに記載した化合物の一つを形成する他のＣ_1-10ヒドロ キシル保護基も更に包含する。換言すると、本発明は、上記化合物の代謝型前駆 体、および抗癌、抗ウィルスまたは抗増殖活性を有する上記化合物の代謝生成物 を包含する。 更に本発明は、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、クエン酸塩、乳酸塩、 酒石酸塩を含む、４級アミン塩および上記化合物の他の有機塩も包含し、好まし くはホルメートおよびアセテート、または他のカルボン酸、アミノカルボン酸も しくはポリカルボン酸塩を包含する。 本発明の結晶は、例えば、スワインソニン塩酸塩または臭化水素酸塩を溶媒（ 例えば、メタノール）中に溶解して、溶媒を蒸発することによって形成されても よい。前記結晶は、標準的な方法を用いる拡散によって調製されてもよい。 スワインソニンの機能性誘導体の結晶性塩化物または臭化物塩（特に、塩酸ま たは臭化水素酸塩）が、ここで記載した方法を用いて調製できることも高く評価 され、当該方法により調製される塩も本発明に包含される。スワインソニンの「 機能性誘導体」とは、スワインソニンの生物学上の活性と実質的に同じである生 物学的（機能的であるかまてたは構造上の）活性を持つ化合物をいう。「機能性 誘導体」は、スワインソニンの「変態」、「類似体」または「化学誘導体」を包 含するものとする。「変態」とは、スワインソニンまたはその一部と構造上およ び機能的に実質上同一の分子を意味する。両者が実質上同一の構造を有するか、 または両方の分子が同様の生物学上の活性を有するのであれば、分子はスワイン ソニンと「実質上同一」である。「化学誘導体」は、普通、基本分子の一部では ない別の化学部位を含む分子を表す。 本発明の組成物 本発明は、本発明のスワインソニン塩（例えば、塩化物または臭化物塩、好ま しくは結晶性塩酸または臭化水素酸塩、最も好ましくはスワインソニンの斜方晶 塩酸塩）、本発明のスワインソニン塩の組み合わせ、あるいはスワインソニンと 本発明のスワインソニン塩との組み合わせから処方される医薬組成物を提供する 。組成物は、本発明のスワインソニン塩を包含するか、または上記塩から調製さ れるスワインソニンの形態（例えば、タブレット、ソフトゲルカプセルを含むカ プセル、または粉末もしくは微粉末状のハロゲン化物塩、または当該分野で既知 の 他の非経口的、経皮的、鼻腔内もしくは経口投与形態）を包含する。 本発明の好ましい組成物は、活性成分（すなわち、本発明の塩）が結晶性形態 である固形組成物である。例えば、組成物は、タブレット、カプセルまたはパウ ダー状であり得る。高い安定性を有する、特に好ましい本発明の固形組成物は、 本発明の結晶性塩酸塩を含んで成る。 本発明の結晶性塩は、実質上純粋な活性成分の医薬組成物中での使用を可能に する。「実質上純粋な」とは、少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９ ７重量％の純度（例えば、少なくとも９９重量％〜９９．５重量％）を包含する 。不純物は、合成または分解の副生成物を包含する。実質上純粋なスワインソニ ンの結晶性塩酸塩は、実際には無色で、かつ角柱形態で有り得る。 本発明の組成物は、１つまたはそれ以上の医薬用キャリヤー、および場合によ り１つまたはそれ以上の生理活性剤を包含する。例えば、本発明のスワインソニ ンの塩から処方される組成物は、(a)本発明のスワインソニン塩、医薬用キャリ ヤーを含むタブレットであって、吸収増強剤も含んでいてよい、(b)結晶性、非 晶質またはガラス粉末を含有するカプセル、ミクロスフェアー、または本発明の スワインソニン塩から作製されたペレットであって、前記カプセル中ではスワイ ンソニン塩は透明な結晶の形態（例えば、角柱）ではないもの、(c)本発明のス ワインソニン塩から作製されたソフトゲルカプセル、(d)本発明のスワインソニ ン塩の水溶液であって、溶解したスワインソニン塩は、透明な結晶ではなく、例 えば、水素または塩化物もしくは臭化物と関連していなくてもよいもの、および (e)当該分野において既知の多の非経口的、経皮的または経口投与形態を包含し ていてよい。本発明の塩から誘導されるスワインソニンを含まない基剤も、本発 明の特定の処置方法では有用である。しかしながら、純粋なスワインソニンを含 まない基剤は単独では本発明の組成物中での使用に含まれない。 投与経路は、経口、肺、局所、体腔（例えば、鼻腔眼腔、口腔）、経皮、非経 口（例えば、静脈、筋内および皮下経路）を含む。外用作用性ドラッグデリバリ ーシステムは、熱、超音波、電波、イオン導入、電気泳動、磁気変調および光に よって活性化されるものを含む。 製剤は、固体（タブレット、ソフトもしくはハードゼラチンカプセル）、半固 体（ゲル、クリーム）または液体（溶液、コロイドもしくはエマルション）を包 含するが、好ましくは固体である。コロイド状キャリヤーシステムは、ミクロカ プセル、エマルション、ミクロスフェア、多層ベシクル、ナノカプセル、単層ベ シクル、ナノ粒子、マイクロエマルションおよび低密度リポタンパク質を包含す る。非経口投与のための処方システムとしては、脂質エマルション、リポソーム 、混合ミセル系、生分解性繊維およびフィブリン−ゲル並びに移植用生分解性ポ リマーが挙げられる。肺投与のための処方システムとしては、計量投与吸入器、 粉末吸入器、吸入用溶液およびリポソームが挙げられる。組成物は、徐放（多ユ ニット分解性粒子またはビーズ、単ユニット非分解性システム）、徐放（経口浸 透圧ポンプ）および生体接着剤またはリポソームにおいて処方され得る。徐放性 製剤は、完結的に放出するものや連続的に放出するものを包含する。 薬剤キャリヤーとしては、リン酸カルシウムおよび二酸化チタンのような無機 物；−ラクトース１水和物および−シクロデキストリンのような炭水化物；硫酸 ラウリルナトリウム塩およびポロキサマーのような表面活性剤；澱粉、エチルセ ルロース、ハイドロゲルおよびポリアクリル酸のようなポリマー；ポリアクチド ステアリン酸、グリセリドおよびリン脂質のような脂質；またはロイシンおよび 低密度リポタンパク質のようなアミノ酸やペプチドが挙げられる。 組成物は、生理学的ｐＨにおいて活性を維持するように処方される。組成物は 、ｐＨ４〜７に処方されてよい。 本発明の一態様において、本発明のスワインソニン塩（好ましくは結晶性塩酸 または臭化水素酸塩）と、吸湿性で不活性な、好ましくは無水の賦形剤（例えば 、ラクトースもしくはマニトール）とを含んで成る経口投与形態の組成物が提供 される。別の態様では、本発明のスワインソニン塩（好ましくは結晶性塩酸また は臭化水素酸塩）と、少なくとも１つの親水性ベシクル（例えば、グリセリンも しくはプロピレングリコール）および少なくとも１つの親油性ベシクル（例えば 、ＰＥＧ４００）とを含んで成るソフトゼラチンカプセルである組成物が提供さ れる。 組成物は、吸収増強剤、粒状コーティング（例えば、腸溶性コーティング）、 潤滑剤、ターゲティング剤、および当該分野の熟練者に既知の他の試薬も包含し 得る。組成物は、活性成分約０．１〜９０重量％（例えば、約０．１〜２０重量 ％または約０．５〜１０重量％）を含んでいてよい。そのような医薬用組成物中 の活性成分の割合や、開示内容の処置のために本発明を実施するのに使用される 活性成分の有効量は、投与方法、対象の年齢や体重および処置される対象の状態 に依存し、結局は付き添っている内科医または獣医によって決定されるであろう 。付き添っている内科医または獣医によって決定される化合物のそのような量を ここでは、「有効量」という。スワインソニンを含まない基剤を含むグロスらの 研究（１９９４年および１９９６年）に基けば、１日に３００μｇ／ｋｇ未満、 好ましくは１日に１５０μｇ／ｋｇ以下の投与量、より好ましくは７５μｇ／ｋ ｇの投与量を１日に２回またはそれより少ない量が、ヒトには十分に許容される であろう。 本発明の前記塩は、治療薬として、単独でまたは他の治療薬もしくは他の形態 の処置（例えば、化学療法もしくは放射線療法）と組み合わせて示されている。 例えば、前記化合物は、増殖抑制剤、抗菌剤、免疫賦活薬または抗炎症剤と組み 合わせて使用されてよい。特に、前記化合物は、Ｔｈ１サイトカインのような抗 ウィルス剤および／または増殖抑制剤と組み合わせて使用でき、それらの活性を 高め得る。Ｔｈ１サイトカインは、インターロイキン−２および１２（ＩＬ−２ 、ＩＬ−１２）、およびインターフェロン−α、β、γ（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ− β、ＩＦＮ−γ）、並びにそれらの誘発剤を包含する。本発明の前記化合物は、 ポリ（Ｉ．Ｃ．）、ポリ（Ｉ．Ｃ．）−ＬＣ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはト ランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）と共に使用できる。前記化合物は、デキ ソルビシン、５−フルオロウラシル、シクロホスファミドおよびメトトレキセー トを含む化学療法薬と、末梢神経障害の予防および治療のためのイソニアジドと 、および十二指腸潰瘍の予防および治療のためのＮＳＡＩＤ組み合わせて使用で きる。本発明の前記化合物は、他の治療薬または治療と同時に、別々にまたは連 続的に投与されてよい。 本発明の組成物を投与され得る対象は、哺乳類を含む動物を包含し、特にヒト である。動物には食用またはペットとしての家畜も包含し、ウマ、ウシ、ヒツジ 、飼鳥類、魚、ブタ、猫、犬および動物園の動物を含む。 本発明のスワインソニン塩は、通例の方法を用いて医療用組成物に転化され得 る。例えば、本発明の結晶性スワインソニン塩酸または臭化水素酸塩は、選ばれ た医療に許容できるキャリヤー、賦形剤またはここに記載した希釈剤と混合され てもよい。 マンノシダーゼ抑制 本発明の化合物、特に結晶性スワインソニン塩酸および臭化水素酸塩およびそ れらから製造される組成物は、酵素であるゴルジ体マンノシダーゼIIを抑制する 。本発明の化合物の通常のマンノシダーゼ抑制は、タチナタマメ、ゴルジ体また はリソソームα−マンノシダーゼの抑制を直接測定することによって確認できる （実験における実施例１８を参照のこと）。マンノシダーゼ抑制は、Ｌ−ＰＨＡ 毒性アッセイを用いても試験できる。前記アッセイは、有毒植物レシチンＬ−Ｐ ＨＡの、ＭＤＡＹ−Ｄ２腫瘍細胞のような癌化した株価細胞への特定の結合が、 オリゴ糖処理の抑制の特定測定値であるという結果を基にしている。Ｌ−ＰＨＡ 毒性アッセイにおけるＩＣ５０の測定は、前記化合物が細胞に入って、オリゴ糖 処理の抑制に影響を及ぼす可能性を反映している。それは、細胞侵入、ターゲッ トである酵素の抑制および得られた細胞質表現型を測定する通常の活性スクリー ンである。 Ｌ−ＰＨＡアッセイは、通常、癌化細胞をＬ−ＰＨＡと前記化合物の存在下で 増殖させること；細胞生存力および／または細胞の増殖量を測定すること；およ び細胞の増殖量および／または細胞生存力をＬ−ＰＨＡのみの存在下で成長させ た細胞について観察された増殖量と比較することにより、前記化合物がＮ−結合 したオリゴ糖処理を抑制する可能性を決定することを伴う。このアッセイで用い られ得る癌化細胞としては、ＭＤＡＹ−Ｄ２、Ｌ１２１０、ＣＨＯ、Ｂ１６、メ ラノーマ腫瘍細胞、およびＳＷ４８０、ＬＳ１７４Ｔ、ＨＴ−２９、ＷｉＤｒ、 Ｔ２、ＭＤＡ−２３１、ＭＣＦ７、ＢＴ−２０、Ｈｓ５７８Ｔ、Ｋ５６２，Ｈｓ ５７８Ｔ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＣＹ６Ｔ、ＭＤＡ−４６８、Ｈ２３、Ｈ１５７、Ｈ ３５８、Ｈ１３３４、Ｈ１１５５、Ｈ２８、Ｈ４６０、Ｈｍｅｓｏｌ、Ｈ１８７ 、Ｈ５１０Ａ、Ｎ４１７、Ｈ１４６、Ｈ１０９２、Ｈ８２のようなヒト腫瘍細胞 が挙げられる（Restifo，N．P.