JP2002105100A - モノクローナル抗体、それを産生する細胞及びそれを含有してなる歯科用診断・研究用基剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトの口腔内のミュータンス連鎖球菌の中で
う蝕原性細菌である特定のミュータンス連鎖球菌とのみ
特異的に反応するモノクローナル抗体と、それらのモノ
クローナル抗体を産生する細胞と、それらのモノクロー
ナル抗体を含有してなる歯科用診断・研究用基剤とを提
供する。 【解決手段】 ストレプトコッカス・ミュータンスのみ
と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生可能な細
胞及びストレプトコッカス・ソブリヌスのみと特異的に
結合するモノクローナル抗体を産生可能な２種類の細胞
を樹立し、これらの細胞から産生されるモノクローナル
抗体を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトのう蝕原性細
菌であるストレプトコッカス・ミュータンス又はストレ
プトコッカス・ソブリヌスとそれぞれ特異的に反応する
モノクローナル抗体と、それらのモノクローナル抗体を
産生する細胞と、それらのモノクローナル抗体を含有し
てなる歯科用診断・研究用基剤とに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヒトの口腔内のミュータンス連鎖球菌の
存在とう蝕の発生との間には密接な関係があることが広
く知られており、多くの研究（例えば、Anders Thylstr
upら編著、「Text book of cariology」、Munksgaard社
発行の第405頁参照）が報告されている。またう蝕の多
い母親の口腔内からのミュータンス連鎖球菌が子供に感
染し、子供にう蝕を引き起こすという報告もなされてい
る。このような口腔内のミュータンス連鎖球菌を同定
し、計数することは、虫歯になり易い状態にあるかどう
かを診断する重要な指標である。

【０００３】ヒトの口腔内のミュータンス連鎖球菌は、
血清学的違いからａ〜ｈの８種類に分類されている。こ
のうち血清型ｃ，ｅ，ｆのストレプトコッカス・ミュー
タンスと血清型ｄ，ｇのストレプトコッカス・ソブリヌ
スとがヒトのう蝕により関連があるとされている。

【０００４】最近になって、ストレプトコッカス・ソブ
リヌスはストレプトコッカス・ミュータンスよりもヒト
のう触に重篤な影響を及ぼす可能性のあることが明らか
になってきた。例えば、岡田らはう蝕の多い患者とう蝕
の全くない者との口腔内からストレプトコッカス・ミュ
ータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスとの分離を
試みている。この結果によると、ストレプトコッカス・
ミュータンスはう蝕の全くない人の口腔内からも検出さ
れたのに対し、ストレプトコッカス・ソブリヌスはう蝕
の多い患者からのみ検出されている（岡田ら著、「Jour
nal of DentalResearch」1991年刊，第74巻の第501頁参
照）。

【０００５】また、ケーラーや広瀬らが小児に対して行
った研究によってもストレプトコッカス・ソブリヌスと
ストレプトコッカス・ミュータンスとの両方を保有する
人の方が、ストレプトコッカス・ミュータンスのみを保
有する人よりもう蝕が多いと報告されている（Kohlerら
著、「Community Dentistry and Oral Epidemiology」1
987年刊，第15巻の第332〜335頁、及び広瀬ら、「Carie
s Research」1993年刊，第27巻の第292〜297頁参照）。
このため、ヒトの口腔内におけるストレプトコッカス・
ソブリヌスとストレプトコッカス・ミュータンスとの各
々の感染度合いを検査する重要性が極めて高まってい
る。

【０００６】しかしながら、従来、口腔内のストレプト
コッカス・ミユータンスとストレプトコッカス・ソブリ
ヌスとの分離同定は極めて面倒であった。例えば、ＭＳ
Ｂ培地（Mitis Salibarius Bacitracin培地）等の選択
培地を用いて口腔内からストレプトコッカス・ミユータ
ンスとストレプトコッカス・ソブリヌスとのコロニーを
採取した後、種々の発酵試験を行い、その程度の差から
推定しなければならなかった（Beightonら著、「Caries
Research」1991年刊，第25巻の第174〜178頁参照）。
この方法は結果が得られるまでに日数が必要なだけでな
く、その他様々な問題を有していた。

【０００７】そもそもＭＳＢ培地はストレプトコッカス
・ミユータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスとの
コロニーの選択培地とされているが、これら以外の雑菌
が生育する場合があることや添加されている抗生物質の
バシトラシン（Bacitracin）によって生育を阻害される
ストレプトコッカス・ミュータンスやストレプトコッカ
ス・ソブリヌスの存在が報告されている（武笠英彦ら
著、「う蝕細菌の分子生物学」、クインテッセンス出版
発行の第66頁参照）。このため、余計なコロニーまで面
倒な発酵試験を行わねばならなかったり、実際よりも菌
数を少なく評価してしまう危険性があった。

【０００８】この他、カンジェロッシらは特殊なヌクレ
オチドプローブを合成し、ストレプトコッカス・ミユー
タンスとストレプトコッカス・ソブリヌスとのコロニー
を分離同定することに成功している（Cangelosiら著、
「Molecular Probes」1994年刊，第8巻の第73〜80頁参
照）。しかしながら、このような実験には生化学の研究
に用いられる高価な機械と高度な実験技術とが必要で、
とても歯科医院や歯科検診の現場で扱えるものではな
い。このように従来の方法では菌の検査に時間がかかる
ばかりでなく、高価な機械と高度な技術とを要するもの
であった。

【０００９】う蝕原生細菌の検査は簡便且つ迅速に行え
るものが望まれる。これは、この検査によって虫歯にな
り易い状態にあると判断された場合の対処が直ちに実施
できるからである。しかしながら細菌の培養による試験
では、歯科医院ではこのような培養は行い難い他、結果
を当日に得ることができないので結果を通知するために
患者を再来院させる必要が生じてしまうという問題があ
る。また、虫歯は多くの人がかかる可能性があるため、
早期治療を目的として集団歯科検診も行われている。こ
のような場合においても、う蝕原性細菌の検査は有益で
あるが、簡便な検査でないと実施が困難であるという問
題がある。

