JP2002509727A - 遺伝子突然変異誘発および遺伝子発見のためのベクター - Google Patents

遺伝子突然変異誘発および遺伝子発見のためのベクター

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Abstract

(57)【要約】 これまで知られていなかった細胞性遺伝子を効率的にトラップし、同定するために用いることができる新規な3’遺伝子トラップカセットを特に組み込んだ新規なベクターが記述される。上記の3’遺伝子トラップカセットを組み込んだベクターは、遺伝子発見ならびに突然変異させた細胞および動物の作製に特定の用途を見いだす。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】1.0.発明の属する技術分野 本発明は、いったんベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれたならば、同定す
ることが可能で、かつ効果的に突然変異させることが可能な細胞性遺伝子の数を
増大させる構造エレメントを組み込んだ組換えベクターに関する。このベクター
は、遺伝子発見、遺伝子クローニング、遺伝子突然変異、遺伝子調節、核酸配列
のゲノム内シャトリング(shuttling)、ならびに遺伝子活性化および過剰発現の ための重要な手段である。
【０００２】2.0.発明の背景 遺伝子トラップ法は、遺伝子の突然変異と同定を同時に行うための強力なアプ
ローチを提供する。遺伝子トラップベクターは、標的細胞のゲノム中に非特異的
に挿入されうる。したがって、遺伝子トラップベクターが遺伝子に挿入されて該
遺伝子を突然変異させる現象を選択する遺伝子トラップベクターが構築されてき
た。細胞性スプライシング機構を利用することにより、これらのベクターの選択
的性質は、ベクターが遺伝子内に組み込まれない、大きなバックグラウンドとな
る挿入を取り除く。
【０００３】 殆どの哺乳動物遺伝子はエキソンおよびイントロンに分けられる。エキソンと
は、mRNAにスプライシングされて遺伝子のタンパク質産物をコードする遺伝子の
部分である。ゲノムDNAにおいては、これらのコード性エキソンは非コード性イ ントロン配列によって分断されている。RNAポリメラーゼはイントロンおよびエ キソン配列の両方を転写するが、得られるmRNAがタンパク質に翻訳されるように
イントロン配列は転写産物から除去されなければならない。したがって、すべて
の哺乳動物細胞および殆どの真核生物細胞はエキソンをmRNAにスプライシングす
る機構を有する。遺伝子トラップベクターは、細胞性スプライシング機構がベク
ターによってコードされるエキソンを細胞性mRNAに連結するのを可能とするよう
に、イントロンまたは遺伝子中に組み込まれるように設計されてきた。しばしば
、そのような遺伝子トラップベクターは強力なスプライスアクセプター配列の後
に位置し、先行するプロモーターを持たない選択マーカー配列を含有する。した
がって、そのようなベクターが遺伝子に組み込まれると、細胞性スプライシング
機構はトラップされた遺伝子由来のエキソンを選択マーカー配列の5’末端にス プライシングにより連結する。典型的には、このような選択マーカー遺伝子は該
遺伝子をコードするベクターがイントロン中に組み込まれた場合にのみ発現され
うる。次に、選択培養で生存する細胞を選択することによって、遺伝子トラップ
現象が同定される。
【０００４】 遺伝子トラップ法は多数の遺伝子を突然変異させる非常に効率的な方法である
ことが示された。遺伝子トラップベクターの挿入は、トラップされた遺伝子に突
然変異を創出し、そしてまた該トラップされた遺伝子を同定するのに用いること
ができる分子タグを提供する。ROSAβgeoを用いて遺伝子をトラップした場合、 マウスを用いて調べると、生じた突然変異の少なくとも50%は表現型をもたらす ことが示された。これは遺伝子トラップ挿入ベクターが有用な変異原であること
を示している。遺伝子を突然変異させる強力な手段であるが、この方法の可能性
はトラップした遺伝子の同定が困難であることにより限定されていた。トラップ
現象を同定するために用いられてきた方法は、トラップされた遺伝子由来のエキ
ソン配列の該遺伝子トラップベクターによってコードされる配列とのスプライシ
ングによる連結によって生じる融合転写産物に依存している。これらの融合転写
産物由来の配列を得るために用いられる一般的な遺伝子同定プロコトールには、
5’RACE、cDNAクローニング、およびベクター組み込み部位周辺のゲノムDNAのク
ローニングが含まれる。しかし、これらの方法は労働集約的であり、自動化が困
難で、一般に大量処理には実用的でないことが示されている。
【０００５】3.0.発明の概略 最近、先行するプロモーターを有し、そして後ろにはポリアデニル化配列の代
わりにスプライスドナー配列を有する選択マーカー遺伝子を含有するベクターを
用いる、遺伝子トラップ法の新しい戦略に依存するベクターが開発された。これ
らのベクターは、遺伝子中に組み込まれて、該選択マーカーの発現に必要なポリ
アデニル化配列を提供する下流エキソンをトラップしない限り、選択を提供しな
い。このようなベクターの染色体への組み込みは、トラップされた遺伝子の3'エ
キソンへの選択マーカー遺伝子のスプライシングによる連結をもたらす。これら
のベクターはいろいろな利点を有する。すなわちこれらのベクターは、ベクター
が組み込まれた細胞型において通常発現されるものであるかどうかに関わりなく
遺伝子をトラップするのに使用することができる。さらに、このようなベクター
を担持する細胞は、3’RACE等の自動化された（例えば、96ウエルプレートフォ ーマット）遺伝子同定アッセイを用いてスクリーニングすることができる（総論
については、Frohman, 1994, PCR Methods and Applications, 4:S40-S58参照）
。これらのベクターを用いて、多数の突然変異を創出し、そして突然変異させた
、すなわちトラップされた遺伝子を迅速に同定することが可能である。しかし、
本発明以前には、このようなベクターの商業的規模における活用は、それらを用
いて効率的にトラップできる標的遺伝子の数によって限定されていた。
【０００６】 第１世代3’遺伝子トラップベクターの相対的な非効率性は、迅速かつ実用的 にトラップし、同定し、分析し、そして効果的に突然変異させることができる遺
伝子の総数を限定した。この非効率性は、トラップされ、DNA配列分析などによ って迅速に同定される標的細胞ゲノム中の遺伝子の百分率をより大きくする3’ 遺伝子トラッピングの一層効率的な方法の開発を促進した。
【０００７】 本発明は、高効率の3’遺伝子トラッピングを可能とする3’遺伝子トラップカ
セットを含む新規ベクターの構築に関する。本発明の3’遺伝子トラップカセッ トは、機能しうる組み合わせで、プロモーター領域、エキソン（典型的には翻訳
開始コドンおよびオープンリーディングフレームおよび／または内部リボソーム
エントリー部位によって特徴づけられる）、スプライスドナー配列、および場合
によりイントロン性配列を含む。上記スプライスドナー(SD)配列は、3’遺伝子 トラップカセットのエキソンがスプライシングにより下流エキソンまたは細胞的
にコードされるエキソンのスプライスアクセプター(SA)部位に連結されるように
機能的に配置されている。それゆえ、本発明の3’遺伝子トラップカセット（ま たはこれを組み込んでいる遺伝子トラップベクター）には、遺伝子トラップカセ
ットのSD配列の下流に機能的に配置されたスプライスアクセプター(SA)配列およ
びポリアデニル化部位は組み込まないものとする。好ましい実施形態においては
、3’遺伝子トラップカセットのエキソン構成部分（これもまた配列獲得カセッ トとして役立つ）は、エキソン配列および真核細胞に天然に存在する遺伝子物質
に由来するスプライスドナー配列を含む。
【０００８】 本発明のさらなる実施形態は、感染させた１または複数の標的細胞の遺伝子ト
ラップされたエキソンから新規なDNA配列情報を得るための上記ベクターの使用 である。
【０００９】 本発明のさらなる実施形態は、上記3’遺伝子トラップカセットを組み込むよ うに遺伝子操作された組換えベクター、特にウイルスベクターを含む。必ずしも
そうでなくてよいが好ましくは、これらのベクターは標的細胞中でベクター配列
の維持および検出を可能とする選択マーカーをさらに組み込んでいる。この選択
マーカーは、3’遺伝子トラップカセットの上流に同じ方向を向いて配置された5
’遺伝子トラップカセットとして利用することができる。本発明のさらなる実施
形態は、標的細胞または組織の集団中の遺伝子をin vivoまたはin vitroで突然 変異させ、トラップするため、および／または未知遺伝子のポリヌクレオチド配
列を得るため（すなわち、新しい遺伝子を発見するため）の新規な3’遺伝子ト ラップカセットまたはこれを含むベクターの使用である。したがって、上記3’ 遺伝子トラップカセットおよびこれを含むベクターを用いる、遺伝子突然変異、
同定および表現型スクリーニングの一般的な方法が記述される。
【００１０】 本発明の別な実施形態は、標的細胞における遺伝子発現を活性化するための本
明細書に記述するベクター（例えば、上記3’遺伝子トラップカセットを含むウ イルスベクター）の使用である。好ましくは、これらのベクターは標的細胞ゲノ
ムに（ウイルス組み込み機構を用いて）非特異的に組み込まれるレトロウイルス
ベクターである。さらに、新しい遺伝子を活性化し、遺伝子的または表現型的に
選択し、そして同定するために上記の3’遺伝子トラップカセットまたはこれを 含むベクターを用いるアッセイが記述される。
【００１１】 本発明のさらなる実施形態は、上記のベクターを用いて同時に（上記の１以上
の変異原性構成要素によって）突然変異させ、そして（上記の3’遺伝子トラッ プカセットを用いて）同定された遺伝子を有する真核細胞のライブラリー、およ
び／または上記ベクターのターゲッティング頻度および配列獲得特性を利用して
作製したcDNAライブラリーを含む。
【００１２】 本発明の別の実施形態は、標的細胞からDNA配列情報を得る方法である。この 方法は以下の工程を含んでなる。すなわち、3’遺伝子トラップカセットを非特 異的に組み込む工程、該遺伝子トラップカセットが標的細胞の内在性スプライシ
ング機構によってスプライシングされて標的細胞ゲノム内でコードされている内
在性エキソンに連結された場合に生じるキメラRNA転写産物を得る工程、そして 標的細胞ゲノム由来の内在的にコードされたエキソンの配列情報を得る工程であ
る。
【００１３】4.0.図面の簡単な説明 （図面の説明については下記参照）5.0.発明の詳細な説明 現代のゲノム学において、遺伝子トラップ法は遺伝子配列を機能的なカテゴリ
ーに分けるため、および新規遺伝子を同定するための両方にとって強力なアプロ
ーチであることが実証された。例えば、初期の成果は、これまでに特徴づけられ
た胚性幹細胞に由来する遺伝子トラップ現象の約半分が伝統的なcDNAライブラリ
ー技法によっては発見されなかった遺伝子配列を同定することを示した。
【００１４】 遺伝子トラップ法（プロモータートラップを用いる）は、種々の細胞型におい
て、誘導性シグナル、分化現象、または目的の表現型によって誘導される遺伝子
を遺伝学的にスクリーニングするために（すなわち、遺伝子発見に）使用されて
きた。さらに、そのようなスクリーニングは腫瘍抑制遺伝子、造血および筋肉細
胞の分化などの細胞分化プロセスによって誘導される遺伝子、Ｂ細胞活性化また
はアポトーシスなどの細胞現象を誘導するシグナルによって誘導される遺伝子、
および小分子または他の化合物によって活性化される遺伝子を同定するために用
いられてきた。これらの研究は、遺伝子トラップ法は重要な細胞性および生理学
的プロセスにおける機能に基づいて遺伝子を分類するのに用いることができるこ
とを示している。しかし,これらのスクリーニングのより広い利用は、トラップ された遺伝子の同定が困難であるために制限されていた。
【００１５】 遺伝子トラップベクターを設計する際に一般に取り組まなければならない問題
のいくつかは、限定するものではないが、１）特定のベクターによって効果的に
トラップされ得る標的細胞ゲノムの百分率（「標的サイズ」）；２）標的細胞の
ゲノムに挿入した後のベクターの変異原性；および３）遺伝子トラップ現象によ
り生じるキメラ転写産物の配列決定による突然変異した遺伝子の同定、を含む。
本発明のベクターは、例えば、ベクター中に存在するスプライスアクセプターお
よびスプライスドナーの効果を最大にする特徴を組み込むことにより、上記の問
題点に対処するように作製された。
【００１６】5.1.本発明のベクターの広い利用可能性 本発明のベクターは、細胞ゲノム中に遺伝子トラップベクターを挿入する操作
が可能な事実上任意の種類の真核細胞に用いることができる。例えば、本発明の
3’遺伝子トラップカセットを組み込んだベクターは、一次動物組織ならびに酵 母、糸状菌、真菌および植物を含むがそれらだけに限定されない他の任意の真核
細胞または生物から遺伝子をトラップするため、および／または配列情報を得る
ために用いることができる。特に興味深い植物としては、双子葉植物及び単子葉
植物、被子植物（ケシ、バラ、ツバキ等）、裸子植物（マツ等）、モロコシ属植
物、イネ科植物（grasses）、ならびに農業上重要な植物が含まれる。農業上重 要な植物には、限定するものではないが、穀物植物（コメ、コムギ、トウモロコ
シ、キビ、カラスムギ等）、堅果植物、レンズマメ、ヒヨコマメ、塊茎植物（ジ
ャガイモ、ヤマノイモ、タロイモ等）、草本植物、綿、麻、コーヒー、カカオ、
タバコ、ライムギ、ビート、アルファルファ、ソバ、干し草用牧草、ダイズ、バ
ナナ、サトウキビ、果実（柑橘類およびその他）、ブドウ、野菜、および真菌（
キノコ類、フランスショウロ等）、ヤシ、カエデ、セコイア、ナタネ、サフラワ
ー、サフラン、ココヤシ、セイヨウイチイ、カシおよび他の落葉樹および常緑樹
が含まれる。または、ヌクレオチドデリバリーのための通常の方法を用いて、線
状化した3’遺伝子トラップカセットを標的細胞に導入することができる。
【００１７】 適切な動物標的細胞のさらなる例としては、限定するものではないが、ヒトを
含む哺乳動物またはトリの内皮細胞、上皮細胞、小島、神経細胞または神経組織
、中皮細胞、骨細胞、リンパ球、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主要な腺また
は器官（例えば、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、皮膚、等）の細胞、外分泌および ／または内分泌細胞、胚性または他の全能性または多能性幹細胞、繊維芽細胞、
および上記細胞の培養物および／または形質転換細胞が挙げられ、上記のベクタ
ーと共に用いることができる。さらに、腫瘍形成性細胞系または他の細胞系を本
発明のベクターによって標的とすることができる。
【００１８】 上記ベクターを用いた遺伝子トラッピングの好ましい標的細胞は、胚性幹細胞
(ES細胞）である。ES細胞は多能性または全能性である。したがってin vitroで 遺伝子操作されたES細胞を次に発生しつつある胎児または胚（例えば、桑実胚ま
たは胚盤胞）に導入し、キメラ動物をもたらすことができる。次にこれらのキメ
ラ動物を飼育し、遺伝子操作した対立遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接
合性である子孫を得ることができる。哺乳動物の場合は、ES細胞は典型的には胚
盤胞にマイクロインジェクションされる。次に、この胚盤胞を偽妊娠した宿主動
物に移植する。
【００１９】 上記のES細胞技術がうまく適用された多数の動物系において、該技術の広い利
用可能性が示されている。例えば、限定するものではないが、トリ系（米国特許
第5,656,479号）、ブタ（米国特許第5,523,226号）、非マウス多能性細胞（米国
特許第5,690,926号）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギおよびミンク(Whiteらによ って出願された米国特許出願第60/007689号またはWO1996US00189/88号、およびW
O1997EP0002323号)およびヒトES細胞（Roblらによって出願された米国特許出願 第08/699,040号）において、ES細胞および/またはトランスジェニック動物が記 述されている。これらのすべては参照により本明細書に組み入れる。
【００２０】 典型的には、本明細書に記述する特徴を組み込んだベクターは、当技術分野で
公知の種々の方法のうち任意の方法によって標的細胞に導入することができる。
そのような方法の例としては、限定するものではないが、カチオン性脂質複合体