ら著、ジャーナル・オブ・エキスペリメンタル・ メ ディスン１７７；２６５〜２７２頁、１９９３年）。 細胞の増殖量は、通常の方法を用いて測定されてよい。例えば、細胞増殖は、 ラベルしたチミジンの取り込みを測定することによって測定され得る。特に、放 射性ラベルされたチミジンを、約２〜５時間、好ましくは３〜４時間で添加して 、細胞を収集して放射能をシンチレーションカウンターを用いて測定してよい。 アルカリホスファターゼ活性の測定に基く全自動酵素法を用いて、マンノシダ ーゼIIの抑制をスクリーンすることもできる。前記方法は、残存している細胞の 数とアルカリホスファターゼのレベルが密に相関関係にあるという観測に基く。 前記方法は、比色計アッセイを用いて、Ｌ−ＰＨＡ処理後の癌化細胞の細胞増殖 をモニターする。細胞ペレット化および洗浄工程は必要ないことから、反応混合 物を直接、それ自体の媒体中で増殖している細胞に添加する。すなわち、前記方 法は、培養媒体を除去したり、またはペレット化や洗浄を行わずに単一工程で行 うため、全自動化されたプロセスを許容する。反応は、広範な時間間隔（５〜１ ８０分）で時間に比例し、基剤ｐ-ニトロフェニルホスフェートについての酵素 のＫｍは、比較的低い（０．８１ｍＭ）。インキュベーション時間および基剤濃 度は、反応速度を変調して、自動化および速度調節を目的とするために試料の数 にプロトコルを調整するために変化できる。ロボット・プラットフォームの使用 は、多数の試料（例えば、３６個の９６穴プレート）を同時に処理することがで きる。 自動化方法は、通常、(a)本発明の化合物を癌化細胞とＬ−ＰＨＡの存在下で 反応させること、およびアルカリホスファターゼ活性を測定すること；および(b )化合物の不存在下の対照と比較することを含んで成り、アルカリホスファター ゼ活性の向上は、化合物が、Ｎ−結合したオリゴ糖処理を抑制する可能性を有す ることを示す。本発明の方法で使用され得る癌化細胞は、ここに記載した株価細 胞、または骨芽株価細胞のような、本質的なまたは誘導できる酵素活性のいずれ かを含む株価細胞を包含する。アルカリホスファターゼ式構成を、細胞内に導入 して信号を増幅することができる。細胞の増殖量は、アルカリホスファターゼ活 性を測定することによって測定される。アルカリホスファターゼは、通常の方法 を用いて（例えば、対象としてp-ニトロフェニルホスフェートを用い、約４０ ５ｎｍでの吸収を測定することにより）測定され得る。 前記方法を行う条件は、化合物の性質および用いられる細胞に関連して選択さ れる。例えば、癌化細胞がＭＤＡＹ−Ｄ２腫瘍細胞であれば、約１〜６×１０³ 個、好ましくは５×１０³個の濃度で使用され得る。ＭＤＡＹ−Ｄ２細胞は、通 常、約１０〜３０時間、好ましくは１６〜２０時間培養された後、Ｌ−ＰＨＡを 約５０〜１５０μｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬの濃度で添加される。 アルカリホスファターゼアッセイ混合物は、緩衝液（例えば、ジエタノールアミ ン緩衝液）およびp-ニトロフェニルホスフェートを約１．５〜４ｍＭ、好ましく は２〜３ｍＭ、最も好ましくは２．５ｍＭの濃度で含み得る。 本発明の自動化方法は、一般に、細胞増殖の抑制剤を中和する化合物を同定す るのに使用され得る。例えば、前記方法を用いて、ＴＧＦβのような細胞増殖抑 制剤の拮抗剤またはＴＮＦαのようなアポトーシス剤を同定することができる。 そのため、本発明は、(a)試験化合物を癌化細胞と細胞増殖抑制剤の存在下で反 応させること；(b)アルカリホスファターゼ活性を測定すること；および(c)試験 化合物の不存在下の対照と比較することを含む方法を幅広く企図しており、カル カリホスファターゼ活性の増加は、細胞抑制剤を中和する可能性を有することを 示す。 本発明のスワインソニン塩の特性 本発明の塩は、価値の有る薬理学特性を有し、抗菌性、癌抑制効果、血液回復 、化学保護、放射線保護および免疫調節特性を提供するものであり、特に細胞免 疫反応のＴｈ１力を刺激することができる。これらの特性を以下により詳細に説 明する。 癌抑制特性 炭化水素処理酵素であるゴルジ体α−マンノシダーゼIIの封鎖は、腫瘍細胞の 増殖および転移速度に重要であることが知られている（Dennis，J．W.著、サイ エンス２３６：５８２〜５８５頁、１９８７年）、Ｎ−結合したオリゴ糖の「複 合型」構造物（Elbein，A．D.著、アン・レヴ・バイオケム５６：４９７〜５３ ４頁、１９８７年）への通常の熟成を妨げる。動物および腫瘍モデルにおいて、 ゴルジ体α−マンノシダーゼII抑制剤による処置は、腫瘍の成長および転移の速 度を抑制することが分かっている（Dennis著、カンサー・リサーチ.４６：５１ ３１〜５１３６頁、１９８６年、１．Dennis，J．W.著、カンサー・リサーチ.５ ０：１８６７〜１８７２頁、１９９０年、Newton，S．A.著、ジャーナル・オブ ・ナショナル・カンサー・インスティチュート８１：１０２４〜１０２８頁、１ ９８９年）。スワインソニンのようなゴルジ体α−マンノシダーゼII抑制剤は、 腫瘍細胞における直接転移抑制および非侵入効果を含む広く様々な腫瘍種につい ての癌抑制特性、およびここに記載した免疫刺激作用や骨髄増殖および血液回復 作用のような他の抗癌作用を有する。 免疫刺激特性 ゴルジ体α−マンノシダーゼIIで経路を封鎖することは、末端マンノース残渣 を有する「ハイブリッド型」炭化水素構造の蓄積を生じる。現れたマンノース残 渣は、免疫刺激に直接関係する重要な特徴である（Sherblom，A．P.著、ジャー ナル・オブ・イムノロジー１４３：９３９〜９４４頁、１９８９年；Yagita，M ．およびSaksela著、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー.３１ ：２７５〜２８２頁、１９９０年）。分子レベルにおいて、インターフェロン（ ＩＦＮ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）および細胞壊死因子（ＴＮＦ−α ）を含む特定のサイトカインが、ゴルジ体α−マンノシダーゼIIを封鎖すると蓄 積するもののような、マンノース構造を末端に有する炭化水素構造と結合するこ とが分かっている。この炭化水素構造は、細胞表面に見出され、細胞表面のグリ コプロテイン、およびサイトカイン作用を細胞免疫反応に伝播するのに必要とさ れる受容体または共受容体とのサイトカイン結合を高めることを暗示する。 ウィルスまたは細菌または真菌による感染の後、ホスト免疫反応は、炎症や、 免疫系の細胞および体液の力の活性化を引き起こす。ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、細胞免 疫に関するＴｈ１表現型、または抗体生成に関するＴｈ２表現型によってヘルパ ーＴ細胞への分化を刺激されることがある（Shindler著、Annu．Rev．Biochem． ６４：６２１〜６５１頁、１９９５年）。Ｔｈ１細胞は、サイトカインＩＮＦ− α、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、Ｉｌ−１２を生成することを特徴とし、Ｔｈ２細胞 は、サイトカイン１１−４およびＩＬ−１０を生成する。Ｔｈ１サイトカインは 更に、Ｔｈ１反応を促進すると同時に、Ｔｈ２反応を抑制する。逆に、Ｔｈ２サ イトカインは、Ｔｈ２反応を促進し、Ｔｈ１反応を抑制する。Ｔｈ１反応とＴｈ ２反応とのバランスは、感染疾病並びに自己免疫およびアレルギー反応の結果の 主な決定子である。 マウスおよび細胞培養におけるゴルジ体α−マンノシダーゼIIの抑制は、Ｔｈ １依存性細胞媒介免疫応答を高めることが示された。これは、ナチュラルキラー （ＮＫ）細胞およびリンフォカイン活性化されたキラー（ＬＡＫ）細胞の活性化 や、抗原およびＩＬ−２によるＴ細胞刺激を包含する（Wall，K．A.著、プロシ ーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・ エー８５：５６４４〜５６４８頁、１９８８年）。ゴルジ体α−マンノシダーゼ の抑制は、マクロファージの細胞壊死因子（ＴＮＦα）−依存刺激（Muchmoreら 著、カンサー・リサーチ.５０：６２８５〜６２９０頁、１９９０年）およびＬ ＡＫ細胞の生体外でのII−２依存刺激も高める（Yagitaら著、スカンジナビアン ・ジャーナル・オブ・イムノロジー.３１：２７５〜２８２頁、１９９０年）。 さらに、ゴルジ体α−マンノシダーゼの抑制は、抗腫瘍および増殖抑制応答、並 びに２'−５'オリゴアデニレート合成とＴＩＭＰ（メタロプロテアーゼの細胞抑 制剤）遺伝子発現の誘発を含む、α−ＩＦＮに対する応答も向上させる（Dennis 著、ジェイ・エヌ・シー・アイ８１：１０２８〜１０３３頁、１９８９年、Korc zakら著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・カンサー５３：６３４〜６ ３９頁、１９９３年）。 サイトカインは、細胞表面受容体に結合して、転写因子の信号伝達剤および転 写活性化剤（ＳＴＡＴ）系統群のリン酸化および２量化を介して核への信号を伝 播する。ＳＴＡＴ１は、α−ＩＦＮに対する抗ウイルス応答、Ｔｈ１免疫応答お よび関連するサイトカイン生成、並びにマウス肝炎ウイルスの生体内でのクリア ランスに要求される（Durbinら著、セル８４：４４３〜４５０頁、１９９６年） 。これについての証拠は、発育上は普通であって、ウイルス肝炎感染に非常に感 受性が高く、かつＩＦＮに不感応である無変異体ＳＴＡＴ１マウスによって提供 されている（Meraz，M．A.ら著、セル８４：４３１〜４４２頁、１９９６年）。 ＳＴＡＴ３活性は、炎症に関係しており、ＩＬ−６依存応答が顕著である。ＳＴ ＡＴ６は、無変異体マウスがＴｈ２（抗体依存）免疫応答に欠陥があり、かつ線 虫 感染に対する通常のＩｇＧ応答を欠くため、Ｔｈ２応答に要求される。この遺伝 子を持たないマウスがＮＫおよびＬＡＫ細胞のＩＬ−１２依存刺激並びにＴｈ１ サイトカインの生成にも欠陥を有することから、ＳＴＡＴ４も、Ｔｈ１応答に要 求される（Kaplan著、ネイチャー３８２：１７４〜１７７頁、１９９６年）。 Ｔｈ１細胞の免疫応答は、特定のウィルス、細菌、真菌および寄生虫感染並び に癌腫瘍の成長および転移並びに除去には必須であることが分かっている。Ｔｈ １応答の重要性は、Ｂ型肝炎（Milich DR、Schodel F、Hughes JL、Jones JE、P eterson DL著、１９９７年、ジャーナル・オブ・ヴィロロジー７１：３：２１９ ２〜２２０１頁）、Ｃ型肝炎（Tsai SL、Liaaw YF、Chen MH、Huang CY、Kuo GC 、１９９７年、ヘパトロジー２５：２：４４９〜４５８頁）、ＨＩＶ（Clerici M、Shearer GM著、１９９４年、イムノロジー・トゥデイ１５：１２：５７５〜 ５８１頁）、口唇単純ヘルペス（Spruance SL、Evans TG、McKeough MB、Thai L 、Araneo BA、Daynes RA、Mishkin EM、Abramovitz AS著、１９９５年、アニヴ ィラル・レス２８：１：３９〜５５頁）を含む慢性のウィルス感染、のう胞性線 維症ラットモデルの気道の緑膿菌感染（Johansen HK著、１９９６年、ＡＰＭＩ Ｓサプル６３：５〜４２頁）、微生物ライ菌によって引き起こされるライ病（Mo dlin RL著、１９９４年、ジャーナル・オブ・インヴァースティゲイト・ダーマ トロジー１０２：６：８２８〜８３２頁）のような細菌感染、カンジタ白色体を 含む真菌感染（Romani Lら著、１９９５年、イムノロ・レス１４：２：１４８〜 １６２頁）およびリーシュマニア（Kemp M著、１９９７年、ＡＰＭＳサプル６８ 、１〜３３頁）および住血吸虫として既知の５種の扁形動物の一つによて引き起 こされる住血吸虫病（Wynn TAら著、１９９６年、ジャーナル・オブ・イムノロ ジー.