【００１０】これらの問題に対応するため、モノクロー
ナル抗体を応用したミュータンス連鎖球菌の検査が簡便
な検査方法として試みられている。例えば、特開平10-3
6400号公報や特開平2-177898号公報には、ストレプトコ
ッカス・ミュータンスを認識するモノクローナル抗体が
示されている。これらの技術で認識される細菌は、血清
型がｃ，ｅ，ｆのストレプトコッカス・ミュータンスで
あって、血清型ｄ，ｇのストレプトコッカス・ソブリヌ
スは認識されない。血清型ｄ，ｇのストレプトコッカス
・ソブリヌスはｅ型のストレプトコッカス・ミュータン
スと共にヒトのう蝕原性細菌としてｃ型のストレプトコ
ッカス・ミュータンスに次いで多く見出されるとされて
いる（武笠英彦ら著、「う蝕細菌の分子生物学」、クイ
ンテッセンス出版発行の第40頁第7〜13行参照）。この
ためヒトのう蝕に関連が高いとされるもう一方の菌であ
るストレプトコッカス・ソブリヌスが認識できず、虫歯
になり易い状態にあるかどうかを診断する際に誤った判
断をしてしまう危険性があった。

【００１１】このため、血清型がｃ，ｅ，ｆのストレプ
トコッカス・ミュータンスと血清型がｄ，ｇのストレプ
トコッカス・ソブリヌスとをそれぞれ分離して識別でき
るモノクローナル抗体が望まれていた。ところで、ヒト
の口腔内にはストレプトコッカス・ミュータンスやスト
レプトコッカス・ソブリヌス以外にも多くの細菌が存在
しており、一説にはプラーク１ｍｇ中には10⁸オーダー
の細菌が存在するとも言われている。そして、口腔内の
細菌はプラーク，唾液共に連鎖球菌が最も多いことが報
告されている（Socransky, S.S.ら、「Journal of Peri
odontology」1971年刊，第42巻の第485頁参照)。このた
め、口腔内の細菌検査に応用されるモノクローナル抗体
としては、目的菌以外のストレプトコッカスには結合し
ないものであることが望まれていた。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記事情に
鑑み、ストレプトコッカス・ミュータンスと特異的に結
合し他の口腔内細菌とは結合しないモノクローナル抗体
と、ストレプトコッカス・ソブリヌスと特異的に結合し
他の口腔内細菌とは結合しないモノクローナル抗体と、
この２種類のモノクローナル抗体をそれぞれ産生する細
胞と、これらのモノクローナル抗体を含有してなる歯科
用診断・研究用基剤とを提供することによって、両細菌
それぞれの分離同定を迅速且つ簡便に行える技術を提供
することを課題とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ストレプトコッカ
ス・ミュータンスのみと特異的に結合するモノクローナ
ル抗体を産生可能な細胞及びストレプトコッカス・ソブ
リヌスのみと特異的に結合するモノクローナル抗体を産
生可能な２種類の細胞を樹立した。これらの細胞から産
生されるモノクローナル抗体は各々に対応したストレプ
トコッカス・ミュータンス又はストレプトコッカス・ソ
ブリヌスに対しては結合能を示すが、他のヒト口腔内細
菌には反応しない。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明に係るモノクローナル抗体
を得る方法は、「Nature」1975年刊，第256巻の第495〜
497頁、Kohler G.及びC. Milstein著“Continuous cult
ures of fused cells secreting antibody of predefin
ed specificity”に記載の細胞融合によるハイブリドー
マの樹立法に基づいている。得られたハイブリドーマを
培養することにより、その培養液中に目的の抗体が産生
される。この方法自体は誰でも応用可能な公知のもので
ある。例えば、富山朔二・安藤民衛編、「単クローン抗
体実験マニュアル」（講談社発行）に詳細な実験方法が
記載されている。

【００１５】この方法に基づく本発明における細胞融合
によるハイブリドーマを樹立する方法について、更に詳
しく説明する。先ず、抗原としてストレプトコッカス・
ミュータンス又はストレプトコッカス・ソブリヌスを単
独で培養し、公知の方法により目的とするエピトープを
有する抗原を調製する。次に、得られた抗原で動物
（馬，牛，羊，ヤギ，マウス，ニワトリ等）を免疫する
が、近交系動物が確立されているマウスを用いるのが一
般的である。動物への免疫方法としては、皮下注射，筋
肉注射，腹腔内投与等による通常の方法や、点滴，点眼
等の方法によって行うことができる。抗原の投与は、所
望の抗体価が得られ且つ免疫動物に対して悪影響を与え
ない量を適宜選択すればよい。この際に、例えばフロイ
ント（Freund）完全アジュバント，フロイント（Freun
d）不完全アジュバント，水酸化アルミニウム等のアジ
ュバントをその抗原と共に併用することが多い。

【００１６】最終免疫後、抗体価が上昇していることを
確認し、全血採取を行い、無菌的に脾臓を取り出し、脾
細胞を得る。この脾細胞と免疫に用いた同種動物由来の
継代培養した骨髄種細胞とをポリエチレングリコールの
存在下で融合させてハイブリドーマを造り、融合した細
胞のみ増殖できる特殊な培養条件下で培養し、限界希釈
法という方法を用いて目的のモノクローナル抗体産生株
をスクリーニングする。このハイブリドーマは、免疫動
物の抗体産生細胞が特異抗体を産生する能力と骨髄種細
胞が半永久的に増殖するという両者の長所を有するもの
である。なお、本発明に係るモノクローナル抗体を産生
する細胞は、前記ハイブリドーマ以外にも、遺伝子組み
換え，形質転換等によっても樹立することが可能であ
る。モノクローナル抗体の生産は、細胞種に適した方
法、例えば、細胞培養法，腹腔を利用した培養等を各々
選択することができる。モノクローナル抗体の精製は、
当該分野で通常行われている硫安沈殿法，イオン交換ク
ロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー
等の各方法及びそれらの組合わせによって行うことがで
きる。

【００１７】このようにして得られた本発明に係るモノ
クローナル抗体の反応特異性は極めて高く、下記実施例
で詳述するように、20％ウシ胎児血清を含有する培養上
清中にモノクローナル抗体が存在するような低純度のモ
ノクローナル抗体組成物を用いても、ストレプトコッカ
ス・ミュータンス又はストレプトコッカス・ソブリヌス
の特異的検出が可能である。本発明に係るモノクローナ
ル抗体の含有液には、必要に応じてアジ化ナトリウムの
ような防腐剤，ブロテアーゼ阻害剤等を添加することも
できる。

