JPH05304990A - マイコプラズマ・ニウモニアエに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
マイコプラズマ・ニウモニアエに対するモノクローナル抗体Info
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- JPH05304990A JPH05304990A JP4278251A JP27825192A JPH05304990A JP H05304990 A JPH05304990 A JP H05304990A JP 4278251 A JP4278251 A JP 4278251A JP 27825192 A JP27825192 A JP 27825192A JP H05304990 A JPH05304990 A JP H05304990A
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- JP
- Japan
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- hybridoma
- pneumoniae
- mycoplasma
- monoclonal antibody
- antibody
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Gram-negative bacteria
- C07K16/1253—Gram-negative bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 Mycoplasma pneumoniaeに特異的で、マイコ
プラズマ属の他の種または共存する菌叢の他の病原種と
は１％もしくはそれ未満の交差反応性しか示さないモノ
クローナル抗体およびそのフラグメント、ならびに本発
明のモノクローナル抗体の製造方法に関する。さらに本
発明の抗体を産生するハイブリドーマ、その製造方法に
関する。さらにまた、サンプル中のMycoplasma pneumon
iaeの検出のための、本発明のモノクローナル抗体の使
用に関する。 【効果】 Mycoplasma pneumoniae感染の迅速かつ特異
的な診断が可能となる。
プラズマ属の他の種または共存する菌叢の他の病原種と
は１％もしくはそれ未満の交差反応性しか示さないモノ
クローナル抗体およびそのフラグメント、ならびに本発
明のモノクローナル抗体の製造方法に関する。さらに本
発明の抗体を産生するハイブリドーマ、その製造方法に
関する。さらにまた、サンプル中のMycoplasma pneumon
iaeの検出のための、本発明のモノクローナル抗体の使
用に関する。 【効果】 Mycoplasma pneumoniae感染の迅速かつ特異
的な診断が可能となる。
Description
【０００１】本発明は、Mycoplasma pneumoniae（マイ
コプラズマ・ニウモニアエ）に特異的でマイコプラズマ
属の他の種または共存する菌叢の他の病原種と１％また
はそれ未満の交差反応性しか示さないモノクローナル抗
体およびそれらのフラグメントならびに本発明のモノク
ローナル抗体の製造方法に関する。本発明はさらに、本
発明の抗体を産生するハイブリドーマ、およびそれらの
製造方法に関する。最後に、本発明は、サンプル中のMy
coplasma pneumoniaeを検出するための本発明のモノク
ローナル抗体の使用に関する。
コプラズマ・ニウモニアエ）に特異的でマイコプラズマ
属の他の種または共存する菌叢の他の病原種と１％また
はそれ未満の交差反応性しか示さないモノクローナル抗
体およびそれらのフラグメントならびに本発明のモノク
ローナル抗体の製造方法に関する。本発明はさらに、本
発明の抗体を産生するハイブリドーマ、およびそれらの
製造方法に関する。最後に、本発明は、サンプル中のMy
coplasma pneumoniaeを検出するための本発明のモノク
ローナル抗体の使用に関する。
【０００２】Mycoplasma pneumoniae（M. pneumoniae）
は、上気道および気道下部の疾患の原因になる。M. pne
umoniaeはウイルスとは異なり、抗生物質に感受性であ
るから、迅速に診断されればかなりの治療結果が得られ
る。しかしながら、類似の徴候および病状をもつウイル
スまた細菌感染からのM. pneumoniae感染の信頼できる
鑑別はこれまで不可能であった。M. pneumoniaeを決定
するための臨床検査的診断方法も同様に、現在まで満足
すべきものではなかった。病原体の培養による検出も、
厳密な培地上でのきわめて長期間（１〜２週）の生育を
要するために、確認的な価値しかない。大部分の場合、
現時点では診断は血清学的方法によって行われる。最も
一般的に用いられている試験、補体結合試験（ＣＦＴ）
はM. pneumoniaeからの糖脂質抽出物を抗原として使用
する。しかしながら、これらの糖脂質に対する抗体は、
細菌（Streptococcus MG intermedicus）および植物脂
質の両者またはヒト細胞成分と交差反応を示し、したが
って偽陽性反応を与える。このタイプの偽陽性ＣＦＴ反
応はとくに、細胞溶解反応に関連する疾患、たとえば膵
炎、髄膜炎および心臓炎で報告されている。他の利用で
きる試験法も、時間がかかりすぎる(たとえば免疫蛍光
法)、特別の臨床検査室でのみ使用できる（接着性阻止
試験）またはＣＦＴと同程度の低い特異性しか示さない
(M. pneumoniae総抽出物のＥＬＩＳＡ）ことから、M. p
neumoniaeの日常的手順での検出には不適当である。
は、上気道および気道下部の疾患の原因になる。M. pne
umoniaeはウイルスとは異なり、抗生物質に感受性であ
るから、迅速に診断されればかなりの治療結果が得られ
る。しかしながら、類似の徴候および病状をもつウイル
スまた細菌感染からのM. pneumoniae感染の信頼できる
鑑別はこれまで不可能であった。M. pneumoniaeを決定
するための臨床検査的診断方法も同様に、現在まで満足
すべきものではなかった。病原体の培養による検出も、
厳密な培地上でのきわめて長期間（１〜２週）の生育を
要するために、確認的な価値しかない。大部分の場合、
現時点では診断は血清学的方法によって行われる。最も
一般的に用いられている試験、補体結合試験（ＣＦＴ）
はM. pneumoniaeからの糖脂質抽出物を抗原として使用
する。しかしながら、これらの糖脂質に対する抗体は、
細菌（Streptococcus MG intermedicus）および植物脂
質の両者またはヒト細胞成分と交差反応を示し、したが
って偽陽性反応を与える。このタイプの偽陽性ＣＦＴ反
応はとくに、細胞溶解反応に関連する疾患、たとえば膵
炎、髄膜炎および心臓炎で報告されている。他の利用で
きる試験法も、時間がかかりすぎる(たとえば免疫蛍光
法)、特別の臨床検査室でのみ使用できる（接着性阻止
試験）またはＣＦＴと同程度の低い特異性しか示さない
(M. pneumoniae総抽出物のＥＬＩＳＡ）ことから、M. p
neumoniaeの日常的手順での検出には不適当である。
【０００３】M. pneumoniaeの各種蛋白質に対するモノ
クローナル抗体の産生については、いくつかの刊行物に
記載されている。
クローナル抗体の産生については、いくつかの刊行物に
記載されている。
【０００４】M. pneumoniaeの赤血球への結合を阻害す
ることができる、Ｐ１蛋白質（接着蛋白質(adhesin)ま
たは１６８kd蛋白質)に対するモノクローナル抗体が確
立されている〔B. Gerstenecker & E. Jacobs, J. Gen.
Microb. 136 (1990) 471〕。
ることができる、Ｐ１蛋白質（接着蛋白質(adhesin)ま
たは１６８kd蛋白質)に対するモノクローナル抗体が確
立されている〔B. Gerstenecker & E. Jacobs, J. Gen.
