JP2002500202A

JP2002500202A - 免疫優位部位の生成のための色素性網膜上皮細胞の使用

Info

Publication number: JP2002500202A
Application number: JP2000527281A
Authority: JP
Inventors: リチャードシー．アレン，; マイケルエル．コーンフェルドット，; ウイリアムアール．キドウェル，
Original assignee: タイタンファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1998-01-02
Filing date: 1998-12-31
Publication date: 2002-01-08
Also published as: CA2317115A1; EP1044024A1; AU2019199A; KR20010033834A; NZ505459A; AU759273B2; US20060147437A1; WO1999034834A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、組織において局所的な免疫抑制環境を生成するための、新規なインビボの方法に関する。本方法は、色素性網膜上皮細胞の哺乳動物への移植する工程で、それにより局所的な免疫抑制環境を産生する工程に関する。移植された色素性網膜上皮細胞はまた、疾患の処置において有用であり得る、治療タンパク質または他の生物学的に活性な分子を産生するために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、組織において局所的な免疫抑制環境を生成するための、新規なイン
ビボの方法に関する。本方法は、色素性網膜上皮細胞の哺乳動物動物への移植す
る工程、それにより局所的な免疫抑制環境を産生する工程に関する。移植された
色素網膜上皮細胞は、疾患の処置において有用であり得る、治療タンパク質また
は他の生物学的に活性な分子を産生するために使用され得る。

【０００２】（発明の背景）特定の慢性疾患は、罹患された器官において機能的な細胞の破壊を生じる。そ
のような疾患を有する哺乳動物は、しばしば、正常な生理的機能を維持するため
に必要なタンパク質またはホルモンを産生し得ない。そのような例において、罹
患した哺乳動物への健常な器官または細胞の移植は、その疾患の症状を緩和し得
る。細胞および組織の移植は、嚢胞性線維症（肺）、腎不全、変性心疾患、糖尿
病、神経変性障害、肝不全、および膵臓不全を含むが、これらに限定されない広
範な障害において、治療的に利用されている。

【０００３】不幸にも、そのような移植は、しばしば外来性の組織または細胞に対する応答
において惹起される免疫応答に起因して、身体に拒絶される。現在、移植された
組織の拒絶を防ぐ、ただ一つの頼みの綱は、免疫抑制剤を投与することであるが
、いくつかの場合において、個体は、その免疫抑制治療自身を利点よりもより多
くの負担にする、医療的な危険性にさらされる。従って、移植の利点は、成功し
た移植がヒトにおいて達成されるべき場合に必要とされる全身性の免疫抑制の、
深刻な副作用により制限されてきた。

【０００４】移植された組織が、長い期間生存し得る身体において、免疫優位部位が存在す
ることが、最近発見された（Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎ，Ｊ．Ｗ．、１９９５、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２７０：１１５８−１１５９）。そのような部位は、例えば、眼、精
巣、および脳を含む。その優位部位の特徴は、血液組織関門の存在、輸出リンパ
管の非存在および血液中の組織液の直接的排液法のような、組織内の構造的関門
を含む。免疫優位部位のさらなる特徴は、ＴＧＦβまたはＦａｓＬのような免疫
抑制サイトカインの分泌を通した、免疫抑制環境の確立を含む。ＦａｓＬタンパ
ク質は、移植された組織の長期の生存にとくに重要であると考えられ、そしてレ
シピエントのＦａｓ＋、抗原活性化Ｔ細胞のアポトーシスの活性化を通して作用
すると考えられる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｔ．Ｓ．ら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７０：１１８９−１１９２）。

【０００５】眼は、解剖学的に異なる２つの領域に分離される器官であり、免疫優位部位の
特に興味深い例である。前眼房における免疫優位性は、ＦａｓＬに起因すると考
えられるが、後眼房は、網膜の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞により作製される物
理的関門に起因すると考えられ、それは血液の免疫細胞から後眼房を分離する。
これに基づくと、単離されたＲＰＥ細胞（もはや、密接にコンフルエントな層で
ない）が、免疫優位部位を産生し得るなら、実に驚くべきことである。

【０００６】本発明は、網膜色素上皮細胞がＦａｓＬを分泌し、そして網膜の構造上の境界
の外部で機能し、免疫優位部位を産生し得るという発見に基づく。眼の免疫優位
部位におけるＦａｓＬの発現は、炎症に対する応答において眼に侵入する、活性
化リンパ球を直接的に殺し、それによって、網膜のような重要な構造と反応する
ことによって、視覚を破壊すると考えられている。網膜色素上皮細胞によるＦａ
ｓＬタンパク質の発現は、その細胞がまたＦａｓＬに対するレセプターも発現し
ているという事実を考えると驚くべきことである（Ｅｓｓｅｒら、１９９５、Ｂ
ｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２１３：１０２６−１０３４）。
にもかかわらず、その細胞は、アポトーシスのためのシグナルに対して抵抗性が
あるようである。

【０００７】最近、セルトリ細胞が、糖尿病ラットに膵島細胞とともに同時に移植される場
合、宿主組織上で有効な局所的免疫抑制剤として機能することが、研究により示
唆された（ＳｅｌａｗｒｙおよびＣａｍｅｒｏｎ、１９９３、ＣｅｌｌＴｒａ
ｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ２：１２３−１２９）。この細胞移植プロトコール
は、長期の全身性免疫抑制を用いずに達成される。さもなければセルトリ細胞が
島に移植されなかった場合に必要とされる。結果として、移植片は拒絶されず、
そしてその生存可能に残存している島が、移植された膵島細胞を正常に機能させ
、無期限に、インスリンを産生させ得る。移植片の生存は、セルトリ細胞による
ＦａｓＬの構成的発現に関連するようである。

【０００８】生産的な細胞移植技術を向上させるために設計される方法の開発は、パーキン
ソン病および糖尿病のような疾患の処置に有用である。同様に、宿主が生物学的
に耐性を示す免疫抑制剤を投与することによる局所的免疫抑制（すなわち、移植
片部位で）の能力で、全身性の免疫抑制を回避することが望ましい。従って、局
所的免疫抑制を送達し得る細胞の同定、ならびに効率的な移植片の受容および組
織に関連する機能障害の機能的修復を促進することが望ましい。

【０００９】（発明の要旨）本発明は、哺乳動物における免疫学的に優位な部位を生成するための新規な方
法に関する。本発明の方法は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の移植を含み、それ
によって、移植部位で局所的な免疫抑制環境を産生する工程を含む。本発明は、
ＲＰＥ細胞がＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）と呼ばれる免疫抑制サイトカインを大
量に分泌する発見に関する。ＦａｓＬタンパク質は、レシピエントのＦａｓ＋抗
原活性化Ｔ細胞においてアポトーシスを刺激することによって、その免疫抑制効
果を及ぼすと考えられる。免疫抑制サイトカインに加え、ＲＰＥ細胞は、広範な
異なる疾患の治療において有用であり得る、さらなる生物学的因子（例えば、増
殖因子、サイトカイン、およびホルモン）を産生する。

【００１０】本発明はさらに、哺乳動物における生物学的因子の不全から生じる疾患の処置
方法として、ＲＰＥ細胞の機能的に活性な治療分子を供給する細胞との同時投与
に関する。例えば、ＲＰＥ細胞は、治療分子を供給する細胞および／またはマト
リックスと同時投与される場合、ＲＰＥ細胞は、単一の組成物として、あるいは
代替的に、別々の組成物としてのいずれかで同時投与され得る。ＲＰＥ細胞が別
々の組成物として投与される場合、ＲＰＥ細胞は、免疫優位部位の生成に十分な
量の治療タンパク質または生物学的に活性な分子を供給する細胞の同時投与の前
に投与され得る。ＲＰＥ細胞の同時投与は、ＲＰＥ細胞が免疫学的に優位な部位
を生成し、それにより同時投与された細胞の生存時間を増加するという利点を有
する。機能的に活性なタンパク質または生物学的に活性な分子を産生する、同時
投与される細胞としては、インシュリン産生β細胞、ドーパミン産生神経細胞ま
たは非神経細胞、あるいはホルモン産生内分泌細胞を含むが、これらに限定され
ない。

