JP2003018996A - 物質のホルモン作用の試験方法 - Google Patents

物質のホルモン作用の試験方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】ある物質のホルモン作用を、低コストで簡易、
迅速、高感度の信頼し得る様式で試験すること。 【解決手段】物質のホルモン作用（特にアンドロゲンま
たは抗アンドロゲン作用）の試験方法は、ａ）二つのベ
クター（一方のベクターは核内受容体タンパク質または
そのフラグメントをコードするＤＮＡを含み、他方のベ
クターはコモジュレーターまたはそのフラグメントをコ
ードするＤＮＡを含む）で形質移入した細胞を物質に暴
露する工程と、ｂ）前記核内受容体またはそのフラグメ
ントが前記コモジュレーターまたはそのフラグメントの
存在下で誘発する転写活性か、前記核内受容体またはそ
のフラグメントと前記コモジュレーターまたはそのフラ
グメント間の相互作用に及ぼす該物質の影響か、の少な
くともいずれか一方を、タンパク質−タンパク質相互作
用またはタンパク質−タンパク質−ＤＮＡ相互作用によ
り測定する工程と、から成る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、物質のホルモン作
用の試験方法、核内受容体の共同調節機序（Co-Modulat
ionsmechanismus ）障害の測定方法、特にヒトアンドロ
ゲン受容体および他の核内受容体のコアクチベーターＡ
ＲＡＰ１１とそれをコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】医薬への適用について物質を評価する場
合、通常、これらの物質の起こり得るホルモン作用、特
に、存在するアンドロゲンまたは抗アンドロゲン活性を
試験する。薬理効果のある物質を投与するとき、これら
の物質のホルモン作用、特に、アンドロゲンまたは抗ア
ンドロゲン作用の知識が重要である場合が少なくない。
何故なら、これらの物質が患者で不都合な副作用を誘発
し得るからである。物質のホルモン作用の試験には、特
に、ホルモン受容体と結合し、その転写活性を活性化す
る物質の能力を測定する方法が用いられる。
【０００３】しかし、物質のホルモン作用に関する知識
は、薬剤の場合だけでなく、非医薬物質の場合でも重要
である。何故なら、環境に存在する多くの物質の一部の
集団で、アンドロゲンまたは抗アンドロゲンないしはエ
ストロゲンまたは抗エストロゲン活性を示し得ると考え
られるからである。場合によっては、それによって、不
都合な有害作用が誘発される。
【０００４】従って、コストが安く、簡易、迅速、高感
度の信頼し得る様式で物質のホルモン作用を適切に表現
し得る方法とその方法を実行するのに適した薬剤が非常
に必要とされる。これまで公知の方法は、これを十分満
たしていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、コストが安
く、簡易、迅速、高感度の信頼し得る様式で試験すべき
物質のホルモン作用を適切に表現し得る方法とそれに適
した薬剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するた
めに、請求項１に記載の発明は、ある物質のホルモン作
用、特に、アンドロゲンまたは抗アンドロゲン作用の試
験方法であって、ａ）二つのベクター（一方のベクター
は、核内受容体タンパク質またはそのフラグメントをコ
ードするＤＮＡを含み、他方のベクターは、コモジュレ
ーターまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡを含
む）で形質移入した細胞を物質に暴露する工程と、ｂ）
核内受容体またはそのフラグメントがコモジュレーター
またはそのフラグメントの存在下で誘発する転写活性
か、前記核内受容体またはそのフラグメントと前記コモ
ジュレーターまたはそのフラグメント間の相互作用に及
ぼす該物質の影響か、の少なくともいずれか一方を、タ
ンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−タン
パク質−ＤＮＡ相互作用により測定する工程とから成る
方法を要旨とする。
【０００７】請求項２に記載の発明は、請求項１に記載