として、または非パッケージ化／複合体化DNAまたは「裸の」DNAとしての、エレ クトロポレーション、ウイルス感染、レトロ転位（retrotransposition)、転位 、微粒子衝撃法（microparticle bombardment）、マイクロインジェクション、 リポフェクション、トランスフェクションが含まれる。
【００２１】 本発明のベクターは、事実上任意の種類の表現型または遺伝子スクリーニング
プロトコールと共にin vitroおよびin vivoの両方で用いることも可能である。 そして、本発明のベクターはトラップした遺伝子のDNA配列の迅速な同定を可能 とするというさらなる利点を提供する。
【００２２】 本発明のベクターの構造的特徴は、得られる構築物が真核細胞のゲノムに実質
的に非特異的な様式で、そして好ましくは完全に非特異的な様式で統合され得る ように、任意のベクター骨格に組み込むことができる。当技術分野で公知の多数
のベクターを用いることができる。使用できるベクターとしては、限定するもの ではないが、プラスミドまたは改変ウイルスが挙げられるが、ベクター系は使用 する宿主細胞と適合性のものでなければならない。そのようなベクターには、限
定するものではないが、λ誘導体等のバクテリオファージ、またはpBR322もしく
はpUCプラスミド誘導体もしくはBluescriptベクター（Stratagene USA, La Joll
a, California)等のプラスミドが含まれる。以下に記述する特徴に対応するDNA 断片の適切なベクターへの挿入は、例えば、相補的付着末端を有する選択された
ベクターに適切なDNA断片を連結することによって達成することができる。しか し、該DNA断片の相補的制限部位がクローニングベクターに存在しない場合、DNA 分子の末端を酵素的に改変することができる。または、ヌクレオチド配列(リン カー)をDNA末端に連結することによって任意の所望部位を作製することができる
。これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードす
る特殊な、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを構成する。
【００２３】5.2.本発明のベクターの構造的特徴 5.2.1.マーカー遺伝子 本発明により意図されているベクターは、マーカーを細胞ゲノムに組み込んだ
細胞の選択を提供する選択マーカー遺伝子を含むように作製することができる。
一般にそのような選択マーカーは、該選択マーカーを組み込み、それによってコ
ードされるタンパク質を発現する真核細胞を同定および選択する容易な方法を可
能とする。そのような選択方法の例としては、遺伝子トラップ事象を統合した細
胞の抗生物質、比色分析、酵素および蛍光による選択が挙げられる。そのような
選択マーカー遺伝子の1例はβgeoであるが、多数の他の選択マーカーのうち任意
のマーカーを用いることができる（例えば、参照により本明細書に組み入れる米
国特許第5,464,764号参照）。植物選択マーカーの1例は、ハイグロマイシンホス
ホトランスフェラーゼである。
【００２４】 したがって、本発明の１つの実施形態は、本発明の3’遺伝子トラップカセッ トを組み込んでいる標的細胞の追跡および同定を容易にするマーカー遺伝子を組
み込み、そして場合により発現するように作製されたベクターを意図している。
そのようなマーカーとしては、限定するものではないが、抗生物質耐性遺伝子、
比色分析マーカー遺伝子、酵素（例えば、β-ラクタマーゼ）、または、例えば 緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子などの蛍光マーカー遺伝子の直接または
間接発現、またはそれを検出するためのアッセイを媒介する他のマーカー遺伝子
が含まれる。これらは、特に参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,625,
048号に記述されている。本発明を開示する目的上、生物学的または生化学的関 連で用いられる場合の「直接（的に）」という用語は、通常は1つの分子と別の 分子（これは同一種類の分子または異なる種類の分子でありうる）との接触また
は結合によって引き起こされる、中間工程を必要としない、プロセスを直接的に
引き起こすこと(causation)を指す。例えば、分子Ａが分子Ｂと接触し、これが 分子Ｂに生物学的プロセスの一部である効果Ｘを発揮させる。本発明の目的上、
生物学的または生化学的関連で用いられる場合の「間接(的に）」という用語は 、通常2以上の直接的工程によって引き起こされる、中間工程を必要とする間接 的引き起こしを指す。例えば、分子Ａが分子Ｂと接触して効果Ｘが発揮され、こ
れが次に効果Ｙを引き起こす。また本発明の目的上、「遺伝子」という用語は、
細胞ゲノムの個々のコード領域の任意の及び全てのもの、ならびに関連する非コ
ード領域および調節領域を指すものとする。または、特定の機能性タンパク質産
物または活性をコードする領域を指すものとする。さらに、「機能しうるように
配置された」という表現は、制御エレメントまたは制御遺伝子が該制御エレメン
トまたは制御遺伝子の所望の又は必要とされる機能を提供するのに適切な配向お
よび間隔で存在するという事実を指すものとする。また、本発明の目的上、遺伝
子は、細胞中の制御エレメントが該遺伝子によって、または該遺伝子に挿入され
た選択マーカーによってコードされるmRNAの機能的レベルまたは検出可能レベル
の産生を媒介する場合に、「発現」される。該mRNAは次にスプライシング／プロ
セシングされ、適切な場合には、翻訳されて活性な産物を生成することができる
。上記適切な制御エレメントが、細胞中に存在しない、不活性化された、あるい
は該遺伝子によって、または該遺伝子に挿入された選択マーカーによってコード
されるmRNAの機能的および／または検出可能レベルでの産生を媒介しない場合は
、遺伝子は発現されない。本発明の目的上、mRNAは、翻訳後に対応する遺伝子座
と正常に関連するサイズ及び活性を有するタンパク質を生成する場合、mRNAは「
機能的」レベルで産生されるという。
【００２５】 マーカー遺伝子は、機能しうる組み合わせでマーカー、該マーカーを発現する
ためのプロモーター、リボソーム結合／翻訳開始部位およびポリアデニル化配列
を含む完全に独立した発現カセットとして本発明のベクターに組み込むことがで
きる。さらに、上記マーカーは、ベクターのプロモーターから発現されるように
ベクター中に配置することが可能で、そして場合によりマーカー発現を容易にす
る独立したリボソームエントリー部位(IRES)を機能性に組み込むように遺伝子操
作することができる。
【００２６】5.2.2. 5’遺伝子トラップカセット 本発明のベクターは、5’遺伝子トラップカセットを含むように遺伝子操作す ることができる。このカセットは、典型的には、機能しうるように配置されたポ
リアデニル化配列を後ろに有するエキソン（これは選択マーカー遺伝子をコード
することができる）の5’側に位置するスプライスアクセプター部位を含有する 。典型的には、5’遺伝子トラップを組み込んだベクターは、該5’遺伝子トラッ
プカセット内でコードされるエキソンを発現するプロモーターを含有しない。ま
た、このベクターは該5’遺伝子トラップカセットのエキソンのスプライスアク セプターの5’側に機能しうるように配置されたスプライスドナー配列をコード しない。その結果、このベクターが細胞染色体に組み込まれた後、該5’遺伝子 トラップカセットは上流遺伝子の正常なスプライシングを妨害し、末端エキソン
として作用する。その最終効果は、該5’遺伝子トラップカセットによって細胞 性転写産物は破壊され、効果的に突然変異誘発されるということになる。5’遺 伝子トラップカセットは、エキソン構成要素としてマーカー遺伝子を組み込むこ
とが可能で、したがって第5.2.1.節に記述するマーカー遺伝子の代わりに、また
はそれに加えて用いることができる。
【００２７】 5’遺伝子トラップカセットの構造的特徴もまた、該5’遺伝子トラップが細胞
ゲノムのどこに組み込まれたかについて一方に片寄る遺伝子トラップ事象を生じ
るように操作することができる（限定するものではなく説明の目的上、以下の議
論では、5’遺伝子トラップカセットのエキソンは選択マーカーをコードすると 想定するものとする）。例えば、プロモーターが全く存在しないとすると、5’ 遺伝子トラップカセット（IRESなしで作製された）によってコードされるマーカ
ーは、典型的には、内在性遺伝子の翻訳開始部位の5’側に位置するイントロン 中に該カセットが組み込まれた場合にのみ発現されうる。IRESが存在しないとす
ると、そのような5’遺伝子トラップカセットを組み込んだベクターが、内在性 遺伝子の翻訳開始部位の下流に位置するイントロンに組み込まれた場合、マーカ
ーは、選択マーカー活性を示す融合タンパク質を生じる正しいリーディングフレ
ームで存在する場合にのみ発現されうる。したがって、そのような5’遺伝子ト ラップカセットを組み込んだベクターは、同定された遺伝子トラップされた配列
が翻訳開始部位の5’側に位置する配列から始まるという確率を選択的に増大さ せることができる。
【００２８】 類似の効果をもたらす別の方法は、5’遺伝子トラップカセットのSAと選択マ ーカーの翻訳開始コドンの間の領域に存在する(または遺伝子操作してそこに存 在させた）１セットのネステッド（nested)終止コドンを組み込んだベクターを 用いる。または、そのような終止コドンは選択マーカーのコード領域の末端とポ
リアデニル化配列との間に配置することができる。選択マーカーは、ベクターが
標的ゲノムに組み込まれた位置と主として独立した様式でマーカーが発現される
ように、独立したリボソームエントリー部位(IRES)を含むように作製することも
可能である。必ずそうとは限らないが典型的には、IRESは上記の１セットのネス
テッド終止コドンと共には使用されない。
【００２９】 特に好ましい実施形態においては、本発明のベクターは、スプライスアクセプ
ター配列によって先行され、そして後ろにポリアデニル化(pA)配列が続く選択マ
ーカー遺伝子を含む5’遺伝子トラップカセット（SAβgeopA、図２）を用いる。
または、βgeo遺伝子の上流に内部リボソームエントリー部位をさらに組み込ん だSAIRESβgeopAを用いることができる。または、SAneopA（これはβ-gal活性を
不要にする）を用いることができる。上記の5’遺伝子トラップカセットは、遺 伝子を効率的に突然変異させることが可能で、またトラップされた遺伝子の発現
を追跡するのに用いることができる。使用するSA配列の最適化は、5’遺伝子ト ラップカセットの効率をさらに増進する、または調節することができる。適切な
SA配列の例としては、限定するものではないが、以下のものが含まれる： 上記SA配列の任意のものを、例えば、SAneopAまたはSAIRESneopAと共に用いるこ
とができる。
【００３０】 場合により、5’遺伝子トラップカセットの両側に適切なリコンビナーゼ部位 （例えば、lox P、frt、等）を配置することができる。そのような実施形態の１
つにおいては、リコンビナーゼ部位を両側に配置した5’遺伝子トラップカセッ トを、検出可能なマーカー、異なる選択マーカー、または酵素マーカー（緑色蛍
光タンパク質、β-ラクタマーゼ、TK、ブラストサイジン、HPRT、等）をコード する第２の5’遺伝子トラップカセット（3’リコンビナーゼ部位の下流に存在す
る）であって、好ましくは第１の5’遺伝子トラップカセットと同一のリコンビ ナーゼ部位を両側に配置していない該トラップカセットと共に用いる。２つの5 ’遺伝子トラップカセットの両方が（選択的スプライシングにより）許容可能な
レベルで発現されない場合は、適切なリコンビナーゼ活性（すなわち、cre、 fl
p、等）をin vitroまたはin vivoで用いて第１の5’遺伝子トラップカセット（ 両側にリコンビナーゼ部位を有する）を除去することにより、第２の5’遺伝子 トラップカセット（検出可能なマーカーをコードしている）を「活性化する」こ
とができる。
【００３１】5.2.3. 3’遺伝子トラップカセット 本発明の3’遺伝子トラップカセットは、機能しうる組み合わせで、エキソン の発現を媒介するプロモーター領域、および該エキソンの3’末端を定める機能 性のスプライスドナー(SD)配列を含む。標的細胞染色体に組み込まれた後、3’ 遺伝子トラッププロモーターによって発現された転写産物は、組み込まれた3’ 遺伝子トラップカセットの下流に位置するトラップされた細胞性エキソンのスプ
ライスアクセプター（SA）配列にスプライシングされる。その結果、3’遺伝子 トラップカセットのエキソンおよび任意の下流細胞性エキソン（その3’最末端 はポリアデニル化シグナルを有する）を含む融合転写産物が生成される。
【００３２】 この融合転写産物は、当業者に公知の種々の方法によって、任意の発現レベル
で、すなわち異種核RNA、メッセンジャーRNA、タンパク質などとして同定するこ
とができる。例えば、3’遺伝子トラップカセットのエキソンおよび転写産物の ポリＡテールに特異的な１対のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を実
施することができる。または、例えば、抗体スクリーニング（すなわち、エピト
ープタグ付け(tagging)）によって同定することができるエピトープをコードす る3’遺伝子トラップカセット中のエキソンを用いることができる。当技術分野 で公知の他のスクリーニング法としては、限定するものではないが、3’遺伝子 トラップカセットのエキソンに特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーショ
ン（固体支持体上または溶液中、等）が挙げられる。タンパク質レベルでスクリ ーニングする場合は、任意の細胞位置でスクリーニングすることができる。例え
ば、上記融合転写産物によってコードされる分泌されたタンパク質をスクリーニ
ングすることができる。または、例えば、分泌シグナルをコードする第１エキソ
ンを用いて、それによって融合転写産物によってコードされる多数のまたは全部 の融合ペプチドを宿主細胞に分泌させることができる。全てのスクリーニング方
法を改変して、トラップされたエキソン、ならびにそれによってコードされるタ ンパク質およびポリペプチドに対して特異的にすることもできる。すなわち、PC
Rプライマー、ハイブリダイゼーションプローブ、または特定の遺伝子もしくは 遺伝子クラスに特異的な抗体を用いてスクリーニングすることができる。または
、例えば、翻訳後修飾に基づいてスクリーニングすることができる。例えば、特
定のまたは全ての糖タンパク質に特異的な抗体を用いてスクリーニングすること
ができる。
【００３３】 上述のように、3’遺伝子トラップカセットは、スプライスドナー配列が後ろ 続いている１以上のエキソン（場合により１以上のオープンリーディングフレー
ムをコードする）の発現を導くプロモーターを含有する（図１）。下記のものを
含むがそれらだけに限定されない、任意の数の転写プロモーターおよびエンハン
サーを3’遺伝子トラップカセットに組み込むことができる。すなわち、細胞ま たは組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、単純ヘルペスチミジンキナ
ーゼプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター／エンハンサー、S
V40プロモーター、PGKプロモーター、調節性プロモーター(例えば、メタロチオ ネインプロモーター）、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス
7.5Kプロモーター、トリ（すなわち、ニワトリ等）β-グロビンプロモーター、 ヒストンプロモーター（例えば、マウスヒストンH3-614、等）、β-アクチンプロ モーター(好ましくはニワトリ）、メタロチオネインプロモーター（好ましくは 、マウスメタロチオネインI および II）、カリフラワーモザイクウイルス35Sプ
ロモーター等、ならびに十分確立された分子生物学的技法を用いて作製すること
ができるそれらの置換形および変形を含む（総論としては、Sambrookら, 1989,
Molecular Cloning, 第I-III巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, New YorkおよびCurrent Protocols in Molecular Biology, 198
9, John Wiley & Sons, 全巻およびそれらの定期更新を参照されたい。これらは
参照により本明細書に組み入れる。）プロモーター／エンハンサー領域もまた組