【００１１】本発明のさらに別の実施態様において、ＲＰＥ細胞は、疾患の処置に有用であ
り得る治療タンパク質または生物学的に活性な分子を産生するために遺伝子的に
操作され得る。例えば、ＲＰＥ細胞は、増殖因子、サイトカイン、またはホルモ
ンのような生物学的に活性な分子を含むが、これらに限定されない広範なタンパ
ク質を産生するために、遺伝子的に操作され得る。レシピエント宿主において、
通常刺激される正常な移植片の拒絶応答を抑制するＲＰＥ細胞の能力は、移植さ
れたＲＰＥ細胞の増殖および生存能力を増加する。本発明はさらに、移植された
細胞の長期間の生存能力を増加する目的のための、ＲＰＥ細胞の同じまたは異な
るマトリックスへのインビトロ接着に関する。さらに、治療タンパク質または生
物学的に活性な分子を産生する同時投与される細胞は、移植前に同じまたは異な
るマトリックスに接着し得る。支持マトリックスを構成し得る材料は、細胞がイ
ンビトロインキュベーション後に接着する、細胞が増殖し得る、そして移植され
た細胞を破壊する毒性反応または炎症反応を産生せずに、哺乳動物体内に移植さ
れ得るそれらの材料を含む。

【００１２】本発明は、ＲＰＥ細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物
を提供する。本発明はさらに、ＲＰＥ細胞および機能的に活性な治療タンパク質
、または生物学的に活性な分子を産生する細胞を含む薬学的組成物を含み、その
組成物は、薬学的に受容可能なキャリアに含まれる。本発明の組成物は、免疫学
的に優位な部位の生成、および機能的に活性な治療タンパク質、または他の生物
学的に活性な分子の投与が望まれる場合の疾患の処置に利用され得る。そのよう
な疾患は、神経性疾患、心疾患、内分泌疾患、肝臓疾患、肺疾患、代謝疾患、ま
たは免疫学的に関連する疾患を含む．例えば、パーキンソン病、ハンティングト
ン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、発作性のおよび外傷性の頭部傷害および脊髄
傷害のような、神経性障害が処置され得る。非神経性疾患は、糖尿病、血餅障害
、および嚢胞性線維症を含むが、これらに限定されない。

【００１３】（発明の詳細な説明）本発明は、組織中の持続的で局所的な免疫抑制効果を産生する方法を提供する
。これは、宿主レシピエント組織内にＲＰＥ細胞を移植する一般的な工程により
達成される。持続的で局所的な免疫抑制効果により、移植されたＲＰＥ細胞は、
移植された細胞のような外来物に対する宿主組織により通常高められる免疫学的
応答を抑制することが意図され、そしてその免疫抑制は、シクロスポリンのよう
な薬剤による通常の免疫抑制の方法により起こる、一般的な体全体（全身性）の
抑制によるのではなくむしろ移植部位で（局所的に）起こることが意図される。

【００１４】好ましい実施態様において、移植されたＲＰＥ細胞（機能障害細胞と置き換え
るか、または何らか方法で、組織の機能障害を緩和することが意図される）は、
拒絶されることを回避し得、その結果生存し得、そして宿主組織内に機能的に組
込まれ得る。さらに、本発明の方法はまた利用され得、ここで、ＲＰＥ細胞は、
神経細胞、内分泌細胞、筋肉細胞、および機能的に活性な治療分子を産生する他
の細胞のような、さらなる細胞または組織と共に同時投与される。さらに、ＲＰ
Ｅ細胞は、移植前に、移植細胞の長期間の生存能力を増大する、天然または合成
マトリックスへインビトロで接着され得る。本発明の方法は、局所的な免疫抑制
を提供することによって、組織移植の成果を向上するために使用され得る。すな
わち、ＲＰＥ細胞は、移植片の生存および移植される細胞の移植片の機能を容易
にするために使用され得る。

【００１５】本発明は、ＲＰＥ細胞が、免疫抑制サイトカインＦａｓＬを分泌することの発
見に基づく。ＦａｓＬタンパク質は、レシピエントのＦａｓ＋抗原活性化リンパ
球におけるアポトーシスの活性化を通じて、移植された組織の生存能力を引き延
ばすことが示されている。

【００１６】ＦａｓＬのような、ＲＰＥ細胞由来の免疫抑制剤による局所的免疫抑制により
、ＲＰＥ細胞自体を含む、移植された細胞に対して行われる細胞性の免疫学的攻
撃は全く存在しない。さらに、免疫抑制は局所的であり、そして生物学的に耐容
され得る薬剤によるものであることから、その全身性の免疫抑制およびシクロス
ポリンのような薬剤の細胞障害性の両方に関連する副作用は回避される。従って
、ＲＰＥ細胞移植の方法は、移植に対して必要な付随的な治療であるような、シ
クロスポリンを用いる全身性の免疫抑制の使用を超える有意な改善を提供する。

【００１７】ＲＰＥ細胞由来の免疫抑制剤（例えば、ＦａｓＬ）による局所的な免疫抑制は
、異種移植片および同種移植片の両方の生存を容易にし得る。同種移植片を用い
た、ＲＰＥ細胞との同時移植は、全身性の免疫抑制に対する必要性を排除するよ
うな局所的な免疫抑制を提供するはずである。異種移植片を用いた、ＲＰＥ細胞
との同時移植は、全身性の免疫抑制に対する必要性を排除するために、十分な局
所的な免疫抑制を提供し得るか、またはＲＰＥ細胞は、拒絶を防止するために、
全身性の免疫抑制との組み合わせで使用され得、その結果、必要とされる全身性
の免疫抑制の投薬量を減少させ得る。同時移植される場合、ＲＰＥ細胞は、免疫
抑制を供給し得るだけでなく、同時移植された組織の生存および／または増殖を
支持する調節因子、栄養因子、および他の因子を提供し得る。従って、ＲＰＥ細
胞は免疫応答の阻害を提供するだけでなく、併用される栄養性の支持体により、
同種移植片および異種移植片の増殖および生存能力を増強を可能にする。

【００１８】（ＲＰＥ細胞の供給源）ＲＰＥ細胞の供給源は、哺乳動物の網膜からの初代細胞の単離による。ＲＰＥ
細胞回収のためのプロトコルは、詳細に規定されており（ＬｉおよびＴｕｒｎｅ
ｒ、１９８８、Ｅｘｐ．ＥｙｅＲｅｓ．４７：９１１〜９１７；Ｌｏｐｅｚら
、１９８９、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３０：５
８６〜５８８）そして慣用的な方法論が考慮されている（以下、参照）。ＲＰＥ
細胞の同時移植の発表された報告のほとんどで、細胞はラットに由来している（
ＬｉおよびＴｕｒｎｅｒ、１９８８；Ｌｏｐｅｚら、１９８９）、しかし、本発
明の方法が、任意の適切な哺乳動物供給源由来のＲＰＥ細胞で用いられ得ること
は企図される。哺乳動物、例えばヒトでの使用のためのＲＰＥ細胞の好ましい供
給源は、ヒトＲＰＥ細胞である。しかし、利用可能でありそして適切である場合
、ブタのＲＰＥ細胞が利用され得る。単離された初代ＲＰＥ細胞に加えて、培養
されたヒトおよび動物のＲＰＥ細胞株は、本発明の実施において用いられ得る。
本発明の方法は、さらに、機能的に活性な治療的タンパク質、生物学的に活性な
因子を産生する酵素、または生物学的に活性な分子を発現するために遺伝的に操
作されたＲＰＥ細胞の移植を包含する。