の方法において、コモジュレーターが配列番号２のアミ
ノ酸配列を含むＡＲＡＰ１１であることを要旨とする。
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の方法におい
て、コモジュレーターのフラグメントがＡＲＡＰ１１の
アミノ酸８１３〜１３９０を有することを要旨とする。
【０００８】請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３
のいずれか一項に記載の方法において、核内受容体がア
ンドロゲン受容体、エストロゲン受容体α、エストロゲ
ン受容体β、プロゲステロン受容体Ａ、プロゲステロン
受容体Ｂ、糖質コルチコイド受容体、鉱質コルチコイド
受容体、甲状腺ホルモン受容体、ビタミンＤ受容体、ペ
ルオキシソーム増殖因子活性化受容体、レチン酸受容
体、レチノイドＸ受容体およびオーファン受容体から選
択されることを要旨とする。
【０００９】請求項５に記載の発明は、請求項１乃至４
のいずれか一項に記載の方法において、細胞が株化細胞
か真核細胞の少なくともいずれかであることを要旨とす
る。
【００１０】請求項６に記載の発明は、請求項５に記載
の方法において、真核細胞が、前立腺細胞、神経細胞、
グリア細胞、繊維芽細胞、血球、骨芽細胞、破骨細胞、
肝細胞、上皮細胞または筋細胞から選択されることを要
旨とする。
【００１１】請求項７に記載の発明は、請求項１乃至６
のいずれか一項に記載の方法において、ベクターが真核
性発現ベクターであることを要旨とする。請求項８に記
載の発明は、ＡＲＡＰ１１またはそのフラグメントか、
アンドロゲン受容体またはそのフラグメントかの少なく
ともいずれか一方の濃度を測定することを要旨とする。
【００１２】請求項９に記載の発明は、請求項８に記載
の方法において、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ試験、
免疫染色、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、ノーザ
ンブロット、ＤＮＡチップまたはタンパク質チップによ
り、濃度を測定することを要旨とする。
【００１３】請求項１０に記載の発明は、請求項２に記
載のアミノ酸配列を含む、アンドロゲン受容体に対して
コモジュレーター特性を有することを要旨とする。請求
項１１に記載の発明は、請求項１０に記載のタンパク質
において、前記フラグメントがアミノ酸８１３〜１３９
０を有することを要旨とする。
【００１４】請求項１２に記載の発明は、請求項１０ま
たは１１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡまたは
それとハイブリダイズするＤＮＡをその要旨とする。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明によれば、ある物質のホル
モン作用、特に、アンドロゲンまたは抗アンドロゲン作
用の試験方法が提供される。本方法では、 ａ）二つのベクター（一方のベクターは核内受容体タン
パク質またはそのフラグメント（特にヒト核内受容体タ
ンパク質またはそのフラグメント）をコードするＤＮＡ
を含み、他方のベクターはコモジュレーターまたはその
フラグメントをコードするＤＮＡを含む）で形質移入し
た細胞を物質に暴露する工程と、 ｂ）前記核内受容体またはそのフラグメントが前記コモ
ジュレーターまたはそのフラグメントの存在下で誘発す
る転写活性か、前記核内受容体またはそのフラグメント
と前記コモジュレーターまたはそのフラグメント間の相
互作用に及ぼす該物質の影響か、の少なくともいずれか
一方を、タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパ
ク質−タンパク質−ＤＮＡ相互作用により測定する工程
と、から成る。
【００１６】本発明の方法では、ベクターで形質転換し
た細胞を用いる。該ベクターは、核内受容体タンパク質
またはそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む。５
０を超える種々のタンパク質が属する核内受容体（Ｎ
Ｒ）のスーパーファミリーは、特異的リガンド、例え
ば、ホルモンに対する反応としてそれぞれの目的遺伝子
の転写を制御する類似転写因子の一群である。そのファ