Microb. 136 (1990) 471〕。
【０００５】E. Jacobsらによる刊行物〔Diagnostik vo
n Infektionskrankheiten, Publisher: Projekttraeger
schaft Forschung im Dienste der Gesundheit in der
Deutschen Forschungs-und Versuchsanstalt fuer Luft
-und Raumfahrt e. V., 第１巻（1987), 84頁〕には、
接着蛋白質に対する２種のモノクローナル抗体が記載さ
れている。いずれも（ｍｏＡＫ １４ Ｃ１１，ｍｏＡＫ
１１ Ｇ７）M. pneumoniaeとはドット−ブロット法で
のみ反応し、他の免疫測法では反応しない。しかも、ｍ
ｏＡＫ １４ Ｃ１１はM. salivariumおよびM. genitali
umと交差反応性を示し、ｍｏＡＫ １１ Ｇ７はたとえば
Branhamella catarrhalisと交差反応性を示す（表１参
照）。
n Infektionskrankheiten, Publisher: Projekttraeger
schaft Forschung im Dienste der Gesundheit in der
Deutschen Forschungs-und Versuchsanstalt fuer Luft
-und Raumfahrt e. V., 第１巻（1987), 84頁〕には、
接着蛋白質に対する２種のモノクローナル抗体が記載さ
れている。いずれも（ｍｏＡＫ １４ Ｃ１１，ｍｏＡＫ
１１ Ｇ７）M. pneumoniaeとはドット−ブロット法で
のみ反応し、他の免疫測法では反応しない。しかも、ｍ
ｏＡＫ １４ Ｃ１１はM. salivariumおよびM. genitali
umと交差反応性を示し、ｍｏＡＫ １１ Ｇ７はたとえば
Branhamella catarrhalisと交差反応性を示す（表１参
照）。
【０００６】確立された方法がモノクローナル抗体の製
造に利用できるが、もっぱら特定の有利な性質を有する
ハイブリドーマ細胞系の産生および選択にはなお、かな
りの困難を伴うことが多い。
造に利用できるが、もっぱら特定の有利な性質を有する
ハイブリドーマ細胞系の産生および選択にはなお、かな
りの困難を伴うことが多い。
【０００７】すなわち、上に引用した研究では、マイコ
プラズマ属の種の１種もしくは２種以上、または共存す
る菌叢中の他の病原種、たとえば検討すべき生物学的サ
ンプル中のH. influenzae、N. meningitidis、S. pneum
oniaeまたはP. aeruginosaと交差反応するモノクローナ
ル抗体が示されている。この交差反応性は排除されなか
ったかまたはある試験条件下でのみ試験されている。
プラズマ属の種の１種もしくは２種以上、または共存す
る菌叢中の他の病原種、たとえば検討すべき生物学的サ
ンプル中のH. influenzae、N. meningitidis、S. pneum
oniaeまたはP. aeruginosaと交差反応するモノクローナ
ル抗体が示されている。この交差反応性は排除されなか
ったかまたはある試験条件下でのみ試験されている。
【０００８】したがって、本発明は、Mycoplasma pneum
oniaeと反応するが、他のマイコプラズマ属の種および
共存する菌叢の他の上述の病原種との交差反応性を本質
的に示さない単一特異性抗体の製造の技術上の問題に基
づくものであった。この技術的問題の解決は特許請求の
範囲に定義された実施態様によって達成される。
oniaeと反応するが、他のマイコプラズマ属の種および
共存する菌叢の他の上述の病原種との交差反応性を本質
的に示さない単一特異性抗体の製造の技術上の問題に基
づくものであった。この技術的問題の解決は特許請求の
範囲に定義された実施態様によって達成される。
【０００９】すなわち、本発明は、M. pneumoniaeに特
異的で、マイコプラズマ属の他の種とは１％またはそれ
未満の交差反応性しか示さない抗体およびそのフラグメ
ントに関する。
異的で、マイコプラズマ属の他の種とは１％またはそれ
未満の交差反応性しか示さない抗体およびそのフラグメ
ントに関する。
【００１０】「フラグメント」の語は、それ自体は本技
術分野の熟練者によく知られている免疫反応性抗体フラ
グメントを意味する。これらのフラグメント中では、Ｆ
（ａｂ′)2フラグメントが好ましい。
術分野の熟練者によく知られている免疫反応性抗体フラ
グメントを意味する。これらのフラグメント中では、Ｆ
（ａｂ′)2フラグメントが好ましい。
【００１１】好ましい実施態様においては、本発明のモ
ノクローナル抗体およびそのフラグメントは、共存する
菌叢の他の病原種と１％またはそれ未満の交差反応性し
か示さない。「共存する菌叢」の語は、同時に生体内の
同一部位に存在することがある１種または２種以上の病
原性または非病原性微生物を意味する。本発明のモノク
ローナル抗体は、たとえば半モノクローナル固相サンド
イッチ検定において、これらの有利な特異性を発揮す
る。半モノクローナル固相サンドイッチアッセイとは、
固相に結合され、抗原たとえばMycoplasma pneumoniae
の蛋白質に結合するたとえばポリクローナル捕捉抗体
と、続く指示反応によって結合抗原を検出するたとえば
モノクローナル検出抗体を使用するアッセイを意味す
る。このタイプの半モノクローナル固相サンドイッチア
ッセイの例には、抗原ＥＬＩＳＡ（捕獲ＥＬＩＳＡ）お
よびＰＩ ＥＬＩＳＡがある。本発明におけるモノクロ
ーナル抗体は、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく知
られている各種の方法、たとえばイムノブロット、細胞
ＥＬＩＳＡ、沈降法、間接ＥＬＩＳＡにおいてさらにM.
pneumoniaeを検出するために使用できる。
ノクローナル抗体およびそのフラグメントは、共存する
菌叢の他の病原種と１％またはそれ未満の交差反応性し
か示さない。「共存する菌叢」の語は、同時に生体内の
同一部位に存在することがある１種または２種以上の病
原性または非病原性微生物を意味する。本発明のモノク
ローナル抗体は、たとえば半モノクローナル固相サンド
イッチ検定において、これらの有利な特異性を発揮す
る。半モノクローナル固相サンドイッチアッセイとは、
固相に結合され、抗原たとえばMycoplasma pneumoniae
の蛋白質に結合するたとえばポリクローナル捕捉抗体
と、続く指示反応によって結合抗原を検出するたとえば
モノクローナル検出抗体を使用するアッセイを意味す
る。このタイプの半モノクローナル固相サンドイッチア
ッセイの例には、抗原ＥＬＩＳＡ（捕獲ＥＬＩＳＡ）お
よびＰＩ ＥＬＩＳＡがある。本発明におけるモノクロ
ーナル抗体は、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく知
られている各種の方法、たとえばイムノブロット、細胞
ＥＬＩＳＡ、沈降法、間接ＥＬＩＳＡにおいてさらにM.