【００１９】本発明の方法および組成物は、広い範囲の、機能的に活性な治療的タンパク質
、生物学的に活性な因子を産生する酵素、または生物学的に活性な分子（増殖因
子、サイトカイン、ホルモンおよびホルモンのペプチドフラグメント、サイトカ
インのインヒビター、ペプチド成長因子およびペプチド分化因子、インターロイ
キン、ケモカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子、ならびに脈管形成因
子を含む）を産生するために遺伝的に操作されたＲＰＥ細胞を使用し得る。この
ようなタンパク質の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｔ
ＧＦ−β分子のスーパーファミリー（５つのＴＧＦ−βアイソフォームおよび骨
形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む）、潜在性ＴＧＦ−β結合タンパク質（Ｌ
ＴＢＰ）；ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；血
小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）；塩基性線維
芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２など）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ
）；第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；組織プ
ラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）；アクチビンおよびインヒビン。本発明の実
施において用いられ得るホルモンとしては、成長ホルモン（ＧＨ）および副甲状
腺ホルモン（ＰＴＨ）が挙げられる。

【００２０】当業者に一般に公知である種々の分子生物学的技術を用いて目的のタンパク質
をコードするＤＮＡセグメントを獲得し得る。例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子ラ
イブラリーは、公知のヌクレオチド配列に基づく配列を有するプライマーまたは
プローブを用いてスクリーニングされ得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は
また、目的のタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントを生成するために用い
られ得る。あるいは、このＤＮＡフラグメントは、商業的な供給源から入手され
得る。

【００２１】目的の翻訳産物または転写産物をコードするＤＮＡは、遺伝的に操作されたＲ
ＰＥ細胞の調製のために大スケールでのＤＮＡ複製を提供する種々のベクター系
内に組み替え的に操作され得る。これらのベクターは、ＲＰＥ細胞において、Ｄ
ＮＡ配列の転写および／または翻訳を指向するために必須のエレメントを含むよ
うに設計され得る。

【００２２】用いられ得るベクターとしては、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミ
ドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡに由来するベクターが挙げられるがこれらに限定
されない。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、ｐＵＣ１１８、１１９お
よＭ１３ｍｐ系列のベクターのようなプラスミドベクターが用いられ得る。バ
クテリオファージベクターは、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λｇｔ１８〜２３、λ
ＺＡＰ／ＲおよびＥＭＢＬ系列のバクテリオファージベクターを含み得る。利用
され得るコスミドベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない
：ｐＪＢ８、ｐＣＶ１０３、ｐＣＶ１０７、ｐＣＶ１０８、ｐＴＭ、ｐＭＣＳ、
ｐＮＮＬ、ｐＨＳＧ２７４、ＣＯＳ２０２、ＣＯＳ２０３、ｐＷＥ１５、ｐＷＥ
１６、およびｃｈａｒｏｍｉｄ９系列のベクター。あるいは、ヘルペスウイルス
、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス
またはウシパピローマウイルスのようなウイルス由来のベクターを含むがそれら
に限定されない組換えウイルスベクターが操作され得る。

【００２３】当業者に周知の方法は、適切な転写／翻訳のコントロールシグナルと作動可能
に連結した配列をコードするタンパク質を含む発現ベクターを構築するために用
いられ得る。これらの方法は、インビトロの組換えＤＮＡ技術および合成技術を
含む。例えば、以下に記載された技術を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９
９２、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ
．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ＆ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃ
ｅ，Ｎ．Ｙ．。

【００２４】目的のタンパク質をコードする遺伝子は、種々の異なるプロモーター／エンハ
ンサーエレメントと作動可能に連結され得る。これらのベクターの発現エレメン
トは、その強度および特異性において変化し得る。利用される宿主／ベクター系
に依存して、多くの適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントの任意の１つが
用いられ得る。プロモーターは、目的の遺伝子と天然に連結されるプロモーター
の形態であり得る。あるいは、このＤＮＡは、組換えプロモーターまたは異種の
プロモーター（すなわち、その遺伝子と正常に連結されないプロモーター）の制
御下に位置され得る。例えば、ＲＰＥ特異的プロモーター／エンハンサーエレメ
ントは、ＲＰＥ細胞において転移されたＤＮＡの発現を調節するために用いられ
得る。

【００２５】いくつかの場合には、このプロモーターエレメントは、構成的プロモーターま
たは誘導性プロモーターであり得、そして目的の遺伝子の高レベルまたは調節さ
れた発現を指向するために適切な条件下で用いられ得る。構成的プロモーターの
制御下での遺伝子の発現は、遺伝子発現を誘導するための特異的基質の存在を必
要とせず、そして細胞増殖のすべての条件下で起こる。対照的に、誘導性プロモ
ーターにより制御される遺伝子の発現は、誘導物質の存在または非存在に応答性
である。

【００２６】特異的な開始シグナルはまた、挿入されたタンパク質コード配列の十分な翻訳
のために必要である。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を
含む。開始コドンおよび隣接配列を含むコード配列全体が適切な発現ベクターに
挿入される場合、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされ得ない。しかし、コー
ド配列の一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御
シグナルが供給されるべきである。さらに、開始コドンは、挿入体全体の翻訳を
保証するためにタンパク質コード配列のリーディングフレームと位相が一致する
べきである。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然およ
び合成の両方の種々の起源であり得る。発現の有効性および制御は、転写減衰配
列、エンハンサー、エレメントなどの含有により増強され得る。

【００２７】１つ以上のプロモーターの制御下の単一の遺伝子構築物上で連結される複数の
遺伝子、または同じ型もしくは異なる型の別の構築物として調製された複数の遺
伝子が用いられ得ることはまた、本発明の範囲内である。従って、異なる遺伝子
および遺伝的構築物の無限の組合わせが、使用され得る。特定の遺伝子組み合わ
せが、細胞刺激についての相乗効果を達成するように設計され得るか、またはそ
れらの使用は、別の方法でその相乗効果の達成を生じ得る。いずれのおよび全て
のこのような組み合わせは、本発明の範囲内にあることが意図される。実際に、
多数の相乗効果が科学文献に記載されている、そのため当業者は、相乗的であり
そうな遺伝子組み合わせまたは遺伝子−タンパク質の組み合わせさえ容易に同定
し得る。

【００２８】組換えタンパク質の長期間の高収量の産生のためには、安定な発現が好ましい
。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主ＲＰＥ
細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列
、転写終結ポリアデニル化部位など）により制御されたＤＮＡおよび選択可能マ
ーカーで形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後、操作されたＲＰＥ細胞は、富
化培地中で１〜２日間増殖させられ得、次いで選択培地に切り替えられる。組換
えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、そして細胞
がその染色体へのプラスミドを安定に組み込むこと、および次に細胞株中でクロ
ーン化され、そして拡大され得るフォーカスを形成するために増殖することを可
能にする。この方法は、目的の治療用遺伝子産物を発現する細胞株を操作するた
めに有利に用いられ得る。

【００２９】移植された細胞（すなわち、移植されたＲＰＥ細胞または同時投与された細胞
）の長期の生存率を上昇させるため、移植されるべき細胞は、移植の前に、イン
ビトロで支持マトリックスに付着され得る。支持マトリックスが構成され得る物
質としては、インビトロインキュベーション後に細胞が接着し、そしてその上で
細胞が増殖し得、そして毒性反応もしくは移植された細胞を破壊するか、または
さもなければ、その生物学的もしくは治療的活性を妨害する炎症性反応を産生す
ることなく、哺乳動物の体内に移植され得る物質が挙げられる。このような物質
は、合成的もしくは天然の化学物質、または生物学的起源を有する物質であり得
る。このマトリックス物質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない
：ガラスおよび他の酸化ケイ素、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン
、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタン、ポリアルギナート、ポリスルホン、ポ
リビニルアルコール、アクリロニトリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリカ
ーボネート、ポリペンテン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変ゼラチンな
らびに天然および改変コラーゲン、天然および改変多糖類（デキストランおよび
セルロース（例えばニトロセルロース）を含む）、寒天ならびに磁鉄鉱。再吸収
可能なまたは再吸収不可能な物質のいずれかが用いられ得る。また、当該分野で
周知の細胞外マトリックス物質が意図される。細胞外マトリックス物質は、商業
的に入手可能であり、またはこのようなマトリックスを分泌する細胞を増殖し、
分泌細胞を除去し、そして移植されるべき細胞がマトリックスに対して相互作用
および接着することを可能にすることにより調製され得る。その上に移植される
べき細胞が増殖するマトリックス物質、または細胞と混合されるマトリックス物
質は、ＲＰＥ細胞自身の常在性の産物であり得る。従って、例えば、マトリック
ス物質は、移植されるべきＲＰＥ細胞により産生および分泌される細胞外マトリ
ックスまたは基底膜物質であり得る。