織特異的発現または誘導発現をもたらすように選択することができる。
【００３４】 好ましくは、3’遺伝子トラップカセットのエキソン(または複数のエキソン）
は、遺伝子のエキソン、好ましくは第1エキソンを模倣して設計されている。一般
に、エキソンまたは複数のエキソン(および該エキソンの後に続くイントロンの一
部）およびスプライスドナー配列は、天然に存在する遺伝子に由来する。しかし
、本物のエキソンを模倣して設計された合成エキソンも用いることができる。例
えばそのようなエキソンは、新規に、あるいは既存のエキソンを改変して、高い
効率もしくはコンセンサスなリボソーム結合部位を組み込むことによって、また
はIRES配列をオープンリーディングフレームまたはエキソンの翻訳開始コドンの
5’側に付加することによって、またはオープンリーディングフレームを創出す ることによって、コドン使用法を最適化することによって、またはオープンリー
ディングフレームによってコードされるアミノ酸配列を変更しない1以上の制限 部位を作製することによって、または選択的もしくはコンセンサスなスプライス
ドナー配列をエキソン内に作製することによって、設計し、構築することができ
るであろう。
【００３５】 本発明のベクターは、非原核生物起源のエキソン、すなわち真核生物から得た
エキソンを用いた3’遺伝子トラップカセットを使用する。本発明の3’遺伝子ト
ラップカセットに有用なエキソンは、抗生物質耐性活性または他の選択マーカー
活性(例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードしない。本明細書に論じるように 、非真核生物起源のオープンリーディングフレームを組み込んだ3’遺伝子トラ ップカセットは、典型的に3’エキソントラップの著しい効率低下を示す。した がって、本発明の3’遺伝子トラップカセットを採用したベクターは、トラップ し、そして遺伝子トラップ配列タグ付けによって迅速に同定することができる標
的遺伝子の数を大幅に増大させる。
【００３６】 したがって、3’遺伝子トラップカセット（SD部位を含む）のエキソンは、好 ましくは、真核細胞または恐らく動物ウイルスもしくは植物ウイルスにとって天
然のものである、あるいは標的細胞中、または近縁の種、属、目、綱、門、もし
くは界由来の細胞のゲノム中に天然に存在する、ヌクレオチド配列に類似した又
は相同なヌクレオチド配列に由来する。例えば、ヒト遺伝子由来のエキソンを、
マウス細胞に使用する3’遺伝子トラップカセットに用いることができる。また 、マウス遺伝子由来のエキソンを、ヒト細胞に使用する3’遺伝子トラップカセ ットに用いることができる。本発明の目的上、相同配列とは、例えば0.5 M NaHP
O4、7% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1 mM EDTA中65℃におけるフィルター結 合DNAとのハイブリダイゼーションおよび0.1xSSC／0.1% SDS中68℃における洗浄
などの高ストリンジェンシー条件下（Ausubel, F.M.ら(編), 1989, Current Pro
tocols in Molecular Biology, 第I巻, Green Publishing Associates, Inc.お よびJohn Wiley & Sons, Inc., New York, p. 2.10.3)、またはよりストリンジ ェンシーの低い条件、例えば、0.2xSSC／0.1% SDS中42℃における洗浄（Ausubel
ら, 1989, 前出）などの中程度にストリンジェントな条件下で、標的配列と結合
することができる核酸配列と定義される。場合により、エキソンは標的細胞ゲノ
ム中の配列に対してアイソジェニックである。
【００３７】 本発明の3’遺伝子トラップカセットに適切なエキソンは、天然に存在するエ キソンを組み合わせることによって、または天然に存在するエキソンの断片を組
み合わせることによって、または天然に存在するエキソンの断片を天然に存在す
るエキソンのコンセンサス配列である合成配列と組み合わせることによって、得
ることもできる。例えば、真核生物のゲノム中に見いだされるエキソンであって
遺伝子の第1エキソンではないエキソンを用いる場合は、該エキソンの5’末端に
適切な転写開始配列を付加することによって該エキソンを本発明の3’遺伝子ト ラップカセットに有用とすることができる。
【００３８】 標的細胞ゲノムが3’遺伝子トラップカセットのエキソンと同一の(またはそれ
に対応する）遺伝子をコードする場合、好ましくは、該天然に存在する遺伝子は
、該標的細胞中のトラップされたエキソン配列の増幅および配列決定を実質的に
妨げるレベルでは、該標的細胞によって発現されない。本発明の開示の目的上、
「増幅および配列決定を実質的に妨げる」という表現は、天然に存在するエキソ
ンの内因性発現は、3’RACEプロトコルまたは場合により通常のクローニングお よび配列決定法によって、トラップされたエキソン配列の増幅および配列決定を
妨げる場合があるが、それらを阻止しない、という事実を指すものとする。起り
うるこの厄介な問題を回避するさらなる方法としては、3’遺伝子トラップカセ ットの天然に存在するエキソン内にPCRプライミング部位として用いうる独特の 配列を組み込むこと、または標的細胞ゲノム中に天然には存在しないエキソンを
有する3’遺伝子トラップカセットを用いることが挙げられる。起りうるこの厄 介な問題を回避する、さらに別の方法は、誘導遺伝子(例えば、ストレス遺伝子 ）から得たエキソンを3’遺伝子トラップカセットに用いることである。この実 施形態においては、該誘導遺伝子が3’遺伝子トラップカセットの使用対象であ る細胞中に存在する場合は、好ましくはそれらの細胞は、該エキソンがそこに由
来する該遺伝子が全くまたは殆ど誘導されない条件下に維持されるであろう。
【００３９】 本発明の3’遺伝子トラップカセットのエキソンは、翻訳開始部位および／ま たはオープンリーディングフレームを含んでいても、含んでいなくてもよい。場
合により、該エキソン中に存在してよい任意のオープンリーディングフレームを
、宿主細胞に好まれているコドン使用法を反映するように最適化されたコドンを
組み込むように遺伝子操作することができる。
【００４０】 本発明の3’遺伝子トラップカセットのエキソンが好ましくは真核細胞(または
好ましくは哺乳動物細胞）にとって天然の配列を含むとすると、該エキソンは抗
生物質耐性活性を有するタンパク質をコードするマーカー（neo、ampなど、例え
ばβ-ラクタマーゼ、tet、kanなど）を典型的には構成しないし、または他の方 法で宿主細胞に選択可能な薬剤耐性または感受性を付与することもしない（その
ようなマーカーを、場合により例えば該エキソンの5’末端領域に付けることは 可能であるが）。本発明の目的上、ある遺伝子が抗生物質耐性遺伝子を発現する
原核または真核細胞に、適切な濃度の対応する抗生物質を含む培地中で選択的増
殖をもたらす活性を有する遺伝子産物をコードする場合、該遺伝子または遺伝子
産物は抗生物質耐性を「付与する」ことができる。
【００４１】 または、上記エキソンは一般に、周知の通常の発色または蛍光アッセイによる
選択的検出を媒介する、標的細胞(好ましくは哺乳動物細胞）にとって天然のも のではない酵素活性またはリポーター遺伝子(例えば、β-ガラクトシダーゼ、ア
ルカリ性ホスファターゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼ）をコードしない
。さらに、本発明のベクターは、好ましくは、本発明の3’遺伝子トラップカセ ットの両側に位置するターゲッティングDNA配列（すなわち、相同組換えによる3
’遺伝子トラップカセットの、特定の遺伝子座への遺伝子ターゲッティングを導
くための配列）の領域を含まないものとする。
【００４２】 さらに、スプライスドナーの効率が、該スプライスドナー部位の下流に位置す
るイントロン配列によって影響されうるとすると、本発明の3’遺伝子トラップ カセットは、場合により約１塩基から約数千塩基のイントロン配列を上記スプラ
イスドナー配列の近隣かつ3’側に含むように遺伝子操作することができる。
【００４３】5.3.本発明のベクターの応用 上記3’遺伝子トラップカセットを組み込んだベクターは、3’遺伝子トラップ
の効率の顕著な改善によって特徴づけられる。したがって、本発明の別の実施形
態は3’遺伝子トラップカセット、および以下のことによって特徴づけられる、 該カセットを組み込んだベクターである。すなわち、同様に位置しているSAβge
o 5’遺伝子トラップカセット（またはSAneo 5’遺伝子トラップカセット）が5 ’エキソンをトラップする効率の少なくとも約15%、好ましくは少なくとも約25%
、より好ましくは少なくとも約40%、より好ましくは少なくとも約60%、そして最
も好ましくは少なくとも約85%の効率で3’エキソンをトラップする能力によって
特徴づけられる。本発明の目的上、同様に位置している遺伝子トラップカセット
とは、類似のベクター内に類似の配向で存在するカセットをいう。または、同様
に位置している遺伝子トラップカセットが両方とも同一のベクター内に存在して
もよい。
【００４４】 種々の定量測定法のうち任意のものが当業者には利用可能であり、それらを用
いて3’および5’遺伝子トラップカセットのそれぞれの相対的効率ならびに効果
的にトラップされうる遺伝子の数を計算することが可能である。例えば、SAβge
oまたはSAneoなどの5’遺伝子トラップによって同定され、そして例えば抗生物 質G418を用いて選択された標的遺伝子に対する、本発明の3’遺伝子トラップカ セットによって同定された標的遺伝子の百分率を決定することができる。または
、同定可能な3’遺伝子トラップ事象の百分率を、SAβgeoによって媒介される5 ’遺伝子トラップ事象によって抗生物質耐性となった、または色素原的に同定可
能となった標的細胞の百分率と比較することができる。
【００４５】 本発明の3’遺伝子トラップカセットの機能効率は、本発明のベクターを用い て特徴づけられる独立した遺伝子トラップ事象の絶対数によっても定量すること
ができる。一般に、本発明のベクターは少なくとも約1から約数百個の遺伝子、 典型的には少なくとも約1000個の異なる遺伝子、より典型的には少なくとも約30
00個、好ましくは少なくとも約10,000個、より好ましくは少なくとも約25,000個
、より好ましくは少なくとも約50,000個、そして最も好ましくは少なくとも約55
,000個から特定の細胞または細胞型に存在する最大数の遺伝子までの好都合なト
ラップを可能とする。例えば、マウス細胞は約60,000から100,000個またはそれ 以上の遺伝子をコードすると考えられる。
【００４６】 遺伝子トラップ効率の別の基準は、トラップされうる別個の細胞性エキソンの
数である。典型的には、本発明の3’遺伝子トラップカセットは、少なくとも約1
0,000個の異なる3’遺伝子トラップされた細胞性エキソン（一般に、約7,500か ら9,500個の異なる遺伝子に相当する。同一遺伝子内の異なるイントロン／エキ ソン内で独立した組み込み事象が起りうるので、この数字は典型的にはより小さ
い）、好ましくは少なくとも約15,000個の異なる3’遺伝子トラップされた細胞 性エキソン、より好ましくは少なくとも約25,000個の異なる3’遺伝子トラップ された細胞性エキソン、そして最も好ましくは少なくとも約50,000個の異なる3 ’遺伝子トラップされた細胞性エキソンから哺乳動物ゲノムに存在する遺伝子の
約70〜約100％までの容易な検出、スクリーニング、および同定を可能とするに 十分な効率で細胞性3’エキソンをトラップする。
【００４７】5.3.1.細胞の遺伝子トラップされたライブラリー 本発明のベクターを用いて迅速に特性評価できる遺伝子の数を前提として、本
発明のさらなる実施形態は本発明の3’遺伝子トラップカセットを安定に組み込 む培養動物細胞の遺伝子トラップされたライブラリーを含む。本明細書に記述す
るライブラリーは、以下の工程を含む方法によって構築することができる。すな
わち、細胞集団を処理して（感染、トランスフェクション、レトロ転位、または
ポリヌクレオチドを細胞に導入する事実上任意の他の方法による）3’遺伝子ト ラップカセットを含有するベクターを安定に組み込ませ、安定に形質導入された
細胞を同定し、または他の方法で選択し、そしてトラップされた3’細胞性エキソ
ンを同定する工程である。好ましい実施形態においては、動物細胞ライブラリー
は哺乳動物細胞を含み、そして特に好ましい実施形態においては、該哺乳動物細
胞は胚性幹(ES)細胞である。好ましくは、そのようなライブラリーはライブラリ
ー中の突然変異した各細胞が1個の同定可能な3’遺伝子トラップベクター／現象
を担持するように構築される。（複数の遺伝子トラップベクターを担持する突然
変異細胞もまた本発明の意図するところである。） 本発明のさらなる実施形態においては、ライブラリー中の個々の突然変異細胞
を分離し、クローン的に増殖させる。次に、単離し、クローン的に増殖させた突
然変異細胞を分析して、挿入的に突然変異させた宿主の遺伝子のDNA配列または 部分DNA配列を突き止める。したがって、本発明はライブラリー中の突然変異さ せた各遺伝子の少なくとも一部の配列決定をさらに提供する。次に、得られた配
列データベースはライブラリーの索引として役立つ。本質において、ライブラリ
ー中のクローン的に増殖させた各グループはそれぞれ部分配列情報を用いてカタ
ログに載せられる。本方法は3’遺伝子トラップカセットにスプライシングされ て連結されたエキソンから配列情報を得るように設計されているので、得られた
配列は突然変異させた遺伝子に特異的である。得られた配列データベースは興味
のある突然変異させた遺伝子を同定するために用いることができる。または、こ
のデータベースは新規遺伝子の同定のための強力な手段である。一旦遺伝子が同
定されたならば、対応する突然変異細胞をライブラリーから取り出し、以下に記
述するようにさらに研究することができる。
【００４８】 一般に、本発明の3’遺伝子トラップカセットを組み込んだベクターによって 突然変異させた単離された細胞または各細胞型（例えば、ES細胞）の索引付きラ
イブラリーは、少なくとも約50の異なる単離された突然変異細胞培養系 (cultur
e line)、典型的には少なくとも約100、より典型的には少なくとも約500、好ま しくは少なくとも約1,000、より好ましくは少なくとも約5,000、より好ましくは
少なくとも約10,000、より好ましくは少なくとも約25,000、そしてさらにより好
ましくは少なくとも約40,000から約100,000-500,000までの異なる単離され特性 評価された突然変異細胞培養系またはそれ以上からなる集団を含む。好ましくは
、所与のライブラリーに存在する異なる突然変異細胞培養物のゲノムは、挿入さ
れた遺伝子トラップカセットまたはそれを組み込んだベクターの位置を除いて、
本質的に同一である（例えば、共通の供給源または同系繁殖系統に由来する）。
【００４９】 理想的には、突然変異誘発の範囲は、標的細胞系においてトラップすることが できる遺伝子の全セットである。ライブラリーの富化(redundancy)を増大させる
ことによって、得られる配列データベースは、理想的には標的細胞中のトラップ
されうる遺伝子の本質的に完全な代表を含むことになるであろう。本発明の目的
上、「本質的に完全な代表（representation)」という用語は、ライブラリーの 構築に用いた細胞のゲノムが、標的細胞ゲノム中のトラップされうる遺伝子の少
なくとも約70%、好ましくは少なくとも約85%、そして最も好ましくはトラップさ
れうる遺伝子の少なくとも約95%（標準ポアソン分布により決定される）（所与 のベクターはゲノム中に非特異的に組み込まれると仮定している）の中に、全体
として安定に挿入された3’遺伝子トラップカセットを含む確率が一般に少なく とも約80-95％ある、統計学的状況を指すものとする。
【００５０】 本発明のベクターによって提供される広いゲノム範囲は、標的細胞ゲノムの大
規模な突然変異誘発をも可能とする。典型的には、突然変異させた標的細胞の上
記のようなライブラリーは、標的細胞ゲノム中に存在する各染色体中に少なくと
も１つの3’遺伝子トラップ突然変異（上述の3’遺伝子トラップカセットまたは
これを含むベクターによって媒介される）を全体として表わす、突然変異細胞ま
たはその単離された培養物の集団を含む。好ましくは、染色体あたり少なくとも
約２から３個の独立した遺伝子トラップ突然変異がライブラリー中に全体として
存在する。より好ましくは、染色体あたり少なくとも約10個の独立した遺伝子ト
ラップ突然変異が現われており、そして最も好ましくは、常染色体（性染色体を