pneumoniaeを検出するために使用できる。
【００１２】とくに好ましい実施態様においては、本発
明のモノクローナル抗体およびそのフラグメントは、My
coplasma pneumoniaeのＰ１蛋白質に特異的である。Ｐ
１蛋白質も本技術分野の熟練者には接着蛋白質または１
６８kd蛋白質として知られている。
明のモノクローナル抗体およびそのフラグメントは、My
coplasma pneumoniaeのＰ１蛋白質に特異的である。Ｐ
１蛋白質も本技術分野の熟練者には接着蛋白質または１
６８kd蛋白質として知られている。
【００１３】他の好ましい実施態様においては、本発明
のモノクローナル抗体またはそのフラグメントのＨ鎖は
γ１サブクラスに属し、Ｌ鎖はκクラスに属する。
のモノクローナル抗体またはそのフラグメントのＨ鎖は
γ１サブクラスに属し、Ｌ鎖はκクラスに属する。
【００１４】他の好ましい実施態様においては、Ｈ鎖は
γ３サブクラスに属し、Ｌ鎖はκクラスに属する。
γ３サブクラスに属し、Ｌ鎖はκクラスに属する。
【００１５】免疫グロブリンクラスおよびサブクラス
は、それ自体本技術分野の熟練者によく知られた方法で
決定される。本発明の抗体はさらに、それ自体公知の方
法により、たとえばそれらの電気泳動集束パターンまた
はそれらの親和性定数によって特性づけることができ
る。
は、それ自体本技術分野の熟練者によく知られた方法で
決定される。本発明の抗体はさらに、それ自体公知の方
法により、たとえばそれらの電気泳動集束パターンまた
はそれらの親和性定数によって特性づけることができ
る。
【００１６】本発明はさらに、本発明のモノクローナル
抗体のひとつを産生するハイブリドーマに関する。本発
明のハイブリドーマの好ましい実施態様においては、融
合に使用される脾臓細胞はＢＡＬＢ／ｃマウスから誘導
される。本発明のハイブリドーマの他の好ましい実施態
様においては、融合に使用される骨髄腫細胞はＸ６３／
Ａｇ ８.６５３である。
抗体のひとつを産生するハイブリドーマに関する。本発
明のハイブリドーマの好ましい実施態様においては、融
合に使用される脾臓細胞はＢＡＬＢ／ｃマウスから誘導
される。本発明のハイブリドーマの他の好ましい実施態
様においては、融合に使用される骨髄腫細胞はＸ６３／
Ａｇ ８.６５３である。
【００１７】本発明はさらに、ハイブリドーマ系Ｍ５７
に関する。本発明はさらに、ハイブリドーマ系Ｍ７４に
関する。本発明はさらに、ハイブリドーマ系Ｐ１.２５
に関する。本発明はさらに、ハイブリドーマ系Ｐ１.２
７に関する。本発明はさらに、ハイブリドーマ系Ｍ７５
に関する。
に関する。本発明はさらに、ハイブリドーマ系Ｍ７４に
関する。本発明はさらに、ハイブリドーマ系Ｐ１.２５
に関する。本発明はさらに、ハイブリドーマ系Ｐ１.２
７に関する。本発明はさらに、ハイブリドーマ系Ｍ７５
に関する。
【００１８】これらのハイブリドーマは、系Ｘ６３／Ａ
ｇ ８.６５３の骨髄腫細胞と、Ｍ．ｐｎ細胞（融合Ｍ）
または精製Ｐ１蛋白質（融合Ｐ１）のいずれかで免疫感
作されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞が用いられる２
つの異なる融合に由来するものである。５つのハイブリ
ドーマ系はすべて、細胞培養において１年間、一つの特
異性を有する安定な抗体を分泌している。５つのすべて
のハイブリドーマによって分泌される抗体はＰ１蛋白質
に特異的であり、これらの抗体はいずれも他のマイコプ
ラズマ種たとえばM. genitalium、M. honinis、M. ferm
entans、M. salivariumまたはM. Oraleと有意な交差反
応を示さない。これらのマイコプラズマ種は、M. pneum
oniaeとともに夾雑する菌叢中に存在することがあり、
現在の技術水準においてはM. pneumoniaeの明確な診断
を妨害する。
ｇ ８.６５３の骨髄腫細胞と、Ｍ．ｐｎ細胞（融合Ｍ）
または精製Ｐ１蛋白質（融合Ｐ１）のいずれかで免疫感
作されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞が用いられる２
つの異なる融合に由来するものである。５つのハイブリ
ドーマ系はすべて、細胞培養において１年間、一つの特
異性を有する安定な抗体を分泌している。５つのすべて
のハイブリドーマによって分泌される抗体はＰ１蛋白質
に特異的であり、これらの抗体はいずれも他のマイコプ
ラズマ種たとえばM. genitalium、M. honinis、M. ferm
entans、M. salivariumまたはM. Oraleと有意な交差反
応を示さない。これらのマイコプラズマ種は、M. pneum
oniaeとともに夾雑する菌叢中に存在することがあり、
現在の技術水準においてはM. pneumoniaeの明確な診断
を妨害する。
【００１９】これらのハイブリドーマは、１９９１年４
月１１日および１９９１年５月２４日付で、PHLS Cente
r for Applied Microbiology & Research, Porton Dow
n, Solisbury, Wilts. SP4 OJG, Englandに、受付番号
９１０４１０１０(Ｍ５７)、９１０４１０１１（Ｍ７
４）、９１０４１０１２（Ｐ１.２５）、９１０４１０
１３（Ｐ１.２７）および９１０５２３１０（Ｍ７５）
として寄託された。
月１１日および１９９１年５月２４日付で、PHLS Cente
r for Applied Microbiology & Research, Porton Dow
n, Solisbury, Wilts. SP4 OJG, Englandに、受付番号
９１０４１０１０(Ｍ５７)、９１０４１０１１（Ｍ７
４）、９１０４１０１２（Ｐ１.２５）、９１０４１０
１３（Ｐ１.２７）および９１０５２３１０（Ｍ７５）
として寄託された。
【００２０】本発明はさらに、本発明のモノクローナル
抗体少なくとも１種を含有する、サンプル中のMycoplas
ma pneumoniaeを検出するためのキットに関する。本発
明のキットは、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく知
られた免疫化学的不均一または均一測定法に基づくもの
であることが好ましい。均一測定法の場合は、粒子増強
比濁法の使用が好ましい。
抗体少なくとも１種を含有する、サンプル中のMycoplas
ma pneumoniaeを検出するためのキットに関する。本発
明のキットは、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく知
られた免疫化学的不均一または均一測定法に基づくもの
であることが好ましい。均一測定法の場合は、粒子増強
比濁法の使用が好ましい。
【００２１】本発明のキットのとくに好ましい態様にお
いては、M. pneumoniaeは固相免疫測定系によって検出
される。固相免疫測定系には不均一イムノアッセイの使
用が好ましい。不均一イムノアッセイの例としては、固
相は好ましくはポリスチレンチューブ、マイクロタイタ
ープレート、ラテックス粒子、磁化粒子またはシート様
固相である固相結合サンドイッチアッセイを挙げること
ができる。
いては、M. pneumoniaeは固相免疫測定系によって検出
される。固相免疫測定系には不均一イムノアッセイの使
用が好ましい。不均一イムノアッセイの例としては、固
相は好ましくはポリスチレンチューブ、マイクロタイタ
ープレート、ラテックス粒子、磁化粒子またはシート様
固相である固相結合サンドイッチアッセイを挙げること
ができる。
【００２２】本発明はさらに、（ａ） マウスをMycopl
asma pneumoniae細胞またはMycoplasma pneumoniaeのＰ
１蛋白質で免疫感作し、（ｂ） 免疫感作マウスからの
脾臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合させ、ついで（ｃ）
工程(ｂ)で得られたハイブリドーマを、M. pneumonia
eに対して特異的でマイコプラズマ属の他の種とは１ま
たはそれ未満の交差反応性しか示さない抗体の分泌につ
いて選択することを特徴とする本発明のハイブリドーマ
の製造方法に関する。
asma pneumoniae細胞またはMycoplasma pneumoniaeのＰ
１蛋白質で免疫感作し、（ｂ） 免疫感作マウスからの
脾臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合させ、ついで（ｃ）