１５７：９：４０６８〜４０７８頁）を含む寄生虫感染に現れている。 インターフェロンとインターフェロン誘発剤は、抗癌活性や抗ウィルス活性を 有するが、疾病を排除できる適切なＴｈ１応答を刺激するのには単独では不充分 であると考えられている。例えば、インターフェロンは、大抵の種類の癌の治療 のために臨床試験で使用されており、様々な効力を有する（Goldstein DおよびL asglo J著、カンサー・リサーチ４６：４３１５頁、１９８６年）。インターフ ェロンは、Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎の治療にいくらか効力が有ることが分かって いる。肝炎では、α−ＩＦＮに対する初期応答が５０％未満の患者に生じており 、Ｃ型肝炎では、α−ＩＦＮ治療された全患者の７５〜９０％が再発する（Hoof nagle JHら著、１９８６年、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディ スン：３１５：１５７５〜１５７８頁；Davis GLら著、１９８９年、ニュー・イ ングランド・ジャーナル・オブ・メディスン：３２１：１５０１〜１５０６頁） 。さらに、もう一つのＴｈ１サイトカインであるＩＬ−２は、ＨＩＶ患者やライ 病の患者において、ある種の癌の治療に効力を有することが示された（カレント ・オピン・バイオテック４：６：７２２〜７２６頁、１９９３年）。 血液回復特性／放射線および化学療法の致死に対する保護 骨髄抑制は、癌（hoagland著、化学療法源の本「癌化学療法の血液学的合併症 」Perry MC（編）４９８〜５０７頁、ウィリアムス・アンドウィルキンス発行： バルトモア１９９２年）および後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）（McLeodおよびHa mmer著、アナルス・オブ・インターナル・メディスン１１７：４８７頁、１９９ ２年；Richmanら著、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン３ １７：１９２頁、１９８７年；ShaunakおよびBarlett著、ランセットII：９１頁 、１９８９年；Walkerら著、クリニカル・リサーチ３５：４３５Ａ頁、１９８７ 年）を含む多数の疾病のための化学療法において投与量制限特徴であることがあ る。骨髄抑制の期間中患者を我慢させることまたは感染への低下した抵抗力が、 化学療法管理の重要な部分である。ゴルジ体α−マンノシダーゼIIの抑制剤（例 えば、スワインソニンを含まない基剤）は、様々な化学療法治療剤の致死性（Or edipeら著、１９９１年）および放射線致死照射量（Whiteら著、カンサー・コミ ュニケーション３：８３〜９０頁、１９９１年）に対し保護することが分かって いる。これらの研究において、スワインソニン治療したマウスにおける高い生存 率は、骨髄の増殖の刺激、マウスにける骨髄細胞性および移植効率（Oredipeら 著、１９９１年；Whiteら著、１９９１年）並びに末梢血球数の増加と相関性が あった。 本発明のスワインソニン塩を用いた治療 本発明の塩を、腫瘍の成長および腫瘍の転移の防止、治療および予防のための 方法で使用できることが明白である。本発明の塩および組成物は、患者の固体細 胞の白血病、リンパ腫、メラノーマ、腺腫、肉腫および癌腫のような、様々な形 態の腫瘍形成の治療のための方法において特に有用である。特に、前記塩および 組成物は、悪性メラノーマ、脾臓癌、子宮頚癌、子宮癌、転移性腎臓細胞癌腫、 胃、肺、直腸、胸部、腸、胃、肝臓、甲状腺の癌、切除できない頭部および頸ブ の癌のような頭部および頸部の癌、リンパ管炎腫、頸部、乳房、唾液腺、下肢、 舌、唇、胆管、骨盤、縦隔、尿道、気管支、膀胱、食道および結腸の癌、小さく ない細胞肺癌、および後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）を含むＨＩＶ感染患者に関 する癌の形態であるカポジ肉腫のような種類の癌を治療するのに使用することが できる。 本発明の塩および組成物は、免疫無防備状態の対象を治療するのに使用できる 。例えば、ＨＩＶ、または他のウイルスもしくは細菌、真菌および寄生虫を含む 感染剤に感染した対象、骨髄移植を行う対象および化学的にまたは腫瘍により誘 発された免疫抑制をもつ対象に使用できる。 本発明の塩およい組成物は、特に、骨髄細胞増殖を刺激した後、更に化学療法 または放射線療法を受けるために、血液回復剤として使用され得る。本発明の塩 および組成物の脊髄増殖活性は、化合物をマウスに注入し、マウスを屠殺し、骨 髄細胞を取り出して、骨髄細胞を直接数え、メチルセルロースアッセイ内のクロ ーン原性種細胞を測定することによって化合物の骨髄増殖を刺激する可能性を測 定することによって決定されてよい。 本発明の塩および組成物は、特に、レトロウイルス、インフルエンザウイルス 、サイトメガロウイルスおよびヘルペスウイルスのようなウイルスを包み込んだ 膜上で抗ウイルス剤としても使用できる。本発明の塩および組成物は、細菌、真 菌および寄生虫感染を治療するのにも使用できる。 本発明の化合物は、関節リウマチや喘息のような炎症性疾患の治療にも使用で きる。前記化合物は、マンノシダーゼを抑制して、好中球上の炭化水素構造をセ レクチンに結合できなくさせることがある。セレクチンは、好中球が上皮壁にそ って転がり、突き刺さり、浸透して細胞損傷を引き起こすように、好中球上の炭 化水素構造と相互作用する損傷部位に存在する。 本発明の塩は、手術後、腫瘍の再発を予防するのに（すなわち、補助的治療と して）、特定の用途を有する。 インターロイキン−２およびポリ−ＩＣのような試薬の抗癌効果を増大させる ため、ナチュラルキラーおよびマクロファージ殺腫瘍活性を増大させ、サイトカ イン合成および分泌を誘導して、ＬＡＫおよびＨＬＡクラス１特殊抗体；活性蛋 白キナーゼＣ；の発現を高めるため、造血原種細胞増殖を含む骨髄細胞増殖を刺 激して、移植効率とコロニー形成ユニット活性を高めるため、化学療法および放 射線療法に対する保護（例えば、化学穂とおよび放射線保護剤）を確立するため 、並びに特に、癌や後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）を含むヒトの疾病を治療する のに通常使用される化学試薬と組み合わせて使用する時に骨髄細胞の回復を促進 するために使用できることは、本発明の塩の特性から明らかである。例えば、本 発明の塩は、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シクロホスファミドおよ びメトトレキセートを含む抗癌剤と組み合わせて、およびイソニアジドまたはＮ ＳＡＩＤと組み合わせて化学保護剤として使用されてよい。 特定の治療用途における本発明の塩の活性は、ここで記載されかつ当該分野に おいて既知の種々の生体外および生体内モデルにおいて試験され得る。特に、本 発明の塩および組成物の転移抑制効果は、肺コロニー形成アッセイを用いて評価 されてよい。例えば、１種の化合物で処理したメラノーマ細胞をマウスに注入し 、メラノーマ細胞のマウスの肺にコロニー形成する可能性を、死後、肺における 腫瘍小瘤を数えることにより試験することができる。経口的にまたは静脈注射に より投与される化合物によるマウスにおける腫瘍成長の抑制は、腫瘍細胞の体積 を測定することによって調べることができる。本発明の塩の抗癌効果を確認する 細胞モデルおよび動物モデルは、表３にまとめるモデルを包含する。本発明の塩 の活性を確認するためのプロトコルの例は、実施例の欄に挙げている。 本発明の他の態様は、本発明のスワインソニン塩、開示されたスワインソニン 塩の代謝生成物またはその代謝生成物のプロドラッグもしくは代謝前駆体の製剤 的有効量に対しそのような公開を要する対象を公開することを含む露出された状 態を治療方法を提供する。この態様において、代謝生成物は、Ｃ型肝炎感染に対 する実施例において試薬として使用され得る。 本発明の塩または組成物は、それ自体に対する潜在的な免疫応答を促す、およ び／または抗体（特に、通常低い免疫原である抗体）に対する免疫質を促すのを 補助するワクチンとして使用され得る。本発明の塩または組成物は、モノサイト またはマクロファージのような細胞を発現する抗体の活性を通じてワクチンの免 疫原性を高めて、Ｂ細胞およびＣＴＬ応答に対して補助するＴ−細胞を増やすこ とができるサイトカインを放出することがある。結果として、本発明の塩は、よ り好ましい抗原を高い滴定濃度で誘発することができ、免疫中により早く現れて 延長して存続し、さらに記憶応答およびＣＤ８＋ ＭＨＣ クラスＩ−制限ＣＴ Ｌを増やす。本発明の塩または組成物は、ワクチンに含有されても、別々に投与 されてもよい。本発明の塩は、Ｔ細胞応答を誘発する抗原（例えば、Ｔ細胞抗原 ）の免疫原性を高めるために使用されてよく、特に、癌または感染疾病に関する 炭化水素系抗原を高めるのに使用できる。本発明の塩または組成物を用いて免疫 原性を高めることができるワクチンの例としては、癌ワクチン（例えば、乳癌ワ クチン）、および慢性の感染疾病に対するワクチンが挙げられる。実施例 実施例１ スワインソニン塩酸塩の合成 スワインソニンを含まない基剤（203.7ｍｇ、1.18ミリモル）を1.0ｍＬ蒸留水 中に溶解した。１Ｍ塩酸（1.41ｍＬ、1.2等量）を添加した。凍結乾燥後、非晶 質の残渣をメタノール−エタノールまたはエタノールから結晶化させた。 スワインソニン塩酸塩（448.6ｍｇ）をメタノール5.0ｍＬに溶解した。濾過後 、溶液を随時攪拌しながら、ジエチルエーテル約6.3ｍＬを30分間隔で滴下した 。エーテルを0.25ｍＬ添加すると結晶が形成し始めた。結晶化溶液を室温で20分 間放置した。吸引濾過してメタノール：ジエチルエーテル＝１：２ ６ｍＬで洗 浄した後、無色結晶が得られた（347.1ｍｇ、収率77.4％）。この合成は、クロ マトグラフ法による精製を必要としない。 透明なスワインソニン塩酸塩結晶の融点は１９０〜１９１℃であった。室温の スワインソニン塩酸塩の蒸留への溶解性は、スワインソニンを含まない基剤の溶 解性（約0.8ｇ／ｍＬ）に比べて、約３ｇ／ｍＬであった（表５参照）。実施例２ スワインソニン塩酸塩の合成 スワインソニン塩酸塩は、１，２−ｏ−イソプロピリデンスワインソニンから 合成することができる。１，２−ｏ−イソプロピリデンスワインソニンの１０( ｗ／ｗ)％テトラヒドロフラン、メタノール、エタノールまたはイソプロパノー ル溶液を、同体積の６Ｍ塩酸を添加して酸性化する。周囲温度で一晩攪拌した後 、溶液を乾固するまで濃縮する。残渣をメタノールかエタノールに溶解し、木炭 で脱色する（５０℃ｍ１５分）。木炭を濾別して、残渣を実施例１と同様にして 結晶化させる。実施例３ スワインソニン塩酸塩の安定化 Dr．David Dime（トロント化学研究所、トロント、オンタリオ州）およびDr． William Pearson（ミシガン大学、アン・アーバー、ミシガン州）によって開発 された合成経路を用いて合成したスワインソニンを含まない基剤の試料を、塩酸 塩、臭化水素酸塩またはスワインソニンを含まない基剤のいずれかを得るために 再結晶した。試料を、秤量して、以下の条件に露出した。 長期安定性または保存安定性の模擬試験を行うために、様々な条件を用いて分 解プロセスを加速した。結晶角柱のスワインソニン塩酸塩およびスワインソニン を含まない基剤（スワインソニン塩酸塩から得られた白色のけばけばした粉末を クロロホルム−メタノール−ジエチルエーテルから結晶化した）の試料を秤量し 、以下の条件に露出した（歪み試料）。歪んでいない試料を１ｍｇ／ｍＬ濃度で 調製し、測定毎に６倍でクロマトグラフを行った。示された間隔の後、各歪み試 料を歪んでいない試料と同様の条件で移動相を用いて希釈した。