除いた）あたり少なくとも約500個の独立した遺伝子トラップ突然変異、および ／または約70〜90％までの、もしくは本質的に完全なゲノム内の遺伝子の代表が ライブラリー中に全体として現われるであろう。
【００５１】 本発明は、本発明のベクターによって形質導入されうる、または培養された細
胞系の存在する任意の生物／細胞のゲノムの大規模な遺伝子分析を可能とする。
したがって、上記のライブラリーは、標準的技法によって、または本発明の3’ 遺伝子トラップカセットを担持する組換えベクターを用いてトランスフェクショ
ンすることができる任意の細胞型から構築することができる。それゆえ、本明細
書に記述する突然変異させた動物細胞のライブラリーを作製し、整理し、および 索引をつける方法もまた、遺伝子操作することができ、培養下で増殖させること
が可能な事実上任意の真核細胞に広く適用可能である。
【００５２】 ライブラリーの構築にマウスES細胞、好ましくは初期継代のES細胞を用いる場
合は、該ライブラリーはマウスゲノムの総合的機能研究のための遺伝子的手段と
なる。ES細胞を胚盤胞に注入して正常な発生に組み込み、最終的には生殖系列に 組み込むことが可能なので、ライブラリーの突然変異させたES細胞は突然変異ト ランスジェニックマウス系統の集団を効果的に表わす（総論としては、参照によ
り本明細書に組み入れる、1995年11月7日発行の米国特許第5,464,764号参照）。
【００５３】 類似の方法を用いて事実上任意の非ヒトトランスジェニック動物（もしくは、
トランスジェニックにされうる動物）、またはトランスジェニック植物を作製す
ることができる。そのような非ヒトトランスジェニック動物としては、例えば、
トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサ
ギ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、およびその他当技術分
野で公知のトランスジェニック動物種、特に哺乳動物種が含まれる。さらに、ウ
シ、ヒツジ、およびブタ種、齧歯類動物の他のメンバー（ラットならびにウサギ
およびモルモット、およびチンパンジーなどの非ヒト霊長類動物）を用いて本発
明を実施することができる。
【００５４】 本明細書に記述するライブラリーおよび／またはベクターを用いて作製された
トランスジェニック動物および細胞は、基礎的な生物学的プロセスの研究、およ
び老化、癌、自己免疫疾患、免疫障害、脱毛、腺障害、炎症性障害、毛細管拡張
性運動失調、糖尿病、関節炎、高血圧、アテローム硬化、心臓血管性疾患、肺疾 患、神経および骨格系の変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、喘息、 発育障害または異常、不妊、上皮潰瘍、ならびにウイルス性および微生物性の病
原性および感染性疾患（これらの病原の比較的総合的な総論が、特に参照により
本明細書に組み入れる、Mandellら,1990, Principles and Practice of Infecti
ous Disease,第３版, Churchill Livingstone Inc., New York, N.Y. 10036に提
供されている）を含むがこれらだけに限定されない疾患の治療剤および診断剤の
開発に有用である。それゆえ、上述の動物および細胞は機能ゲノム学の実施に特
に有用である（類似のライブラリーならびにその作製およびスクリーニング方法
は、1997年10月2日に出願の米国特許出願第08/942,806号で考察されている。そ の開示は参照により全体を本明細書に組み入れる。）5.3.2.DNA配列情報の獲得 cDNAライブラリーの配列決定は幾十万の発現配列タグ(EST)を提供してきた。 これらの配列タグは典型的には遺伝子またはDNAのコード領域を同定するものと 考えられている。遺伝子は全部でないにしろ殆どの可能性のある薬物標的をコー
ドすると考えられるので、全ての哺乳動物遺伝子を同定するESTを獲得しようと殺
到が起こった。しかし、これまでに作製された膨大な配列データにかかわらず、
多数の遺伝子が、確立されたcDNA法を用いて同定するのは困難であることが示さ
れた。なぜなら、多くの遺伝子は発現されないか、非常な低レベルで発現される か、特定の細胞型のみで発現されるか、または一過性にのみ発現されるからであ
る。遺伝子トラップ法は内因性発現レベルに関係なく遺伝子を同定できるとする
と、遺伝子トラップ法は（上述のベクターを用いて同定された多数の新規配列に
よって示されるように）、遺伝子発見のための重要な手段である。EST技術と同 じく、5’遺伝子トラップベクター(5’エキソンをトラップするために設計され たベクター）の考えうる1つの制限は、発現された遺伝子のみが典型的にトラッ プされることである。したがって、特に遺伝子発見のためには、ES細胞は特に好
ましい標的細胞である。なぜなら、ES細胞は殆どの遺伝子の発現が一般に入り混
じっていると考えられるからである。この入り混じった状態であるとすると、ES
細胞中の殆どの遺伝子は本発明のベクターを用いてトラップできるであろう。ES
細胞中で発現されていると検出しうる遺伝子の比率を調べるため、GenBank dbes
tデータベース由来の23個のESTを無作為に選択し、遺伝子をPCRにより同定する プライマーを合成した。これらのプライマーをES細胞RNAを用いたRT-PCRアッセ イに用いると、23セットのプライマーの全部が生成物をもたらした。これは、全
23遺伝子の転写産物がES細胞中に検出できたことを示す。スクリーニングされた
上記23個のESTが無作為に選択されたとすると、それらは遺伝子全般を大いに代 表していて、他の細胞型で、従来のcDNAライブラリーの配列決定で同定されるに
十分な高いレベルで発現される遺伝子の大半もまたES細胞で発現され、したがっ
てSA選択マーカーポリＡ(5’遺伝子トラップ）ベクターを用いておそらく同定可
能であることを示しているようである。
【００５５】 しかし、遺伝子が発現されないか、またはごくわずかしか発現されない場合、
そのような遺伝子をトラップし同定するためには3’遺伝子トラップカセットを 利用しなければならない。さらに、3’遺伝子トラップカセットはトラップされ た遺伝子由来のDNA配列データの自動化手段による迅速な獲得を可能とする。
【００５６】 3’エキソンをトラップするように設計されたベクターは、多数の突然変異を 生成し、そして突然変異させた遺伝子を迅速に同定することを可能とした。しか
し、そのようなベクターの初期のものは、3’遺伝子トラップに用いられる選択マ
ーカー遺伝子が殆どの真核細胞のスプライシング機構によって効率的に利用され
ない、という制限をもつ。その結果、抗生物質耐性を付与する活性をコードする
エキソンを用いた3’遺伝子トラップカセットを採用したベクターは、ゲノム中 の遺伝子の比較的小部分の容易かつ効率的な遺伝子トラッピングおよび同定(3’
RACEによる）を可能とするのみである。さらに、トラップされた3’エキソンの 選択における固有の非効率性は、そのような方法を用いて分析できる遺伝子の総
数を限定する。したがって本発明以前には、細胞ゲノムの小部分しか、抗生物質
選択媒介3’エキソントラッピングを用いて効果的にトラップ／突然変異させら れなかった。
【００５７】 本発明のベクターは、選択マーカー活性をコードするエキソンを用いた初期の
3’遺伝子トラップベクターと比較して、数倍から２桁以上大きい数の遺伝子の エキソン配列によるトラッピングおよび同定を可能とする。
【００５８】 本発明のベクターには、3’遺伝子トラップカセットおよび／または遺伝子の オープンリーディングフレームの5’末端を同定する確率を増大させるように作 製された5’遺伝子トラップカセットを組み込むことも可能である。遺伝子の5’
末端はしばしば分泌および膜貫通タンパク質に見いだされるシグナル配列をコー
ドするので、これは重要である。このグループの遺伝子には、可能性のあるタン
パク質治療剤および薬剤標的の遺伝子が多数含まれる。5’非コード配列の長さ の平均が約100 bpであり、平均長遺伝子トラップ配列が約500 bpであるとすると 、本発明のベクターを用いて作製される遺伝子トラップされた配列は、典型的に
はタグをつけたオープンリーディングフレームの5’部分を同定する。これは特 に重要である。なぜなら、遺伝子の5’末端は高いGC含有量、二次構造、および 逆転写酵素のプロセッシビリティーの欠如などの複雑な因子のために、得ること
が困難な場合があるからである。
【００５９】 上記のベクターを用いて公知遺伝子の多数の遺伝子トラップを作成し、同定し
た場合、GenBankのcDNA配列とマッチした遺伝子トラップ配列タグの93%は、同一
の、または付加的5’配列を含んでいた。このことにより、本発明の3’遺伝子ト ラップカセットは遺伝子の5’末端を同定し、特性評価するために使用できること
が確認される。実際、本発明の遺伝子トラップ法は今日までに記述されている他
の方法よりも良好に、または同等に遺伝子の5’末端を同定する。
【００６０】 ゲノム学の分野における主要なチャレンジの1つは、依然として全ての遺伝子 の全長cDNAの単離およびクローニングである。今日まで、これは種々の組織に由 来するcDNAの作製、およびそれに続く個々のcDNAの配列決定を必要とした。上述 のように、そのような方法を用いるとcDNAの5’末端を得ることが非常に困難な 場合がある。さらに、cDNAの完全なレパートリーを得るためには、本質的に全て
の分化した細胞型から、そして全ての発生時点において、それぞれのcDNAライブ
ラリーを作製しなければならないという問題が存在する。なぜなら、ESTとして クローン化するためには遺伝子を発現させなければならないからである。
【００６１】 上に考察したように、本発明のベクターはcDNAライブラリーの構築に用いるこ
とができる。培養下の細胞に導入した場合、3’遺伝子トラップカセットはその細
胞型において通常発現されるか否かにかかわりなく、遺伝子の転写産物を産生す
る。種々のトラップされた遺伝子の発現レベルは、非常に低いレベルでしか発現
されない遺伝子も同定されるように挿入されたプロモーターによって標準化され
る。本発明の方法およびベクターを用いるならば、複数の条件下で増殖させた複
数の細胞型に由来する複数のcDNAライブラリーを別々に作製する必要なしに、1 つのライブラリーから標的細胞ゲノムの広いcDNA範囲を得ることができる。
【００６２】 本発明の3’遺伝子トラップカセットは、例えば組織培養細胞のゲノムに挿入 することができる。そして、トラップされた遺伝子から生じるcDNAのみをcDNAラ
イブラリーにサブクローン化することを可能とする方法(例えば、PCR）を用いる
ことができる。これらの方法は、ライブラリーの作製に要する労力を実質的に低
下させる一方、作製されるcDNAの範囲を増大させる。上に考察したように、本発
明の方法は遺伝子の5’末端を得るためにも特に有用であり、したがって全長cDN
Aを得る機会を最大化することができる。本発明のベクターを用いて作製された トラップされたcDNAの多様性および数を変更するために用いることができる変数
の例としては、限定するものではないが、感染多重度の調整、および外因性に導入
された選択マーカーを組み込んで発現する細胞を選択するために一定期間の選択
培養にかけなかった感染標的細胞からのcDNAの作製が挙げられる。その結果得ら
れる遺伝子トラップされたcDNAライブラリーを配列決定し、複数の遺伝子トラッ
プされた遺伝子のコード領域を作製することができる。これらのコード領域は、
バイオインフォーマティクス(bioinformatics)、in situ およびin vitroの両方
における遺伝子発現研究（すなわち、ハイブリダイゼーション研究、遺伝子チッ
プ（これはトラップされた遺伝子配列に対応するオリゴヌクレオチド配列を用い
ることもできる）、等）および種々の動物および植物由来の遺伝子トラップ配列
データベースの作製に用いることができる。これらの遺伝子トラップ配列は、プ
ローブとして直接利用することができる。または、これらの遺伝子トラップ配列
に対応するオリゴヌクレオチド配列を用いて、ハイブリダイゼーションまたはPC
Rによってライブラリーをスクリーニングすることができる。また、本発明のベ クターを用いて同定された遺伝子トラップ配列は、該遺伝子トラップ配列の発現
を指令するクローニングベクター中に組み込むことができる。本発明の開示の目
的上、このような遺伝子トラップ配列(またはそれに由来するオリゴヌクレオチ ド配列)を有するか、含むか、または組み込んだ単離されたポリヌクレオチド配列
とは、上記cDNA遺伝子トラップ配列(またはそれに由来するオリゴヌクレオチド 配列)の連続したストレッチを、任意の付加的な天然または組換え配列（かかる 単離されたポリヌクレオチドまたはベクター内に存在する上記遺伝子トラップ配
列に隣接してよい）を含めて最小限に組み込んだ、または含む、任意および全て の単離されたポリヌクレオチドまたはベクターを意味するものとする。
【００６３】 本発明の方法およびベクターを用いてDNA(および対応するアミノ酸）配列情報
が得られる速度および効率を考えるならば、本発明の方法およびベクターはスプ ライシング機構およびイントロンを含む遺伝子を含有する任意の細胞（初代およ
び二代細胞を含む）または細胞系において遺伝子スクリーニングを実施するため
の重要な手段を提供することが明らかである。本発明の遺伝子トラップベクター
は特に重要な技術的大躍進を表わす。なぜなら、本明細書に記述する3’遺伝子 トラップカセットは、抗生物質選択によって検出される遺伝子トラッピングに依
存する従来の3’遺伝子トラップベクターを用いて効率的に得られる遺伝子より 、およそ13倍（これは経験的に決定される）の数の遺伝子の迅速な同定を可能と
するからである。新規遺伝子配列を得る頻度と組み合わせると、同定可能な遺伝 子トラップ標的において観察された増大は、多数の新規遺伝子および遺伝子配列
の配列情報を提供するであろう。さらに、ES細胞を標的とすると、これらの新規
配列のそれぞれは新たに同定された遺伝子（および可能性のある薬剤または薬剤
標的）ならびに「ノックアウト」細胞および可能性のある「ノックアウト」胚ま
たは動物のいずれをも表わす。
【００６４】 本明細書に記述する方法、ライブラリー、細胞および動物の迅速な配列獲得特 性は、疾患ならびに遺伝的に決定される有利な点の分子的／遺伝子的基礎を迅速
に同定するのによく適している。遺伝的に決定される有利な点とは、長い寿命、
低コレステロール、低血圧、癌への耐性、糖尿病の低い発生率、肥満の欠如、ま
たは全ての炎症性障害（冠状動脈性疾患、多発性硬化、慢性関節リウマチ、全身
性エリテマトーデス、および炎症性腸疾患を含むが、これらだけに限定されない
）の軽減または予防、などである。多数の標的遺伝子によって提供される広い範
囲を前提とするならば、本明細書に記述する技法の特に有用な用途はコード領域
単一ヌクレオチド多型(cSNP)の特性評価および分析を包含する。
【００６５】5.4.導入方法 本発明の3’遺伝子トラップカセットは、好ましくは、標的細胞ゲノム中に特異
的または非特異的に挿入されうる広範なベクターのうち任意のものの構造成分と
して標的細胞に導入される（3’遺伝子トラップカセットを導入するためにリコ ンビナーゼ系を使用することもできる）。本発明が開示する特徴と共に用いるこ
とができる適切なベクターとしては、限定するものではないが、単純ヘルペスウ
イルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レト
ロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、仮性狂犬病ウイルスベクター、
α-ヘルペスウイルスベクター、などが含まれる。ウイルスベクター、特に非複 製性細胞を改変するのに適するウイルスベクター、およびそのようなベクターを
どのようにして目的のポリヌクレオチドの発現と結びつけて用いるか、について
の徹底した総論が Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applicatio
ns, CaplittおよびLoewy（編), Academic Press, San Diego (1995)に見いださ れる。
【００６６】 本発明の3’遺伝子トラップカセットを送達するためにレトロウイルスベクタ ーを用いる場合は、該レトロウイルスベクターを1995年9月12日発行の米国特許 第5,449,614号（「614特許」）（参照により本明細書に組み入れる）に記述され
るようなレトロウイルスパッケージング細胞系と共に用いることができる。上記
ライブラリーを構築するための標的として非マウス動物細胞を用いる場合は、宿
主細胞の広範な感染を可能とするため、両種向性エンベロープを有するレトロウ