【００１８】本発明に係るモノクローナル抗体は、それ
ぞれストレプトコッカス・ミュータンス又はストレプト
コッカス・ソブリヌス検出用の歯科用診断・研究用基剤
に使用することができる。この場合、検体中のストレプ
トコッカス・ミュータンス又はストレプトコッカス・ソ
ブリヌスを検出する方法としては、一般的な抗原抗体反
応に基づく抗原の検出方法がそのまま利用できる。例え
ば、オクタロニー法，免疫電気泳動法，受身赤血球凝集
反応法，菌体凝集法，ラテックス凝集法，酵素抗体法
（enzyme-linked immunosorbent assay；以下ＥＬＩＳ
Ａと記す）等が挙げられる。簡便且つ迅速に検出するな
らば、ラテックス凝集法，イムノクロマト法，イムノコ
ンセントレーション法が適している。また、原因菌の量
を精度良く測定するならば、ＥＬＩＳＡが好ましい。

【００１９】例えば、米国特許第5,591,645号に開示さ
れている技術を応用したイムノクロマト法は、現在最も
簡便な臨床検査キットの一つと言える。しかしながら、
本発明に係るモノクローナル抗体が特異的に認識するス
トレプトコッカス・ミュータンス又はストレプトコッカ
ス・ソブリヌスの検査にこの方法を用いる場合には連鎖
球菌特有の問題があり応用が難しい。即ち、イムノクロ
マト法では抗原と結合した抗体が、ニトロセルロース等
のメンブレン中を緩衝液と共に数ｃｍもの距離を流れて
行かなければならないが、本発明に係るモノクローナル
抗体が認識するストレプトコッカス・ミュータンス又は
ストレプトコッカス・ソブリヌスは連鎖球菌であるので
長さが10μｍ以上ある場合が多く、その結果メンブレン
中を流れずに詰まってしまうわけである。これは、イム
ノクロマト法に使われるメンブレンが通常10〜50μｍの
隙間を有する多孔質体であることに由来する。一方、目
詰まりを防止するために隙間の大きなメンブレンを用い
ると、抗原がメンブレン中を速く流れすぎてしまうた
め、抗体と抗原である連鎖球菌とが接触する時間が短く
なり、感度が低下してしまうことになる。

【００２０】本発明に係るモノクローナル抗体が認識す
るストレプトコッカス・ミュータンス又はストレプトコ
ッカス・ソブリヌス菌体表層の抗原部位は適当な水溶性
界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコールモノオク
チルフェニルエーテル（商品名：TRITON X100，SIGMA社
製）や３-[(３−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニ
オ]−１−プロパンスルホナート（商品名：CHAPS，SIGM
A社製）、３−[(３−コラミドプロピル)−ジメチルアン
モニオ]−１−ヒドロキシプロパンスルホナート（商品
名：CHAPSO，SIGMA社製）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グ
ルコシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ
−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシドを含む緩衝液中で
振とうすると、簡単に抽出することができる。このよう
な方法で抽出した抗原はイムノクロマト法で用いられる
メンブレンの小さな隙間を容易に通り抜けることができ
る。

【００２１】本発明者らが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ
−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動）を用いて分子量
を推定したところ、このような抗原は１０万ＫＤａ程度
の比較的低分子量なものであった。このため、隙間の小
さなメンブレンを用いても目詰まりを発生することがな
い。隙間の小さなメンブレン中で抗原はゆっくりと流れ
るため、抗体との接触時間を充分取ることができる。こ
のためイムノクロマト法による高感度なアッセイを実現
することができる。

【００２２】ヒト被検者からの検体としては、プラー
ク，唾液等が用いられる。この検体はそのまま本発明に
係るモノクローナル抗体と反応させてもよいが、適当な
前処理を行った後、モノクローナル抗体と反応させても
よい。

【００２３】本発明に係るモノクローナル抗体は、直接
口腔内のストレプトコッカス・ミュータンス又はストレ
プトコッカス・ソブリヌスと別個に結合させて歯面やプ
ラーク中に存在する当該細菌を検出することに応用可能
である。即ち、本発明に係るモノクローナル抗体に適当
な色素，金属，酵素等を標識させておき、口腔内の歯面
に塗布すれば、ストレプトコッカス・ミュータンス若し
くはストレプトコッカス・ソブリヌス、又は両方の菌が
存在する部位を染め出すことが可能である。例えば、本
発明に係るモノクローナル抗体に蛍光色素を結合させ、
これを歯面に塗布し、一定時間経過後、水洗する。歯面
にストレプトコッカス・ミュータンス及び／又はストレ
プトコッカス・ソブリヌスが存在すれば、紫外線ランプ
を照射したとき蛍光を発することにより、表面上の存在
部位を明らかにすることができる。

【００２４】本発明に係るモノクローナル抗体が、スト
レプトコッカス・ミュータンス又はストレプトコッカス
・ソブリヌスと結合する性質を応用してこの抗体を溶解
又は分散させた適当な担体を口腔内に挿入し咬合させる
ことにより、ストレプトコッカス・ミュータンス又はス
トレプトコッカス・ソブリヌスを担体に取り込ませるこ
とができる。これによって口腔内から目的菌の除菌が可
能である。

【００２５】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明は下記実施例に制限されるものではな
い。なお、特に記述がない限り、温度は室温で操作し、
pHは20〜25℃におけるpHを示す。蛋白質濃度は415ｎｍ
の吸光度測定結果からその濃度を算出した。

【００２６】

【実施例１】（Ａ）ストレプトコッカス・ソブリヌスに
対する抗体の作製 (1) 抗原の調製 ストレプトコッカス・ソブリヌス 6715株（血清型ｇ，
以下6715株と記す）をＢＨＩ培地（Brain Heart Infusi
on培地，Difco社製）を用いて、37℃にて１日間培養す
る。培養液から遠心分離によって菌体を回収した後、Ｐ
ＢＳ（10ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水）にて２回洗浄
後、蒸留水中に分散させた。これを凍結乾燥し乾燥菌体
を得た。

【００２７】(2) 動物の免疫 この乾燥菌体を２ｍｇ／ｍｌの濃度となるように生理食
塩水に分散し、¹³⁷Cs照射によって不活化した。この液1
00μｌと生理食塩水100μｌとフロイント（Freund）の
不完全アジュバンド200μｌとを混合し、投げ込み式超
音波振動器によってホモジナイズした。この液をBALB/C
マウス（雄性，８週齢、日本ＳＬＣ社）の皮下に１匹当
り200μｌ注射した。２週間飼育後、追加免疫を行っ
た。追加免疫には前回の免疫時に使用したのと同じ菌分
散液100μｌとフロイント（Freund）の不完全アジュバ
ンド100μｌとを投げ込み式超音波振動器によってホモ
ジナイズしたものを同じくマウスの皮下に注射した。更
に２週間飼育後、最終免疫を行った。最終免疫は菌分散
液100μｌと生理食塩水400μｌとを混合し、マウス１匹
当り200μｌ使用し、皮下に注射した。