スワインソニン 塩酸塩またはスワインソニンを含んでいない基剤の残留割合は、歪んでいない試 料中の前記塩酸塩またはスワインソニンを含んでいない基剤の割合に対して算出 した。 条件としては、(a)ＵＶ光で７日間；(b)雰囲気酸素中、１０５℃において７日 間（＊＝２試料の平均）；(c)窒素下、１０５℃で７日間（＊＝２試料の平均） ；(d)低い湿度で７０℃において７日間；および(e)相対湿度７５％で４０℃ において７日間が挙げられた。他の試験は、(f)ＵＶで２４時間；(g)１００℃水 溶液で２時間；(h)水性酸性処理２４時間；(i)水性アルカリ性処理４時間；およ び(j)３％過酸化水素（水）で４時間を包含する。驚くべきことに、前記塩酸塩 の熱安定性は、スワインソニンを含まない基剤または臭化水素酸塩よりも高い（ 表４参照）。さらに、前記塩酸塩の光化学安定性は、臭化水素酸塩よりもかなり 高い（表４参照）。スワインソニンを含まない基剤やスワインソニン臭化水素酸 塩およびスワインソニンフッ酸塩と比較したスワインソニン塩酸塩の物理特性を 表５に示す。 スワインソニン塩酸塩、スワインソニン臭化水素酸塩およびスワインソニンを 含まない基剤を５０℃／相対湿度（ＲＨ）５０％および８０℃／周囲湿度に４週 間露出した。ベースラインと１週間間隔で、試験材料の安定性を上述と同様にし てＨＰＬＣにより測定した。色と水分評価も実験の最初と最後で行っており、基 剤と塩の試料を秤量して、水の色と構成も記録している。実施例４ スワインソニン臭化水素酸塩の合成 スワインソニンを含まない基剤（299.7ｍｇ）を蒸留水（6.5ｍＬ）に溶解した 。１Ｍ臭化水素酸水溶液（1.1等量）を添加して、溶液を凍結乾燥した。残渣を 、実施例１の塩酸塩の場合と同じ方法で、メタノール−ジエチルエタノールから 結晶化させた。スワインソニン臭化水素酸塩（341ｍｇ、７７．６％）が、融点 １５３〜１５４℃無色結晶として得られた。実施例５ スワインソニンフッ化水素塩の合成 スワインソニンを含まない基剤（301.03ｍｇ）をメタノール（10ｍｌ）に溶解 し、48％フッ酸水溶液を添加した。溶液を濃縮した後、残渣を沸騰メタノールか ら結晶化させた。無色の針晶（14.9ｍｇ、4.5％）が得られた。この針晶は、溶 解せずに152℃以上で分解する。実施例６ スワインソニン塩酸塩およびスワインソニン臭化水素酸塩のＸ線結晶学分析 Ｘ線結晶学分析は、通常の手順を用いて行った。歳差カメラ写真から、空間群 および細胞パラメータを決定した。正確な細胞パラメータは、12個の高角反射（ ４０°＜２θ＜６０°）の干渉計測定および最小二乗法の適用によって得られた 。結晶写真データを表１および２に示す。結晶寸法は、銅Ｋα線とスキャンモー ド２°／分のθ２θスキャンモードを用いて、干渉計でのデータ収集において選 択された。１００回毎の反射をモニターした３つの標準反射は、５％以内の不規 則な強度変態のみを示した。強度は、ローレンツ・分極ファクターで補正した。 吸収補正は適用しなかった。結晶構造は、ＳＨＥＬＸ-86プログラムまたはＳＩ Ｒ-88プログラムのようなプログラムを用い、直接法で決定した。それぞれの場 合で、Ｅ−マップは、構造内の全ての非水素領域を明示した。構造改善および相 差電子密度解析は、残留電子密度を示さなかった。最終矛盾因子は、Ｒ＝3.6％ において、２σで強度データほぼ1200に（塩酸塩）、Ｒ＝3.8％において、２σ で強度データ1002に（臭化水素酸塩）変換した。 スワインソニン塩酸塩の立体構造を図１に示し、同様にスワインソニン臭化水 素酸塩の立体構造を図２に示す。図３および４はそれぞれ、スワインソニン塩酸 塩およびスワインソニン臭化水素酸塩の結晶充填図である。 前記塩酸塩の単位セル長ｈ、ａ＝8.086±0.01、ｂ＝9.386±0.01、ｃ＝13.621 ±0.01Åである。単位セルは斜方晶であり（いずれも角度＝９０°）、空間群は ｐ２₁２₁２₁である。前記塩の原子配位座標を表１に示す。最終矛盾因子Ｒ＝3.6 ％において、２σで強度データ約1200。いくつかの捻れ角は以下の通りである； Ｈ７−Ｃ７−Ｃ８−Ｈ８＝39.75±3.33；Ｈ８−Ｃ８−Ｃ９−Ｈ９₁＝−140.68° ±3.10；Ｈ８−Ｃ８−Ｃ９−Ｈ９₂＝−20.90°±2.86。ＳＷ塩酸塩とＳＷ二酢酸 塩との最も優れた最小二乗平面を表６にまとめる。表６からは、スワインソニン 中の４つの原子が、スワインソニン塩酸塩結晶構造中の４つの原子よりも僅かに 平坦であることが分かる。単位セル中のスワインソニン塩酸塩分子は互いに、１ 分子のプロトン化Ｎ原子と３つのヒドロキシル酸素原子との間の水素結合相互作 用によって、他の分子の塩化物イオンに保持されている。結合距離は、以下の通 りである；Ｎ１−Ｈ１＝0.88Å；Ｈ１から塩化物イオンまで＝2.35Å；Ｏ５−Ｈ ５０＝0.78Å；Ｈ５０から塩化物イオンまで＝2.33Å；Ｏ７−Ｈ７０＝0.74Å； Ｈ７０から塩化物イオンまで＝2.44Å；Ｏ８からＨ８０まで＝ 0.67Å；およびＨ８０から塩化物イオンまで＝2.50Å。 前記臭化水素酸塩の単位セル長は、ａ＝8.405±0.01、ｂ＝8.629±0.01、ｃ＝ 14.118±0.01Åである。単位セルは斜方晶であり（いずれも角度＝９０°）、空 間群はｐ２₁２₁２₁である。前記塩の原子配位座標を表２に示す。最終矛盾因子 Ｒ＝3.8％において、２σで強度データ約1200。いくつかの捻れ角は以下の通り である；Ｈ７−Ｃ７−Ｃ８−Ｈ８＝40.07±0.21；Ｈ８−Ｃ８−Ｃ９−Ｈ９₁＝− 137.29°±0.09；Ｈ８−Ｃ８−Ｃ９−Ｈ９₂＝−16.96°±0.19。ＳＷ臭化水素酸 塩とＳＷ二酢酸塩との最も優れた最小二乗平面を表６にまとめる。単位セル中の スワインソニン臭化水素酸塩分子は互いに、他の分子の臭化物イオンに対する第 １分子の３つのヒドロキシル酸素原子と、第２分子上の酸素原子に対する第１分 子のプロトン化Ｎ原子との間の水素結合相互作用によって保持されている。結合 距離は、以下の通りである；Ｎ１−Ｈ１＝0.91Å；Ｈ１から酸素原子０８まで＝ 1.94Å；Ｏ５−Ｈ５０＝0.82Å；Ｈ５０から臭化物イオンまで＝2.47Å；Ｏ７− Ｈ７０＝0.82Å；Ｈ７０から臭化物イオンまで＝2.61Å；Ｏ８からＨまで＝0.82 Å；およびＨから臭化物イオンまで＝2.56Å。 塩酸塩の結晶構造と臭化水素酸塩の結晶構造との間の主な顕著な差は、分子間 水素結合スキームにある。スワインソニン塩酸塩の場合、各Ｃｌ^-イオンは、Ｎ −Ｈ…Ｃｌ；Ｏ５−Ｈ…Ｃｌ；Ｏ７−Ｈ…Ｃｌ；Ｏ８−Ｈ…Ｃｌからの４本の水 素結合に対する受容体である。スワインソニン臭化水素酸塩の場合、Ｂｒ^-イオ ンは、スワインソニン分子に関して異なる部分を占め、Ｏ５−Ｈ…Ｂｒ；Ｏ７− Ｈ…Ｂｒ；Ｏ８−Ｈ…Ｂｒからの３本のＨ結合に対する受容体であって、窒素− Ｈ結合は、Ｏ８に結合している（すなわち、Ｎ−Ｈ…Ｏ８）。実施例７ スワインソニンおよびスワインソニン塩酸塩のＮＭＲスペクトル スワインソニンおよびスワインソニン塩酸塩の¹Ｈおよび¹³Ｃ ＮＭＲスペク トルを、スワインソニンについてのデータ（M．J．Schneiderら、テトラヘドロ ン３９；２９頁、１９８３年）と比較することにより分析した。実験に使用した 化合物は、約4.5ｍｇ／ｍＬの濃度までＤ₂Ｏ（アイソテック・インコーポレイテ ッド）に溶解した。表７に報告された¹Ｈケミカルシフトは、ＣＯＳＹおよ び¹Ｈ−¹³Ｃ ＨＳＱＣ実験によって確認された。６員環内の軸方向とエクアト リアルなプロトンとの区別は、ビシナルカップリング定数調査と、軸方向のプロ トンがエクリアトリアルなプロトンと比べると普通、遮蔽されているという一般 的な観測によって達成された（F．A．Bovey著「核磁気共鳴スペクトル分析」、 アカデミック・プレス発行、1988年）。５員環上のＣ−３のメチレンプロトンは 、２−Ｄ ＲＯＳＥＹ調査によって仮軸および仮エクアトリアル部分に帰属した （２−Ｄ ＲＯＳＥＹ試験は、２−Ｄ ＮＯＥスペクトルと同様のデータを提供 するが、回転フレームＮＯＥ機構によってプロトン間に直通空間相関関係を形成 する；A．BaxおよびD．G．Davies著、ジャーナル・オブ・マグネティック・レゾ ナンス６３：２０７頁、１９８５年；D．HeuhausおよびM．Williamson著「構造 および配座分析における核オーバーハウザー効果」ヴイ・シー・エイチ・パブリ ッシャーズ・インコーポレイテッド、ニューヨーク、１９８９年；およびW．E． Hull著「二次元ＮＭＲスペクトル分析−化学および生化学における応用」、第２ 版W.R．CroasmunおよびR．M．K．Carlson編、ヴイ・シー・エイチ・パブリッシ ャーズ・インコーポレイテッド、ニューヨーク、１９９４年第２章）。Ｃ−３メ チレンプロトン（2.754および2.420ｐｐｍ）は、Ｈ−２を含むＡＢＸスピン系の ＡＢ部分として現れた（4.217ｐｐｍ）。この帰属は、Ｈ−２とＨ−３の間の二 面角が６０°未満であり得ることから、7.9ＨｚのＨ−２に関するより大きなビ シナルカップリング定数によっても支持されていた。カップリング定数は、十分 に分かれたスプリットを表すこの三重項状態のみについて報告されている。６員 環のエクアトリアルプロトンは、いくつかの小さなカップリングの相互作用の重 なりに起因する、分割されていないブロードな三重項状態として表された。 ¹³Ｃケミカルシフト（表９）は、Ｊ−変調されたスピン種と¹Ｈ−¹³Ｃ ＨＳ ＱＣスペクトルによって確認された。６員環における置換基効果を考慮すると、 Ｃ−５およびＣ−６についてのケミカルシフトは、モデル化合物であるペルヒド ロインドリジンと一致した（H．O．Kalinowski、S．BergerおよびS．Braun著、 「カーボン−１３ＮＭＲスペクトル分析」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ 発行、ニューヨーク、１９８８年）。 同じ手順を用いて、スワインソニン塩酸塩のＮＭＲスペクトルを得た。¹Ｈ ＮＭＲスペクトルの初期調査は、試料ＳＷに比べて、全ケミカルシフトの反遮蔽 を示した（表７）。Ｃ−３、Ｃ−５およびＣ−９上のプロトンは、窒素のプロト ン化によって最も強く影響された。スワインソニン塩酸塩（ＳＷＨＣｌ）につい ての大抵のケミカルシフトの帰属は、ＳＷデータとの比較によって達成できたが 、ＣＯＳＹおよびＲＯＥＳＹスペクトルは、特にＣ−３プロトンの帰属を確認す るのに必要であった。試料ＳＷＨＣｌでは、仮軸および仮エクウアトリアルＣ− ３プロトンのケミカルシフトの順番の逆であった。ＳＷＨＣｌの価値軸Ｃ−３プ ロトンは、仮エクアトリアルＣ−３プロトン（3.306ｐｐｍ）に比べて、より高 い頻度であった（3.379ｐｐｍ）。この帰属は、3.379ｐｐｍ多重項がＣ−９での 軸プロトン（2.959ｐｐｍ）およびＣ−５（2.805ｐｐｍ）を含むはっきりと分か れた直通空間相関関係を表す場合ＰＯＥＳＹデータによって確認された。Ｃ−３ プロトンとＨ−２の間のビシナルカップリング定数はこの帰属を支持している（ 表８）。 カーボン・ケミカルシフトは、Ｊ−変調されたスピン種と¹Ｈ−¹³Ｃ ＨＳＱ Ｃスペクトルから帰属した。Ｃ−５を除いて、ＳＷＨＣｌのカーボン共鳴は、Ｓ Ｗに比べて様々な量で遮蔽されていた（表９）。このことは、アルキルアミンが プロトン化を行うときに、一般に観察される（上述のH．O．Kalinowski著、１９ ８８年）。６員環炭素６および８で経験される遮蔽は、窒素上の軸水素の導入に 少しは起因することもある。軸Ｎ−Ｈは、Ｃ−６およびＣ−８軸プロトンにより 、１，３−２軸立体相互作用を形成し、結果として、Ｃ−６およびＣ−８¹³Ｃケ ミカルシフト上にγ−置換効果をもたらすであろう（上述のH．O．Kalinowski著 、１９８８年）。 ケミカルシフトとＲＯＥＳＹデータの調査は、これらの試料の全体構造には殆 ど差がないことを示した。窒素プロトン化は、軸の外面的形態を占めるＮ−Ｈプ ロトンと共に発生すると考えられる。