イルスを産生するパッケージング細胞が一般に用いられる。または、限定される
ものではないが、細胞系293/GPG (Oryら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
3:11400-11406; および米国特許出願第08/651,050号：これらは参照により本明 細書に組み入れる）等の向汎性パッケージング細胞系を用いて上記のベクターを
パッケージングすることができる。または、適切なウイルス(例えば、レトロウ イルス）の受容体遺伝子を非マウス(例えば、ヒト）の標的細胞中にトランスフ ェクションすることができる。
【００６７】 さらに、上記のレトロウイルスベクターを米国特許出願第08/907,598号(参照 により本明細書に組み入れる）に記述されているキメラインテグラーゼ分子と共
にパッケージングすることができる。典型的には、パッケージング細胞系の構築 に用いられるLTRは自己不活性化性である。すなわち、エンハンサーエレメント は感染により生じたプロウイルスがどちらのLTRにもエンハンサーを持たないよ うに3’U3配列から除かれる。そうでなければ、プロウイルス中のエンハンサー は突然変異させた遺伝子またはその近傍の遺伝子の転写に影響を及ぼしうる。典
型的には、上記レトロウイルスベクターの遺伝子トラップカセットは、レトロウ
イルスLTRの正常に機能する向きとは逆の向きで存在する。
【００６８】 特に3’遺伝子トラップカセットを組み込んだ組換えウイルスベクターを送達 するためにウイルス、特にレトロウイルス感染（例えば、生物学的方法）を用い るさらなる利点は、遺伝的物質を標的細胞に送達する標準的非生物学的方法より
もウイルス感染の方が効率的であるということである。組換え遺伝的物質をレト
ロウイルス感染によって送達する場合、該レトロウイルスの組換えRNAゲノムは標
的細胞内で逆転写され、次に該感染性ウイルス内にパッケージングされているレ
トロウイルスインテグラーゼがベクター（および3’遺伝子トラップカセット） の標的細胞ゲノムへの本質的に非特異的な組み込みを媒介する。したがって、本
発明のさらなる実施形態は、標的細胞に外因的に付加されたものであるか、また
は標的細胞内では天然に存在しないインテグラーゼまたはリコンビナーゼ活性に
よって媒介される、本発明の3’遺伝子トラップカセットを組み込んだ組換えベ クターの挿入方法を含む。
【００６９】 本発明の3’遺伝子トラップカセットを組み込むように適合させることができ る代表的なレトロウイルスベクターは、特に米国特許第5,521,076号ならびに199
7年10月2日に出願された米国特許出願第08/942,806号および1997年8月8日に出願
された米国特許第08/907,598号に記述されている（これらは特異的遺伝子トラッ
プ現象を生化学的または表現型的にアッセイするために用いることができるスク
リーニングプロトコールをさらに開示している）。これらの開示は参照により本
明細書に組み入れる。
【００７０】 典型的には、レトロウイルスベクターに組み込まれる遺伝子トラップカセット の方向は、正常なレトロウイルス転写の方向の逆である。しかし、1個以上の遺 伝子トラップカセットが正常なレトロウイルス転写の方向と同じ方向に組み込ま
れているレトロウイルスベクターもまた意図される。典型的には、遺伝子トラッ プカセットをLTRに対して逆方向に配置する理由は、ポリアデニル化シグナル、ス
プライス部位およびプロモーターなどの遺伝子操作された制御エレメントの存在
がパッケージング細胞系のレトロウイルスゲノムの正しい転写を妨げ、その結果 レトロウイルス力価を減少させる可能性があるからである。
【００７１】 さらに、逆向きのLTR中に「潜在」スプライスドナー配列が見いだされるので、
このスプライスドナーがトラッピングに関連したスプライシング現象に悪影響を
及ぼさないように、これを部位特異的突然変異誘発によって除去することができ
る。場合により、プロモーターおよび/またはエンハンサー配列の全部または一 部を削除することによってLTRプロモーターおよび/またはエンハンサー機能を不
活性化することができる。
【００７２】5.5. 分子遺伝学的応用 5.5.1. 遺伝子の活性化 本発明のもう一つの実施形態は、動物、たとえばマウス、および培養細胞にお
ける機能の獲得または損失の両方をスクリーニングするために3'遺伝子トラップ
カセットを使用することである。翻訳開始部位を欠くエキソンを有する3'遺伝子
トラップを取り込んだベクターを用いる場合、与えられた標的遺伝子は、ベクタ
ーが遺伝子の中のどこに組み込まれたかに依存して、過剰発現されるか挿入不活
化（変異）するかのいずれかとなる。翻訳開始前にベクターがイントロンの中に
着地した場合、細胞タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム全体
の過剰発現が生じる。これらのタイプのトラッピング事象を用いて、遺伝子の過
剰発現に基づく遺伝スクリーニングをおこなうことができる。これらのスクリー
ニングは、たとえば、疾病の過程において重要な役割を果たす遺伝子を発見する
ために、細胞培養中またはマウス中でおこなうことができる。たとえば、これら
のスクリーニングは、3'遺伝子トラップカセットを初代胚線維芽細胞に導入し、
軟寒天中における増殖能力により選択することによって、ガン細胞を識別するた
めに用いることができる。あるいは、細胞の老化を免れることができる細胞をア
ッセイすることによっても、がん遺伝子の可能性のあるものが識別できる。
【００７３】 本発明のベクターを、遺伝子発現（または過剰発現）をもたらすトラッピング
事象を選択するために用いることができることを証明するために、ES細胞の分化
を促進する因子を発現させる遺伝子がトラップされるかどうかを決定するための
実験をおこなった。数多くの遺伝子が組織培養プレート上の培養細胞にトラップ
された。多数のプレートを平行して感染させ、得られたプレートについて、ES細
胞の分化を観察した。いくつかのプレートではほとんど分化が見られないのに対
して、いくつかのプレートでは100%分化したES細胞が見られた。この分化は、分
化因子である遺伝子、または、ES細胞に分化因子を産生させ、それを培地中にく
み出させて、その結果として皿上のすべての細胞を分化させる遺伝子のいずれか
の発現の結果であると思われる。重要なことに、これは、3'遺伝子トラップ系を
、遺伝子トラッププールの上清を試験することによって、特定の生物学的応答を
引き起こす分泌される分子を活性化またはスクリーニングするために用いること
ができることをも示している。ES細胞分化因子のスクリーニングは一つの例であ
るが、この技術は、興味あるすべての細胞応答に関与する分泌される分子を同定
するために用いることができる。たとえば、アポトーシスまたは造血細胞の分化
を誘導する分泌された分子をスクリーニングすることができる。
【００７４】 本明細書に記載された3'遺伝子トラップカセットによってもたらされる発現の
増加を考えると、本明細書に記載された3'遺伝子トラップカセットのもう一つの
応用は、遺伝子の活性化である。たとえば、適当な動物細胞を、前記の3'遺伝子
トラップカセットを取り込むベクターで処理または感染させた後、ベクターが本
来休止状態の遺伝子の5'イントロンに組み込まれた場合、この遺伝子は「活性化
」され、調節性要素、たとえば、3'遺伝子トラップカセットに取り込まれたエン
ハンサー/プロモーター要素によって過剰発現され得る。このような標的のない 、非特異的な、または偏った非特異的な（米国特許出願番号第08/907,598号参照
）遺伝子活性化を用いて、さまざまな天然の細胞産物のいずれかを過剰発現する
、改変した動物細胞（ヒト細胞を含む）を作ることができる。
【００７５】 このような応用に特に有用であると思われる産物には、エリトロポエチン(epo
)、tPA、サイトカイン、インターロイキン、腫瘍サプレッサー、ケモカイン、分
泌された分子、G-CSF、GM-CSF、神経成長因子(NGF)、繊毛性神経栄養因子(CNTF)
、脳由来神経栄養因子(BDNF)、インターロイキン1-2および4-14、腫瘍壊死因子-
α(TNF-α)、αまたはγインターフェロン等、レプチン(leptin)および因子VIII
およびIXのような、けれどもこれらに限定されない、正常に分泌される分子また
はホルモンが含まれる。
【００７６】 3'遺伝子トラップカセットによる休止状態の遺伝子の活性化、過剰発現、また
は遺伝子の異常な発現はまた、生物体の中での遺伝子の機能を研究するためにも
用いることができる。遺伝子の過剰発現は遺伝子の機能を研究するために用いら
れ、3'カセットで遺伝子をトラップすることにより、遺伝子を生物体中で過剰発
現させることができる。過剰発現によって生物体に生じた表現型によって、その
遺伝子の機能を解明することができる。たとえば、具体的に記載されたレトロウ
イルスベクターは、遍在して発現されるPGKプロモーターを含む。遺伝子がES細 胞にトラップされ、それに続いてES細胞をマウスを作るために用いる場合、マウ
スはトラップされた遺伝子を遍在的に過剰発現する。この方法は、たとえば、ト
ラップされた遺伝子を組織特異的な方式で過剰発現するために、PGKプロモータ ーではなく組織特異的なプロモーターを使うというように、さらに改変すること
ができる。アルブミンプロモーターは肝臓特異的過剰発現のために用いることが
できる。さらに、トラップされた遺伝子のタンパク質産物の、細胞から細胞外空
間へ、血流または乳汁中への分泌を生じさせるために、3'トラッピングカセット
にシグナル配列を加えることができる。これは遺伝子機能の理解を促すであろう
。
【００７７】 過剰発現は、3'遺伝子トラップカセットを用いた遺伝子トラップ事象の一つの
可能性な結果なので、3'トラップ/過剰発現構成要素を除去することができるこ とは有用であることが証明される。これは、3'トラップカセットの必要不可欠な
構成要素（必要不可欠な構成要素にはプロモーター、エキソン、スプライス供与
体、イントロン配列またはカセット全体が含まれる）のいずれかを、flpまたはc
reリコンビナーゼによって認識されるもののようなリコンビナーゼ部位と隣接さ
せることによって達成することができる。この方法で、リコンビナーゼを対応す
る細胞または生物体に加えることによって、希望通りに過剰発現の条件を逆転さ
せるか、過剰発現をなくすことができる。
【００７８】 遺伝子の活性化のために、標的細胞に本来備わっているエキソンか、あるいは
標的細胞に生物学的に適合したエキソンを取り込む包括的な3'遺伝子トラップカ
セットを用いることができる。または、公知の遺伝子から得た特定のエキソンお
よびスプライス供与体部位を利用する特定の3'遺伝子トラップカセットを構築す
ることができる。場合によっては、3'遺伝子トラップを用いた遺伝子の活性化が
、典型的には活性化された遺伝子の翻訳開始部位から上流(5')のベクターの組込
みまたはインサートを必要とすることを考えると、遺伝子活性化エキソンは、好
ましくは、機能的翻訳開始部位(IRESまたはKozak配列）を取り込まない、または
付随的なレベルの翻訳活性のみを仲介することができる名目上機能的（または陰
性の）翻訳開始部位のみを取り込む。別の方法では、エキソンへの内部リボソー
ム侵入部位の取り込みは、3'遺伝子にトラップされた、または活性化された遺伝
子の過剰発現をもたらす。
【００７９】 3'遺伝子トラップエキソンと下流の細胞にコードされたエキソン（たとえば、
「活性化された」遺伝子のタンパク質産物に特有のドメインのみをコードする）
の間の融合産物が望まれる場合は、典型的には、遺伝子トラップベクターは機能
的翻訳開始部位または内部リボソーム侵入部位および翻訳開始部位を取り込む。
【００８０】 あるいは、前記のベクターが翻訳開始部位から下流を組み込む場合には、遺伝
子は変異し、そのような機能の喪失を検出するスクリーニングをおこなうことが
できる。このアプローチの例としては、線維芽細胞を、たとえば、本発明のベク
ターで変異させ、軟寒天中で増殖することができるヒットについてスクリーニン
グすることである。この方法で、腫瘍サプレッサーをコードする遺伝子を同定す
ることができる。典型的には２つの対立遺伝子のうち１つのみがトラップされる
が、培養中の細胞のゲノムは不安定なことが多く、選択を通じて、第２の対立遺
伝子が喪失したものが見いだされる。これによって劣性の表現型をもスクリーニ
ングすることが可能になる。
【００８１】5.5.2. 機能に基づく遺伝子の発見 本明細書に記載されたベクターの遺伝子活性化能力は、さらに選択的な遺伝子
の発見に応用できる。たとえば、増殖欠陥細胞（たとえば、腫瘍サプレッサーま
たはDNA修復ノックアウト細胞等）に、本明細書に記載した遺伝子活性化ベクタ ーを感染させることができる。これに続いて、感染した細胞を、部分的にまたは
完全に修正された増殖表現型を示す細胞/コロニーについてスクリーニングする ことができる。修正された表現型を示す細胞が同定されれば、増殖欠陥表現型の
修正に寄与する「活性化された」遺伝子は、たとえば3' RACEを用いるDNA配列決
定によって迅速に同定することができる。典型的には、DNA修復変異（動物およ びヒトにおける癌にしばしば伴う変異）を部分的にまたは完全に修正する遺伝子
は、腫瘍サプレッサー活性またはおそらく癌遺伝子活性をコードすると思われる
（一般的には、Seltenら、1985、EMBO J., 4(7):1793-1798を参照されたい）。
【００８２】 反対に、癌性のまたはトランスフォームされた細胞（または細胞系）を前記の
遺伝子活性化ベクターに感染させた後、増殖するまたは迅速に増殖する細胞に毒
性を有するさまざまな細胞毒性剤で処理することができる（一般的に、Wilsonら
、1986, Cell, 44:477-487; Stephensonら、1973, J. Virol., 11:218-222; Sac
ksら、1979, Virology, 97:231-240; Inoueら、1983, Virology, 125:242-245;
Nortonら、1984, J. Virol., /50:439-444; Choら、1976, Science, 194:951-95
3; Steinbergら、1978, Cell, 13:19-32; Maruyamaら、1981, J. Virol., 37:10
28-1043; Varmusら、1981, Cell, 25:23-26; Varmusら、1981, Virology, 108:2
8-46; Mathey-Prevotら、1984, J. Virol. 50:325-334; およびRyanら、1985, M
ol. Cell. Biol., 5:3477-3582を参照されたい）。好ましくは、感染した細胞を
、トランスフォームされていない表現型に戻った細胞が接触阻害され、培養培地
中に存在する細胞毒性剤の影響を受けにくいような条件下で、細胞毒性剤または
化学療法剤に曝す。これはさらに、迅速に増殖するまたはトランスフォームされ
た細胞の優先的な脱離、および数サイクル後に、結果としておこる非癌性のまた
はトランスフォームされていない表現型に部分的にまたは完全に復帰した細胞の
単離に寄与する。これに続いて、トランスフォームされた表現型の修正、または
腫瘍化表現型の抑圧に寄与する「活性化された」遺伝子を、前記の3' RACEプロ トコールを用いたDNA配列決定によって迅速に同定することができる。
【００８３】 本明細書に記載された方法はまた、癌の遺伝的基礎を同定するために有用であ
る。本明細書に記載される方法を用いて研究され、治療される可能性のある癌に
は、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、心臓：肉腫（
血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂
肪腫および奇形腫；肺：気管支癌（鱗状細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺
癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中
皮腫；胃腸：食道（鱗状細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌、リン
パ腫、平滑筋腫）、膵臓（管腺腫、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリ
ノーマ、類癌腫、VIP産生腫瘍）、小腸（腺癌、リンパ腫、類癌腫、カポジ肉腫 、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、