工程(ｂ)で得られたハイブリドーマを、M. pneumonia
eに対して特異的でマイコプラズマ属の他の種とは１ま
たはそれ未満の交差反応性しか示さない抗体の分泌につ
いて選択することを特徴とする本発明のハイブリドーマ
の製造方法に関する。
【００２３】本発明はさらに、（ａ） マウスをMycopl
asma pneumoniae細胞またはMycoplasma pneumoniaeのＰ
１蛋白質で免疫感作し、（ｂ） 免疫感作マウスからの
脾臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合させ、（ｃ） 工程
(ｂ)で得られたハイブリドーマを、M. pneumoniaeに対
して特異的でマイコプラズマ属の他の種とは１またはそ
れ未満の交差反応性しか示さない抗体の分泌について選
択し、ついで（ｄ） 工程(ｃ)で得られたハイブリドー
マを、共存する菌叢の他の病原種とは１％またはそれ未
満の交差反応性しか示さない抗体の分泌について選択す
ることを特徴とする本発明のハイブリドーマの製造方法
に関する。
asma pneumoniae細胞またはMycoplasma pneumoniaeのＰ
１蛋白質で免疫感作し、（ｂ） 免疫感作マウスからの
脾臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合させ、（ｃ） 工程
(ｂ)で得られたハイブリドーマを、M. pneumoniaeに対
して特異的でマイコプラズマ属の他の種とは１またはそ
れ未満の交差反応性しか示さない抗体の分泌について選
択し、ついで（ｄ） 工程(ｃ)で得られたハイブリドー
マを、共存する菌叢の他の病原種とは１％またはそれ未
満の交差反応性しか示さない抗体の分泌について選択す
ることを特徴とする本発明のハイブリドーマの製造方法
に関する。
【００２４】本発明のハイブリドーマは、マウスを適当
な免疫原(M. pneumoniaeまたはＰ１蛋白質）により、そ
れ自体公知の方法(たとえば、Harlow & Lane; “Antibo
dies", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, 1988, 参照）で免疫感作することによって製造
される。
な免疫原(M. pneumoniaeまたはＰ１蛋白質）により、そ
れ自体公知の方法(たとえば、Harlow & Lane; “Antibo
dies", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, 1988, 参照）で免疫感作することによって製造
される。
【００２５】好ましい実施態様においては、免疫感作に
用いられるマウスはＢＡＬＢ／ｃマウスである。免疫感
作は少なくとも１週間間隔で実施される。マウスは少な
くとも２回免疫感作されるのが好ましく、最終の免疫感
作は静脈内および／または腹腔内に行われるのが好まし
い。各免疫感作後に抗体力価をチェックする。このため
には、免疫原の注射後３〜５日に、マウスから血液サン
プルを採取し、これからそれ自体公知の方法で血清を得
て、M. pneumoniaeまたはＰ１特異的抗体の力価を試験
する。力価が十分高い場合には、マウスを屠殺し、脾臓
を摘出し、各脾臓細胞を滅菌条件下に組織から分離させ
る。脾臓細胞を１回もしくは２回以上洗浄し、ついでマ
ウス骨髄腫細胞系と融合させる。
用いられるマウスはＢＡＬＢ／ｃマウスである。免疫感
作は少なくとも１週間間隔で実施される。マウスは少な
くとも２回免疫感作されるのが好ましく、最終の免疫感
作は静脈内および／または腹腔内に行われるのが好まし
い。各免疫感作後に抗体力価をチェックする。このため
には、免疫原の注射後３〜５日に、マウスから血液サン
プルを採取し、これからそれ自体公知の方法で血清を得
て、M. pneumoniaeまたはＰ１特異的抗体の力価を試験
する。力価が十分高い場合には、マウスを屠殺し、脾臓
を摘出し、各脾臓細胞を滅菌条件下に組織から分離させ
る。脾臓細胞を１回もしくは２回以上洗浄し、ついでマ
ウス骨髄腫細胞系と融合させる。
【００２６】好ましい実施態様において融合に用いられ
る骨髄腫細胞系はＸ６３／Ａｇ ８.６５３である。脾臓
細胞と骨髄腫細胞は２：１〜１０：１の比で融合に使用
するのが好ましい。融合プロモーターとしては好ましく
はポリエチレングリコールが使用される。しかしなが
ら、他の融合プロモーター、たとえばセンダイウイスル
も利用できる。
る骨髄腫細胞系はＸ６３／Ａｇ ８.６５３である。脾臓
細胞と骨髄腫細胞は２：１〜１０：１の比で融合に使用
するのが好ましい。融合プロモーターとしては好ましく
はポリエチレングリコールが使用される。しかしなが
ら、他の融合プロモーター、たとえばセンダイウイスル
も利用できる。
【００２７】融合後、細胞をマイクロタイタープレート
好ましくは９６ウエルのプレート上に接種する。ハイブ
リドーマの増殖を促進する因子、たとえばインターロイ
キン６を分泌する同遺伝子型または類似遺伝子型マウス
からのマクロファージまたは胸腺細胞を、マイクロタイ
タープレートに、好ましくは前日に添加する。
好ましくは９６ウエルのプレート上に接種する。ハイブ
リドーマの増殖を促進する因子、たとえばインターロイ
キン６を分泌する同遺伝子型または類似遺伝子型マウス
からのマクロファージまたは胸腺細胞を、マイクロタイ
タープレートに、好ましくは前日に添加する。
【００２８】用いられる生育培地は選択培地、好ましく
はＨＡＴ培地である。脾臓細胞は細胞培養では限られた
生存能しか示さず、数回の細胞分裂後に死滅する。融合
パートナーとして選択された骨髄腫細胞系は、ヌクレオ
チド合成に関与する酵素（たとえばヒポキサンチン−グ
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）を欠き、し
たがってＨＡＴ培地中では生存できない。脾臓細胞から
の完全な酵素的装備と、骨髄腫細胞からの細胞培養にお
ける無限の増殖能を亨受したハイブリドーマのみが選択
培地中で生存する。
はＨＡＴ培地である。脾臓細胞は細胞培養では限られた
生存能しか示さず、数回の細胞分裂後に死滅する。融合
パートナーとして選択された骨髄腫細胞系は、ヌクレオ
チド合成に関与する酵素（たとえばヒポキサンチン−グ
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）を欠き、し
たがってＨＡＴ培地中では生存できない。脾臓細胞から
の完全な酵素的装備と、骨髄腫細胞からの細胞培養にお
ける無限の増殖能を亨受したハイブリドーマのみが選択
培地中で生存する。
【００２９】マイクロタイタープレートのウエルを１〜
２週後に、ハイブリドーマの生育について調べる。つい
で、ハイブリドーマ陽性ウエル中の生育培地について、
所望の性質を有する抗体の存在を試験する。この場合の
試験系は通常、免疫原または抗原の性質を対象とするも
のである。
２週後に、ハイブリドーマの生育について調べる。つい
で、ハイブリドーマ陽性ウエル中の生育培地について、
所望の性質を有する抗体の存在を試験する。この場合の
試験系は通常、免疫原または抗原の性質を対象とするも
のである。
【００３０】所望の性質をもつ抗体を分泌するハイブリ
ドーマを少なくとも１回、限界希釈法でサブクローニン
グして、クローナリティーを確認する。細胞は通常、統
計的観点からウエルあたり０.５〜３個の細胞が存在す
るまで希釈する。さらに、サブクローニング法は、安定
な性質をもつハイブリドーマの製造にも有効なことが明
らかにされている。ハイブリドーマの製造方法について
は、例えばHarlow & Lane、前出；Melchers, Potter &
Warner編“Lymphocyte Hybridomas", Springer-Verlag,
Berlin 1979およびJ.H. Peters & H. Baumgarten, Mon
oclonale Antikoerper, Herstellung und Charakterisi
erung（モノクローナル抗体、製造と性質）、Springer-
Verlag, Berlin 1990に詳細に記載されている。
ドーマを少なくとも１回、限界希釈法でサブクローニン
グして、クローナリティーを確認する。細胞は通常、統
計的観点からウエルあたり０.５〜３個の細胞が存在す
るまで希釈する。さらに、サブクローニング法は、安定
な性質をもつハイブリドーマの製造にも有効なことが明