【００２８】(3) 細胞融合 眼底静脈から少量採血し、ＥＬＩＳＡによって抗体が産
生されていることを確認した後、最終免疫５日後、マウ
スの腹腔より脾臓を摘出した。この摘出した脾臓をＨＢ
ＳＳ（Hank's balanced salt solution）の入ったシャ
ーレに移し、周囲の組織をほぐし、金属メッシュでろ過
し、脾細胞浮遊液を作製した。この操作により、1.24×
10⁸個（10ｍｌ）の脾細胞を得た。この脾細胞と予め培
養しておいたマウス由来のSp2／O細胞3.36×10⁷個（３
ｍｌ、ＨＢＳＳで分散）とを50％ポリエチレングリコー
ル（商品名：PEG4000，MERCK社製）含有ＤＭＥＭ（Dulb
ecco's Modified Eagle Medium）に加え、攪拌及びタッ
ピングによって細胞融合させた。

【００２９】(4) ＨＡＴ選択，ハイブリドーマの培養 細胞融合した細胞にＨＡＴ選択培地［30％ＦＣＳ（Feta
l Calf Serum）含有ＨＹ培地（ウシ胎児血清ハイブリド
ーマ培地）にヒポキサンチン(H)，アミノプテリン(A)，
チミジン(T)を各々100μＭ，0.4μＭ，16μＭとなるよ
うに添加したもの］（この培地の作製法は、例えば、浜
田茂幸編、「う蝕と歯周病」、日本歯科評論社刊の第21
8頁参照）25ｍｌ加え、細胞数6.3×10⁶個／ｍｌに調製
した。この細胞懸濁液を96穴マルチウェルプレートに１
ウェル当り100μｌずつ分注し、炭酸ガス培養装置で培
養した。数日後、ＨＡＴ選択培地を適宜追加した。

【００３０】(5) ＥＬＩＳＡによる抗体産生細胞の選択 細胞融合後、顕微鏡で細胞のコロニーが確認できたウェ
ルについてＥＬＩＳＡを実施し、ストレプトコッカス・
ソブリヌスに対する抗体を産生しているウェルを選別し
た。選別には凍結乾燥したストレプトコッカス・ソブリ
ヌス 6715株を１ウェル当り５μｇとなるようにＰＢＳ
で希釈して加えたＥＬＩＳＡ用96穴マルチウエルプレー
ト（住友ベークライト社製、以下ＥＬＩＳＡプレートと
記す）を使用した。具体的なＥＬＩＳＡによる抗体の確
認法は以下の通りである。ストレプトコッカス・ソブリ
ヌスに対する抗体の産生が確認されたウェルは培地を順
次ＨＴ培地（30％ＦＣＳ含有ＨＹ培地に、ヒポキサンチ
ン(H)，チミジン(T)を各々100μＭ，16μＭとなるよう
に添加したもの）に置き換え、培養を続けた。

【００３１】（ＥＬＩＳＡによる抗体価の測定方法）Ｅ
ＬＩＳＡプレートを使用して行った。試薬等の量は、１
ウェルあたりの量を記した。以下に示した例では２次抗
体にアルカリフォスファターゼ標識したものを用いｐ−
ニトロフェニルりん酸２ナトリウムで発色させている。
この例では、抗体の結合性が高い程、黄色く発色する。

【００３２】１．抗原となる菌体の調製 抗体の反応性を評価するために以下の菌を培養した。Ｂ
ＨＩ培地を用いて37℃にて１〜２日間培養した。括弧内
は血清型を示す。 ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans） MT8148 (ｃ) ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans） ATCC25175 (ｃ) ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans） LM7 (ｅ) ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans） MT6229 (ｆ) ストレプトコッカス・ソブリヌス（S. sobrinus） 6715 (ｇ) ストレプトコッカス・ソブリヌス（S. sobrinus） ATCC33478 (ｄ) ストレプトコッカス・ソブリヌス（S. sobrinus） OMZ176 (ｄ) ストレプトコッカス・ソブリヌス（S. sobrinus） AHT (ｇ) ストレプトコッカス・サンギス（S. sanguis） ATCC10556 ストレプトコッカス・サリバリウス（S. salivalius） ATCC7073 ストレプトコッカス・ミテイス（S. mitis） ATCC49456 ストレプトコッカス・ラタス（S. rattus） ATCC19645 (ｂ) ストレプトコッカス・フェラス（S. ferus） ATCC33477 (ｃ) トレプトコッカス・アンギノーサス（S. anginosus） ATCC33397 ストレプトコッカス・ゴルドーニ（S. gordonii） ATCC10558 ラクトバチラス・カゼイ（L. casei） PSR1002 ポルフィロモナス・ジンジバリス（P. gingivalis） ATCC33277 エシェリキア・コーリー（E. coli） W3102 アクチノミセス・ビスコサス（A. visucosus） ATCC15987 培養液から遠心分離によって菌体を回収した後、ＰＢＳ
にて２回洗浄後、蒸留水中に分散させた。これを凍結乾
燥し乾燥菌体を得た。乾燥菌体をＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌ
となるように分散し¹³⁷Cs照射によって不活化した。

【００３３】２．抗原のコート¹³⁷ Cs照射した菌体のＰＢＳ分散液をＰＢＳで50μｇ/ｍ
ｌとなるように調製し、ＥＬＩＳＡプレートに100μｌ
ずつ分注した。37℃の乾燥器で水分を蒸発させる。

【００３４】３．ブロッキング マイクロプレートウオッシャー（商品名：MODEL 1575，
バイオラッド社製）を用いて、中性界面活性剤（商品
名：TWEEN20，SIGMA社製）0.05％濃度のＰＢＳ（以下Ｐ
ＢＳＴと記す）を１ウェル当り200μｌ用いて３回洗浄
する。その後、１％濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ，SIGMA社製）含有ＰＢＳを１ウェル当り200μｌずつ
加え、37℃１時間インキュベートした後、マイクロプレ
ートウオッシャーを用いＰＢＳＴ100μｌで３回洗浄す
る。

【００３５】４．抗体の注入 ハイブリドーマ培養上清又はＢＳＡを１％含有するＰＢ
Ｓに抗体を希釈したものを100μｌ注入し37℃で１時間
インキュベートした後、マイクロプレートウオッシャー
を用いＰＢＳＴ100μｌで３回洗浄する。

【００３６】５．２次抗体注入 アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（CE
DERLANE社製）を前記１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにて3000倍
希釈したものを100μｌ加え37℃１時間インキュベート
した後、マイクロプレートウオッシャーを用いＰＢＳＴ
100μｌで３回洗浄する。