繊毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖器管：腎臓（腺癌、ヴィルムス腫[腎芽 細胞腫]、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（鱗状細胞癌、移行性細胞癌、 腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌、
絨毛癌、肉腫、間隙細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝臓：
肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原
性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫
、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫(o
steochondroma)（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液腫、
類骨骨腫および巨細胞腫；神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形
性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、
神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫[松果体腫]、多形膠芽腫、乏突起膠腫、神経線維腫
、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄：（神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；
婦人科系：子宮（子宮内膜癌）、頸部（頚癌、前腫瘍子宮頸部形成異常）、卵巣
（卵巣癌[漿液嚢胞腺腫、ムチン嚢胞腺腫、子宮内膜腫瘍、腹芽腫、明細胞癌、 未分類癌]、顆粒層包膜細胞癌、セルトーリ-ライディヒ細胞腫、未分化胚細胞腫
、悪性奇形腫）、外陰（鱗状細胞癌、上皮癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、腟（
明細胞癌、鱗状細胞癌、ブドウ状肉腫[胎児性横紋筋肉腫]、ファローピウス管（
癌）；血液：血液（骨髄性白血病[急性および慢性]、急性リンパ芽球性白血病、
慢性リンパ性白血病、骨髄芽球病、多発骨髄腫、骨髄形成異常症候群）、ホジキ
ン病、非ホジキンリンパ腫[悪性リンパ腫]；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、鱗
状細胞癌、カポジ肉腫、色素性母斑、形成異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維
腫、ケロイド、乾癬；乳房：癌および肉腫；および副腎：神経芽腫。
【００８４】 上記の研究の変更には、レトロウイルス遺伝子をトラップするベクターを、特
定の制御配列または転写因子によって調節される遺伝子へのレトロウイルスの組
込みを標的とするまたはこれに偏らせるキメラインテグラーゼと共に用いること
が含まれる。たとえば、本明細書に記載されたレトロウイルス遺伝子活性化ベク
ターを、この公知の腫瘍サプレッサー活性により調節される遺伝子に対するベク
ター介在型遺伝子活性化を優先的に標的とするp53-キメラインテグラーゼを取り
込んだウイルス（米国特許出願番号第08/907,598号に記載されるような）にパッ
ケージングすることができる。
【００８５】 適切に変更されると、本明細書に記載されたベクターは、さらに、実質的にす
べてのDNA配列を、標的細胞のゲノム全体のどこにでも配置し、どこにベクター が組み込まれたかを速やかに同定するためのベヒクルを提供する。ゲノム全体の
どこかに配置したいと考えるDNA配列は、ますます数多く同定されてきている。 このような配列の例には、それぞれflpおよびcreリコンビナーゼにより同定され
たfrt部位またはlox P部位のような組換え部位が含まれる。これらの部位は相同
組換えまたは他の形質転換法によってゲノム全体のどこにでも配置することがで
きるが、本発明によれば、自動化された方法を用いた組み込み部位の迅速な同定
および目録作成が可能になる。これらの組換え部位は、特定のDNAの挿入に、ま たは他の位置における挿入と同時に用いることができ、また、これらは、逆位、
欠失および転座のような染色体の再配列を引き起こすために用いることができる
。このように、本明細書に記載されたベクターは、染色体の再配列を通じて遺伝
子の機能を研究するために特に有用である。ゲノム全体のどこかに配置したいと
考えられる他の配列には、tet、エクジソン、またはエストロゲン受容体DNA結合
部位または応答要素が含まれるが、これらに限定されない。これらの部位は、一
般に遺伝子発現の誘導または抑制のために用いられており、これらの部位をゲノ
ム全体のどこかに、好ましくは何千もの異なる遺伝子のうちの何十かの遺伝子に
配置することによって、遺伝子発現の条件的または組織特異的な調節を引き起こ
す機会を提供するであろう。
【００８６】 前記の変異誘発法のもう一つの特徴は、ベクターにコードされる配列および構
造的な特徴を、組み込まれた遺伝子トラップ構築物と直接隣接するゲノムDNAの 迅速な同定をおこなうために利用することができることである。このアプローチ
は、構築物が組み込まれた遺伝子を識別するエキソン配列は、3'遺伝子トラップ
カセットの配列獲得能力を介してアクセス可能であるという事実を利用している
。（生物情報科学によって）適切に同定された細胞エキソンにハイブリダイズす
るオリゴヌクレオチドは、クローン化され得る鋳型を作るPCR反応において、ま たは組込み部位を同定するために直接配列決定された、ベクターにコードされる
配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと共に用いることができる。PCR が完全に適切であると証明されない場合には、比較的まれな切断制限部位、たと
えば、Sfi I等を取り込むように遺伝子操作されたベクターを用いることによっ て、PCR反応を増大することができる。このような制限部位は、PCR産物を、また
はベクターにフランキングするゲノム配列さえも、適当なクローニングベクター
またはそのライブラリーにサブクローニングするために利用することができ、そ
れに続いて、たとえば、確立された方法、たとえばPCR、ロングレンジPCR、サイ
クル配列決定等を用いてベクター組込み部位を同定するために用いることができ
る。
【００８７】 本発明の別の態様において、リコンビナーゼ活性をコードする遺伝子を（たと
えば、flpまたはcre等、米国特許第5,654,182号および第4,959,317号を参照され
たい。この文献を参照により本明細書に組み入れる）、前記の3'遺伝子トラップ
カセットを含むベクターに配置する。このリコンビナーゼ遺伝子は、前述のマー
カー遺伝子についての記載と同様の方法で発現させることができる。簡単に述べ
ると、リコンビナーゼは、独立した発現カセットから発現することができ、5'遺
伝子トラップに取り込むことができ、またはベクタープロモーターから発現する
ことができる。リコンビナーゼを発現するために用いられる戦略に依存して、リ
コンビナーゼは別々の構築物上に、または3'遺伝子トラップカセットの5'または
3'のどちらかでベクターに存在し得る。リコンビナーゼ遺伝子を前記の遺伝子ト
ラップベクターに取り込むことによって、さまざまなトラップされた遺伝子と本
質的に同じパターンのリコンビナーゼを発現する変異した細胞の収集物またはラ
イブラリーが得られる。上記の考察には、本明細書に記載されたベクターを用い
て、ベクターが標的細胞のゲノムの中のどこに組み込まれたかを迅速に同定する
ことができる方法によって、如何にしてゲノム全体にわたって任意のDNA配列を 配置するかを示す少数の例しか記載されていない。当業者は、前記のベクターが
真核生物の分子遺伝学の分野に広い応用可能性を有する技術を構成することを理
解するであろう。さまざまなベクターおよび遺伝的応用のすべてが本発明の開示
の範囲に含まれることが意図されている。たとえば、他の前述した特徴を持たな
い3'遺伝子トラップカセットを含むレトロウイルスベクターをデザインすること
ができる。さらに、3'遺伝子トラップは、プロモーターの一つが誘導性である縦
列プロモーターを有するようにデザインすることができる。あるいは、たとえば
、前記の5'遺伝子トラップから得たSAneoが、好ましくは枠内で、前記の3'遺伝 子トラップカセットのエキソンに融合した（すなわち、pAおよびプロモーター配
列が欠失している）ハイブリッド遺伝子トラップもまた本発明の範囲に含まれる
ことも意図する。このような構築物は、前記の遺伝子トラップカセットの増大し
たSAおよびSD機能の両方で有利であり、与えられた標的細胞に発現された遺伝子
の自動化された同定を可能にする。
【００８８】5.5.3. 条件変異誘発 本発明の別の態様は、細胞内で、または生物体あるいは動物の中で、時間的お
よび空間的にオンおよびオフを切り替えることができる変異を作る能力である。
特定の場所または特定の時間においてのみ遺伝子を変異させる能力は、遺伝子機
能の理解に重要な影響を与える。たとえば、イントロン内のSAβgeoの配向はそ のトラップする能力を調節し、それによって、トラップされた遺伝子によって作
られる正常な転写物を変異させる。適切に配向したfrtリコンビナーゼ部位は、f
lpリコンビナーゼと共に用いて上のゲノム再配列に影響を与えることができる（
すなわち、遺伝子トラップカセットを「フリップ」またはさらに除去することに
より、変異の「オン」または「オフ」を切り替える）。あるいは、与えられた変
異原性構築物がcreリコンビナーゼを発現する組織または細胞中のみで選択的に 改変される（置換、フリップ、欠失等）ような条件変異を作り出すために、たと
えば、cre/lox系を用いることもできる。
【００８９】 上記の概念を立証するために、二つの逆転したlox部位内にSAβgeoカセットを
配置したベクターを構築した。これらの部位は、lox部位の間に位置するDNA配列
を効果的にフリップすることができるcreリコンビナーゼによって認識される。 逆方向lox部位が隣接するSAβgeoを含むレトロウイルスベクターを、相同組換え
によってHPRT遺伝子のイントロンの中に組み入れた。SAβgeoが順方向の配向で 存在したとき、6-チオグアニンの存在下での細胞の生存によって証明されるよう
に、HPRT機能は廃止された。ところが、creリコンビナーゼがこれらの細胞に発 現されたとき、SAβgeoの配向は逆向きの配向にフリップして、HATを含む培地に
おける細胞の増殖によって示されるように、HPRT機能が回復した。このように、
HPRT遺伝子は、SAβgeoの配向をフリップすることによって効果的にオフまたは オンに切り替えることができる。したがって、本発明のもう一つの実施形態は、
遺伝子発現の選択的および可逆的な調節を可能にするベクターに関する。同様の
方法論を用いて、遺伝子トラップ変異もまた、リコンビナーゼ発現、およびそれ
による、たとえばさまざまな刺激/制御要素に対するSAβgeoのフリップと結合さ
せることによって、条件的または組織特異的におこなうことができる。中または
外に「交換」するリコンビナーゼが介在する戦略を用いて対立遺伝子系を操作す
ること、または、さまざまなより大きいまたは小さい変異原性構築物（好ましく
はloxまたはfrt部位とフランキングしている）のいずれかを操作することも可能
である。
【００９０】 本明細書に記載したベクターを組織特異的または調節可能な発現に用いるため
の別の方法は、LTR内にfrtまたはlox部分のような特異的DNA結合部位を配置する
ことである。LTRにlox部位を有する場合、一旦挿入がおこなわれ同定されると、
たとえば、creリコンビナーゼを加えて、単一のfrtまたはlox部位を含む一つのL
TRを除くインサート全体を除去するために用いることができる。さらに、調節可
能な遺伝子発現を可能にするDNA応答要素を、全体としてまたは部分的に、リコ ンビナーゼ部位と共に取り込むことができる。ベクターまたは遺伝子トラップイ
ンサートがリコンビナーゼ活性によって除去された場合、単一のLTRの産生をも たらす同じ組換え事象はまた、機能的DNA応答要素を産生する。この単一のLTRは
遺伝子機能を妨害しないが、DNA要素は遺伝子発現を調節するために用いること ができる。真核生物の遺伝子発現を調節するために用いられる典型的なDNA要素 またはオペレーターには、tet、エクジソンまたはエストロゲンDNA結合部位が含
まれる。tetオペレーターがtetリプレッサータンパク質と結合して存在すると、
遺伝子の発現を増加または減少するように調節することが可能になる。これはマ
ウスにおいて、LTR挿入物を有するマウスの系統を、tetリプレッサーを遍在して
または特定の組織のみにおいて発現するマウスの系統と交配することによって実
施することができる。
【００９１】 本発明の別の実施形態は、flpリコンビナーゼが、たとえば、frt隣接組込みベ
クター配列の、外因的に加えたfrt隣接配列との置き換えを仲介することができ るという事実に基づいている。そこで、適切に構築されたベクター（フランキン
グするリコンビナーゼ部位を取り込む）が標的細胞のゲノムの所与の領域に取り
込まれると、同じ隣接するリコンビナーゼ部位を取り込む実質的にすべてのさま
ざまなDNA配列（すなわち、プロモーター、エンハンサー、IRES、応答要素等） は、適切なリコンビナーゼタンパク質を使用することによって上記ベクターの中
に入れたり外に出したりの切り替えをおこなうことができる。
【００９２】5.5.4. 生物学的アッセイ 明らかなように、本明細書に記載された3'遺伝子トラップカセットを取り込ん
だベクター、特にレトロウイルスベクターは、さまざまな真核生物標的細胞の内
因性遺伝子の発現を、変異誘発、活性化、または制御するために用いることがで
きる。したがって、本明細書に記載されたベクターは、植物、および鳥類、魚類
および哺乳類のような高等な真核生物における分子遺伝学的技術を実施するため
に特に有用である。このような分子遺伝学的技術の例には、遺伝子の活性化、変
異、および調節のin vitroおよびin vivo両方のスクリーニングが含まれる。
【００９３】 たとえば、CD4陽性ヒトT細胞をin vitroで本明細書に記載されたベクターに感
染させた後、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の細胞変性株に感染させる。HIV感染か
ら生き残ることができた細胞を単離し、HIV耐性に関与した遺伝的変異を迅速に スクリーニングする。
【００９４】 in vitroで使用できる別のスクリーニング法は、前記の遺伝子トラップベクタ
ーによって形質転換された細胞を変異し、形質転換された細胞の速い増殖を妨げ
る変異を選択することである。この戦略は、癌遺伝子または腫瘍サプレッサー遺
伝子を同定するために用いることができる。細胞の変異後に、さまざまな化学物
質を迅速に分裂する細胞を殺すために用いて、細胞増殖および形質転換された表
現型に役割を果たす遺伝子への挿入物を選択する。迅速に増殖する細胞を殺す化
学物質の一つの例は、ブロモデオキシウリジン(BrdU)、PestovおよびLau、1994,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(26):12549-12553である。BrdUは迅速に分裂
する細胞のDNA中に優先的に入り込み、そしてHoechst 33258を加えた後、蛍光で
処理すると迅速に分裂する細胞を陰性選択し、同時にゆっくり増殖する細胞を選
択する。
【００９５】 前記のベクターを形質導入された細胞の別の応用法は、ヘテロ接合細胞を用い
て、またはこのようなスクリーニングアッセイの前に培養された、または（たと
えば、適用可能な遺伝子トラップベクターに取り込まれた対応する選択可能なマ
ーカー遺伝子のホモ接合表現を選択するために高濃度の抗生物質を用いて）ホモ
接合性に操作された細胞を用いて実施することができる、細胞ベースのin vitro
表現型スクリーニングである。
【００９６】 本発明が意図するin vivoのアッセイには、動物をin vivoで変異誘発しスクリ
ーニングするために3'遺伝子トラップカセットを用いるベクターの使用が含まれ
る。これらのアッセイにおいて、本発明のベクターは、たとえばENU（一般的に は、Vitaternaら、1994, Science, 264:719-725を参照されたい）のような典型 的な化学的変異誘発物質の代わりに、またはこれに加えて用いられる。たとえば