しかしながら、窒素プロトン化は、より堅 い環配座を形成しかつ以下で表される構造を採用するものと考えられる。 この結論は、Ｈ−１とＨ−５ｅの間の0.7Ｈｚにおける５重カップリングの観 察から生じた。スピン分裂実験はこのカップリング相互作用を確かにした。この 種の長期のカップリングは高い立体特異性であり、同一平面上のジグザグまたは 「Ｗ」型構造であるためにカップリング経路中の原子を全て要する。５員環の配 座は、通常、ステロイドのような大きな構造でさえ、よりフレキシブルである。 そのため、プロトン化は、Ｈ−１およびＨ−５ｅ多重項において観察される分裂 を生じさせるために、図示するような長期のカップリング経路中の原子の外面的 形態を確定しなければならない。より堅い構造は、ＳＷＨＣ１試料における５員 環中のビシナルカップリング定数に変化をもたらすこともある（表８）。 結論として、スワインソニン塩酸塩およびその窒素プロトン化アナログの¹Ｈ および¹³Ｃケミカルシフトは完全に帰属されており、および大抵の¹Ｈ−¹Ｈカッ プリング定数は、十分に分析された多重項について報告されている。２試料間の 最も顕著な構造上の相違は、長期の¹Ｈスピンカップリング相互作用によって示 されるようなＳＷＨＣｌ分子のより堅い配座であった。実施例８ 前成説研究 スワインソニン塩酸塩の固体薬物、および粉末および半固体調合ゼラチンカプ セルとの組み合わせの前成説の研究は、以下の性質（吸湿性、ｐＨ、安定性およ び溶解性）に関して行った。前記化合物は、高吸湿性であることが分かった。固 体薬物について行われた研究は、前記化合物が、最初の２時間および８時間にお いてそれぞれＲＨ７５％で水を約８％（ｗ／ｗ）および２４％（ｗ／ｗ）吸収し 、半固体に転化することを示した。ＲＨ２０％および５０％では、前記化合物は 、カールフィッシャー法によれば、４８時間貯蔵後、水を１．９％および２．１ ％吸収した。無水粉末賦形剤（例えば、無水ラクトースやマンニトール粉末）を 使用してハードカプセル中に製剤活性を処方すると、水分吸収は半減する。 前記化合物は、水性および親水性ベシクルによく溶解した。そのため、ソフト ゼラチンカプセル処方では、親水性ベシクルが好ましい。ＰＥＧ中のグリセリン またはプロピレングリコールのような共溶媒の使用は、液体または半固体調合物 に適していることがある。 ｐＨ研究の結果は、前記化合物が、雰囲気および緊張（４０℃および５０℃） 貯蔵条件下においてｐＨ４および７の緩衝溶液中で安定であることを示していた 。実施例９ スワインソニン塩酸塩固体薬物のＮＭＲ 重水素（Ｄ₂Ｏ）中の(-)−(１Ｓ，２Ｓ，８Ｒ，８ａＲ)−１，２，８−トリヒ ドロキシオクタヒドロ−インドリジジン塩酸塩（スワインソニン塩酸塩、白色ま たはオフホワイトの結晶性固体、分子量２０９．６６、ｐＫａ７．４、融点１８ ９〜１９０℃）について、プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）および単分子相関スペ クトル分析（ＣＯＳＹ）スペクトルを得た。Ｄ₂Ｏは、4.60ｐｐｍにおける内部 参照として使用した。ピークの帰属は、実施例７で述べたように、プロトンＮＭ ＲスペクトルとＣＯＳＹスペクトルカッブリングに基く。ビシナルカップリング 定数と、６員環軸プロトンが通常、エクアトリアルプロトンに比べて遮蔽される という一般的な観察の調査により、軸プロトンとエクアトリアルプロトンとの差 を得た。Ｃ−３におけるメチレンプロトンを仮軸に割り当てて、２−Ｄ ＲＯＥ ＳＹ実験によって仮エクアトリアル位置を割り当てた。 Ｄ₂Ｏ中の(-)−(１Ｓ，２Ｓ，８Ｒ，８ａＲ)−１，２，８−トリヒドロキシオ クタヒドロ−インドリジジン塩酸塩（スワインソニン塩酸塩、白色またはオフホ ワイトの結晶性固体、分子量２０９．６６、ｐＫａ７．４、融点１８９〜１９０ ℃）について、カーボンＮＭＲスペクトル、帰属プロトン試験（ＡＰＴ）および ヘテロ核スピン量子干渉（ＨＳＱＣ）スペクトルを得た。ＮＭＲスペクトル、Ｄ ＥＰＴおよびＨＳＱＣスペクトル解釈に基くピーク帰属を表１０に示す。帰属は 、ナカニシ K.著、「最新パルス技術による１次元ＮＭＲスペクトル」、ユニヴ ァーシティ・サイエンス・ブックス、東京、日本、１９９０年に記載のスペクト ル情報を基にした。実施例１０ 微量分析 (-)−(１Ｓ，２Ｓ，８Ｒ，８ａＲ)−１，２，８−トリヒドロキシオクタヒド ロ−インドリジジン塩酸塩（スワインソニン塩酸塩、白色またはオフホワイトの 結晶性固体、分子量２０９．６６、ｐＫａ７．４、融点１８９〜１９０℃）につ いて、パーキン・エルマー社製２４００燃焼分析器を用いて電子微量分析（ＣＨ Ｎ）を行った。塩素分析は、電位差滴定により行った。結果を表１１に示す。実施例１１ 赤外線吸収スペクトル ペレット状にした(-)−(１Ｓ，２Ｓ，８Ｒ，８ａＲ)−１，２，８−トリヒド ロキシオクタヒドロ−インドリジジン塩酸塩（スワインソニン塩酸塩、白色また はオフホワイトの結晶性固体、分子量２０９．６６、ｐＫａ７．４、融点１８９ 〜１９０℃）のフーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）スペクトルを得た。主な吸収バ ンドは、化合物の構造を構成するものであった。特徴的な吸収バンドの帰属を表 １２に列挙する。この帰属は、Silverstein R．M、.Bassler G．C.およびMorril l T．C.著、「有機化合物のスペクトル同定」第３版、ジョン・ワイリー・アン ド・サンズ、ニューヨーク、１９７４年、第３章および「スペクトル分析入門」 Pavia D．L.、Lampman G．M.およびKriz G．S.著、サンダース・ゴールデン・サ ンバーストシリーズ、第２章に記載のスペクトル情報を基にした。実施例１２ 紫外線吸収スペクトル (-)−(１Ｓ，２Ｓ，８Ｒ，８ａＲ)−１，２，８−トリヒドロキシオクタヒド ロ−インドリジジン塩酸塩（スワインソニン塩酸塩、白色またはオフホワイトの 結晶性固体、分子量２０９．６６、ｐＫａ７．４、融点１８９〜１９０℃）の紫 外線吸収スペクトルによれば、ＨＰＬＣピーク純度評価において２００ｎｍ〜３ ００ｎｍで調べたＵＶ領域には吸収ピークが現れなかった。実施例１３ 質量分析スペクトル (-)−(１Ｓ，２Ｓ，８Ｒ，８ａＲ)−１，２，８−トリヒドロキシオクタヒド ロ−インドリジジン塩酸塩（スワインソニン塩酸塩、白色またはオフホワイトの 結晶性固体、分子量２０９．６６、ｐＫａ７．４、融点１８９〜１９０℃）を、 高解像度ＶＧ ＺＡＢ ＩＳダブルフォーカス磁気セクター装置での化学イオン 化(ＣＩ)(メタン)質量分析によって特徴付けた。スペクトルを表５に示し、その フラグメンテーションスキームを表１３に示す。実施例１４ 処方のために乾燥させたスワインソニン塩酸塩のＸ線回折 スワインソニン塩酸塩の乾燥試料は、元の固体薬物と結晶学上同一であること が分かった。Ｘ線回折研究により、ゼロ背景試料固定技術の使用が、製剤に再生 産可能な、特徴的な粉末パターンを与えることが示された。実施例１５ 熱分析 (-)−(１Ｓ，２Ｓ，８Ｒ，８ａＲ)−１，２，８−トリヒドロキシオクタヒド ロ−インドリジジン塩酸塩（スワインソニン塩酸塩、白色またはオフホワイトの 結晶性固体、分子量２０９．６６、ｐＫａ７．４、融点１８９〜１９０℃）につ いての示差走査型熱量計（ＤＳＣ）のサーモグラムは、窒素パージ４５ｍＬ／分 において５℃／分で加熱すると、約１８７．５〜１９０．３℃において溶融の吸 熱を示した。熱重量分析（ＴＧＡ）は、窒素パージ４０ｍＬ／分において５℃／ 分で加熱すると、１６０℃までで約０．２０％の重量損失および１８７．６〜１ ９０．５℃において溶融の吸熱を示した。実施例１６ 高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） 逆相アイソクラチック高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）手順を展開 して、薬物の潜在物質と関連物質の両方を分析した。薬物の計量は、物質の外部 標準と比較することによって行った。関連物質は面積％で定量した。潜在物質と 関連物質についてのクロマトグラフ分析手順は、その合成前駆体と潜在性不純物 から薬物を分離した。ＨＰＬＣについての妥当なクロマトグラフ条件は、以下の 通りである；カラム：Prodigy ５μＯＤＳ−２（２５ｃｍ×内径４．６ｍｍ）； 移動相：アセトニトリル：緩衝液（１０ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ＝９．０）５： ９５；流速：１．０ｍＬ／分；インジェクション量：１０μＬ；検出：ＵＶ、２ ０５ｎｍ；温度：周囲温度；試料濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ；試料希釈：移動相。 代表的なクロマトグラムを図６に示す。実施例１７ ゴルジ体およびリソソーム型マンノシダーゼIIの生体外での抑制決定方法 試験化合物スワインソニンは、４０μＭストックの０．４連続希釈により調製 した。それぞれの決定には、１０μＬ試験化合物、１０ｍＭパラニトロフェニル マノピラノシド２５μＬ、酢酸ナトリウム２００ｍＭ、ｐＨ５．６の精製したラ ット肝臓ゴルジ体マンノシダーゼII １５μＬが含まれていた。３７℃で６０分 間の恒温反応後、０．５Ｍ炭酸ナトリウム５０μＬを用いて反応を停止した。吸 収は、４０５ｎｍで読み取る。陽性対照と試料からブランクを差し引いた後、試 料を陽性対照平均に対して様々な勾配を用いて標準化し、底部＝０で頂点＝１０ ０のＳ字曲線に適合させた。信号は、非抑制反応からの生成物の量に比例する。 スワインソニン塩酸塩による、精製されたゴルジ体マンノシダーゼIIの抑制につ いての計算値ＩＣ₅₀は、０．０６８±０．０２１μＭである。 リソソーム型マンノシダーゼに対する本発明の化合物の効果は、化合物（１０ μＬ）を９６穴Elisaプレートに添加した後、ｐＨ５．０の２００ｍＭ酢酸ナト リウムおよび１０ｍＭｐ−ニトロフェニルα−マンノスピラノシド２５μＬを添 加することによって測定された。リソソーム型マンノシダーゼ（約８ｍＭ／ｍＬ ）１５μＬを各穴に添加して、プレートを３７℃で６０分間インキュベートした 。０．５Ｍ炭酸ナトリウム５０μＬを添加することによって反応を停止し、４０ ５に設定されたプレートでｐ−ニトロフェノールの形成が測定された。スワイン ソニン塩酸塩によるリソソーム型マンノシダーゼの抑制についての計算値ＩＣ₅₀ は、０．０４５±０．０１０μＭである。実施例１８ Ａ．細胞中のマンノシダーゼIIの抑制を測定するためのＬ−ＰＨＡ細胞アッセイ 試験化合物スワインソニン塩酸塩は、最小必須媒体（ＭＥＭ）中の５％ウシ胎 児血清（ＦＢＳ）５０μＬ中の４０μＭストックの０．５連続希釈によって調製 される。９６穴プレート中の希釈した試験試料５０μＬに、ＭＥＭ中の５％ＦＢ Ｓ ５０μＬ中のＭＤＡＹ−Ｄ２腫瘍細胞10,000個を各穴に添加する。試料を、 ５％ＣＯ₂インキュベータで３７℃において一晩インキュベートする。試験穴は 、ＭＥＭ中の５％ＦＢＳまたはＬ−ＰＨＡ１００μｇ／ｍＬを含有するＭＥＭ中 の５％ＦＢＳをそれぞれ２５μＬ／穴ずつ添加するために二重に調製されている 。 試料を再度、５％ＣＯ₂インキュベータにおいて、３７℃で一晩インキュベート する。各穴中の細胞の生存力および／または増殖を、プロメガ・セル・タイター ９６ＡＱキットに記載のフェナジンメチルスルフェート（ＰＭＳ）と（３（４， ５−ジメチルチアゾール−２−イル−５−）−３−カルボキシメトキシフェニル ）−２，４−スルホフェニル）−２Ｈテトラゾリウム塩（「ＭＴＳ」）を用いて 測定する。吸収は、４９０ｎｍで読み取る。Ｌ−ＰＨＡ毒性の低下は、薬剤の細 胞内への侵入、ゴルジ体マンノシダーゼIIの抑制および細胞表面上のＬ−ＰＨＡ 結合炭化水素構造の低減に直接関係している。 Ｂ．高いスループットＬ−ＰＨＡアッセイ 材料および方法 薬品：Ｌ−ＰＨＡ、トリトンＸ−１００およびｐ−ニトロフェニルホスフェート は、シグマ社から入手した。