【００３０】細胞の接着、生存および機能を改善するために、固体マトリックスは、細胞の
接着、増殖、または生存を促進するため、当該分野で公知の因子で、必要に応じ
てその外部表面をコートされ得る。このような因子としては、細胞接着分子、細
胞外マトリックス（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラス
チン、グリコサミノグリカン、またはプロテオグリカンのような）、または増殖
因子（例えば、神経増殖因子（ＮＧＦ）のような）が挙げられる。あるいは、移
植された細胞が付着される固体マトリックスが多孔性の物質からなる場合、増殖
促進因子もしくは生存促進因子は、そこからマトリックス物質に組み込まれ得、
インビボでの移植後、緩徐に放出される。

【００３１】本発明による支持体に付着された場合、移植に用いられた細胞は、一般に支持
体の「外部表面」上に存在する。この支持体は、固体または多孔体であり得る。
しかし、多孔性の支持体でさえ、細胞は、膜または他のバリアへの介入なしに、
外部環境と直接接触する。従って、本発明に従って、細胞は、たとえ細胞が付着
する表面が、粒子またはビーズ自体の外側にない多孔性支持体物質の内部折りた
たみまたは回旋の形態であり得るにしても、支持体の「外部表面」にあると考え
られる。

【００３２】支持体の立体配置は、好ましくは、ビーズのような球状であるが、円柱状、楕
円形、平坦なシートまたは片、針またはピン状などであり得る。支持マトリック
スの好ましい形態は、ガラスビーズである。別の好ましいビーズは、ポリスチレ
ンビーズである。ビーズのサイズは、直径で約１０ミクロン〜１ｍｍ、好ましく
は約９０μｍ〜約１５０μｍの範囲であり得る。種々の微小担体（ｍｉｃｒｏｃ
ａｒｒｉｅｒ）ビーズの記載については、例えば、以下を参照のこと：Ｆｉｓｈ
ｅｒＢｉｏｔｅｃｈＳｏｕｒｃｅ８７〜８８、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃＣｏ．、１９８７、７２〜７５頁；ＳｉｇｍａＣｅｌｌＣｕｌ
ｔｕｒｅＣａｔａｌｏｇ，ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣＯ．，Ｓｔ，Ｌ
ｏｕｉｓ，１９９１、１６２〜１６３頁；ＶｅｎｔｒｅｘＰｒｏｄｕｃｔＣ
ａｔａｌｏｇ、ＶｅｎｔｒｅｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１９８９；これら
の参考は、参考として本明細書に援用されている；ビーズのサイズの上限は、移
植細胞の機能を妨害し得るが、または周囲の組織に損傷を生じ得る、所望されな
い宿主反応のビーズの刺激により決定され得る。ビーズのサイズの上限はまた、
投与の方法により決定され得る。このような制限は、当業者によって容易に決定
可能である。

【００３３】（免疫学的優位（ｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ）部位を生成する薬学的処方物および
方法）本発明は、局所的な免疫抑制的環境を生成するための方法および組成物を包含
する。本発明に従った使用のための薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に受容可
能なキャリアまたは賦形剤を用いて通常の様式で処方され得る。従って、ＲＰＥ
細胞およびＲＰＥ細胞と同時に移植されるべき任意の細胞、組織またはマトリッ
クス、ならびに薬学的に受容可能な塩および溶媒は、外科的な移植または注射に
よる投与のために処方され得る。本明細書において用いられるように、薬学的に
受容可能なキャリアは、任意のおよび全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗
菌剤および抗真菌剤、等張剤などを含む。このような培地および薬剤の使用は、
当該分野において周知である。

【００３４】本発明はまた、ＲＰＥ細胞を含むことに適合した容器、および治療的分子を産
生する細胞を含むことに適した第２の容器を受容することに適合した区画化され
たキットを包含する。本発明はまた、包装材を含む製品および包装材内に含まれ
たＲＰＥ細胞に関する。

【００３５】本発明の方法は、選択された組織に近接して位置するようにするための哺乳動
物内へのＲＰＥ細胞の投与を包含する。例えば、この位置は、哺乳動物の体内の
任意の部位（例えば、内皮組織、筋組織、神経組織、および器官など）であり得
る。ＲＰＥ細胞の組織への近接は、移植されている特定の組織、および所定の移
植において回復されることを求められる機能により決定される。

【００３６】ＲＰＥ細胞の投与は、従来の技術で達成される。ＲＰＥ細胞の投与のための好
ましい技術としては、宿主内へのＲＰＥ細胞の注射または宿主内への細胞の外科
的移植が挙げられる。移植の前に、レシピエントの哺乳動物は、従来の技術によ
って局所麻酔または全身麻酔を用いて麻酔され得る。

【００３７】本発明の目的を達成するために必要なＲＰＥ細胞の数は、移植されている特定
の組織およびＲＰＥ細胞の所望の機能に依存して変化する。例えば、ＲＰＥ細胞
は、免疫学的優位の部位を提供するために有効な量で投与される。一般に、この
ような有効量は、引き続いてまたは同時に投与された細胞または組織の免疫拒絶
を予防するように規定される。本発明の実施において用いられるためのＲＰＥ細
胞の用量範囲は、１０³〜１０⁹細胞の間で変化し得る。しかし投与されるＲＰＥ
細胞の好ましい用量は、１０⁵〜１０⁷細胞の間である。免疫拒絶は、例えば、組
織学的にまたは同時移植された細胞もしくは組織の機能的評価により決定され得
る。

【００３８】ＲＰＥ細胞と、機能的に活性な治療的タンパク質または他の生物学的に活性な
分子を産生する細胞との同時投与を含む本発明の実施態様では、この細胞は治療
的に有効な量で投与される。本発明のこのような実施態様では、ＲＰＥ細胞は、
単独の組成物として、あるいは、２つの別の組成物として同時投与され得る。さ
らに、ＲＰＥ細胞は、免疫学的な優位部位を維持するための必須物として有効量
で再投与され得る。あるいは、治療的タンパク質または他の生物学的に活性な分
子を供給する同時投与された細胞は、治療的効果を維持するため有効量で再投与
され得る。

【００３９】本発明のさらに別の実施態様では、移植された細胞は、移植の前にインビトロ
でマトリックスに付着し得る。移植されるべき細胞の数は、当業者によって当該
分野で公知の方法により決定され得、そして細胞により産生される治療的タンパ
ク質または他の生物学的に活性な分子の量、および疾患を処置するために必要な
分子の治療的に有効な公知の量に依存する。

【００４０】以下の実施例は、例証のために提供され、本発明を限定しない。

【００４１】（実施例）（ＲＰＥ細胞による免疫学的かつ生物学的に活性なＦＡＳＬの産生）以下の節は、網膜色素性上皮細胞が生物学的に活性なＦａｓＬを発現すること
を実証する実験結果を記載する。抗ＦａｓＬ抗体を用いた酵素結合免疫アッセイ
は、ＦａｓＬの実質的な量が網膜色素性上皮細胞により培養培地に放出されたこ
とを示した。さらに、分泌されたＦａｓＬは、ヒト胎児の胸腺細胞におけるアポ
トーシスの誘導において生物学的に活性であった。