らかにされている。ハイブリドーマの製造方法について
は、例えばHarlow & Lane、前出；Melchers, Potter &
Warner編“Lymphocyte Hybridomas", Springer-Verlag,
Berlin 1979およびJ.H. Peters & H. Baumgarten, Mon
oclonale Antikoerper, Herstellung und Charakterisi
erung（モノクローナル抗体、製造と性質）、Springer-
Verlag, Berlin 1990に詳細に記載されている。
【００３１】本発明はさらに、本発明のハイブリドーマ
を（ａ） in vitroで培養し、ついで（ｂ） その培養
培地からモノクローナル抗体を得ることを特徴とする本
発明のモノクローナル抗体の製造に関する。
を（ａ） in vitroで培養し、ついで（ｂ） その培養
培地からモノクローナル抗体を得ることを特徴とする本
発明のモノクローナル抗体の製造に関する。
【００３２】本発明はさらに、本発明のハイブリドーマ
を（ａ） 同遺伝子型または類似遺伝子型マウスの腹腔
内、in vitroで培養し、ついで（ｂ） 腹水からモノク
ローナル抗体を得ることを特徴とする本発明のモノクロ
ーナル抗体の製造に関する。
を（ａ） 同遺伝子型または類似遺伝子型マウスの腹腔
内、in vitroで培養し、ついで（ｂ） 腹水からモノク
ローナル抗体を得ることを特徴とする本発明のモノクロ
ーナル抗体の製造に関する。
【００３３】本発明のモノクローナル抗体は大量に、本
技術分野の熟練者にはそれ自体よく知られた方法で、本
発明のハイブリドーマのin vitro細胞培養ついで上清か
らの精製および取得、またはハイブリドーマの同遺伝子
型もしくは類似遺伝子型マウス腹腔内でのin vivo培養
ついで腹水からの抗体の精製によって得ることができる
（Harlow & Lane, 前出参照）。
技術分野の熟練者にはそれ自体よく知られた方法で、本
発明のハイブリドーマのin vitro細胞培養ついで上清か
らの精製および取得、またはハイブリドーマの同遺伝子
型もしくは類似遺伝子型マウス腹腔内でのin vivo培養
ついで腹水からの抗体の精製によって得ることができる
（Harlow & Lane, 前出参照）。
【００３４】本発明はさらに、サンプル中のMycoplasma
pneumoniaeの検出のための、本発明のモノクローナル
抗体の使用に関する。
pneumoniaeの検出のための、本発明のモノクローナル
抗体の使用に関する。
【００３５】本発明のモノクローナル抗体は、診断方法
の範囲内で使用することができ、この場合、M. pneumon
iae抗原に対する特異的結合パートナーとして少なくと
も１種の抗体が用いられる。第二の特異的結合パートナ
ーは、他の抗体もしくは抗体フラグメント、レクチンま
たは受容体とすることができる。本発明のモノクローナ
ル抗体は、診断方法において好ましくは一段階アッセイ
で用いられるのが好ましい。この場合、第二の特異的結
合パートナーも本発明のモノクローナル抗体で、第一の
特異的結合パートナーとは異なるエピトープを認識す
る。
の範囲内で使用することができ、この場合、M. pneumon
iae抗原に対する特異的結合パートナーとして少なくと
も１種の抗体が用いられる。第二の特異的結合パートナ
ーは、他の抗体もしくは抗体フラグメント、レクチンま
たは受容体とすることができる。本発明のモノクローナ
ル抗体は、診断方法において好ましくは一段階アッセイ
で用いられるのが好ましい。この場合、第二の特異的結
合パートナーも本発明のモノクローナル抗体で、第一の
特異的結合パートナーとは異なるエピトープを認識す
る。
【００３６】この場合の検出および定量は、一方の特異
的結合パートナーに検出可能な標識を保持させることに
よって可能になる。これらの標識は本技術分野の熟練者
にはそれ自体よく知られていて、たとえば、発色原、発
光原、蛍光原、酵素、放射性同位元素または着色もしく
は無着色の粒子とすることができる。
的結合パートナーに検出可能な標識を保持させることに
よって可能になる。これらの標識は本技術分野の熟練者
にはそれ自体よく知られていて、たとえば、発色原、発
光原、蛍光原、酵素、放射性同位元素または着色もしく
は無着色の粒子とすることができる。
【００３７】抗体でコートされた固相を製造するための
好ましい方法は、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく
知られている方法で、直接または間接に、たとえば固相
にカップリングした他の抗体もしくはビオチン−アビジ
ン橋を介して非標識特異的結合パートナーを結合させる
方法である。
好ましい方法は、本技術分野の熟練者にはそれ自体よく
知られている方法で、直接または間接に、たとえば固相
にカップリングした他の抗体もしくはビオチン−アビジ
ン橋を介して非標識特異的結合パートナーを結合させる
方法である。
【００３８】以下の実施例は本発明を例示するものであ
る。 実施例１半モノクローナル二重サンドイッチ試験 Ａ． 捕捉抗体の製造 ウサギ（German GiantとLarge Chinchillaの交配）を、
T.W. Kokら; Epidem.Inf. 101 (1988), 669の記載に従
い、M. pneumoniae蛋白質０.５mgで免疫感作した。免疫
血清のＩｇＧ分画をゲル透過クロマトグラフィーで精製
した。このためには、血清を、５０mM tris／ＨＣｌ（p
H８.０）で平衡化したSephacrylR Ｓ−３００スーパー
ファインカラム（Pharmacia）上に負荷し、ＩｇＧ分画
を５００mM ＮａＣｌで溶出した。
る。 実施例１半モノクローナル二重サンドイッチ試験 Ａ． 捕捉抗体の製造 ウサギ（German GiantとLarge Chinchillaの交配）を、
T.W. Kokら; Epidem.Inf. 101 (1988), 669の記載に従
い、M. pneumoniae蛋白質０.５mgで免疫感作した。免疫
血清のＩｇＧ分画をゲル透過クロマトグラフィーで精製
した。このためには、血清を、５０mM tris／ＨＣｌ（p
H８.０）で平衡化したSephacrylR Ｓ−３００スーパー
ファインカラム（Pharmacia）上に負荷し、ＩｇＧ分画
を５００mM ＮａＣｌで溶出した。
【００３９】Ｂ． マイクロタイタープレートのウサギ
抗体によるコーティング ＮＵＮＣ（Roskilde, Denmark）製の９６ウエル付きマ
イクロタイタープレートを、欧州特許出願８９１０３４
７８号の記載に従い、精製ウサギ抗−M. pneumoniae抗
体（上記Ａ参照）でコートした。
抗体によるコーティング ＮＵＮＣ（Roskilde, Denmark）製の９６ウエル付きマ
イクロタイタープレートを、欧州特許出願８９１０３４
７８号の記載に従い、精製ウサギ抗−M. pneumoniae抗
体（上記Ａ参照）でコートした。
【００４０】Ｃ． 半モノクローナル二重サンドイッチ
試験（捕獲アッセイ）の操作 サンプル緩衝液ＳＴＤ(製品番号：ＯＵＷＯ；Behringwe
rke AG, Marburg, FRG）で可溶化したM. pneumoniaeお
よび共存菌叢中の「非Mycoplasma pneumoniae種」の細
胞（サンプル緩衝液中１μｇ〜０.４ｎｇに様々に希
釈）０.１mlを、Ｂに記載したように予めコーティング
したマイクロタイタープレート中、３７℃で１時間イン
キュベートした。ついで洗浄溶液ＰＯＤ（製品番号：Ｏ
ＳＥＷ，Behringwerke AG, Marburg, FRG）０.３mlで３
回洗浄した。試験すべきモノクローナル抗体（表１参
照）を接合緩衝液microbiol.(製品番号：ＯＵＷＷ，Beh
ringwerkeAG, Marburg, FRG)に希釈して、マイクロタイ
タープレートの各ウエルあたり０.１mlを加えて、３７
℃て３０分間インキュベートした。ついで上述したと同
様に３回洗浄した。試験系を次に、接合緩衝液microbio
l.に１：８０００に希釈した抗−マウスＩｇＧ／ＰＯＤ
接合体(製品番号：ＮＣＩＫＯ３、Behringwerke AG,Mar
burg, FRG）０.１mlとともに、３７℃で６０分間インキ
ュベートした。前述したと同様に洗浄を３回実施した。
発色のために、そのまま使用できるＴＭＢ発色原溶液
０.１mlを各ウエルにピペットで加えた。室温で３０分
間インキュベートしたのち、停止溶液ＰＯＤにより発色
を停止させた。