ジエタノールアミンはフィッシャー社から入手した 。細胞：ＤＢＡ−２歪みリンパ網細腫瘍ＭＤＡＹ−Ｄ２の起源および特性は、先 に記載している（Kerbel RS、Florian M、Man MS、Dennis JおよびMcKenzie IF 著（１９８０年）、ジャーナル・オブ・ナショナル・カンサー・インスティチュ ート６４、１２２１〜１２３０頁）。細胞は、２％熱活性ウシ胎児血清（ギブコ ・ビー・アール・エル）を含有するα−変性イーグル媒体中、９５％Ｏ₂／５％ ＣＯ₂湿潤雰囲気において３７℃で培養した。 アルカリホスファターゼ・アッセイ：９６穴プレートを用いて決定を行った。各 穴には、２％ウシ胎児血清を増補した培養媒体１２５μＬ中に保持した様々な数 のＭＤＡＹ−Ｄ２細胞が含まれていた。アルカリホスファターゼ反応は、アッセ イ混合物（１Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ９．８、２ｍＭＭｇＣｌ、１％ トリトンＸ−１００および２．５ｍＭｐ−ニトロフェニルホスフェート）７５μ Ｌを添加して開始し、３７℃で９０分までインキュベートした。反応は、３．５ ＭＮａＯＨ ８０μＬで停止した。カラー現像の１５〜３０分後、色原体生成物 ｐ−ニトロフェノールの吸収を、多穴走査光度計（サーモマックス・マルチプレ ート・リーダー、モレキュラー・デバイシズ）を用いて４０５ｎＭで測定した。 背景の値は、細胞のみを含まない培養媒体上で行ったアッセイにより決定し、ル ーチンに差し引いた。４０５ｎＭでの吸収とｐ−ニトロフェノールの濃度との間 の線形は、０〜２．５の範囲であった（ε＝１７．２３ｍＭ^-1ｃｍ^-1）。 Ｌ−ＰＨＡアッセイによるスクリーニング：手順は、９個の９６穴プレートを同 時に処理できるロボット化ワークステーション（バイオメック2000、ベックマン ）を用いることにより全自動であった。平底９６穴プレート中で決定した（試料 数８８＋プレート当たりの対照数８）。各穴（カラム１〜１１）には化合物（２ ．５％ＤＭＳＯ中）１０μＬを入れ、水中２．５％ＤＭＳＯ １０μＬをカラム １２に加えた。９６穴全てに、２％ＦＣＳを増補した培養媒体９０μＬ中のＭＤ ＡＹ−Ｄ２細胞５×１０³個を入れた。３７℃で１６〜２０時間インキュベート した後、Ｌ−ＰＨＡ（培養媒体中、１００μｇ／ｍＬ）２５μＬを最初の１１カ ラムまでと１２番目のカラムの４穴目まで（陽性対照）に入れた。残りの４穴に は２％ＦＣＳを増補した媒体２５μＬを入れた（陰性対照）。アッセイプレート は、３７℃で３０〜３６時間保持し、上述のプロトコルに従い、１時間のインキ ュベート時間を用いてアルカリホスファターゼ活性を測定した。細胞密度は、ア ッセイの全工程を通じて低かった。増殖率は％で表し、以下の式を用いて算出し た。 標準化信号＝（試料のＡ₄₀₅−平均Ａ₄₀₅陽性対照）／（平均Ａ₄₀₅陰性対照−平 均Ａ₄₀₅陽性対照） 細胞にでのスワインソニン塩酸塩によるゴルジ体マンノシダーゼIIのＩＣ５０ 抑制計算値は、0.057±0.01μＭである。実施例１９ ＳＰ１．Ａ３乳房腫瘍細胞増殖の生体外増殖に対するスワインソニン塩酸塩の効 果 サイトカインＴＧＦβ１およびＴＮＦαは、細胞増殖、リンパ細胞活性、細胞 分化およびアポプトシスによる細胞の死滅に影響を及ぼす。このサイトカインは 、細胞増殖を誘発するが、分化または死滅は細胞種に非常に特有なものであって 、通常の分化中はしっかりと制御されている。メラノーマ、大腸癌および子宮癌 についてのＴＧＦβおよびＴＮＦαの細胞分裂促進効果が既に報告されている。 増殖を調停する成長因子は、その信号経路を通じて、または他の成長因子受容体 発現の増加により、直接導き出すことができる。 ＳＰ１．Ａ３ａマウス乳癌細胞を、濃度０．２μｇ／ｍＬにおいて、スワイン ソニン塩酸塩を含むおよび含まない、１０％ウシ血清を含有する培養媒体中で２ ４時間増殖させた。その後２４時間、スワインソニン塩酸塩を含むおよび含まな い血清を含まない媒体（ＳＦＭ）中で細胞を保持した。その後、細胞を、６時間 、成長因子の不存在下において増殖させるか、または以下の成長因子のうち一つ に暴露した；ＴＨＦα（腫瘍壊死因子−α）、ＴＧＦβ１（トランスフォーミン グ成長因子−β）、ＴＧＦα、血小板派生成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖 因子（ＥＧＦ）。最後の１８時間でトリチウム化チミジンを添加し、多重細胞収 集器を用いて細胞を収集し、細胞増殖の速度としてβ−カウンターで放射能を測 定した。 図７に示すように、ＳＰ１．Ａ３ａ細胞の増殖は、成長因子ＴＧＦ−β１およ びＴＮＦ−αによって刺激され、およびスワインソニン塩酸塩処置は、ＴＧＦ− β１およびＴＮＦ−α依存増殖刺激を抑制する。実施例２０ スワインソニン塩酸塩の抗癌剤活性 Ａ．ＳＰ１．Ａ３ａ腫瘍細胞の増殖に対するスワインソニン塩酸塩の効果 ＳＰ１腫瘍株価細胞の転移サブクローン（Ａ３ａ）であるマウス乳腺癌を、１ ０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０中で指数関数的増加に維持した。細胞 を収集し、ＰＢＳ中１×１０⁶／ｍＬまたは１×１０⁷／ｍＬで再懸濁して、１× １０⁵個を含有する０．１ｍＬを、７週の雌ＣＢＡ／Ｊマウス（ジャクソン・ラ ボラトリーズ）の右横腹に皮下注射した。アルゼット小型浸透圧ポンプを、麻酔 下のマウスの逆のわき腹に皮下移植した。ポンプは、塩水（対照）または１日０ ．５ｍｇ／ｋｇのスワインソニン塩酸塩を２８日かけて配送するために注入され た。明白な腫瘍の発現についてマウスをモニターし、その後の腫瘍増殖をベルニ エ・カルパスを用いて測定した。４２日目に、腫瘍重量および肺転移の数を測定 した。 処置後３２日目、３９日目および４２日目の平均腫瘍量は、浸透圧ポンプを介 して２８日間スワインソニン塩酸塩を受容したマウス（＋）よりも対照動物（− ）の方が多かった（図８）。３２日目、２９日目および４２日目における対 照群とスワインソニン塩酸塩処置群との平均腫瘍量の差はそれぞれ、３５％、２ ７％および３２％であった。 対照群の５匹の動物についての４２日目の犠牲点で決定された平均腫瘍重量（ ７．３５）は、スワインソニン塩酸塩群における４匹の動物の平均腫瘍重量（４ ．８７）よりも高かった。処置した群は、１個の非常に大きな腫瘍があった。 ４２日目の犠牲点において、対照マウスの肺転移の発生はマウス１匹当たり平 均小瘤１．８個であり、スワインソニン塩酸塩処置したマウス１匹当たりの平均 は０．２５個の小瘤であった。 この実験により、スワインソニン塩酸塩の抗腫瘍活性が確認できる。事実、使 用された投与量は、スワインソニンを含まない基剤を用いて行われた初期実験で の使用量よりも８倍低かった。 Ｂ．マウスのＳＰ１．Ａ３ａ腫瘍細胞の増殖に対する飲料水中の経口スワインソ ニン塩酸塩の効果 飲料水に投与されたスワインソニン塩酸塩を用いて前記実験を繰り返した。Ｓ Ｐ１．Ａ３ａマウス乳腺癌を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０媒体 中で指数関数的増加に維持した。細胞を収集し、ＰＢＳ中３×１０⁵／ｍＬで再 懸濁して、細胞３×１０⁴を含有する０．１ｍＬを、７週雌ＣＢＡ／Ｊマウス（ ジャクソン・ラボラトリーズ）（ｎ＝２５）の右横腹に皮下注射した。その後、 マウスに、飲料水のみ（ｎ＝１３）またはスワインソニン塩酸塩１０μＬ／ｍＬ を含有する飲料水（ｎ＝１２）を与えた（投与量は、２ｍｇ／ｋｇ／日相当）。 明白な腫瘍が現れるたところで、腫瘍寸法を、バルニエ・カリパスを用いて週 に２回測定した。処置期間終了時に、腫瘍を切除して秤量した。 １０μｇ／ｍＬのスワインソニン塩酸塩を含む飲料水で処置した腫瘍をもつマ ウスは、飲料水のみで処置した対照マウスよりもゆっくりと成長する腫瘍を有し ていた。結果を図９に示す。スワインソニン塩酸塩処置したマウス（＋）の腫瘍 寸法の中間点は、塩水処置したマウス（−）よりも非常に小さい。この差は、図 示する期間において、統計的に顕著である。 処置群における３１日目の平均腫瘍重量は、１．７９ｇであり、未処置の群は ３．３３ｇであった。 結論としては、実験は、スワインソニン塩酸塩が生体外および生体内での抗癌 活性を有していることを示している。抗癌活性は、スワインソニンを含まない基 剤についての先の報告よりも非常に少ない投与量を用いて決定された。実施例２１ マウスの骨髄前駆細胞に対するスワインソニン塩酸塩およびスワインソニンの生 体外効果（ＣＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭ） 動物 病原体を有しないＣ５７ＢＬ／６メスマウス（８〜９週）（ジャクソン・ラボ ラトリーズから入手したもの）を使用した。部屋環境および光周期を制御した。 すなわち、２４℃、湿度５０±２０％において、１２時間光に当てて１２時間暗 所に置いた。マウスは、標準ペレット化した市販の餌と滅菌（オートクレーブ処 理した）水道水に自由にアクセスできるケージ１つに１匹を提供した。 材料 スワインソニン塩酸塩は、セレス・ラボラトリーズ、カリフォルニア週によっ て製造された。ＦＢＳおよびメチルセルロース（メソカルトＭ3330）をステム・ セル・テクノロジーズ・インコーポレイテッド(バンクーバー、ブリティッシュ コロンビア)から入手した。イアコーヴ変性したダルベッコ媒体は、ギブコ・ビ ー・アール・エル製の粉末媒体、脱イオン水およびフィルター滅菌を用いて調製 した。細胞を取り扱う場合、２％ＦＢＳとβ−メルカプトエタノール５０μＭを 含む媒体を供給した（ＩＭＤＭ／ＦＢＳともいう）。 細胞収集 健康でＧＤ００３９処置したマウスをＣＯ₂窒息させて安楽死させた。滅菌条 件下、２６ゲージ針を用いて大腿骨と頚骨をＩＭＤＭ／ＦＢＳで洗い流すことに よって骨髄（ＢＭ）細胞懸濁液を調製した。単一細胞懸濁液をＩＭＤＭ／ＦＢＳ １０．０ｍＬに近づけた。懸濁液中で凝集した細胞の濃度を、血球計数器で３回 数えることによって決定した。細胞の一部を、前駆アッセイのためにプレーティ ングする前に適当な濃度に媒体で更に希釈した。 前駆細胞アッセイ コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）は、メチルセルロース法で確立した。２× １０５個の凝集したＢＭ細胞、ＩＭＤＭ ０．１ｍＬおよびメソカルト（Ｍ３３ ３０）０．９ｍＬを含む懸濁液１ｍＬを、３５ｍｍ細胞培養更に３回プレーティ ングした。スワインソニン塩酸塩またはスワインソニンを、ＩＭＤＭ０．１ｍＬ 中、３０μｇ／ｍＬおよび３μｇ／ｍＬの濃度で特定のプレートに加え、最終濃 度３μｇ／ｍＬとした。メソカルト Ｍ３３３０は、３０％ＦＢＳとエリスロポ エチン１０ｎｇ／ｍＬを含有し、早期の赤血球前駆細胞（ＣＦＵ−Ｅ）用に増殖 設計されており、３７℃、５％ＣＯ₂を含む湿潤雰囲気下においてインキュベー トした３日後に評価した。顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）の場 合、メソカルト Ｍ３３３０は３０％ＦＢＳを含有するが、別の成長因子は含ま ず、３７℃、５％ＣＯ₂を含む湿潤雰囲気下においてインキュベートした７日後 に評価するＣＦＵ−ＧＭの増殖を支持する。いくつかのプレートには、ＳＣＦお よび／またはＧＭ−ＣＳＦをＩＭＤＭ ０．１ｍＬで添加して最終濃度を、ＳＣ Ｆに対しては５０μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬ（ＥＤ５０）に、およびＧＭ− ＣＳＦに対しては０．２５μｇ／ｍＬまたは１．７μｇ／ｍＬにする。２０個以 上の細胞を含むコロニーは、倒立顕微鏡を用い、明視野および倍率４０×または １００×で評価した。 結果 健康なマウスおよびスワインソニン塩酸塩を２０μｇ／日で４日間投与された マウスのＢＭ細胞を、Ｍ３３３０メチルセルロースを用いたＣＦＵアッセイで分 析した。