【００４２】（網膜色素性上皮細胞の単離および培養）ＲＰＥ細胞の初代単離物を、妊娠１８〜２０週のヒト胎児の眼を用いて作製し
た。胎児の眼を受胎産物の収集の１５分以内に収集し、そしてその外部表面を、
冷却した滅菌生理食塩水溶液で手短に洗浄し、可能な限り多くの外因性の汚染を
除去する。この眼の組織を溶液Ａ（最終濃度２％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）になる
ようにペニシリン／ストレプトマイシン／ファンギゾン貯蔵溶液（Ｇｉｂｃｏ、
カタログ番号１５４２０−０３９）を添加しているＲＰＭＩ１６４０培養培地
（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号２２−４００）を含有する解剖皿に移す。

【００４３】滅菌したピンセットおよびハサミを用いて、余分な脂肪組織を眼の組織から切
除する。滅菌の使い捨てメスを用いて、眼の組織を虹彩の直後で切断しそして前
部の組織を廃棄する。眼の組織の後部２／３をメスで上端から下端まで切りだし
、そして２つの半分の内側表面を上向きにする。次いで、それぞれの半分を、３
〜４の１インチ滅菌使い捨て２３ゲージ針（Ｂａｘｔｅｒ、カタログ番号２３Ｇ
１）を用いて解剖皿の底のシリコン層に付着させた。これは色素性網膜上皮細胞
層を露出する。これをＲＰＥ細胞シートが付着している脈絡膜から穏やかにはが
す。通常、ＲＰＥ細胞の２つの大きいシートをそれぞれの眼から回収する。

【００４４】一旦、ＲＰＥ細胞層を剥離すると、脈絡膜の有意な混入があるか否かを決定す
ることが顕微鏡的に検査される。このＲＰＥ細胞層を皿から１０ｍｌの滅菌溶液
Ａに移す。濾過滅菌されたコラゲナーゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ^TM、Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を最終濃度１ｍｇ／ｍｌに添加する。ＲＰＥ組織を
、３７℃の水槽に移し、そして１５分間インキュベートする。次いで、このチュ
ーブを、Ｂｅｃｋｍａｎｂｅｎｃｈｔｏｐ遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ、モデル番号ＧＰＲ）で室温で１００×ｇで５分間遠心分離する。このチューブをラ
ミナフローのフードに戻し、そして水相を穏やかに吸引する。１０ｍｌの培養培
地（１０％仔ウシ血清、２ｍＭグルタミンおよび酸性ＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌを
含有するＲＰＭＩ１６４０）を添加し、そしてペレットのＲＰＥ組織を再懸濁
する。懸濁液の少量のアリコートを顕微鏡のスライド上に置き、そして顕微鏡的
に検査する。コラゲナーゼ消化工程は、ＲＰＥ細胞の鞘の限定断片化を生じ、そ
して小さい残留脈絡組織および関連の細胞混入物を取り除くが、ＲＰＥ細胞層の
単一細胞への解離は生じない。

【００４５】上記のように引き出されたＲＰＥ細胞を、１０ｍｌの培養培地（抗菌剤／抗真
菌剤の貯蔵溶液が１％の最終濃度に添加される）に再懸濁した。すべての培養試
薬（継代培養に利用される培地、血清、ＦＧＦ、グルタミンおよびトリプシン）
は、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＬａｂｓによる細胞製造のＧＭＰに適合していた。
これらの規格に適合した試薬は、ＲＰＥ組織の初代単離物の細胞増殖の開始相の
ためにＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＬａｂｓによって提供される。ＲＰＥ細胞懸濁液
を、細胞の付着を容易にするため、組換えの付着タンパク質であるプロネクチン
Ｆ（ＰｒｏｎｅｃｔｉｎＦ）（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
カタログ番号５００２−００、ロット番号Ｒ０１１７−ｃ）でコートされる２５
ｍｌのＦａｌｃｏｎの培養フラスコに移す。

【００４６】フラスコは以下のようにコートする：滅菌プロネクチンＦの５ｍｇバイアルを
、ラミナフローのフード中で５ｍｌの滅菌希釈溶液（水中に過塩素酸リチウム）
に溶解した。アリコートを適合したリン酸緩衝液化生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉ
ｂｃｏ，カタログ番号１４２８７）と混合し、１０μｇ／ｍｌのプロネクチンＦ
濃度にする。この溶液の５ｍｌをＦａｌｃｏｎ培養フラスコに無菌的に移し、こ
れをラミナフローのフード中に室温で２時間立てたままにした。溶液を滅菌ピペ
ットで取り出し、そしてフラスコを滅菌プロネクチンＦを含まないＰＢＳで２回
リンスする。このフラスコを、２回目のリンス溶液の除去後、ラミナフローのフ
ード中で乾燥させた。フラスコにキャップを締め、そしてこのフラスコをＲＰＥ
細胞培養について４ケ月まで冷蔵保存する。

【００４７】プロネクチンＦによるコーティングは、コートしていないフラスコでみられる
細胞分裂に比べて、４〜５倍まで細胞分裂を容易にする。プロネクチンＦでみら
れた結果は、培養フラスコをコートしたマウスのラミニン（Ｇｉｂｃｏ、カタロ
グ番号Ｌ２０２０）およびヒトのラミニン（Ｓｉｇｍａ、胎盤由来、カタログ番
号Ｌ６２７４）でみられた結果とほぼ等価である。

【００４８】ＲＰＥ細胞の初期培養を、ストック溶液抗細菌／抗真菌補助溶液を最終濃度１
％で加えられた培養培地中で行う。抗細菌／抗真菌補助溶液を最終濃度１％未満
で添加した場合、この培養物は、産道移行期間中、組織によって獲得される微生
物薬剤によって均一に混入される。抗細菌／抗真菌補助溶液が培養培地から除か
れた場合、この培養物は、産道を移行する間に、組織によって得られる微生物薬
剤によって均一に混入される。抗細菌／抗真菌補助物が培養培地から除去された
場合、この培養物は、産道を移行する間に、組織によって獲得される微生物試薬
によって均一に混入される。少なくとも１週間に一度の培地変更とともに、抗細
菌／抗真菌薬剤をＲＰＥ培養物中で約２週間維持する。その後、培養物をさらに
２週間、抗細菌／抗真菌を含まない培養培地に換える。抗細菌／抗真菌試薬が、
組織培養開始時から存在する場合、１０の培養物の内の１未満の培養物は、抗細
菌／抗真菌を含まない培養培地への移動後、細菌、酵母または真菌の混入の証拠
を示す。

【００４９】ＲＰＥ細胞培養の間の培地変更頻度を、培養物中のグルコースおよびラクテー
トを変更することによって指示する。ＲＰＥ細胞の初期播種の後、培地のアリコ
ートを２〜３日置きに一回フラスコから取りだし、そしてＹＳＩグルコース−ラ
クテート分析機器（ＹＳＩ、型番２７００）を用いて、このアリコートをグルコ
ースおよびラクトース分析に供した。この分析機器を、ＹＳＩによって提供され
るグルコースおよびラクテートの内部基準を用いて、各アッセイで標準化する。
この分析によって、この培養物が、グルコースの１／２〜２／３を超えて消費し
たことを示す場合、この培養培地を変更する。最小値である場合、この培養培地
を１週間に一回変更し、抗細菌／抗真菌薬剤の効果濃度を維持することを保証す
る。

【００５０】産生されたラクテートに対する消費されたグルコースの比較もまた決定される
。非感染性の培養培地は、０．８０：１の比率のグルコース：ラクテート、およ
びほぼコンフルエントな培養物に対してより低密度な集団を提示する。低密度培
養物による過剰なラクテート産生は、細菌の混入の指標としてみなされ、このよ
うな培養物は処分される。ほぼ当量のラクテート蓄積の非存在下でのグルコース
の過剰な消費は、真菌混入または酵母混入の指標としてみなされ、このような培
養物は処分される。