【００３７】６．発色 ｐ−ニトロフェニルりん酸２ナトリウム６水和物0.1％
含有ジエタノールアミンバッファーを100μｌ加え37℃
で１時間放置した後、540ｎｍにて吸光度を測定した。
ジエタノールアミンバッファーは以下の処方で調製し
た。 ジエタノールアミン ４８.５ｍｌ MgCl₂・６H₂O ５０ｍｇ NaN₃ １００ｍｇ H₂O ４００ｍｌ

【００３８】（６）限界希釈法によるクローニング・細
胞樹立 ＥＬＩＳＡで高い吸光度を示したウェルから細胞を回収
し、限界希釈法によるクローニングを実施した。４週齢
BALB/Cマウスから胸腺細胞を取り出しＨＢＳＳ５ｍｌに
分散させ、¹³⁷Cs照射した。この細胞浮遊液をＨＹ培地
に１×10⁷個／ｍｌとなるように調製した。この液にＥ
ＬＩＳＡで高い吸光度を示したウェルから細胞を回収
し、培地中の細胞数が10個／ｍｌとなるように希釈し
た。この希釈液をウェルに100μｌずつ播き込んだ（計
算上、１ウェル当り播き込み細胞数が１個となる）。数
日間培養後、培養上清を100μｌずつ採取し、ＥＬＩＳ
Ａでストレプトコッカス・ミュータンス又はストレプト
コッカス・ソブリヌスにのみそれぞれ反応するウェルを
選別した。クロス反応のチェックには凍結乾燥菌体をＥ
ＬＩＳＡプレートの各ウェルに５μｇずつ播いたものを
使用した。選別したウェルの細胞をＨＹ培地で培養し、
限界希釈法によるクローニングを合計３回行い、ストレ
プトコッカス・ソブリヌスのみに反応性を示す抗体を産
生するハイブリドーマＳＳ−１を樹立した。ストレプト
コッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリ
ヌスを含む他の血清種も含めたＥＬＩＳＡによる吸光度
の結果を図１に示す。

【００３９】(7) ＳＳ−１産生抗体のアイソタイピング ハイブリドーマＳＭＳ−１の培養上清を検体として、こ
の細胞が産生する抗体のタイプをアイソタイピングキッ
ト（商品名：マウス モノＡｂ ＩＤ，ZYMED社製）を
用いて行った結果、クラスはＩｇＧ，Ｌ鎖のタイプはκ
（カッパ）であった。

【００４０】(8) ハイブリドーマの寄託 ハイブリドーマＳＳ−１は、工業技術院生命工学工業技
術研究所特許微生物寄託センターにMouse-Mouse hybrid
oma SS-1（以下、単にＳＳ−１と称する）、受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１７６１３として寄託されている。

【００４１】(9) モノクローナル抗体の精製 抗原結合アフィニティーカラムは、Affi Gel Protein A
（Bio Rad社製）を用いてプロテインＡ結合アフィニテ
ィーカラムを調製した。

【００４２】(10) マウス腹腔内でのＳＳ−１の培養、
腹水の採取 １．BALB/Cマウス（雄性，８週齢、日本ＳＬＣ社）に
２，6，10，14−テトラメチルペンタデカンをマウス１
匹当り0.５ｍｌ腹控内に投与した。 ２．３〜４週間後、ＩＭＤＭ（Iscove's Modified Dulb
ecco's Medium）＋２０％ＦＣＳで培養したＳＭＳ−１
をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳを用いて生細胞数が２×
10⁷個／ｍｌとなるような細胞懸濁液を調製した。マウ
ス１匹当り0.5ｍｌの細胞懸濁液を腹腔内に投与した。 ３．腹水の貯留が認められたマウスから、経時的に腹水
を採取した。 ４．腹水に同量のＰＢＳを添加し、1000×Ｇにて20分間
遠心分離を行い、上清を回収した。上清は直ちにプロテ
インＡ結合アフィニティーカラムによるモノクローナル
抗体の精製に使用した。精製が直ちにできない場合は−
20℃で精製操作まで保存した。

【００４３】(11) 精製モノクローナル抗体の調製 １．腹水の上清画分をプロテインＡ結合アフィニティー
カラムに通した。サンプルの固定、溶出はAffi Gel Pro
tein A（Bio Rad社製）のマニュアルに従った。フラク
ションコレクターを用い、予めトリス塩酸緩衝液(pH９)
100μｌを加えた試験管に溶出液を約14滴ずつ滴下し回
収した。 ２．上記カラムで得た画分の抗体価をストレプトコッカ
ス・ソブリヌス 6715株を抗原として固定したＥＬＩＳ
Ａプレートを用い測定した（ＥＬＩＳＡによる抗体価の
測定方法の項参照）。 ３．高い抗体価を示した画分を４℃で0.01Ｍ燐酸緩衝液
（0.15Ｍ NaCl ｐH7.4）で１晩透析を行った。精製の度
合いはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認した。精製した溶
液中のタンパク量をBCA PROTEIN ASSAY Kit（Pierce社
製）を用いて定量した結果、濃度は195μｇ/ｍｌであっ
た。この溶液はＰＢＳで3000倍に希釈してもストレプト
コッカス・ソブリヌス 6715株を抗原として固定したＥ
ＬＩＳＡプレートで酵素による発色が得られた。この抗
体をＳＳ−１抗体と称する。 ４．抗体の濃縮 精製抗体は遠心分離による限外ろ過によって濃縮した。
限外ろ過にはセントリカットU-1（倉敷紡績社製）を用
いた。タンパク濃度は1.6ｍｇ／ｍｌであった。

【００４４】（Ｂ）ストレプトコツカス・ミュータンス
に対する抗体の作製 免疫原にストレプトコッカス・ミュータンス MT8148株
を用いた他は、前述の（Ａ）に示した方法に従ってハイ
ブリドーマＭＭ−１を樹立した。このハイブリドーマ
は、工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託
センターにMouse-Mouse hybridoma MM-1（以下、単にＭ
Ｍ−１と称する）、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７６１２
として寄託されている。ハイブリドーマＭＭ−１の培養
上清を検体として、この細胞が産生する抗体のタイプを
アイソタイピングキット（商品名：マウス モノＡｂ
ＩＤ，ZYMED社製）を用いて行った結果、クラスはＩｇ
Ｇ，Ｌ鎖のタイプはκ（カッパ）であった。