スワインソニン塩酸塩およびスワインソニンはいずれも、メチルセルロ ースに生体外で添加すると、３日目に数えた早期ＣＦＵ−Ｅの数を顕著に増加さ せた（表１４）。スワインソニン塩酸塩およびスワインソニンの高い（３μｇ／ ｍＬ）および低い（０．３μｇ／ｍｌ）濃度は、対照（未処置の）マウスのＢＭ 細胞に添加したときと同じ範囲までＣＦＵ−Ｅの数を刺激した。これは、スワイ ンソニン塩酸塩処置したマウスから生体内でＢＭを用いた場合の、投与量依存効 果であった。 スワインソニン塩酸塩およびスワインソニンは共に、赤血球前駆細胞を生体外 で、ほぼ同じ速度で刺激する。０．０３μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ間での濃度 では、早期ＣＦＵ−Ｅの数が３倍まで増加する。 スワインソニン塩酸塩およびスワインソニンは共に、生体外で顆粒球マクロフ ァージ前駆細胞を刺激する（図１１：健康なＣ５７ＢＬ／６マウスからのＢＭ細 胞は、メチルセロロース Ｍ３３３０ ０．８ｍＬ、細胞懸濁液０．１ｍＬ、Ｓ ＷＨＣ１ ０．１ｍＬおよびサイトカイン０．１ｍＬの混合物から得られた懸濁 液を１．０ｍＬでプレーティングした：１−ＳＣＦ ５０ｎｇ／ｍＬ、２−ＳＣ Ｆ ５ｎｇ／ｍＬ、３−ＧＭ−ＣＳＦ １．７μｇ／ｍＬ、４−ＧＭ−ＣＳＦ ０．２５μｇ／ｍＬ、５−ＣＳＦ ５０ｎｇ／ｍＬ＋ＧＭ−ＣＳＦ ０．２５μ ｇ／ｍＬ、６−サイトカイン含まず）。特定の刺激因子の不存在下では、スワイ ンソニン塩酸塩は、ＣＦＵ−ＧＭの４倍増加を示した。実施例２２ 毒理学および薬物動態学的研究 薬理学的および毒理学的研究が、スワインソニン塩酸塩を用いて行われた。特 に、以下の事項を評価した：(a)ラットおよび猿における前記化合物の薬物動態 学；(b)拡大されたヒト投与量のかなり多彩な急性毒性；(c)前記化合物の毒性プ ロファイルは、スワインソニンを含まない基剤についての文献プロファイルと比 較した；(d)遺伝毒性の潜在性；(e)時間経過、投与依存性、細胞感度および細胞 中でのオリゴ糖蓄積の可逆性；および(f)血清ＡＳＴおよび肝臓組織学との関係 。研究より、スワインソニンに対する急性毒性は、非常に高い投与量（拡大され たヒト投与量の13,000倍）で生じることが分かった。時間的な研究は、甲状腺お よびおそらく腎臓もが、ヒトに示唆される投与量で、リソソームにおけるオリゴ マンオシダーゼの可逆的蓄積部位であり得ることを示している。実施例２３ 代表的な生体内および生体外プロトコル Ａ．肺転移の抑制のためのスワインソニン塩酸塩の投与 Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬマウスの側方尾静脈に１０⁵ 個の細胞を注入する前に、スワインソニン塩酸塩の存在下または不存在下におい て４８時間培養する。腫瘍細胞の注入から２４時間後に、Dennis JW著、カンサ ー・リサーチ.４６：５１３１〜５１３６頁、１９８６年に記載の通り、肺小瘤 を数える。 Ｂ．肺の腫瘍細胞コロニー形成を抑制するためのスワインソニン塩酸塩 腫瘍細胞を側方尾静脈に注入して、スワインソニン塩酸塩を１〜１７日間保持 する前に、マウスに、スワインソニン塩酸塩を５．０μｇ／ｍＬ含むまたは含ま ない飲料水を２日間与える。腫瘍細胞の注入から２４時間後に、肺小瘤を数える 。 Ｃ．マウス内でのヒト腫瘍増殖の抑制 ＭｅＷｏ（ヒトメラノーマ腫瘍株細胞）を皮下注射した胸腺欠損のヌードマウ スを、日に１回の滅菌塩水または滅菌塩水中のスワインソニン塩酸塩２０μｇ／ マウスのｉｐ（腹膜腔内）注射で治療する。Dennis JW（カンサー・リサーチ.５ ０：１８６７〜１８７２頁、１９９０年）記載の方法の通り、腫瘍寸法を週に２ 回、カリパスで測定し、腫瘍重量を腫瘍細胞注入４週後に測定する。 Ｄ．固体腫瘍増殖の抑制に関するインターフェロン誘発剤ポリ（Ｉ．Ｃ．）とス ワインソニン塩酸塩との相乗効果の決定 マウスに、ＭＤＡＹ−Ｄ２腫瘍細胞１０⁵個を注射する２日前に、スワインソ ニン塩酸塩（３．０μｇ／ｍＬ）を含むまたは含まない飲料水を２日間与える。 腫瘍直径は、週に２回、カリパスで測定し、その後、腫瘍細胞注射１５日目に細 胞を切除して秤量する。スワインソニン塩酸塩増補された飲料水を与えたおよび ／またはポリ(Ｉ.Ｃ.)を２回注射したマウスにおける１５日目の腫瘍増殖速度お よび腫瘍重量を、Dennis JW著、カンサー・リサーチ.４６：５１３１〜５１３６ 頁、１９８６年に記載のデータと比較する。 Ｅ．スワインソニン塩酸塩による生体外感染の増殖抑制効果の向上 ＨＴ２９ｍ、ＳＮ１２Ｃ１１ヒト癌細胞、またはＭｅＷｏメラノーマ細胞を、 ヒト・インターフェロン・アルファ−２（イントロンＡ、シェーリングプラウ製 ）１０００ＩＵ／ｍＬを含むまたは含まないスワインソニン塩酸塩約（１．２μ Ｌ／ｍＬ）の存在下および不存在下、ＭＥＭ細胞培養媒体中の５％ＦＢＳに１０³ 個／ｍＬで播種する。細胞を、５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で培養し、５日目に 細胞数を決定する。前記方法は、Dennis JW著、ジェイ・エヌ・シー・アイ８１ ：１０２８〜１０３３頁、１９８９年に記載されている通りである。 Ｆ．生体外前駆細胞アッセイ スワインソニン塩酸塩０．７〜５．０μｇ／ｍＬで処置した後、特定の時間に おいて、対照、および処置されたマウスを頚椎脱臼により屠殺する。それぞれか らの骨髄（ＢＭ）および脾臓細胞を、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬマウス骨髄幹細胞増殖 キット（カタログ＃３８２７ＳＡ、グランド・アイランド、ニューヨーク）の手 順に従って処理する。半固体媒体中に形成される潜在性コロニーは、ＣＦＵ−Ｇ ＥＭＭ、ＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵである。プレートを、５％ＣＯ₂および９５ ％空気の湿潤雰囲気下、３７℃で１０〜１４日間インキュベートし、少なくとも ４０個の細胞から成るコロニーを、倒立顕微鏡（倍率２０×）を用いて数え、造 血前駆細胞増殖の刺激を決定する。 Ｇ．骨髄増殖アッセイ マウスを、毎日、２〜６日間、飲料水中のスワインソニン塩酸塩３μｇ／ｍＬ でまたはスワインソニン塩酸塩２０μｇ／ｍＬを注射することにより処置する。 増殖は、［³Ｈ］−チミジン（５μＣｉ／ｍＬ）の、全媒体中に同数の単離され たばかりのＢＭ細胞を含む培養菌への３７℃で１８時間の組み込みにより評価さ れる。放射線ラベルされた細胞を、ガラスフィルター上に細胞収集器を用いて収 集し、液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を決定する。骨髄の細胞 質も、頚骨と大腿骨から流し出した後でＢＭ細胞を直接数えるためにコールター カウンターを用いることにより決定する。 Ｈ．生体内前駆細胞アッセイ：脾臓コロニー形成アッセイ マウス（１０〜１４週）を、全身の合計照射量７００ｃＧＹでＸ線照射する。 照射後のマウスを、滅菌飲料水約３ミクロｇ／ｍＬで保持し、抗生物質を与えて 感染からのモラリティを最小限にする。ＢＭ幹細胞の数を、ティルおよびマッカ ローの方法で確立する。この数は、全身照射の致命照射量まで予め放射線照射さ れたレシピエントマウスの脾臓内において、静脈注射された前駆幹細胞がコロニ ーを形成する可能性に基いている。ＣＦＵの数は、造血移植における多能性の造 血幹細胞の数に比例している。移植から１０日後、レシピエントマウスを屠殺し 、その脾臓を取り出して、ボウイン溶液に定着して、艶のある可視コロニーを数 える。 Ｉ．骨髄移植および再増殖 骨髄細胞を移植する前に、マウスを、Whiteら（カンサー・コミュニケーショ ン３：８３頁、１９９１年）およびOredipeら（ＪＮＣＩ８３：１１４９頁、１ ９９１年）と同様にして、化学療法治療剤の致命的投与量またはＸ線の致命的照 射量で前処理する。１０〜１４週のマウスを、フィリップス製ＲＴ２５０Ｘ線照 射機（二台の対向する２５０Ｋｖｐの治療用Ｘ線照射機、２３５ＫＶ、１５ｍＡ 、０．２５銅および０．５５アルミニウムフィルター、０．９９ｍｍ銅のハーフ レイヤー付き）を用いて照射する。放射線照射は、全身の合計照射量７００ｃＧ ｙの場合、１２６ｃＧｙ／分（６３ｃＧｙ／分）の照射速度で５分３３秒間行う 。この放射線照射基準は、マウスが致死すると記載されている範囲内である。Ｘ 線照射後、動物に、対照またはスワインソニン塩酸塩処置されたいずれかのドナ ーマウスから新たに調製された１０⁵個の骨髄細胞を注入する。スワインソニン 塩酸塩処置されたドナーマウスは、スワインソニン塩酸塩約２０μｇ／ｍＬを６ 日間受容する。レシピエントマウスの生存率を、３０日または５０日間モニター する。 Ｊ．Ｔｈ１免疫応答：ナチュラルキラー（ＮＫ）およびリンホカイン活性化キラ ー（ＬＡＫ）細胞アッセイ 白血球から、標準法を用いてヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する（ Reesら著；ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド６２：７９〜８５頁、 １９８３年；またはSedmanら著、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・サージェ リー７５：９７６〜９８１頁、１９８８年）。ＰＢＭＣを６穴プレートに培養菌 ５ｍＬ中、細胞１５０万個／ｍＬを単独で（対照）またはスワインソニン塩酸塩 を変化する濃度で、ＬＡＫアッセイの場合はＩＬ−２ １０００国際単位（ＩＵ ）／ｍＬと一緒に３日間で、またはＮＫアッセイの場合はインターフェロン・ア ルファ１０００ＩＵと一緒に一晩で播種する。培養したＰＢＭＣのＮＫ細胞活性 は、標的細胞として（ＮＫ細胞感受性のある）Ｋ５６２株価細胞を用いるＣｒ⁵¹ 放出アッセイにおいて測定する。ＬＡＫ細胞活性は、標的としてＣｒ⁵¹ラベルさ れた（ＮＫ細胞耐性のある）ダウディ株価細胞を用いて測定する。 Ｋ．Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答を区別する手段としてのＳＴＡＴレベルの測定およ び活性化分析 ＳＴＡＴのレベルおよび活性化を測定するために、ＤＢＡ／２マウスを、６〜 ９日間、スワインソニン塩酸塩１０μｇ／マウス／日で処置した後、滅菌塩水ま たは滅菌塩水中ポリＩＣ（すなわち、ｄｓＲＮＡ、ウィルスの代理）１００μｇ を１回腹膜腔内（i.p.）注射する。ＳＴＡＴ活性化のために最適な時間である２ 時間後、マウスの脾臓を均質化し、サイトソルおよび細胞核抽出物を調製する。 ＳＴＡＴタンパク質レベルを、ウエスタン・ブロット分析法によってサイトソル および核フラクション中で測定する。ＳＴＡＴリン酸化（すなわち、活性化）は 、抗ホスホチロシン抗体を用いる以下の免疫沈降を測定する。スワインソニン塩 酸塩２０μｇ／日で腹膜腔内処置されたマウスは、高いＳＴＡＴ１サイトソルタ ンパク質レベルを有するが、ＳＴＡＴ３は、変わらなかった（図１０Ａ〜１０Ｃ ）。 以下は、図１０Ａ〜１０Ｃの詳細な説明である：図１０Ａは、ＳＷ塩酸塩が、 ポリＩＣを用いて以下の処置をしたＤＢＡ／２マウスの脾臓中において、ＳＴＡ Ｔ１の活性化を高めることを示している。ＤＢＡ／２マウスは、ＳＷ塩酸塩（２ ０μｇ／日）のi.p.（腹膜腔内）注射を１０日間、毎日受けた。１１日目に、マ ウスは、屠殺前に、ポリＩＣ（１００μｇ／マウス）または等量のＰＢＳ２ｈを 注射された。脾臓および肝臓細胞を収集し、即座に液体窒素中で凍結した。核抽 出物を調製し、指示抗体を用いてイムノブロットすることにより分析した（８μ ｇ）。同様の結果は、肝臓にも見られた（図示せず）。図１０Ｂ。サイトソル抽 出物を調製し、指示抗体を用いてイムノブロットすることにより分析した（２０ μｇ）。