【００５１】単眼に直接的に由来するＲＰＥ細胞の収量は、約２５０，０００〜１，０００
，０００の範囲である。この細胞は微小な円形であり、そして細胞に濃黒色外見
を与えるメラニン顆粒で満たされている。培養への導入において、細胞は、フラ
スコに取り付けられたＲＰＥシートのフラグメントから移動する。メラニン顆粒
は、移動細胞の９５％を超えて明らかであり、そして調製物中のＲＰＥ細胞の純
度の指標を構成する。形態学的に、このＲＰＥ細胞は、微小な円形の黒色細胞か
ら、より大きな立方形の細胞に変化し、この細胞は、ＲＰＥ組織フラグメントか
ら外部へ広がる場合、非常に縮小された色素沈着を有する。コンフルエントな培
養の確立の際に、本来の形態学的外見が再獲得される。コンフルエント状態の２
５ｃｍ²培養フラスコは、約５，０００，０００細胞を産生する。この細胞を０．２％のトリプシン（放射滅菌され、限定される）に１０分間の曝露をすること
によってフラスコから回収した後、滅菌スパーテル（ＣｏＳｔａｒ，カタログ番
号３００８）を用いてフラスコ表面からこの細胞を剥ぎ取る。この細胞は非常に
強い接着性を有し、そしてトリプシン消化のみでフラスコから細胞を解離するの
に必要とされる時間の伸長は、非常に低い細胞生存率（１０％以下）を生じてし
まうため、剥ぎ取り工程は必要である。トリプシン処理と剥ぎ取り工程の組み合
わせは、ＴｒｙｐａｎＢｌｕｅ色素排除によって判定した場合、９０％を超え
る生存率を有する調製物を産生する。

【００５２】フラスコから回収されたＲＰＥ細胞を、３つのアリコートに分割し、そしてさ
らに以下のようにプロセスする。抗細菌／抗真菌を含まない培養培地１ｍｌのア
リコート１（約４，５００，０００細胞）およびアリコート２（約４５０，００
０細胞）を、最終濃度が７．５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ２６５
０、エンドトキシンに適され、そして培養中で試験される）および２０％適格ウ
シ胎児血清になるように調整する。この細胞を凍結保存バイアルに移し、制御速
度凍結保存装置（Ｎａｌｇｅ、Ｃｒｙｏ−１−Ｃ、カタログ番号５１００−００
１）中で凍結する。使用されるこのバイアルは、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ、カタログ番号２５７０４）からである。アリコート３は、ＲＰＥ細胞の公知
のマーカーに対して、免疫ペルオキシダーゼ染色、免疫蛍光染色、および免疫組
織化学染色を行うために利用される。この細胞をプロネクチンＦ（Ｐｒｏｎｅｃ
ｔｉｎＦ）で被覆した滅菌複数ウェルガラススライス上に播種し、そしてこの
細胞を培養インキュベーター中で、終夜で付着することを許容し、次いで、ＲＰ
Ｅ細胞の純度を判定するために、サイトケラチン、小胞性ドーパミン輸送タンパ
ク質、およびチロシンヒドロキシラーゼを含む培養物中のマーカーの存在につい
て、さらに評価した。

【００５３】（馴化培地のＥＬＩＳＡアッセイ）ＳｉｇｍａＴｙｐｅ１ａ（カタログ番号Ｃ−９８９１）のコラゲナーゼの
利用、および２つの培養培地を記載されるような異なる実験で利用することを除
いて、上記に記載のように、ＲＰＥ細胞を単離し、そして培養した。まず初めに
、細胞をＤＭＥＭ−Ｆｌ２培養培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２４４０−２
０および１７６５−０２１）またはＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番
号２１８７０−０８４のいずれかに播種した。両方の培養培地に２ｍＭグルタミ
ン、１０％ウシ胎児血清、抗細菌／抗真菌試薬および酸性ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍ
ｌ）を補充した。この細胞を、マウスラミニン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ｌ２
０２０）またはプロネクチンＦ（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、
カタログ番号５００２−００、ロット番号Ｒ０１１７−Ｃ）のいずれかで被覆し
た培養フラスコに播種した。このＲＰＥ細胞をコンフルエントまで増殖させ、１
０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地または２％ウシ胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ１６４０のいずれかに継代した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２を使用した場合、細
胞をラミニンで被覆したフラスコ上に播種した。ＲＰＭＩ１６４０培地を使用
した場合、細胞をプロネクチン被覆フラスコ上にサブクローンした。

【００５４】ＲＰＥ細胞がコンフルエントに達した場合、この培養培地を収集し、そしてＥ
ＬＩＳＡもしくは胎児胸腺細胞を用いたバイオアッセイによる、ＦａｓＬの存在
についてアッセイされるまで−８０℃で凍結保存した。ＥＬＩＳＡアッセイプロ
トコルは、以下の工程を含む。９６ウェルプレート（ｑｕａｌｉｔｙＢｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号３７９１）を、１ウェルあたり１００μｌの保存
抗体溶液（１０μｇ抗体／ｍｌ）添加する工程および被覆する工程を低温室で終
夜続けることを許容する工程によって、抗ヒトＦａｓＬ抗体（ＳａｎｔａＣｒ
ｕｚＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＳＣ−９５６またはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ
、カタログ番号６５４３１ａ）で被覆した。次いで、９６ウェルプレートを、０
．０５％Ｔｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ−２０、ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１７０
−６５３１）を含む０．５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｒｖｉｎ
ｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号９２４０）で３回洗浄した。次いで、
ＰＢＳ中２００μｌの１％ウシ血清アルブミン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番
号ＲＰＮ４１２）でプレート上の未結合部分を被覆することによって、非特異
的なタンパク質結合を最小限度にした。３７℃で２時間静置した後、ブロッキン
グ溶液をデカントし、そしてこのウェルを、０．５ｍｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで
１回洗浄した。上記のように調製したプレートを、ＦａｓＬペプチド（Ｓａｎｔ
ａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＳＣ９５６Ｌ、１００μｌのＰＢ
Ｓ中の０〜１００ｎｇに対して標準曲線を作製した）か、またはＲＰＥ細胞（継
代数０〜継代数９）から収集された１００μｌの馴化培地のいずれかと共にさら
にインキュベートした。馴化培地中のＦａｓＬペプチドまたはＦａｓＬを室温で
１時間プレートに結合した後、このプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し
た。第２に、ビオチン化抗ヒトＦａｓＬ抗体をサンドイッチを形成させるために
添加した（ビオチン化ＮｏＫ−１抗体、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号６
５３２２、５μｌ／ｍｇの１００μｌの溶液）。室温で１時間結合させた後、結
合していない抗体をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎの３回の洗浄でプレートから洗い流した
。次いで、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液（ＡＢＣＶｅｃｔｒａ
ｓｔａｉｎ、ＶｅｃｔｏｒＬｏｂｓ、カタログ番号ＰＫ−６１００）を１ウェ
ルあたり５０μｌ添加し、ビオチン−抗体への結合を室温で３０分間のインキュ
ベーションによって行った。結合していないアビジン−西洋ワサビペルオキシダ
ーゼをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎの３回の洗浄で除去した。次いで、１００μｌのＯＰ
Ｄ溶液を発色のために加えた。このＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン、Ｓｉｇ
ｍａ、カタログ番号Ｐ６６６２）溶液を１％の過酸化水素を含む５０ｍＭのリン
酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ５．０中（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−４９２２）
にＯＰＤを０．５ｍｇ／ｍｌで溶解することによって、回復させた。室温でのプ
レートのインキュベーションによって適切な発色が生じた後、２Ｎの硫酸溶液（
Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ−１５２６）を添加することによって、この反応を
停止した。Ｂｉｏ−ＴｅｋＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＢｉｏＫｉｎｅｔｉｃｓプ
レートリーダー（型式ＥＬ３４０）で４９０ｎｍフィルターを使用して、このプ
レートの吸収度を決定した。