試験（捕獲アッセイ）の操作 サンプル緩衝液ＳＴＤ(製品番号：ＯＵＷＯ；Behringwe
rke AG, Marburg, FRG）で可溶化したM. pneumoniaeお
よび共存菌叢中の「非Mycoplasma pneumoniae種」の細
胞（サンプル緩衝液中１μｇ〜０.４ｎｇに様々に希
釈）０.１mlを、Ｂに記載したように予めコーティング
したマイクロタイタープレート中、３７℃で１時間イン
キュベートした。ついで洗浄溶液ＰＯＤ（製品番号：Ｏ
ＳＥＷ，Behringwerke AG, Marburg, FRG）０.３mlで３
回洗浄した。試験すべきモノクローナル抗体（表１参
照）を接合緩衝液microbiol.(製品番号：ＯＵＷＷ，Beh
ringwerkeAG, Marburg, FRG)に希釈して、マイクロタイ
タープレートの各ウエルあたり０.１mlを加えて、３７
℃て３０分間インキュベートした。ついで上述したと同
様に３回洗浄した。試験系を次に、接合緩衝液microbio
l.に１：８０００に希釈した抗−マウスＩｇＧ／ＰＯＤ
接合体(製品番号：ＮＣＩＫＯ３、Behringwerke AG,Mar
burg, FRG）０.１mlとともに、３７℃で６０分間インキ
ュベートした。前述したと同様に洗浄を３回実施した。
発色のために、そのまま使用できるＴＭＢ発色原溶液
０.１mlを各ウエルにピペットで加えた。室温で３０分
間インキュベートしたのち、停止溶液ＰＯＤにより発色
を停止させた。
【００４１】そのまま使用できる発色原溶液は、キット
「EnzygnostR／ＴＭＢ用付加試薬」（製品番号：ＯＵＶ
Ｐ，Behringwerke AG, Marburg, FRG）の試薬から、そ
れに添付された指示書に従って調製した。上述のキット
は停止溶液ＰＯＤも含まれている。発色はマイクロタイ
タープレート用比色計で測定した（Behring ELISA プロ
セッサーII；Behringwerke AG, Marburg）。測定波長は
４５０nmとし、６５０nmを補正波長として使用した。
「EnzygnostR／ＴＭＢ用付加試薬」（製品番号：ＯＵＶ
Ｐ，Behringwerke AG, Marburg, FRG）の試薬から、そ
れに添付された指示書に従って調製した。上述のキット
は停止溶液ＰＯＤも含まれている。発色はマイクロタイ
タープレート用比色計で測定した（Behring ELISA プロ
セッサーII；Behringwerke AG, Marburg）。測定波長は
４５０nmとし、６５０nmを補正波長として使用した。
【００４２】実施例２均一ポリクローナル捕獲ＥＬＩＳＡの操作 M. pneumoniaeに対して産生させたウサギ抗体によるマ
イコプラズマ属の他の種（M. gentitalium, M. ferment
ans, M. hominis, M. salivarium, M. orale）の結合を
均一ポリクローナル捕獲ＥＬＩＳＡで検出した。このア
ッセイでは、固相に結合させた捕捉抗体および第二の検
出抗体の両者にウサギ血清を使用した。検出抗体の結合
は、現時点での技術水準において知られている方法によ
りビオチンと接合させ、それ自体公知のアビジン／ＰＯ
Ｄ接合体によって検出した。
イコプラズマ属の他の種（M. gentitalium, M. ferment
ans, M. hominis, M. salivarium, M. orale）の結合を
均一ポリクローナル捕獲ＥＬＩＳＡで検出した。このア
ッセイでは、固相に結合させた捕捉抗体および第二の検
出抗体の両者にウサギ血清を使用した。検出抗体の結合
は、現時点での技術水準において知られている方法によ
りビオチンと接合させ、それ自体公知のアビジン／ＰＯ
Ｄ接合体によって検出した。
【００４３】この試験の操作は、検出系を除いて例１に
記載した半モノクローナル二重サンドイッチ試験の場合
と同じである。
記載した半モノクローナル二重サンドイッチ試験の場合
と同じである。
【００４４】実施例３モノクローナル抗−Mycoplasma pneumoniae抗体の製造 Ａ． Mycoplasma pneumoniaeの増殖 M. pneumoniaeＦＨ株をHayflick改良Eagle培地(L. Hayf
lick: Texas Reportson Biology and Medicine 23 (196
5), 285）中で増殖させた。細胞を遠心分離（１０００
×ｇ，１０分）で沈降させ、滅菌したリン酸緩衝食塩溶
液（ＰＢＳ）中で２回洗浄した。
lick: Texas Reportson Biology and Medicine 23 (196
5), 285）中で増殖させた。細胞を遠心分離（１０００
×ｇ，１０分）で沈降させ、滅菌したリン酸緩衝食塩溶
液（ＰＢＳ）中で２回洗浄した。
【００４５】Ｂ． Ｐ１蛋白質の調製 M. pneumoniaeからのＰ１蛋白質の精製は欧州特許出願
８９１０５００６号に記載されている。
８９１０５００６号に記載されている。
【００４６】Ｃ． 免疫感作処置 ６〜８週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、新たに収穫し
洗浄した無傷のM. pneumoniae細胞、ＰＢＳ中約１０8コ
ロニー形成単位、または完全Freundアジュバント（ＣＦ
Ａ）中に乳化した精製Ｐ１蛋白質５００μｇで、腹腔内
に免疫感作処置をした。免疫感作処置用には、ＣＦＡへ
の乳化前、クロロホルム−メタノール抽出による精製後
に、Ｐ１蛋白質を過剰の界面活性剤（ＳＤＳ）から分離
し、ついでＰＢＳ中に超音波処理によって再懸濁した。
洗浄した無傷のM. pneumoniae細胞、ＰＢＳ中約１０8コ
ロニー形成単位、または完全Freundアジュバント（ＣＦ
Ａ）中に乳化した精製Ｐ１蛋白質５００μｇで、腹腔内
に免疫感作処置をした。免疫感作処置用には、ＣＦＡへ
の乳化前、クロロホルム−メタノール抽出による精製後
に、Ｐ１蛋白質を過剰の界面活性剤（ＳＤＳ）から分離
し、ついでＰＢＳ中に超音波処理によって再懸濁した。
【００４７】免疫感作処置は１０日間隔で４回反復し
た。最終の免疫感作処置４日後に、抗体力価測定後マウ
スを屠殺し、ハイブリドーマの製造用に脾臓を摘出し
た。
た。最終の免疫感作処置４日後に、抗体力価測定後マウ
スを屠殺し、ハイブリドーマの製造用に脾臓を摘出し
た。
【００４８】Ｄ． 融合 混合後に、脾臓細胞を骨髄腫細胞系Ｘ６３／Ａｇ ８.６
５３の細胞と融合させた。使用した融合プロモーターは
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００〔７５mM
ＨＥＰＥＳ、５％（容量／容量）ＤＭＳＯ中５０％（重
量／容量）ＰＥＧ１５００〕とした〔１分間を要してＰ
ＥＧ（１ml）を滴下〕。ついで融合混合物を無血清培地
で希釈し、注意深く洗浄した。細胞沈降物をＨＡＴ選択
培地中に再懸濁し、９６ウエル付きマイクロタイタープ
レートに、１mlあたり２×１０5個細胞の濃度で、腹腔
マクロファージの存在下にプレーティングした。
５３の細胞と融合させた。使用した融合プロモーターは
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００〔７５mM
ＨＥＰＥＳ、５％（容量／容量）ＤＭＳＯ中５０％（重
量／容量）ＰＥＧ１５００〕とした〔１分間を要してＰ
ＥＧ（１ml）を滴下〕。ついで融合混合物を無血清培地
で希釈し、注意深く洗浄した。細胞沈降物をＨＡＴ選択
培地中に再懸濁し、９６ウエル付きマイクロタイタープ
レートに、１mlあたり２×１０5個細胞の濃度で、腹腔
マクロファージの存在下にプレーティングした。
【００４９】ＨＡＴ培地中での選択は７〜１０日間で起
こった。選択相の完了後直ちに、ハイブリドーマをＨＴ
培地に移した。
こった。選択相の完了後直ちに、ハイブリドーマをＨＴ
培地に移した。
【００５０】Ｅ． M. pneumoniae−特異的抗体を分泌
するハイブリドーマの選択 ＨＡＴ培地中での選択方法が完了したのち、Ｐ１蛋白質
からの１００のハイブリドーマおよびＭ融合からの４７
２のハイブリドーマについて、実施例１に記載の方法に
より、M. pneumoniae−特異的抗体の分泌を調べた。可
溶化M. pneumoniae細胞とは反応するが固相に結合した
ウサギ血清抗体とは反応しない抗体を計３７のハイブリ
ドーマが分泌した。
するハイブリドーマの選択 ＨＡＴ培地中での選択方法が完了したのち、Ｐ１蛋白質
からの１００のハイブリドーマおよびＭ融合からの４７