脾臓核抽出物を調製し、抗ホスホチロシン抗体を用いてイムノブロット することにより分析した（８μｇ）。図１０Ｃ。ＳＴＡＴ活性化および活性化し たＳＴＡＴの代謝回転は、１型ＩＦＮ誘発剤ポリＩＣに応答して迅速に生じる。 ＤＢＡ／２マウスは、ポリＩＣ（１００μｇ／マウス）のi.p.（腹膜腔内）注射 を１回受けて、示された時間で屠殺された。 あるいは、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＡ様のアッセイを用いて、ヒト末梢血液 中のＳＴＡＴレベルおよび活性化を検出して、プラスチック微量滴定プレートに ついたＤＮＡ促進剤共通配列と結合することもできる。それは、リン酸アルカリ 塩（または他の好適な標識）と結合した抗ＳＴＡＴ抗体を用いて検出される。ヒ ト末梢血液リンパ球の試料を溶解して、当該分野において既知の方法によって細 胞抽出物を調製した。結合され、活性化されたＳＴＡＴタンパク質レベルは、 （例えば、リン酸アルカリ塩結合した抗体を使用した後、リン酸アルカリ塩と反 応する比色定量基剤を検出のために使用するのであれば、）好適な検出剤と結合 されたＳＴＡＴタンパク質との反応の後、光学的に定量される。 Ｌ．肝炎のマウスモデルにおける活性 ウィルス肝炎に対する薬剤活性は、マウス肝炎ウィルス−３（ＭＨＶ−３）で マウス緊張を感染させることにより決定することができる。ＭＨＶ−３に関する 先の研究は、劇症肝炎（Ｂａｌｂ／ｃＪ）を展開するかまたはＭＨＶ−３に耐性 を示すマウス緊張が中心であった（Yuwarajら著、１９９６年）。 ＭＨＶ−３感染に応答して慢性肝炎を展開するＣＨ３／Ｈ２Ｊ緊張は、塩水ま たはスワインソニン塩酸塩（２０μｇ／マウス／日）を単独でまたはＩＦＮと組 み合わせて治療される。治療前および治療中に、ＳＴＡＴの活性化状態と、血清 サイトカインレベル、ウィルス量および生存量を（Ｋ項の記載と同様にして）測 定する。 Ｍ．慢性Ｃ型肝炎をもつ患者における活性 慢性のＣ型肝炎をもつ患者におけるスワインソニン塩酸塩またはスワインソニ ン塩酸塩＋インターフェロン−アルファによる治療に対する応答は、治療中測定 されるウィルス量および血清肝臓アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ） の減少によって、例えば、３、６および１２ヶ月でモニターされ得る。肝臓組織 構造の向上を、治療前後に生検を行うことによって評価することもできる。 スワインソニン塩酸塩は、日に２回、５０〜２００μｇ／ｋｇの投与量を単独 またはアルファ−インターフェロンと組み合わせて経口投与し、週に３回、１〜 ３ＭＵの投与量で投与される。この期間中、スワインソニン塩酸塩は、連続して または間欠的に（例えば、２週間毎、１週間おきに）投与されてよい。スワイン ソニン塩酸塩を受容する患者の応答を、プラセボまたはアルファ−インターフェ ロンを受容する患者の応答と比較する。 血清、肝臓および末梢血単核細胞におけるＣ型肝炎ウィルスＰＮＡの検出は、 定性検出の場合、高度に保存された５'−未翻訳領域（ＵＴＲ）に特効性を示す プライマーを用いるか、または定量検出の場合には、好適な内部標準ＲＮＡを用 い、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）によって行われる。 別の方法は、単一増幅または分岐鎖ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイである。ウィル ス核酸は、マイクロタイタープレートにハイブリッド化されて、ウィルス特効性 増量剤プローブと反応した後、ｂＤＮＡポリマーと反応する。 肝臓組織構造の向上に関し、ノーデルらによって開発された記録システムに基 く組織学的活動指数は、４分類（門脈周囲の壊死、小葉間壊死、門脈炎および線 維症）において等級分けされている。あるいは、肝炎等級（０〜４）および腺維 症状態（０〜４）に基くシステムを用いることもできる（Scheuer PJ著、ジャー ナル・オブ・ヘパトル１９９１年；１３、３７２〜３７４頁）。 Ｎ．血液回復／化学保護 血液回復／化学保護の細胞および動物モデルは、前述のOredipeら著、１９９ １年、および前述のWhite著、１９９１年に記載されている。 本発明は、現在、好ましい実施例であると考えられているものに関して記載し ているが、本発明は、開示する実施例に限定されるものではないと介されるべき である。対照して、本発明は、添付されるクレームの精神および範囲内に含まれ る様々な改良および同等の変更をも網羅するものである。 全ての刊行物、特許及び特許公報に記載の内容は、個別の刊行物、特許または 特許公報の内容全てが参照により挿入されるものと具体的および個別的に示唆さ れているのと同様の範囲までここに挿入する。 表１ スワインソニンＨＣｌの原子配位座標（×１０⁴）および同等の等方性置換パラ メータ（Ａ²×１０³）。Ｕ（等量）は、直行するＵｉｊテンソルの軌跡の１／３ で表されている。 表２ スワインソニンＨＢｒの原子配位座標（×１０⁴）および同等の等方性置換パラ メータ（Ａ²×１０³）。Ｕ（等量）は、直行するＵｉｊテンソルの軌跡の１／３ で表されている。 表３ 表４ ＳＷ塩酸塩、ＳＷを含まない基剤およびＳＷ臭化水素酸塩の安定性 表５ スワインソニン塩酸塩のその他の物性（ＳＷ＝スワインソニン） 表６ 最も優れた最小二乗平面 表７ Ｄ₂Ｏ中試料ＳＷおよびＳＷＨＣｌの¹Ｈケミカルシフト ^a：５員環における仮エクアトリアル位置および仮軸位置にそれぞれ相当す るプロトン３および３' ^b：ＳＷ中のＨ−３およびＳＷＣ１中のＨ−３'との重なりに起因する概算さ れたケミカルシフト 表８ Ｄ₂Ｏ中試料ＳＷおよびＳＷＨＣ１の選択された¹Ｈ−¹Ｈカップリング定数 表９ Ｄ₂Ｏ中試料ＳＷおよびＳＷＨＣｌの¹³Ｃケミカルシフト 表１０ カーボンＮＭＲおよびＡＰＴバンド帰属をまとめた表 表１１ 定量微分析結果をまとめた表 スワインソニン塩酸塩 (1)燃焼分析（ＴＰ１０８１２）により測定した。 (2)電位差滴定分析（ＴＰ１０１８１２）により測定した。 (3)差により算出した。 (4)フェニックス・ラボラトリーズ製電量分析カール・フィッシャー滴定により 測定した。 (5)ヘッドスペース・ガス・クロマトグラフィ分析により測定した（フェニック ス・ラボラトリーズ製で測定された溶媒Ｈ全部で１６種類あった）。ＮＤ＝検出 されず (6)ユー・エス・ピー＜281＞により測定した。燃焼時の残渣（ＴＰ１８０３８） 表１２ 赤外線バンド帰属をまとめた表 表１３ 質量スペクトルフラグメンテーションスキームのまとめ 表１４ ２×１０⁵個の凝集ＢＭ細胞からの早期赤血球コロニーの成長に関する ＳＷまたはＳＷＨＣ１の効果 ^*：データは、（３回計測の平均ＣＦＵ−Ｅ）±標準偏差である。^** ：ｐは、両側ｔ−検定における対照との差である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 33/00 Ａ６１Ｐ 33/00 35/00 35/00 35/04 35/04 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ツィザー，ロタール カナダ、エム５ビー・２エイチ５、オンタ リオ、トロント、カールトン・ストリー ト・ナンバー1434，20番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．スワインソニンの安定な結晶性塩化物または臭化物塩。 ２．水素結合相互作用により互いに保持されるスワインソニン塩化物塩分子を 含む請求項１記載の結晶性スワインソニン塩化物塩。 ３．水素結合相互作用により互いに保持されるスワインソニン臭化物塩分子を 含む請求項１記載の結晶性スワインソニン臭化物塩。 ４．単位セル内にスワインソニン塩化物または臭化物塩４分子を含む請求項１ 記載の結晶性スワインソニン塩化物または臭化物塩。 ５．スワインソニン塩酸塩または臭化水素酸塩の分子を含む請求項１記載の結 晶性スワインソニン塩化物または臭化物塩。 ６．スワインソニン塩酸塩分子が、スワインソニン塩酸塩の第１分子の窒素お よび酸素原子から他のスワインソニン塩酸塩分子の塩化物イオンへの水素結合相 互作用によって互いに保持されている請求項５記載の結晶性スワインソニン塩酸 塩。 ７．スワインソニン臭化水素酸塩分子が、スワインソニン臭化水素酸塩の第１ 分子の酸素原子から他のスワインソニン臭化水素酸塩分子の臭化物イオンへの水 素結合相互作用、およびスワインソニン臭化水素酸塩の第１分子の窒素原子から 第２の分子の酸素原子への水素結合相互作用によって互いに保持されている請求 項５記載の結晶性スワインソニン臭化水素酸塩。 ８．空間群シンメトリーｐ２₁２₁２₁を有する請求項１記載の結晶性スワイン ソニン塩化物または臭化物塩。 ９．空間群シンメトリーｐ２₁２₁２₁を有する請求項５記載の結晶性スワイン ソニン塩酸または臭化水素酸塩。 １０．単位セルが斜方晶系である請求項９記載の結晶性スワインソニン塩酸ま たは臭化水素酸塩。 １１．単位セル長がａ＝８．０９±０．０１Å、ｂ＝９．３９±０．０１Åお よびｃ＝１３．６２１±０．０１Åである請求項１０記載の結晶性スワインソニ ン塩酸塩。 １２．単位セル長がａ＝８．４０±０．０１Å、ｂ＝８．６３±０．０１Åお よびｃ＝１４．１２±０．０１Åである請求項１０記載の結晶性スワインソニン 臭化水素酸塩。 １３．表１に示す原子配位座標で表される請求項１１記載の結晶性スワインソ ニン塩酸塩。 １４．表２に示す原子配位座標で表される請求項１２記載の結晶性スワインソ ニン臭化水素酸塩。 １５．スワインソニンの安定な結晶性塩化物または臭化物塩を含む組成物。 １６．塩化物または臭化物塩が塩酸または臭化水素酸塩である請求項１５記載 の組成物。 １７．スワインソニンアセトニドを塩酸で処理すること、およびクロマトグラ フィーを用いずに結晶法で精製して結晶性スワインソニン塩酸塩を得ることを含 む請求項５記載の結晶性スワインソニン塩酸塩の調製方法。 １８．請求項１５記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む、免疫系 を刺激して対象の増殖性障害または微生物もしくは寄生虫感染を治療する方法。 １９．請求項１５記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む癌の治療 方法。 ２０．治療が転移または腫瘍の成長を抑制することを含む請求項１９記載の方 法。 ２１．対象に請求項１５記載の組成物の有効量を投与することを含む、造血性 前駆体細胞の増殖を刺激する方法。 ２２．患者が、骨髄抑制剤を投与されたことがあるかまたは骨髄移植レシピエ ントである請求項２１記載の方法。 ２３．対象に請求項１５記載の組成物の有効量を投与することを含む、病原の クリアランスが対象のＴｈ１応答を要するウィルス性、細菌性、真菌または寄生 虫感染の治療方法。 ２４．スワインソニンを含まない基剤、スワインソニンのハロゲン化物塩また はそれらの組み合わせから処方される組成物の有効量を対象に投与することを含 む、Ｃ型肝炎の治療方法。 ２５．請求項１記載の安定な結晶性スワインソニン塩化物または臭化物塩を投 与することを含む、ワクチンの免疫原性を増強する方法。 ２６．ゴルジ体α−マンノシダーゼIIの抑制についての化学的本質をコンピュ ーター評価するために、精製した請求項１記載の結晶性スワインソニン塩化物ま たは臭化物塩の原子配位座標またはその一部を使用する方法。 ２７．免疫系を刺激して増殖性障害または微生物もしくは寄生虫感染を治療す るための医薬組成物の製造における、精製した請求項１記載の結晶性スワインソ ニン塩化物または臭化物塩の使用。 ２８．癌を治療するための医薬組成物の製造における、精製した請求項１記載 の結晶性スワインソニン塩化物または臭化物塩の使用 ２９．ワクチンの製造における、精製した請求項１記載の結晶性スワインソニ ン塩化物または臭化物塩の使用