【００５５】標準曲線を、ＦａｓＬ（ＳＣ０５６７）のＮ末端２２アミノ酸合成ペプチドを
使用して作製した。培養細胞の標準曲線を作製するために使用される補充物と同
一の補充物と共に、このペプチドを２００μｌの反応培地あたり０〜６０ｎｇの
ＦａｓＬペプチドで培養培地に添加した。

【００５６】（アポトーシスバイオアッセイに誘導されるＦａｓＬ）交差反応物質がアポトーシスを誘導し得るか否か決定するために、インタクト
のＦａｓＬ（表面結合または遊離）の場合も同様に、バイオアッセイを行った。

【００５７】リンパ球集団のアポトーシスは、細胞表面結合Ｆａｓのそのリガンド、Ｆａｓ
Ｌとの相互作用に対して誘導性である。しかし、アポトーシスの誘導は、リンパ
球の活性化を要求する（すなわち、Ｔ細胞サブセットの抗ＣＤ３抗体での処置に
よるように）。胎児胸腺細胞は、インビボで高い活性化状態にあり、そしてアポ
トーシスのインビトロでの研究に、活性化の必要なく使用され得る。

【００５８】胎児胸腺細胞を用いる実験プロトコルは以下の通りである：単離された新鮮な
７，５００，０００のヒト胎児胸腺細胞（ＡＢＲ、Ｉｎｃ）を、５ｍｌの新鮮な
培地またはＲＰＥ細胞馴化培地（１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培
地）中で６〜１２時間インキュベートした。アッセイに使用されたＲＰＥ細胞馴
化培地は、ＥＬＩＳＡアッセイによってＦａｓＬ含有量について以前にスクリー
ニングされ、そして馴化培地の０〜１３ｎｇ／１００μｌの範囲の濃度において
材料と交差反応するＦａｓＬを含んだ。

【００５９】インキュベーションに続いて、この細胞を遠心分離において遠心沈殿させ（１
００ｒｐｍで５分間）、そして細胞をペレット固定し、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎに
よって提供されるＡＰＯ−ＤＩＲＥＣＴ^TMキットを使用して、透過化処理そして
染色した。染色工程は、総ＤＮＡ含有量については、ヨウ化プロピジウムの使用
、ならびに標識ＤＮＡ鎖切断（ｌａｂｅｌＤＮＡｃｈａｉｎｂｒｅａｋ）
に対しては、ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰおよび末端デオキシヌクレオチドトランスフェ
ラーゼ（ＴｄＴ）の使用を含む。ヨウ化プロピジウムおよびＦＩＴＣ−ｄＵＴＰ
蛍光を定量するために、Ｂｅｃｋｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＦＡＣＳスキャ
ンセルソーターを使用して、２色ＦＡＣＳ分析を行った。細胞凝集を排除するた
めに、電子ゲート（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｇａｔｉｎｇ）を利用した。したが
って、このデータは単一細胞についてである。

【００６０】（結果）（ＥＬＩＳＡアッセイの結果）ＦａｓＬ（ＳＣ９５６７）のＮ末端２２アミノ酸合成ペプチドを使用して、標
準曲線を作製した。作製された標準曲線データを以下に示す。

【００６１】

【表１】上記の標準曲線の値を使用して、ＲＰＥ細胞馴化培地（ＲＰＥＣＭ）（１０
０μｌアリコートあたりの値）におけるＦａｓＬ交差反応物質の値を、Ｓａｎｔ
ａＣｒｕｚ抗ＦａｓＬ抗体を使用して算出し、そして以下に列挙する。

【００６２】

【表２】ＲＰＭＩ１６４０＋２％もしくは＋１０％ウシ胎児血清、またはＤＭＥＭ／
Ｆ１２＋１０％ウシ胎児血清中で増殖させた後期継代ＲＰＥ細胞のＥＬＩＳＡア
ッセイを以下に示す。前者の場合において、プロネクチンＦ被覆したフラスコ上
に細胞を播種したのに対し、後者の場合、この細胞をマウスラミニン上に播種し
た。ＦａｓＬの質量の算出を、１アッセイあたり５ｎｇのＳＣ９５６７Ｆａｓ
Ｌペプチド値に対する４９０ｎｍでの吸光度で規格化した。ＲＰＥ細胞に曝露さ
れていない培地のコントロールもまた含まれる。結果を以下に示す：

【００６３】

【表３】

【００６４】

【表４】（胸腺細胞に対するアポトーシス誘導活性についてのＲＰＥ馴化培地の評価）上記の結果は、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏＴｅｃｈの抗体調製物を用いた
アッセイにおいて、ＲＰＥ細胞は、ＦａｓリガンドのＮ末端ペプチドに免疫学的
に関連する物質を培養培地に放出することを示す。同様の実験を、Ｐｈａｒｍｉ
ｎｇｅｎから入手した抗ＦａｓＬ抗体を使用して行ったところ、ＦａｓＬ交差反
応物質の存在が確認された。

【００６５】ネガティブコントロール細胞またはポジティブコントロール細胞を、ＴｄＴ酵
素の存在下で、ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰで処置する。これは、ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰの
アポトーシス細胞に見出されるＤＮＡフラグメントへの組込みを誘導する。次い
で、ヨウ化プロピジウムで細胞を染色し、そしてＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｉｎ
ｓｏｎＦＡＣＳＣＡＮ^TMで分析する。アポトーシス細胞の存在は、アポトーシ
ス細胞がＦＩＴＣで明瞭に標識された（黄−緑細胞）場合、増加した蛍光強度に
よって示されるが、非アポトーシス細胞は、ヨウ化プロピジウムの赤染色のみ示
す。

【００６６】ＦＡＣＳ分析の結果を図１に示し、図２に添付した表挿入物に要約する。手短
に要約すると、新鮮培地中でインキュベートされた胸腺細胞（ＲＰＥ細胞に曝露
しない）におけるアポトーシスは、約１２％である。ＲＰＥＣＭのＦａｓＬ濃
度がその最高値、すなわち１３ｎｇ／１００μｌの馴化培地に達するまで、アポ
トーシスの指標は見られなかった。この時点で、アポトーシス値は２４％、すな
わちコントロール培地の値の約２倍に上昇していた。より低いＦａｓＬ濃度で生
成されたアポトーシスが見られなかったことは、ＦａｓＬが有意に分解されるこ
とを示し得るか、またはアポトーシス誘導活性は、高濃度に達するまで遊離リガ
ンドとして下限に近いことを示し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ＦａｓＬ誘導されたアポトーシスのＦＡＣＳ分析。アポトーシス細胞の存在は
、蛍光強度の増加により実証される。アポトーシス細胞のパーセントは、培地中
に存在するＦａｓＬのレベルに比例して増加する。

【図１Ｂ】ＦａｓＬ誘導されたアポトーシスのＦＡＣＳ分析。アポトーシス細胞の存在は
、蛍光強度の増加により実証される。アポトーシス細胞のパーセントは、培地中
に存在するＦａｓＬのレベルに比例して増加する。