【００４５】（Ａ）に示すカラムで精製を行った。スト
レプトコッカス・ミュータンス MT8148株に対する抗体
価の高かった画分を回収し、実施例１に示した方法で透
析を行った。精製した溶液中のタンパク量をBCA PROTEI
N ASSAY Kit（Pierce Chemical Company社製）を用いて
定量した結果、濃度は574μｇ/ｍｌであった。この溶液
はＰＢＳで50,000倍に希釈してもストレプトコッカス・
ミュータンス MT8148株を抗原として固定したＥＬＩＳ
Ａプレートで酵素による発色が得られた。ストレプトコ
ッカス・ソブリヌスとストレプトコッカス・ミュータン
スを含む他の血清種も含めたＥＬＩＳＡによる吸光度の
結果を図２に示す。（Ａ）に記した方法で抗体の濃縮を
行いタンパク濃度1.8ｍｇ／ｍｌのものが得られた。こ
の抗体をＭＭ−１抗体と称する。

【００４６】

【実施例２】（ＥＬＩＳＡによる診断キット）下記内容
から成るう蝕原性細菌の検出キットを作製した。 ●抗体塗布済みＥＬＩＳＡプレート（96穴） 以下の方法で作製した。 １．ＥＬＩＳＡプレートの半数のウェルに１ウェル当り
１μｇのＳＳ−１抗体及び残りのウェルに１ウェル当り
１μｇのＭＭ−１抗体を塗布し、37℃で１時間インキュ
ベートする。 ２．中性界面活性剤（商品名：TWEEN20，SIGMA社製）0.
05％含有ＰＢＳで洗浄する。 ３．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ200μｌを注入し、37℃で１
時間インキュベートする。 ４．中性界面活性剤（商品名：TWEEN20，SIGMA社製）0.
05％含有ＰＢＳで洗浄する。

【００４７】●ウサギ抗ストレプトコッカス・ミュータ
ンス血清溶液 以下の方法で作製した血清を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで10
00倍に希釈した。ストレプトコッカス・ミュータンス凍
結乾燥菌体を２ｍｇ／ｍｌとなるように生理食塩水に分
散し¹³⁷Cs照射によって不活化した。この液１ｍｌと生
理食塩水100μｌとフロイント（Freund）の完全アジュ
バンド１ｍｌを混合し、投げ込み式超音波振動器によっ
てホモジナイズした。この液をウサギ（商品名:JW，船
橋農場）の皮下に1匹当り２ｍｌ注射した。1ヶ月間飼育
後、採血を行い、遠心分離後、ウサギ１匹から33ｍｌの
抗血清を得た。

【００４８】●アルカリフォスファターゼ標識抗ウサギ
ＩｇＧ抗体溶液 以下の配合で作製した。 アルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体 （Santa Cruz Biotechnology社製） １０μｌ アジ化ナトリウム ２０ｍｇ ＰＢＳ ２０ｍｌ ●発色液 ｐ−ニトロフェニル燐酸２ナトリウム６水和物 ０．１０ｇ ジエタノールアミンバッファー １００ｍｌ ※ジエタノールアミンバッファーは以下の処方で調製した。 ジエタノールアミン ４８.５ｍｌ MgCl₂・６H₂O ５０ｍｇ NaN₃ １００ｍｇ H₂O ４００ｍｌ ●洗浄液 中性界面活性剤（商品名：TWEEN20，SIGMA社製）0.１％
含有ＰＢＳ ●菌標準液 ストレプトコッカス・ミュータンス，ストレプトコッカ
ス・ソブリヌスを培養しＰＢＳに再分散させ、¹³⁷Cs照
射によって不活化し菌標準液とする。培養液中のコロニ
ー数を別途ＭＳＢ培地にて計測し、菌標準液中のＣＦＵ
／ｍｌを計測しておく。

【００４９】以上の試薬を用い以下の方法で菌濃度を測
定した。 １．抗体塗布済みＥＬＩＳＡプレートに菌サンプル及び
菌標準液を１ウェル当り100μｌ注入し、37℃で１時間
放置し、洗浄液を１ウェル当り200μｌ注入し、３回洗
浄する。 ２．ウサギ抗ストレプトコッカス・ミュータンス血清溶
液を１ウェル当り100μｌ注入し、37℃で１時間放置
し、洗浄液を１ウェル当り200μｌ注入し、３回洗浄す
る。 ３．アルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体
溶液を１ウェル当り100μｌ注入し、37℃で１時間放置
し、洗浄液を１ウェル当り200μｌ注入し、３回洗浄す
る。 ４．発色液を１ウェル当り100μｌ注入し、37℃で１時
間放置し、540ｎｍにて吸光度を測定する。

【００５０】

【実施例３】（ストレプトコッカス・ミュータンスに対
する迅速診断キット）下記内容から成るう蝕原性細菌の
検出キットを作製した。穴のあいたビニールテープに接
したメンブレンの色調（ピンク又は無色）で菌の有無を
判定する。 ●金コロイド標識抗体液 ＭＭ−１抗体に粒径80ｎｍの金コロイドを標識した。金
コロイドは市販品（British Biocell International社
製）のものを使用した。標識抗体はＢＳＡ１％、中性界
面活性剤（商品名：TWEEN20，SIGMA社製）１％添加ＴＢ
Ｓ（Tris-Buffered Saline）で希釈した。

【００５１】●抗体塗布メンブレンアセンブリ ニトロセルロースメンブレン（商品名：SNHF，日本ミリ
ポア社製）を直径15ｍｍの円形に切り出し、２箇所に直
径３ｍｍの穴がのあいたビニールテープを貼る。各々の
穴にＢＳＡ１％ＴＢＳで希釈したウサギ抗ストレプトコ
ッカス・ミュータンスポリクローナル抗体及び抗マウス
ＩｇＧ抗体（ケミコンインターナショナル社製）を0.1
μｇ塗布し、37℃で１時間乾燥した。このメンブレンを
直径18ｍｍ，長さ30ｍｍに成形した吸水体（商品名：サ
ンファインＡＱ，旭化成工業社製）に載せる。メンブレ
ンの上には内径10ｍｍの穴のあいた厚さ15ｍｍのゴムリ
ングをのせて抗体塗布メンブレンアセンブリとした。