２のハイブリドーマについて、実施例１に記載の方法に
より、M. pneumoniae−特異的抗体の分泌を調べた。可
溶化M. pneumoniae細胞とは反応するが固相に結合した
ウサギ血清抗体とは反応しない抗体を計３７のハイブリ
ドーマが分泌した。
【００５１】これらの３７のハイブリドーマによって分
泌された抗体をＥＬＩＳＡ試験系においてそれ自体公知
の方法により、免疫感作処置Ｐ１蛋白質、超音波で破壊
した細胞全抽出物、部分固定不変M. pneumoniae細胞と
の反応性を、また放射免疫沈降によりＰ１蛋白質および
他のM. pneumoniae表面構造の結合を調べた。
泌された抗体をＥＬＩＳＡ試験系においてそれ自体公知
の方法により、免疫感作処置Ｐ１蛋白質、超音波で破壊
した細胞全抽出物、部分固定不変M. pneumoniae細胞と
の反応性を、また放射免疫沈降によりＰ１蛋白質および
他のM. pneumoniae表面構造の結合を調べた。
【００５２】これらの抗体についてはさらに、実施例１
および２に記載の方法により、マイコプラズマ属の他の
種（M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, M. s
alivarium, M. orale）との交差反応性も調べた。交差
反応性はこの場合、百分率で定義する。これらの百分率
は、一連の試験で各種のマイコプラズマ種を等量（１０
０μｇ／ml；０.１ml）使用することによって確立され
た。抗体のM. pneumoniaeに対する結合およびその際得
られた発色の値を１００％とする。マイコプラズマ属の
他の種について得られた値、すなわち交差反応性はこの
１００％に対する値である。
および２に記載の方法により、マイコプラズマ属の他の
種（M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, M. s
alivarium, M. orale）との交差反応性も調べた。交差
反応性はこの場合、百分率で定義する。これらの百分率
は、一連の試験で各種のマイコプラズマ種を等量（１０
０μｇ／ml；０.１ml）使用することによって確立され
た。抗体のM. pneumoniaeに対する結合およびその際得
られた発色の値を１００％とする。マイコプラズマ属の
他の種について得られた値、すなわち交差反応性はこの
１００％に対する値である。
【００５３】ポリクローナルウサギ抗−M. pneumoniae
血清と異なり、本発明のハイブリドーマによって分泌さ
れた５つのモノクローナル抗体については、マイコプラ
ズマ属の他の種との交差反応性は検出できなかった。結
果は表１にまとめる。
血清と異なり、本発明のハイブリドーマによって分泌さ
れた５つのモノクローナル抗体については、マイコプラ
ズマ属の他の種との交差反応性は検出できなかった。結
果は表１にまとめる。
【００５４】Ｆ． 制限条件下でのクローニング マイコプラズマ属の他の種と交差反応しなかったオリゴ
クローナルハイブリドーマ培養体を、制限条件下でのク
ローニングに使用する十分な細胞数得るために拡張させ
た。
クローナルハイブリドーマ培養体を、制限条件下でのク
ローニングに使用する十分な細胞数得るために拡張させ
た。
【００５５】このためには、培養体を増殖の対数期に収
穫し、生存細胞数を、本技術分野の熟練者にはそれ自体
よく知られた方法、トリパンブルー染色によって測定し
た。９６ウエル付きマイクロタイタープレートの各ウエ
ルあたりのハイブリドーマ細胞が１個になるように細胞
数を調整し、フィーダー層として腹腔マクロファージの
存在下にハイブリドーマを培養した。１４日後、サブク
ローニングの結果としてモノクローナルとなったハイブ
リドーマ培養体を、例１および２に記載の方法により、
M. pneumoniae−特異的抗体の連続的な分泌およびマイ
コプラズマ属の他の種との交差反応性について試験し
た。
穫し、生存細胞数を、本技術分野の熟練者にはそれ自体
よく知られた方法、トリパンブルー染色によって測定し
た。９６ウエル付きマイクロタイタープレートの各ウエ
ルあたりのハイブリドーマ細胞が１個になるように細胞
数を調整し、フィーダー層として腹腔マクロファージの
存在下にハイブリドーマを培養した。１４日後、サブク
ローニングの結果としてモノクローナルとなったハイブ
リドーマ培養体を、例１および２に記載の方法により、
M. pneumoniae−特異的抗体の連続的な分泌およびマイ
コプラズマ属の他の種との交差反応性について試験し
た。
【００５６】検査したすべてのハイブリドーマが１年間
にわたり連続的に抗体を分泌した。特異性および交差反
応性の試験の結果は表１に示す。
にわたり連続的に抗体を分泌した。特異性および交差反
応性の試験の結果は表１に示す。
【００５７】Ｇ． 免疫グロブリン（Ｉｇ）クラスの決
定 ＩｇクラスおよびＩｇサブクラスは捕獲イムノアッセイ
で決定した。Ｉｇクラスおよびサブクラス特異的ポリク
ローナル抗体をニトロセルロース濾紙(捕捉相)にカップ
リングさせた。腹水から部分精製し、ビオチンで標識し
たモノクローナル抗体を捕捉相とインキュベートした。
捕捉された抗体はストレプトアビジン−ペルオキシダー
ゼで検出した。
定 ＩｇクラスおよびＩｇサブクラスは捕獲イムノアッセイ
で決定した。Ｉｇクラスおよびサブクラス特異的ポリク
ローナル抗体をニトロセルロース濾紙(捕捉相)にカップ
リングさせた。腹水から部分精製し、ビオチンで標識し
たモノクローナル抗体を捕捉相とインキュベートした。
捕捉された抗体はストレプトアビジン−ペルオキシダー
ゼで検出した。
【００５８】モノクローナル抗体Ｐ１.２５およびＭ７
４はＩｇＧ１サブクラスに属し、Ｐ１.２７およびＭ７
５はＩｇＧ３サブクラスに属する。すべてのモノクロー
ナル抗体がκ型のＬ鎖を有する。
４はＩｇＧ１サブクラスに属し、Ｐ１.２７およびＭ７
５はＩｇＧ３サブクラスに属する。すべてのモノクロー
ナル抗体がκ型のＬ鎖を有する。
【００５９】実施例４in vivoにおけるモノクローナル抗体の製造（腹水産
生） ６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫系を不完全
Freundアジュバント０.５mlの腹腔内注射によって活性
化した。この注射２４時間後に、一つのクローンからの
１０6個のハイブリドーマ細胞の懸濁液を腹腔内に投与
した。２〜６週間で腫瘍が発症したのちに、動物を屠殺
し、穿刺により腹水を採出した。穿刺液中の高抗体濃度
の検出には捕獲ＥＬＩＳＡ（実施例１参照）を使用し
た。
生） ６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫系を不完全
Freundアジュバント０.５mlの腹腔内注射によって活性
化した。この注射２４時間後に、一つのクローンからの
１０6個のハイブリドーマ細胞の懸濁液を腹腔内に投与
した。２〜６週間で腫瘍が発症したのちに、動物を屠殺
し、穿刺により腹水を採出した。穿刺液中の高抗体濃度
の検出には捕獲ＥＬＩＳＡ（実施例１参照）を使用し
た。
【００６０】実施例５ハイブリドーマＭ５７、Ｍ７４、Ｐ１.２５、Ｐ１.２７
およびＭ７５によって分泌されたモノクローナル抗体の
Mycoplasma pneumoniaeに対する特異性 クローナルハイ
ブリドーマＭ２５、Ｍ５１、Ｍ５７、Ｍ７４、Ｐ１.２
５およびＭ７５によって分泌された抗体、ならびにM. p
neumoniaeに対して産生された２種のポリクローナルウ
サギ抗血清を実施例１および２に記載の方法で試験し、
またクローナルハイブリドーマ１１Ｇ７によって分泌さ
れた抗体をM. pneumoniaeに対する特異性およびマイコ
プラズマ属の他の種との交差反応性の可能性についての
それ自体公知の方法、ドット−ブロットで試験した。結
果は表１に示す。これから、Ｍ５７、Ｍ７４、Ｐ１.２
５、Ｐ１.２７およびＭ７５はM. pneumoniaeのエピトー
プに対してモノ特異的であるのに対し、Ｍ２５、Ｍ５
１、１１Ｇ７および２種のウサギ抗血清は他の「非−My
coplasma pneumoniae種」と交差反応することが明らか
である。
およびＭ７５によって分泌されたモノクローナル抗体の
Mycoplasma pneumoniaeに対する特異性 クローナルハイ
ブリドーマＭ２５、Ｍ５１、Ｍ５７、Ｍ７４、Ｐ１.２
５およびＭ７５によって分泌された抗体、ならびにM. p
neumoniaeに対して産生された２種のポリクローナルウ
サギ抗血清を実施例１および２に記載の方法で試験し、