【図２Ａ】ＦａｓＬ誘導されたアポトーシスのＦＡＣＳ分析。ＦａｓＬの存在下で増加さ
れたアポトーシスは、以下の各ＦＡＣＳ分析に示される添付の表の挿入に示され
る。

【図２Ｂ】ＦａｓＬ誘導されたアポトーシスのＦＡＣＳ分析。ＦａｓＬの存在下で増加さ
れたアポトーシスは、以下の各ＦＡＣＳ分析に示される添付の表の挿入に示され
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 5/00 Ａ６１Ｐ 1/16 9/00 3/00 11/00 5/00 25/00 9/00 37/04 11/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 25/00 Ａ６１Ｋ 37/02 37/04 37/24 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/66 (72)発明者コーンフェルドット，マイケルエル．アメリカ合衆国ニュージャージー 07960，モリスタウン，カンタベリーウェイ 22 (72)発明者キドウェル，ウイリアムアール．アメリカ合衆国メリーランド 21754− 9045，イジャムスビル，ローウェルコート 10905 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA13 DA01 DA12 DA19 DA21 DA58 DB01 DB52 DB57 MA02 NA14 ZA012 ZA162 ZA362 ZA592 ZA752 ZB022 ZB032 ZB052 ZB072 ZC212 ZC352 ZC752 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA16 ZA36 ZA59 ZA75 ZB02 ZB03 ZB05 ZB07 ZC21 ZC35 ZC75 4C087 AA01 AA02 BB51 BB56 MA01 MA02 NA14 ZA01 ZA16 ZA36 ZA59 ZA75 ZB02 ZB03 ZB05 ZB07 ZC21 ZC35 ZC75

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物において免疫優位部位を生成するための方法であっ
て、ここで、該方法は、該哺乳動物における部位に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞
を、該部位に免疫学的に優位な部位を生成するために効果的な量で投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２】哺乳動物における疾患を処置する方法であって、ここで、該
方法は、該処置の必要性のある哺乳動物に対して、治療タンパク質または生物学
的に活性な分子を供給する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を投与する工程を包含し
、ここで、該ＲＰＥ細胞は、該哺乳動物における部位に、該部位において免疫学
的に優位な部位を生成し、そして治療効果を持続するために効果的な量で投与さ
れる、方法。
【請求項３】哺乳動物における疾患を処置する方法であって、該方法は、
治療タンパク質または他の生物学的に活性な分子を供給する細胞と共に、網膜色
素上皮（ＲＰＥ）細胞を同時投与する工程を包含し、ここで、該ＲＰＥ細胞は、
哺乳動物における部位に、該部位において免疫学的に優位な部位を生成するため
に効果的な量で投与され、そして、治療タンパク質または他の生物学的に活性な
分子を供給する該細胞は、治療効果を持続するために効果的な量で該部位に投与
される、方法。
【請求項４】哺乳動物における疾患を処置する方法であって、ここで、該
方法は、該哺乳動物の部位に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を投与する工程、およ
び治療タンパク質または他の生物学的に活性な分子を供給する細胞を続いて投与
する工程を包含し、ここで該ＲＰＥ細胞は、該部位において免疫学的に優位な部
位を生成するために効果的な量で投与され、そして治療タンパク質または他の生
物学的に活性な分子を供給する該細胞は、治療効果を持続するために効果的な量
で該部位に投与される、方法。
【請求項５】請求項２、３、または４に記載の方法であって、ここで、前
記治療タンパク質または他の生物学的に活性な分子は、増殖因子、サイトカイン
、ホルモン、ホルモンのペプチドフラグメント、サイトカインのインヒビター、
ペプチド増殖因子またはペプチド分化因子、インターロイキン、ケモカイン、イ
ンターフェロン、神経伝達物質、コロニー刺激因子あるいは脈管形成因子からな
る、方法。
【請求項６】請求項２に記載の方法であって、ここで前記ＲＰＥ細胞は、
前記治療タンパク質または他の生物学的に活性な分子をコードする核酸により形
質転換される、方法。
【請求項７】請求項３または４に記載の方法であって、ここで、前記治療
分子を産生する前記細胞は、前記治療タンパク質または他の生物学的に活性な分
子をコードする核酸により形質転換される細胞である、方法。
【請求項８】請求項１、２、３、または４に記載の方法であって、ここで
、前記ＲＰＥ細胞あるいは治療タンパク質または他の生物学的に活性な分子を供
給する前記細胞は、マトリックスに付着される、方法。
【請求項９】請求項３または４に記載の方法であって、ここで、前記ＲＰ
Ｅ細胞および治療タンパク質または他の生物学的に活性な分子を供給する前記細
胞は、マトリックスに付着される、方法。
【請求項１０】請求項１、２、３、または４に記載の方法であって、ここ
で、前記投与は、移植によるものである、方法。
【請求項１１】請求項１、２、３、または４に記載の方法であって、ここ
で、前記ＲＰＥ細胞は、１０³〜１０⁷細胞の投薬量で投与される、方法。
【請求項１２】請求項３または４に記載の方法であって、ここで、前記生
物学的因子を産生する前記細胞は、１０³〜１０⁷細胞の投薬量で投与される、方
法。
【請求項１３】請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記移植は、
異種移植によるものである、方法。
【請求項１４】請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記移植は、
同種移植によるものである、方法。
【請求項１５】請求項２、３、または４に記載の方法であって、ここで、
前記疾患は、神経性疾患、心疾患、内分泌疾患、肝臓疾患、肺疾患、代謝疾患、
または免疫学的疾患からなる、方法。
【請求項１６】請求項１、２、３、または４に記載の方法であって、ここ
で、該方法は、前記部位において免疫学的に優位な部位を持続するために効果的
な量でＲＰＥ細胞を該部位に再投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１７】請求項２、３、または４に記載の方法であって、ここで、
該方法は、前記部位において治療効果を持続するために効果的な量で、ＲＰＥ細
胞、または前記治療タンパク質もしくは他の生物学的に活性な分子を供給する細
胞を該部位に再投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】請求項２、３、または４に記載の方法であって、ここで、
該方法は、前記哺乳動物に全身性の免疫抑制剤を投与する工程をさらに包含する
、方法。
【請求項１９】網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、および治療タンパク質また
は他の生物学的に活性な分子を産生する細胞、および薬学的に受容可能なキャリ
アを含む、薬学的組成物。
【請求項２０】網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、および薬学的に受容可能な
キャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２１】マトリックスに付着される網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を
含む、薬学的組成物。
【請求項２２】網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、および治療タンパク質また
はマトリックスに付着される他の生物学的に活性な分子を産生する細胞を含む、
薬学的組成物。
【請求項２３】請求項１９または２２に記載の組成物であって、ここで、
前記治療タンパク質または他の生物学的に活性な分子は、増殖因子、サイトカイ
ン、ホルモン、ホルモンのペプチドフラグメント、サイトカインのインヒビター
、ペプチド増殖因子またはペプチド分化因子、インターロイキン、ケモカイン、
インターフェロン、コロニー刺激因子あるいは脈管形成因子からなる、組成物。
【請求項２４】哺乳動物における疾患の処置における使用のためのキット
であって、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を収容するために適応される第一の容器
、および該第一の容器内に収容されるＲＰＥ細胞、ならびに該疾患が存在しない
または欠損している治療分子を産生する細胞を収容する第二の容器、および該第
二の容器内に保持される該治療分子を産生する細胞を包含する、キット。
【請求項２５】請求項２４に記載のキットであって、ここで、治療分子を
産生する前記細胞は、ランゲルハンス細胞の膵島である、キット。
【請求項２６】請求項２４に記載のキットであって、ここで、前記ＲＰＥ
細胞は、マトリックスに付着される、キット。
【請求項２７】請求項２４に記載のキットであって、ここで、治療分子を
産生する前記細胞は、マトリックスに付着される、キット。
【請求項２８】包装材料および該包装材料内に保持される網膜組織上皮（
ＲＰＥ）細胞を含む製品であって、ここで、該ＲＰＥ細胞は、哺乳動物において
免疫学的に優位な部位を生成するために有効であり、そして、該包装材料は、該
細胞が哺乳動物において免疫学的に優位な部位を生成するために使用され得るこ
とを示すラベルを含む、製品。
【請求項２９】Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）を産生する方法であって、（
ｉ）該ＦａｓＬを発現する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を培養する工程：および
（ｉｉ）細胞培養物からＦａｓＬを回収する工程を包含する、方法。