、試験動物をさまざまな位置で、さまざまな濃度の本明細書に記載されたウイル
スベクターに感染させる。投与の好ましい方法には、経口、鼻腔内、直腸、局所
、腹腔内、静脈内、筋内、皮下、皮内、頭蓋内、鞘内等が含まれる。次に、これ
らの変異誘発性刺激に起因する異常な細胞表現型を同定し、単離し、スクリーニ
ングする。腫瘍細胞が観察され単離された場合、腫瘍化表現型に伴う変異を迅速
に同定するために3' RACEを用いて、これによって腫瘍サプレッサー遺伝子の候 補または癌遺伝子の可能性のあるものを同定することができる。
【００９７】 本明細書に記載されたベクターの別のin vivoの応用は、感染症に関連する病 原体による感染に対して異常に耐性のあるまたは感染しやすい、変異体トランス
ジェニックおよび体細胞トランスジェニックの細胞、動物、ならびに植物の作出
に関する。
【００９８】 本発明のもう一つの強力な応用は、ヒト以外の変異体トランスジェニック動物
の大規模な作出である。このようなヒト以外のトランスジェニック動物には、た
とえば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニ
ックウサギ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヤギ、および、鳥類
および魚類、特に哺乳類の種のような当業者に公知の他のトランスジェニック動
物種が含まれる。これに加えて、ウシ、ヒツジ、およびブタの種、齧歯類の他の
科、たとえば、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒト以外の霊長類、たとえば
、チンパンジーが、本発明を実施するために用いられる。特に好ましい動物はラ
ット、ウサギ、モルモットで、最も好ましいのはマウスである。体細胞トランス
ジェニック動物（上記参照）、および生殖系列トランスジェニック動物の両方が
特に意図されている。さらに、このような動物は、培養細胞を用いてさらに遺伝
子トラッピングの研究をする際に組織および細胞の供給源となる。
【００９９】 相同組換えによってマウス胚性幹細胞に変異をおこすことは十分に確立されて
おり、哺乳類系における遺伝子機能を研究するために有用であることが証明され
ている。けれども、相同な遺伝子を標的とすることには多くの制限がある。この
ような制限の一つは、ゲノム配列のエキソン/イントロン構造を決定するために 、遺伝子が知られており、且つ、マッピングされている必要があることである。
遺伝子およびその構造が知られている場合でも、標的とするベクターは変異させ
ようとする個々の遺伝子それぞれについて作らなければならない。これは、数多
くの遺伝子を相同組換えによって変異させる速さを制限するものである。本明細
書に記載された非相同、または非特異的な3'遺伝子トラッピングおよび変異の方
法は、上記の制限を受けない。一般的に、非特異的にインサートされた、または
標的指向されないベクターは、このようなベクターは相同組換えによる配列を挿
入するためにデザインされたDNAベクターに典型的な相同標的指向性配列の（し ばしば広範囲の）フランキング領域を欠いているという事実によって、相同組換
えのためにデザインされたベクターと区別できる（たとえば、米国特許第5,733,
761号を参照されたい。この文献を参照により本明細書に組み入れる）。
【０１００】 マウスに変異をおこさせるために他の方法を用いることもできる。これらには
、化学物質または放射線によって誘導される変異が含まれるが、これらは、遺伝
子についてあらかじめ何も知識がなくても遺伝子を変異させるために用いること
ができる。これらの変異は大規模におこなうことができるが、変異した遺伝子を
同定するために、たとえば位置クローニングのような非常に長い関連過程を必要
とすることが多い。それに加えて、これらの変異は数多くのマウスを表現型につ
いてスクリーニングした後に初めて同定される。これは、大きなマウスのコロニ
ーを必要とし、このコロニーを維持するのに多大の費用と動物を繁殖させるため
の時間を必要とする。あらかじめ遺伝子についての知識が必要なく、遺伝子の迅
速な変異が可能で、遺伝子が容易に同定可能であるような方法が必要である。本
発明に記載されるような遺伝子トラッピングは、数多くの遺伝子を変異させ、ま
だ胚性幹細胞期にある間に（ほとんど）同時に変異の同定ができる能力を与える
。これによって、大規模にマウスを作る費用を負担することなく前もって実質的
な分析が可能になり、また、前述の通り、強力な遺伝子発見構成要素を提供する
。これに続いて、選択された遺伝子中に遺伝子トラップ変異を含むES細胞からマ
ウスが作られ、得られた表現型を迅速に同定し、特徴づけることができる。これ
に続いて、得られたノックアウトマウスを他のマウス株と交配し、異なる遺伝的
背景における遺伝子トラップ変異の評価を可能にするコンジェニックまたは組換
えコンジェニック動物を作るために戻し交配する。上記の本発明の態様を実施す
るために用いることができるさまざまな株および遺伝子操作の代表的なリスト（
ES細胞ライブラリーを含む）は、「実験マウスの遺伝的変種および株」(“Genet
ic Variants and Strains of the Laboratory Mouse”) 第３版、第１および２ 巻、1996, Lyonら編、Oxford University Press, NY, NY(この文献全体を参照に
より本明細書に組み入れる)に記載されている。
【０１０１】 変化した細胞の表現型を本明細書に記載された遺伝子トラッピングおよび活性
化の方法と組み合わせることができることを考えると、本発明の別の態様は、変
化した細胞のおよび動物の表現型を検出するためのスクリーニングアッセイの使
用である。変化した表現型はまた、変異した細胞および動物を外因性の物質およ
び化合物に曝すことによっても検出することができる。さらに、変異表現型と会
合した遺伝子/タンパク質を単離して、さらに、タンパク質の正常の機能を、改 変、置換、相互作用、阻害または増大することができる薬物の候補を同定するた
めの生化学的分析をおこなう。
【０１０２】 本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、これはいかなる方法
でも本発明を限定するものではない。
【０１０３】6.0. 実施例 SAβgeo (5'エキソントラップとして)およびPGKpuroSD (3'エキソントラップ として)の両方を含むベクターを試験すると、puro耐性コロニーと比較して13倍 多いG418耐性コロニーが得られることが見いだされた。これは、多くの場合、SA
βgeoが遺伝子をトラップすると、遺伝子トラップベクターのpuro SD部分は同じ
遺伝子の3'部分を効果的にトラップすることができなかったことを示している（
標的細胞にピューロマイシン耐性を与えることができなかったことにより証明さ
れる）。これに加えて、G418耐性コロニーを単離して、puroが下流エキソンにス
プライシングしたがpuro選択を与えるのに十分な高レベルではなかったのかどう
かを決定するために3' RACEをおこなったところ、コロニーの約10%しか3' RACE 産物を産生しないことが判明した。さらに、配列データは、ほとんどの場合、ス
プライシングがおこっていなかったことを示していた。これらのデータは、PGKp
uroSD 3'遺伝子トラップカセットは、限られた効率で遺伝子の下流エキソンにス
プライシングしてこれをトラップすることができるのみであったことを示してい
る。同様の非効率は、puroに加えてさまざまな他の選択マーカーを用いても観察
された。これはほとんどの選択マーカーは微生物に由来するという事実に起因す
ると考えられる。たとえば、puro遺伝子はStreptomyces albonigerに由来し、そ
のため、哺乳類細胞によって典型的に用いられるものとは異なるコドン使用を取
り込む。
【０１０４】 コドン使用が、観察されたスプライシングの非効率の原因であるかどうかを試
験するために、最適の哺乳類のコドン使用を取り込むpuro遺伝子を合成した。け
れども、改変したpuroエキソンをを取り込んだ3'遺伝子トラップカセットは効率
的にスプライシングされなかった。不十分なスプライシングの別の理由として考
えられるのは、第１エキソンの平均の長さが約100bpしかないのに対して、ピュ ーロマイシンマーカーは700bpの長さを有することである。そのため、さらに、 選択マーカー遺伝子をプロモーターの隣に配置することが、スプライシング機構
によるpuroエキソンおよびスプライス供与体配列の最適の認識を妨げたという可
能性が残った。
【０１０５】 細胞RNAスプライシング機構は、puro遺伝子エキソンを限られた効率でしかプ ロセシングできなかったという重要な知見に基づいて、天然の哺乳類エキソンを
取り込む3'遺伝子トラップカセットは、著しく増大したスプライシング効率、お
よびそれによるトラッピング効率を示すことが推定された。この仮説を試すため
に、3'遺伝子トラップカセットを遺伝子操作して、puroエキソンおよびスプライ
ス供与体部位を、天然のスプライス供与体配列とスプライス供与体部位に続く天
然のイントロン配列部分とを有する天然のマウスエキソンと置き換えた（マウス
btk遺伝子の第１エキソン、GenBank登録番号MMU58105のヌクレオチド40,043から
40250）。これに続いて、このカセットを、ウイルス遺伝子トラップベクターの 中のSAβgeo遺伝子の3'に挿入した。マウスbtk遺伝子の第１エキソンは、これが
平均的な哺乳類の第１エキソンとほぼ同じ大きさであるため、および重要なこと
には、これはマウスゲノム中に天然に存在するが、btk遺伝子はマウスのES細胞 には発現されないことがあらかじめ決定されていたために選択された。これがES
細胞に発現されたとすると、3' RACE産物には常に内因性遺伝子からのbtk配列が
混入し、トラップした遺伝子を識別する能力を妨げる可能性があるので、この特
徴は重要である。したがって、3'遺伝子トラップカセットエキソンの好ましい特
徴は、これが、正常な状態では標的細胞によって発現されない、または外部の刺
激または操作を加えないと発現されない、天然に存在する遺伝子に由来すること
である。
【０１０６】 本明細書に記載された3'遺伝子トラップカセットに取り込まれ得るエキソンは
、さまざまな真核生物（たとえば、酵母、昆虫、真菌、植物、鳥類、は虫類、魚
類等）のいずれかに天然に存在する配列から取られた、またはこれに由来するも
のであってよいが、典型的には、動物細胞、特に哺乳類細胞が好ましい。あるい
は、エキソンは、真核生物標的細胞のmRNAプロセシング（たとえば、スプライシ
ング、キャップ形成、ポリアデニル化、輸送、および分解）によって効率的およ
び機能的にプロセシングされるようにデザインされ、それを合成することができ
る（たとえば、「コンセンサス」エキソン）。
【０１０７】 ここではbtkの第１エキソンについて特に例示したが、本発明はこのエキソン に限定されるものではない。実際に、すべての天然に存在する真核生物遺伝子の
エキソン、１以上の真核生物遺伝子からの一連のエキソン、コンセンサスエキソ
ン、または合成エキソン、あるいは標的細胞RNAプロセシングおよび発現機構に よって容易に認識され、効率的にプロセシングされるようなエキソンは、本明細
書に記載された3'遺伝子トラップカセットに取り込み可能である。典型的には、
第１エキソンの長さは、約1,000bpより短く、より好ましくは約700bpより短く、
さらに好ましくは約500bpより短く、最も好ましくは300bpより短い。このような
第１エキソンの例は、たとえば、GenBankに見いだすことができ、ヒト成長ホル モンの第１エキソン、エリトロポエチン、hprt、メタロチオネインIおよびII、 トウモロコシ、コムギ、またはダイズリブロース1,5-ビスリン酸カルボキシレー
ト、ラットプレプロインスリン、雄不稔性２(MS2)遺伝子、プロリフェラ(prolif
era;PRL)遺伝子等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】 典型的な抗生物質耐性マーカーは動物または哺乳類細胞に天然に存在しないこ
とを考えると、哺乳類標的細胞に抗生物質耐性または感受性（ヘルペスチミジン
キナーゼ）を与えるマーカーは、一般的に本明細書に記載された3'遺伝子トラッ
プカセットへの取り込みには好ましくない。同様に、遺伝子トラップ事象の検出
および選択のための色素産生(chromogenic)アッセイに用いられる典型的に利用 可能な酵素マーカー（たとえば、β-ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペ ルオキシダーゼ、細菌アルカリホスファターゼ等）もまた哺乳類のゲノムに天然
に存在しないことを考えると、このような遺伝子は本発明の実施には好ましくな
い。けれども、上記の選択マーカーおよび酵素マーカーをコードする転写物の哺
乳類細胞によるプロセシングおよび発現の効率を増加するような適切な遺伝子操
作が見いだされれば、このようなマーカーを特許請求の範囲に記載された発明を
実施するために用いることができる。上記の選択マーカーおよび酵素リポーター
は好ましくは本明細書に記載された3'遺伝子トラップカセットの一部ではないけ
れども、これらは、前記の3'遺伝子トラップカセットと結合して5'遺伝子トラッ
プ構成成分の一部として用いることができる。
【０１０９】6.1. ベクターの構築 マウスホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)遺伝子由来のプロモーターを、天然 に存在するマウスbtk遺伝子（マウスbtk遺伝子のヌクレオチド40,043から40,250
）の第１エキソンの上流に配置した。btk遺伝子の第１エキソンは翻訳開始部位 およびコードした配列の5'領域を示す開始コドンを含まないが、これらのものは
必要ならばエキソンの中に遺伝子操作により入れることができる。第１エキソン
のコード領域の3'末端を、スプライス供与体配列によって印をつける。スプライ
ス供与体認識配列はイントロン配列の中に延長できることから、イントロンDNA の103塩基はbtk第１エキソンの末端の後ろに保持された。PGKbtkSDカセットは3'
ポリアデニル化シグナルを欠いている。したがって、このカセットによって産生
された転写物はすべて適切にプロセシングされず、そのため、転写物がポリアデ
ニル化され得る3'エキソンにスプライシングされない限り、3' RACEによって識 別される。
【０１１０】 上記の3'遺伝子トラップカセットを、3'遺伝子トラップカセットのPGKプロモ ーターの5'のポリアデニル化部位を取り込んだレトロウイルスベクターに（フラ
ンキングするLTR領域に対して反対向きの配向で）配置し、neo遺伝子をポリアデ
ニル化部位の5'に配置し、スプライス受容体(SA)部位をneoコード領域の5'に配 置して、機能的SAneopA、または必要に応じてSAIRESneopA 5'遺伝子トラップカ セットを作製した。このベクターはまた、操作可能な組み合わせで、PGKbtkSDカ
セットにフランキングする１対のリコンビナーゼ認識部位をも取り込む（図２参
照）。このベクターは、典型的には、標的細胞がトラップした遺伝子を自然に発
現することを要求するが、この要求は選択マーカーの発現を独立して制御するプ
ロモーターを加えることによって克服できる。
【０１１１】6.2. 3’遺伝子トラッピング 標準的技法を用いてbtkベクターを胚性幹細胞に導入した。すなわち、GP+Eパ ッケージング細胞由来の上清を約2x106個の胚性幹細胞に16時間添加し（標的細 胞1個あたりウイルス約0.1個のインプット比で）、次にG418を用いて細胞を10日
間選択した。次にG418耐性細胞を単離し、96ウエルプレート上で増殖させ、そし
て自動RNA単離、逆転写、PCRおよび配列決定プロトコールにかけ、遺伝子トラッ
プされた配列を得た。
【０１１２】 RNA単離は、50 mMリン酸ナトリウムバッファー、pH8.6中の5’-アミノ(dT)42
(GenoSys Biotechnologies)を用いて処理し、室温で一晩静置したDNA結合プレー
ト(Corning/Costar)を用いて実施した。使用の直前にこのプレートをPBSで３回 、TEで２回すすいだ。細胞をPBSですすぎ、DEPC処理水中に100 mM Tris-HCl, 50
0 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1% LiDSおよび5 mM DTTを含む溶液を用いて溶解させ、
そしてDNA結合プレートに移し、ここでmRNAが捕獲された。15分間インキュベー トした後、DEPC処理水中に10 mM Tris-HCl, 150 mM LiCl, 1 mM EDTA, および0.