【００５２】ウサギ抗ストレプトコッカス・ミュータン
スポリクローナル抗体は、以下の方法で作製した。スト
レプトコッカス・ミュータンス凍結乾燥菌体を２ｍｇ／
ｍｌとなるように生理食塩水に分散し¹³⁷Cs照射によっ
て不活化した。この液１ｍｌと生理食塩水100μｌとフ
ロイント（Freund）の完全アジュバンド１ｍｌとを混合
し、投げ込み式超音波振動器によってホモジナイズし
た。この液をウサギ（商品名：JW、船橋農場）の皮下に
１匹当り２ｍｌ注射した。1ヶ月間飼育後、採血を行
い、遠心分離後、ウサギ１匹から33ｍｌの抗血清を得
た。この抗血清を実施例１の「精製モノクローナル抗体
の調製」及び「抗体の濃縮」の項と同様方法で精製し濃
縮した。

【００５３】以上の試薬，器具を用い、ストレプトコッ
カス・ミュータンス菌との反応性を比較した。試料には
培養菌（ストレプトコッカス・ミュータンス MT8148
株）を用いた。ＭＳＢ培地による培養法によって培養液
中の菌濃度を計測し、ＰＢＳで10⁶ＣＦＵ／ｍｌに調製
したものを使用した。１．培養液500μｌ、金コロイド
標識抗体液100μｌを混合し、抗体塗布メンブレンアセ
ンブリのゴムリング内にスポイトで注入する。２．数分
間して試料がすべてメンブレンを通過した後、ビニール
テープの穴の開いた部分の色調を観察した処、ウサギ抗
ストレプトコッカス・ミュータンスポリクローナル抗体
及び抗マウスＩｇＧ抗体（ケミコンインターナショナル
社製）を塗布した穴がピンク色を呈していた。ストレプ
トコッカス・ミュータンスの代わりにストレプトコッカ
ス・ミテイス，ストレプトコッカス・サリバリウス，ス
トレプトコッカス・サンギス，ストレプトコッカス・ゴ
ルドーニ，ポルフィロモナス・ジンジバリス，アクチノ
ミセス・ビスコサス，ラクトバチラス・カゼイを試料と
して注入した場合には抗マウスＩｇＧ抗体（ケミコンイ
ンターナショナル社製）を塗布した穴のみがピンク色を
呈していた。

【００５４】

【実施例４】（ストレプトコッカス・ソブリヌスに対す
る迅速診断キット）下記内容から成るう蝕原性細菌の検
出キットを作製した。穴のあいたビニールテープに接し
たメンブレンの色調（ピンク又は無色）で菌の有無を判
定する。 ●金コロイド標識抗体液 ＳＳ−１抗体に粒径40ｎｍの金コロイドを標識した。金
コロイドは市販品（British Biocell International社
製）のものを使用した。標識抗体はＢＳＡ１％、中性界
面活性剤（商品名：TWEEN20，SIGMA社製）１％添加ＴＢ
Ｓ（Tris-Buffered Saline）で希釈した。

【００５５】●抗体塗布メンブレンアセンブリ 実施例４に記したものを使用した。以上の試薬，器具を
用い、ストレプトコッカス・ソブリヌス菌との反応性を
比較した。試料には培養菌（ストレプトコッカス・ソブ
リヌス ATCC33478株）を用いた。ＭＳＢ培地による培
養法によって培養液中の菌濃度を計測し、ＰＢＳで10⁶
ＣＦＵ／ｍｌに調製したものを使用した。

【００５６】１．培養液500μｌ、金コロイド標識抗体
液100μｌを混合し、抗体塗布メンブレンアセンブリの
ゴムリング内にスポイトで注入する。 ２．数分間して試料がすべてメンブレンを通過した後、
ビニールテープの穴のあいた部分の色調を観察した処、
ウサギ抗ストレプトコッカス・ミュータンスポリクロー
ナル抗体及び抗マウスＩｇＧ抗体（ケミコンインターナ
ショナル社製）を塗布した穴がピンク色を呈していた。
ストレプトコッカス・ソブリヌスの代わりにストレプト
コッカス・ミテイス，ストレプトコッカス・サリバリウ
ス，ストレプトコッカス・サンギス，ストレプトコッカ
ス・ゴルドーニ，ポルフィロモナス・ジンジバリス，ア
クチノミセス・ビスコサス，ラクトバチラス・カゼイを
試料として注入した場合は抗マウスＩｇＧ抗体（ケミコ
ンインターナショナル社製）を塗布した穴のみがピンク
色を呈していた。

【００５７】

【実施例５】（ストレプトコッカス・ミュータンスに対
する迅速診断キット）下記内容から成るう蝕原性細菌の
検出キットを作製した。穴のあいたビニールテープに接
したメンブレンの色調（ピンク又は無色）で菌の有無を
判定する。 ●金コロイド標識抗体液 ＭＭ−１抗体に粒径８０ｎｍの金コロイドを標識した。
金コロイドは市販品（British Biocell International
社製）のものを使用した。標識抗体はＢＳＡ１％、中性
界面活性剤（商品名：TWEEN20，SIGMA社製）１％添加Ｔ
ＢＳ（Tris-Buffered Saline）で希釈した。

【００５８】●抗体塗布メンブレンアセンブリ 実施例４に記したものを使用した。 ●唾液ろ過フィルター 孔径30μｍのポリプロピレンフィルター（日本ミリポア
社製） ●唾液採取用ガム イソパラフィンを融解し10ｍｍ×10ｍｍ×10ｍｍの型に
注ぎ成形した。

【００５９】以上の試薬，器具を用い、唾液中のストレ
プトコッカス・ミュータンス菌との反応性をＭＳＢ培地
と比較した。使用方法は以下の通り。 １．被験者に唾液採取用ガムを３分間噛ませ、唾液を試
験管に採取する。採取した唾液の一部をＰＢＳにて希釈
し、ＭＳＢ培地に塗布する。２〜３日間培養した後、コ
ロニー数を計測する。 ２．唾液500μｌと金コロイド標識抗体液500μｌを混合
し試験液とする。３．唾液ろ過フィルターを通して試験
液を抗体塗布メンブレンアセンブリに注入する。 ４．抗体塗布メンブレンアセンブリの抗体塗布部分の色
を観察する。

【００６０】上記試験を二人の人間（被験者１及び２と
記す）において実施した結果を以下の表１に示す。な
お、単位として用いているＣＦＵ／ｍｌは唾液１ｍｌ当
りの細菌のコロニー数である。

【００６１】

【表１】

【００６２】

【実施例６】（ストレプトコッカス・ソブリヌスとスト
レプトコッカス・ミュータンス簡易検出キット）下記内
容から成るう蝕原性細菌の検出キットを作製した。メン
ブレンの色調（ピンク又は無色）で菌の有無を判定す
る。 ●金コロイド標識抗体液 ＳＳ−１抗体及びＭＭ−1抗体に粒径60ｎｍの金コロイ
ドを標識した。金コロイドは市販品（British Biocell
International社製）のものを使用した。標識抗体はＢ
ＳＡ１％、中性界面活性剤（商品名：TWEEN20，SIGMA社
製）１％添加ＴＢＳ（Tris-Buffered Saline）で希釈し
た。