またクローナルハイブリドーマ１１Ｇ７によって分泌さ
れた抗体をM. pneumoniaeに対する特異性およびマイコ
プラズマ属の他の種との交差反応性の可能性についての
それ自体公知の方法、ドット−ブロットで試験した。結
果は表１に示す。これから、Ｍ５７、Ｍ７４、Ｐ１.２
５、Ｐ１.２７およびＭ７５はM. pneumoniaeのエピトー
プに対してモノ特異的であるのに対し、Ｍ２５、Ｍ５
１、１１Ｇ７および２種のウサギ抗血清は他の「非−My
coplasma pneumoniae種」と交差反応することが明らか
である。
【００６１】実施例６ハイブリドーマＭ５７、Ｍ７４、Ｐ１.２５、Ｐ１.２７
およびＭ７５によって分泌されるモノクローナル抗体の
Mycoplasma pneumoniaeに対する結合活性 図１には、モ
ノクローナル抗体についての標準希釈プロットを示す。
試験には、溶解させたMycoplasma pneumoniae細胞の量
が１μｇの一定になるようにし、モノクローナル抗体は
図１に示すようにサンプル緩衝液microbiol.に希釈し
て、実施例１の記載と同様にして試験を行った。
およびＭ７５によって分泌されるモノクローナル抗体の
Mycoplasma pneumoniaeに対する結合活性 図１には、モ
ノクローナル抗体についての標準希釈プロットを示す。
試験には、溶解させたMycoplasma pneumoniae細胞の量
が１μｇの一定になるようにし、モノクローナル抗体は
図１に示すようにサンプル緩衝液microbiol.に希釈し
て、実施例１の記載と同様にして試験を行った。
【００６２】
【表１】
【図１】ハイブリドーマＭ５７、Ｍ７４、Ｐ１.２５、
Ｐ１.２７およびＭ７５によって分泌されるモノクロー
ナル抗体のMycoplasma pneumoniaeに対する結合活性
を、標準希釈プロットに基づいて示す。
Ｐ１.２７およびＭ７５によって分泌されるモノクロー
ナル抗体のMycoplasma pneumoniaeに対する結合活性
を、標準希釈プロットに基づいて示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ｆ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ベルンハルト・ゲルステネカー ドイツ連邦共和国デー−7470アルプシユタ ト．ウンテレフオルシユタト103 (72)発明者 エノ・ヤーコプス ドイツ連邦共和国デー−7800フライブル ク．シユレーエンライン10 (72)発明者 ヴイルヘルム・シユイ ドイツ連邦共和国デー−5431オーベラーバ ハ．シユリーフエルダーヴエーク６
Claims (20)
- 【請求項１】 Mycoplasma pneumoniaeに特異的で、マ
イコプラズマ属の他の種とは１％またはそれ未満の交差
反応性しか示さないモノクローナル抗体およびそのフラ
グメント。 - 【請求項２】 共存する菌叢の他の病原種とは１％また
はそれ未満の交差反応性しか示さない、請求項１記載の
モノクローナル抗体およびそのフラグメント。 - 【請求項３】 Mycoplasma pneumoniaeのＰ１蛋白質に
特異的な請求項１または２記載のモノクローナル抗体お
よびそのフラグメント。 - 【請求項４】 Ｈ鎖はγ１サブクラスにＬ鎖はκクラス
に属する請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナ
ル抗体およびそのフラグメント。 - 【請求項５】 Ｈ鎖はγ３サブクラスにＬ鎖はκクラス
に属する請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナ
ル抗体およびそのフラグメント。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の抗体ま
たはそのフラグメントを産生するハイブリドーマ。 - 【請求項７】 融合に使用される脾臓細胞はＢＡＬＢ／
ｃマウスに由来する請求項６記載のハイブリドーマ。 - 【請求項８】 融合に使用される骨髄腫細胞はＸ６３／
Ａｇ ８.６５３である請求項６または７記載のハイブリ
ドーマ。 - 【請求項９】 ハイブリドーマＭ５７（ＰＨＬＳ寄託番
号９１０４１０１０）。 - 【請求項１０】 ハイブリドーマＭ７４（ＰＨＬＳ寄託
番号９１０４１０１１）。 - 【請求項１１】 ハイブリドーマＰ１.２５(ＰＨＬＳ寄
託番号９１０４１０１２）。 - 【請求項１２】 ハイブリドーマＰ１.２７(ＰＨＬＳ寄
託番号９１０４１０１３）。 - 【請求項１３】 ハイブリドーマＭ７５（ＰＨＬＳ寄託
番号９１０５２３１０）。 - 【請求項１４】 請求項１〜５のいずれかに記載の少な
くとも１種の抗体を含有する、サンプル中のMycoplasma
pneumoniaeを検出するためのキット。 - 【請求項１５】 検出は固相免疫測定系によって行われ
る請求項１４記載のキット。 - 【請求項１６】 請求項６〜１３のいずれかに記載のハ
イブリドーマを製造するにあたり、 （ａ） マウスをMycoplasma pneumoniae細胞またはMyc
oplasma pneumoniaeのＰ１蛋白質で免疫感作し、 （ｂ） 免疫感作マウスからの脾臓細胞を適当な骨髄腫
細胞と融合させ、ついで（ｃ） 工程(ｂ)で得られたハ
イブリドーマを、M. pneumoniaeに対し特異的でマイコ
プラズマ属の他の種とは１％またはそれ未満の交差反応
性しか示さない抗体の分泌によって選択する方法。 - 【請求項１７】 請求項６〜１３のいずれかに記載のハ
イブリドーマを製造するにあたり、 （ａ） マウスをMycoplasma pneumoniae細胞またはMyc
oplasma pneumoniaeのＰ１蛋白質で免疫感作し、 （ｂ） 免疫感作マウスからの脾臓細胞を適当な骨髄腫
細胞と融合させ、 （ｃ） 工程(ｂ)で得られたハイブリドーマを、M. pne
umoniaeに対して特異的で、マイコプラズマ属の他の種
とは１％またはそれ未満の交差反応性しか示さない抗体
の分泌によって選択し、ついで （ｄ） 工程(ｃ)で得られたハイブリドーマを、共存す
る他の病原種とは１％またはそれ未満の交差反応性しか
示さない抗体の分泌によって選択する方法。 - 【請求項１８】 請求項１〜５のいずれかに記載のモノ
クローナル抗体を製造するにあたり、請求項６〜１３の
いずれかに記載のハイブリドーマを(ａ)in vitroで培養
し、ついで(ｂ)モノクローナル抗体をその培養培地から
得る方法。 - 【請求項１９】 請求項１〜５のいずれかに記載のモノ
クローナル抗体を製造するにあたり、請求項６〜１３の
いずれかに記載のハイブリドーマを(ａ)同遺伝子型また
は類似遺伝子型マウスの腹腔内でin vitroで培養し、つ
いで(ｂ)腹水からモノクローナル抗体を得る方法。 - 【請求項２０】 請求項１〜５のいずれかに記載のモノ
クローナル抗体の、サンプル中におけるMycoplasma pne
umoniaeの検出のための使用。
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| DE4134297:6 | 1991-10-17 | ||
| DE4134297A DE4134297A1 (de) | 1991-10-17 | 1991-10-17 | Monoclonale antikoerper gegen mycoplasma pneumoniae, diese produzierende hybridome, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung |
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- 1992-10-16 CA CA002080713A patent/CA2080713A1/en not_active Abandoned
- 1992-10-16 AU AU27121/92A patent/AU666134B2/en not_active Ceased
- 1992-10-16 JP JP4278251A patent/JPH05304990A/ja active Pending
-
1995
- 1995-01-03 US US08/367,769 patent/US5641638A/en not_active Expired - Fee Related
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