1% LiDSを含む溶液を用いてRNAを2回洗浄した。次に同一溶液からLiDSを除いた ものを用いてRNAを3回すすいだ。DEPC処理水中に2 mM EDTAを含む溶出バッファ ーを添加してプレートを５分間70℃に熱した。2X 第1鎖バッファー、100 mM Tri
s-HCl, pH 8.3, 150 mM KCl, 6 mM MgCl2, 2 mM dNTPs, RNAGuard (1.5単位／反
応, Pharmacia), 20 mM DTT, QTプライマー(3 pmol/rxn, GenoSys Biotechnolog
ies, 配列： 5’CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT3’、 配列番号12) およびSuperscript II酵素(200単位/rxn, Life Technologies)を含
有するRTプレミックスを添加した。プレートをサーマルサイクラーに移し、RT反
応（37℃5分間、42℃30分間、および50℃10分間）を行った。
【０１１３】6.2.1.PCR産物の生成 ２ラウンドのPCRを用いてcDNAを増幅した。PCRプレミックスは、1.1X MGBIIバ
ッファー(74 mM Tris, pH 8.8, 18.3 mM 硫酸アンモニウム, 7.4 mM MgCl2, 5.5
mM 2ME, 0.011% ゼラチン), 11.1% DMSO (Sigma), 1.67 mM dNTPs, Taq (5単位
/rxn), 水およびプライマーを含む。第１ラウンドプライマーの配列は、 Po 5’AAGCCCGGTGCCTGACTAGCTAG3’、配列番号13； BTKo 5’GAATATGTCTCCAGGTCCAGAG3’、配列番号14；および Qo 5’CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGAC3’、配列番号15 (pmol/rxn)である。第２ラウ ンドプライマーの配列は、 Pi 5’CTAGCTAGGGAGCTCGTC3’、配列番号16； BTKi 5’CCAGAGTCTTCAGAGATCAAGTC3’、配列番号17；および Qi 5’GAGGACTCGAGCTCAAGC3’、配列番号18 (50 pmol/rxn)である外部プレミッ
クス(outer premix)をcDNAのアリコートに添加し、17サイクル（95℃1分間、94 ℃30秒間、58℃30秒間、65℃3.5分間)反応を実施した。この産物のアリコートを
内部プレミックス(inner premix)に添加し、上記と同じ温度で40サイクル反応さ
せた。
【０１１４】 ネステド（nested, 入れ子）3’RACE産物を96ウエルマイクロタイタープレー トフォーマットで２工程プロトコールを用いて下記のように精製した。すなわち
、25μlの各PCR産物を、STEバッファー（150 mM NaCl, 10 MM Tris-HCl, 1 mM E
TDA, pH 8.0)を用いて前もって平衡化したSephacrylTM S-300 (Pharmacia Biot
ech AB, Uppsala, Sweden)の0.25 ml樹脂床に加えた。1200 x gで5分間遠心する
ことによって産物を回収した。この工程は、組み込まれていないヌクレオチド、
オリゴヌクレオチドおよびプライマーニ量体を除去する。次に産物をMilliQ H2O
中で平衡化したSephadexTM G-50 (DNA級、Pharmacia Biotech AB)の0.25 ml樹脂
床に加え、そして上記のように遠心して回収した。PicoGreen (Molecular Probe
s, Inc., Eugene, Oregon)を用いて、製造者の指示にしたがって蛍光により精製
PCR産物を定量した。
【０１１５】 7 pmolのプライマー(オリゴヌクレオチドOBS; 5’CTGTAAAACGACGGCCAGTC3’、
配列番号19)および約30-120 ngの3’RACE産物を用いて、AmpliTaqTM FS DNA ポ リメラーゼ (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いたダ イ(dye, 色素）ターミネーター法サイクルシークエンシング反応を実施した。反
応は、95℃10秒間、55℃30秒間、60℃2分間を35サイクル実施した。G-50カラムを
先に記述したように使用して、完了したシークエンシング反応液から組み込まれ ていないダイターミネーターを除去した。真空下で反応液を乾燥させ、ローディ
ングバッファーに再懸濁し、そしてXLアップグレード(upgrade)付きのABI Prism TM 377を製造者の指示にしたがって用いて6% Long Rangerアクリルアミドゲル(FT
C BioProducts, RockLand, ME)中で電気泳動にかけた。
【０１１６】 配列情報を得るために自動化96ウエルフォーマットを用いた。70%のコロニー からデータが得られた。検討の結果、btkの第1エキソン由来の配列は、その後に
btkスプライス部位が続いていることが同定された。このスプライス部位の後に は、それぞれ別個の遺伝子トラップ事象に由来するユニークな配列が続いていた
。これらの配列は、長さの平均が500 bpで、高品質であり、しばしば長いオープ
ンリーディングフレームを含んでいた。さらに、blast検索を用いて、これらの 配列の80%をGenBankデータベースに見いだされる配列とマッチさせることができ
た。これは転写されたエキソン配列が同定されたことを示す。これらの遺伝子ト
ラップ配列タグは、従来の遺伝子トラップ設計によってもたらされたものよりも
長さおよび質が非常に良い。これらの新しいタグは長さおよび質の両方において
改善されており、そして80%のタグがGenBankの配列とマッチするという事実は、
それらが効率的に遺伝子をトラップすることを示唆している。
【０１１７】 これらのデータは、スプライシング機構は下流エキソンにスプライシングする
場合にプロモーターに隣接する、または比較的近くに位置するエキソン型配列を
より良く認識できることを示している。また、これらのデータはG418耐性コロニ
ーの大半が遺伝子トラップ配列タグを用いて同定可能であることを示している。
PGKpuroSD 3’遺伝子トラップカセットをpuro選択と共に組み込んだベクターに よってトラップされた約7,000個の異なる遺伝子を表わすDNA配列データがすでに
得られた。そのようなベクターは典型的にpuroコロニーの13倍のG418耐性コロニ
ーをもたらすことがすでに確立されていることを考えると、本発明の3’遺伝子 トラップカセットを組み込んだベクターは非常に大きい標的サイズ、恐らく遺伝
子70,000個を上回るサイズをもつ。この標的は、抗体選択の感受性を増大させる
ため、SAβgeo融合よりむしろSAneopAを用いることによってさらに拡大すること ができる。そして、任意の他の選択マーカーまたは他の方法で同定可能なマーカ
ーをneoの代わりに5’遺伝子トラップカセットに用いることもできるであろう。
IRESneoの使用は、G418耐性コロニーの数をpuro耐性コロニーの数の15倍以上に 増大させ、その増強された感受性を実証した。他の可能性のある5’トラッピン グマーカーとしては、限定するものではないが、抗生物質耐性遺伝子(例えば、 β-ラクタマーゼ）、比色定量マーカー遺伝子、リコンビナーゼ活性をコードす る遺伝子（例えば、flpまたはcreなど）、酵素、緑色蛍光タンパク質をコードす
る遺伝子など蛍光マーカー遺伝子（例えば、細胞性蛍光を直接または間接に媒介
する活性をコードする遺伝子）、およびこれらを検出するアッセイが含まれる。
これらは参照により本明細書に組み入れる、特に米国特許第5,625,048号に記述 されている。
【０１１８】 典型的には、選択マーカーがより感受性になるほど、トラップされうる標的遺
伝子の数が多くなる。G418耐性コロニーの3’エキソンから遺伝子トラップ配列 タグを得るためにbkt第１エキソンを用いる能力は、従来のベクターを用いて突 然変異させ迅速に配列決定することが可能であった細胞数よりも約13倍多い突然
変異させた細胞をもたらした。そしてその結果、遺伝子トラップ技術における重 大な改善となっている。
【０１１９】 上記の結果を前提とするならば、これまでに報告されたいずれの3‘遺伝子トラ
ップカセットと比較しても1桁の改良をもたらした驚くべき予期せぬ特性は、わ れわれの確立された遺伝子トラップのための選択マーカー規範から逸脱すること
によってのみ実現されたことが明白である。
【０１２０】6.3.薬理ゲノム学 上に論じたように、本発明のベクターおよび構築物の標的サイズを増大させる
さらなる方法は、選択を全て不要とし、そして別の（すなわち、分子遺伝学的）
手段を用いてトラップしたエキソンを単離することである。そのようなアプロー
チを用いることは、遺伝子配列情報の迅速な生成および分析を可能とする。配列
獲得の速度に関して明白な利点を提供するのに加えて、遺伝子トラップされたラ イブラリーの配列決定は実質的なコスト節約を可能とする。なぜなら、従来のcD
NAライブラリーと比較して、反復配列の比率が低下しているからである。本明細
書に記述する配列獲得系に固有の経済学は、個体のゲノムまたは個体ゲノムの集
合の広域調査を迅速に得て、疾患と関連している可能性がある（調査した固体の
一部が共通の疾患特性または症状を表わす場合）、中でも遺伝子多型、特にSNPお
よび cSNPを同定することを実践的にする。さらに、ヒトおよび非ヒト動物にお いて行動特性、薬物感受性、薬物過敏性、薬物アレルギー、などの遺伝的基礎を
同定する広域ゲノムアッセイに類似の方法を採用することができる。
【０１２１】 そのような方法においては、上述の3‘遺伝子トラップカセットを含む高濃度 から飽和濃度までの構築物を確立された方法を用いて適切な標的細胞（一次ヒト
または非ヒト細胞を含む）（例えば、白血球およびリンパ球などの核をもつ一次
血液細胞）に導入することができる。3’配列獲得カセットが標的細胞ゲノムに 組み込まれた後、標的細胞からRNAを単離し、cDNAが作製され(そして場合により
上記のようにPCR増幅を行い)、そしてcDNAライブラリーが構築される。次にこの
ライブラリーを配列決定し、そしてカタログ化し、対照ライブラリーならびに他 の「実験」ライブラリーと比較する。SNPとしては、cSNPまたは「実験」もしく は「疾患」グループと相関する他のより著しい多型が同定される。多遺伝子座分
析 を提供し、ならびに特定疾患と相関するゲノム領域を強調する、または他の
方法でさらなる研究および分析を保証する、遺伝子多型のカタログが開発される
であろう。そのような情報もまた、薬物有効性(または有害な薬物反応）と関連 する遺伝子多型の同定ならびに診断アッセイの設計にとって貴重であることが判
明しうる。
【０１２２】7.0.微生物寄託への言及 下記のプラスミドは、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペス
ト条約により米国ヴァージニア州マナサス所在のアメリカンタイプカルチャーコ
レクション(ATCC)に寄託され、維持されており、そしてブダペスト条約の規定に
したがって利用可能とされる。このようなプラスミドの利用可能性は、任意の政
府の権力下にその特許法にしたがって与えられる権利に反して本発明を実施する
ための許諾と解釈されてはならない。
【０１２３】 寄託されたプラスミドは、下記のATCC寄託番号を割り当てられた： プラスミド ATCC番号 pbtK 209712 本明細書に述べた全ての刊行物および特許は、参照によりここに組み入れる。
本発明の範囲から逸脱しない、記述された発明の種々の改変および変法が当業者
には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態と結びつけて説明してき
たが、請求された発明がそれらの特定の実施例に不当に限定されてはならないこ
とが理解されなければならない。実際、動物遺伝学および分子生物学またはそれ
らの関連分野における当業者には自明である、上記の発明を実施するための形態
の種々の改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０１２４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の3’遺伝子トラップカセットが、標的細胞ゲノム中に組み込まれた後 にどのようにスプライシングされて細胞性エキソンに連結されるかを模式的に示
す。
【図２】 5’トラップ内の選択マーカーおよび本発明の3’遺伝子トラップを組み込んだ
二元的な（5’および3’）遺伝子トラップベクターを示す。図２はまた、
例えば3’遺伝子トラップカセットのプロモーターの5’側および3’遺伝子トラ ップカセットのSDの3’側に位置させることができる、リコンビナーゼ認識（例 えば、frt またはlox）部位の位置を示す。図示した特徴物(features)は、両側 に位置するLTRに対して逆方向を向いている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ６０／０８１，７２７ (32)優先日 平成10年４月14日(1998．4．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 フレドリッチ，グレン，エー． アメリカ合衆国 77381 テキサス州，ザ ウッドランズ，リフレクション ポイン ト 30 (72)発明者 サンヅ，アーサー，ティー． アメリカ合衆国 77382 テキサス州，ザ ウッドランズ，ブリストル ベンド サ ークル 163 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 DA02 DA06 EA02 FA02 FA10 GA11 GA12 GA14 HA20 4B065 AA01X AA26X AA57X AA72X AA90X AA97X AB01 AC10 BA02 BA03 BA04 CA60

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下のａ）及びｂ）： ａ）機能しうる組み合わせで以下１）〜３）を含む5’遺伝子トラップカセット ： １）スプライスアクセプター； ２）該スプライスアクセプターの3’側に位置する第１エキソン配列であって 、該第１エキソンは該エキソンを発現する細胞の同定を可能とするマーカーをコ
    ードする；および ３）該第１エキソンの3’末端を定めるポリアデニル化配列； ｂ）該ポリアデニル化配列の3’側に位置し、そして機能しうる組み合わせで以 下１）〜３）を含む3’遺伝子トラップカセット： １）プロモーター； ２）該プロモーターの3’側に位置し、該プロモーターによって発現される第 ２エキソン配列であって、該第２エキソンは抗生物質耐性を付与する活性をコー
    ドしない； ３）該エキソンの3’末端領域を定めるスプライスドナー配列； を含んでなる遺伝子操作されたベクターであって、該ベクターは該第１エキソン
    の発現を媒介するプロモーターをコードせず、かつ該ベクターは該第２エキソン
    配列によってコードされ該プロモーターによって発現されるmRNA転写産物のポリ
    アデニル化を媒介する配列をコードしない、該ベクター。
  2. 【請求項２】 上記第１エキソンが上記スプライスアクセプターと該第１エ
    キソンの開始コドンとの間に機能的に配置された内部リボソームエントリー部位
    をさらにコードする、請求項１に記載のベクター。
  3. 【請求項３】 上記第２エキソンおよびスプライスドナー配列が天然に存在
    する真核生物遺伝子に由来する、請求項1に記載のベクター。
  4. 【請求項４】 上記スプライスアクセプター部位の上流に機能的に配置され
    たリコンビナーゼ認識配列をさらに組み込んでいる、請求項1に記載のベクター 。
  5. 【請求項５】 上記ポリアデニル化配列と上記プロモーターとの間の領域に
    第２のリコンビナーゼ認識配列をさらに組み込んでいる、請求項４に記載のベク
    ター。
  6. 【請求項６】 上記第１エキソンが、抗生物質耐性を付与するマーカー、抗
    生物質感受性を付与するマーカー、酵素マーカー、リコンビナーゼおよび蛍光的
    に検出可能なマーカーよりなる群より選択されるマーカーをコードする、請求項
    1に記載のベクター。
  7. 【請求項７】 上記マーカーがネオマイシン耐性をコードする、請求項６に
    記載のベクター。
  8. 【請求項８】 以下のａ）及びｂ）： ａ）ベクターによってコードされる第1プロモーターによって発現されるマーカ ー遺伝子；および ｂ）機能しうる組み合わせで以下１）〜３）を含む3’遺伝子トラップカセット ： １）ベクターによってコードされる第２プロモーター； ２）該第２プロモーターの3’側に位置し、該プロモーターによって発現され るエキソン配列であって、該エキソンは抗生物質耐性を付与する活性をコードし
    ない； ３）該エキソンの3’末端領域を定めるスプライスドナー配列； を含んでなる遺伝子操作されたレトロウイルスベクターであって、該ベクターは
    該エキソン配列によってコードされるmRNA転写産物のポリアデニル化を媒介する
    配列をコードしない、該ベクター。
  9. 【請求項９】 以下のａ）及びｂ）： ａ）機能しうる組み合わせで以下１）〜３）を含む5’遺伝子トラップカセット ： １）スプライスアクセプター； ２）該スプライスアクセプターの3’側に位置する第１エキソン配列であって 、該第１エキソンは該エキソンを発現する細胞の同定を可能とするマーカーをコ
    ードする；および ３）該第１エキソンの3’末端を定めるポリアデニル化配列； ｂ）該ポリアデニル化配列の3’側に位置し、そして機能しうる組み合わせで以 下１）〜３）を含む3’遺伝子トラップカセット： １）プロモーター； ２）該プロモーターの3’側に位置し、該プロモーターによって発現される第 ２エキソン配列であって、該第２エキソンは非原核生物起源である； ３）該エキソンの3’末端領域を定めるスプライスドナー配列； を含んでなる遺伝子操作されたベクターであって、該ベクターは該第１エキソン
    の発現を媒介するプロモーターをコードせず、かつ該ベクターは該第２エキソン
    配列によってコードされ該プロモーターによって発現されるmRNA転写産物のポリ
    アデニル化を媒介する配列をコードしない、該ベクター。
  10. 【請求項１０】 請求項１、８または９のいずれか１項に記載のベクターを
    含む感染性レトロウイルス。
  11. 【請求項１１】 標的真核細胞中の遺伝子をトラップする方法であって、請
    求項１０に記載のレトロウイルスを該細胞に導入することを含む、該方法。
  12. 【請求項１２】 標的真核細胞中の遺伝子をトラップする方法であって、請
    求項１、８または９のいずれか１項に記載のベクターを該細胞に導入することを
    含み、該ベクターはエレクトロポレーション、ウイルス感染、レトロ転位(retro
    transposition)、マイクロインジェクションおよびトランスフェクションからな
    る群より選択される方法によって該標的細胞に導入される、該方法。
  13. 【請求項１３】 ゲノム中に組み込まれた請求項１、８または９のいずれか
    １項に記載のベクターを有する真核細胞。
  14. 【請求項１４】 請求項１、８または９のいずれか１項に記載のベクターを
    自身の１以上の細胞のゲノム中に組み込むように遺伝子的に改変された非ヒト動
    物。
  15. 【請求項１５】 細胞中の天然に存在する遺伝子の発現を活性化する方法で
    あって、請求項１、８または９のいずれか１項に記載のベクターを該細胞に導入
    することを含む、該方法。
  16. 【請求項１６】 上記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１５に記載の方法
    。
  17. 【請求項１７】 上記哺乳動物細胞がヒト細胞およびマウス細胞からなる群
    より選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 真核細胞中の細胞的にコードされた遺伝子の発現を変更す
    る方法であって、3’遺伝子トラップカセットを該細胞に導入することを含み、 該3’遺伝子トラップカセットは機能しうる組み合わせで以下１）〜３）を含み ： １）プロモーター； ２）該プロモーターの3’側に位置し、該プロモーターによって発現されるエ キソン配列であって、該エキソンは抗生物質耐性を付与する活性をコードしない
    ； ３）該エキソンの3’末端領域を定めるスプライスドナー配列； 該カセットは非相同的に標的真核細胞のゲノム中に組み込まれ、そして該エキソ
    ンによってコードされる転写産物の該スプライスドナー配列は該細胞的にコード
    される遺伝子のスプライスアクセプター配列にスプライシングにより連結される
    、該方法。
  19. 【請求項１９】 上記非相同的に組み込まれるカセットが、上記標的真核細
    胞のゲノムに非特異的に組み込まれたレトロウイルスベクターの一部である、請
    求項1８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 上記エキソンが、標的細胞ゲノムによってコードされてい
    ないエキソンおよび標的細胞ゲノムによって通常は発現されないエキソンからな
    る群より選択される、請求項1９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 新規な真核生物ポリヌクレオチド配列情報を得る方法であ
    って、 ａ）機能しうる組み合わせで以下１）〜３）を含む3’遺伝子トラップカセット を真核細胞に導入し； １）プロモーター； ２）該プロモーターの3’側に位置し、該プロモーターによって発現されるエ キソン配列であって、該エキソンは抗生物質耐性を付与する活性をコードしない
    ； ３）該エキソンの3’末端領域を定めるスプライスドナー配列； ｂ）該遺伝子トラップカセットの細胞ゲノムへの非特異的な又は標的設定されて
    いない組み込みを可能とする条件下で該細胞を維持し； ｃ）該3’遺伝子トラップカセット由来の該エキソンの、該真核細胞ゲノムによ ってコードされる第２エキソンへのスプライシングによる連結から生じるキメラ
    転写産物を獲得し；そして ｄ）該キメラ転写産物のポリヌクレオチド配列を決定する； ことを含む、該方法。
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