【００６３】●抗体塗布メンブレンアセンブリ ニトロセルロースメンブレン（商品名：SNHF，日本ミリ
ポア社製）を５×40ｍｍに切り出す。このメンブレンの
端から20ｍｍの箇所にＢＳＡ１％ＴＢＳで希釈した実施
例２に記載したものと同じウサギ抗ストレプトコッカス
・ミュータンスポリクローナル抗体を塗布する。更に、
端から30ｍｍの箇所に抗マウスＩｇＧ抗体（ケミコンイ
ンターナショナル社製）をＢＳＡ１％ＴＢＳで希釈して
0.1μｇ塗布した。このメンブレンを37℃で１時間乾燥
した。このメンブレンのウサギ抗ストレプトコッカス・
ミュータンスポリクローナル抗体を塗布した側の端に30
ｍｍ四方に切り出したろ紙を六つ折にしてビニールテー
プで固定し、抗体塗布メンブレンアセンブリとした。

【００６４】●増殖培地 ＳＣＤ培地（日本製薬株式会社製）1000ｍｌにイースト
エクストラクト（DIFCO社製）0.5％、１％亜テルル酸カ
リウム１ｍｌ加えた。この培地を滅菌可能なスクリュー
栓付きバイアルに５ｍｌずつ分注し、121℃20分間オー
トクレーブ滅菌した。 ●抗原抽出液 ＰＢＳに中性界面活性剤（商品名：TRITON X100， SIGM
A社製）を５％含有させた。この液900μｌと平均粒径10
0μｍのガラスビーズ（SIGMA社製）100ｍｇを容積1.5ｍ
ｌの蓋付きプラスチックチューブに小分けし抗原抽出液
とした。

【００６５】試験方法 １．被験者の口腔内に綿棒を挿入し、唾液を採取した。 ２．綿棒をスクリュー栓付きバイアルに入れた増殖培地
に浸し唾液をぬぐう。 ３．綿棒を取り出し、バイアルに栓をして37℃の恒温器
に５時間保管した。 ４．恒温器に保管した培地を500μｌ採取し、抗原抽出
液に加え手で良く振とうする。 ５．抽出液をろ過滅菌用フイルター（商品名：マイレッ
クス−ＧＶ，日本ミリポア社製）でろ過する。 ６．ろ液50μｌを金コロイド標識抗体液100μｌと混合
する。この液に抗体塗布メンブレンアセンブリのろ紙の
ついていない一端を浸す。 ７．抗体塗布メンブレンアセンブリが液を全量吸い上げ
たところで、抗体塗布部の着色を観察する。２ヶ所の抗
体塗布部がピンク若しくは赤色を呈していた場合を陽性
とする。この方法で６人の被験者のストレプトコッカス
・ソブリヌスとストレプトコッカス・ミュータンスとの
検出を試みた。比較のため、同様にして採取された唾液
サンプルを従来法によって試験した。即ち、ＭＳＢ培地
とBeightonらによる生化学テスト（Beightonら著，「Ca
ries Research」1991年刊，第25巻の第174〜178頁参
照）を行った。結果を表２に示す。

【００６６】実施例に示した方法と従来法は同じ結果を
示した。しかしながら実施例に示した方法は１日で目的
菌の検出が可能であったが、従来法では１週間を要し
た。

【００６７】

【表２】

【００６８】

【発明の効果】以上に説明した如く、本発明に係るモノ
クローナル抗体は極めて高い反応特異性を有しており、
口腔内のう蝕原性細菌であるストレプトコッカス・ミュ
ータンス又はストレプトコッカス・ミュータンスを他の
ストレプトコッカス属の近縁種と区別して認識できるの
で、ストレプトコッカス・ミュータンス又はストレプト
コッカス・ソブリヌスの特異的検出が可能となる。その
結果、この本発明に係るモノクローナル抗体を含有させ
ることによって、ストレプトコッカス・ミュータンス又
はストレプトコッカス・ソブリヌス検出用の歯科用診断
・研究用基剤等にそれぞれ使用することができる。この
ような本発明の歯科分野に貢献する価値は非常に大きな
ものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１におけるＳＳ−1抗体のストレプトコ
ッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌ
スを含む他の血清種も含めたＥＬＩＳＡによる吸光度の
結果を示す図である。

【図２】実施例１におけるＭＭ−１抗体のストレプトコ
ッカス・ソブリヌスとストレプトコッカス・ミュータン
スを含む他の血清種も含めたＥＬＩＳＡによる吸光度の
結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 西沢 俊樹 東京都練馬区向山３丁目10番４号 Ｆターム(参考） 4B024 AA13 BA50 DA02 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA15 4B065 AA92X AB05 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 BA10 CA11 DA76 EA52 FA74

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ストレプトコッカス・ミテイス，ストレ
   プトコッカス・サリバリウス，ストレプトコッカス・サ
   ンギス，ストレプトコッカス・ゴルドーニ，ポルフィロ
   モナス・ジンジバリス，アクチノミセス・ビスコサス，
   ラクトバチラス・カゼイ及びストレプトコッカス・ソブ
   リヌスとは反応せず、ストレプトコッカス・ミュータン
   スと特異的に反応することを特徴とするモノクローナル
   抗体。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のモノクローナル抗体を
   産生する細胞。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のモノクローナル抗体を
   含有してなる歯科用診断・研究用基剤。
4. 【請求項４】 ストレプトコッカス・ミテイス，ストレ
   プトコッカス・サリバリウス，ストレプトコッカス・サ
   ンギス，ストレプトコッカス・ゴルドーニ，ポルフィロ
   モナス・ジンジバリス，アクチノミセス・ビスコサス，
   ラクトバチラス・カゼイ及びストレプトコッカス・ミュ
   ータンスとは反応せず、ストレプトコッカス・ソブリヌ
   スと特異的に反応することを特徴とするモノクローナル
   抗体。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のモノクローナル抗体を
   産生する細胞。
6. 【請求項６】 請求項４に記載のモノクローナル抗体を
   含有してなる歯科用診断・研究用基剤。
7. 【請求項７】 請求項３に記載の歯科用診断・研究用基
   剤と請求項６に記載の歯科用診断・研究用基剤とが組み
   合わされて成る歯科用診断・研究用基剤。