ミリーは、例えば、二量体化状態、リガンドの種類また
はＤＮＡ反応要素の構造など、特定の特徴に従って、幾
つかのサブファミリーに分類し得る（Ｂｅａｔｏら，２
０００，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔ．Ｕｐｄａｔ
ｅ，６，２２５−２３６）。
【００１７】ＮＲの特徴的指標は、自律性構造的活性化
機能（ＡＦ−１）を有する可変性が大きく保存性の低い
Ｎ末端領域と、特異的なＤＮＡ反応要素認識のための、
二つのジンクフィンガーモチーフからなる保存性の高い
ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、ヒンジドメインと、
二量体化−およびリガンド−依存性トランス活性化機能
（ＡＦ−２）を有する保存性の高い多機能性Ｃ末端リガ
ンド結合ドメイン（ＬＢＤ）と、機能性ドメイン（記号
Ａ〜Ｆ）の構造の一致である。この次ぎに、最も離れた
Ｃ末端につながる領域が続く。その機能は未知で、例え
ば、ＰＲ（プロゲステロン受容体）、ＰＰＡＲ（ペルオ
キシソーム増殖因子活性化受容体）およびＲＸＲ（レチ
ノイドＸ受容体）などの受容体では、その領域が欠失し
ている（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ ＆ Ｅｖａｎｓ，１
９９５；Ｃｅｌｌ，８３，８４１−８５０；Ｒｏｂｙｒ
ら，２０００，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１
４，３２９−３４７）。若干のＮＲ（例えば、アンドロ
ゲン受容体（ＡＲ））について、Ｎ末端領域が、Ｃ末端
領域と相互に作用し得ることが検出された（Ｂｒｉｎｋ
ｍａｎｎら１９９９，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６９，３０７−３
１３）。例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲ
ステロン受容体（ＰＲ）、糖質コルチコイド受容体（Ｇ
Ｒ）、鉱質コルチコイド受容体（ＭＲ）およびアンドロ
ゲン受容体（ＡＲ）などのステロイドホルモン受容体
は、プロゲスチン、エストロゲン、糖質コルチコイドお
よび鉱質コルチコイド、ならびにアンドロゲンなどのプ
レグネノロンに由来するステロイド性リガンドと結合す
る。リガンドとの結合により、受容体が活性化され、該
当の目的遺伝子の発現を制御する。
【００１８】上記で説明したように、本発明の方法の工
程ａ）では、コモジュレーターまたはそのフラグメント
をコードするＤＮＡを有するベクターを含有する細胞が
用いられる。
【００１９】コモジュレーターは、遺伝子転写の活性化
（コアクチベーター）ないしは抑制（コリプレッサー）
時に、転写開始複合体とＮＲ間の架橋分子として働くク
ラスのタンパク質である（ＭｃＫｅｎｎａら，１９９
９，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，２０，３２１−３４
７）。コアクチベーターは、受容体機能を増強し、作動
剤の存在下でＮＲの活性化ドメインと直接相互に作用で
きなければならない。コアクチベーターは、基準の転写
機構とも相互作用するにちがいないが、最終的に、基準
の転写活性自体を増強してはいけない。大部分のコモジ
ュレーターは、一つ以上のＬＸＸＬＬモチーフ（ＮＲ−
Ｂｏｘ）を用いてＮＲのＡＦ−２ドメインと相互作用す
るが、他のＮＲ領域と相互作用する若干のコモジュレー
ターもまた記載されている（Ｄｉｎｇら，１９９８，Ｍ
ｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１２，３０２−３１
３）。さらに、類似の方法で幾つかの様々なＮＲと相互
に作用する多くのコモジュレーターが既に同定されてい
るので、好都合なことに、それぞれのコモジュレーター
の特異性の程度を試験できるようになるだろう。
【００２０】本発明の方法の１つの好ましい実施態様で
は、ＡＲＡＰ１１と表記したコモジュレーターまたはア
ミノ酸８１３〜１３９０を含むＡＲＡＰ１１のフラグメ
ントを使用する。コモジュレーターＡＲＡＰ１１の１３
９０個のアミノ酸を有するｃＤＮＡ配列またはアミノ酸
配列が、配列番号１または配列番号２で示される。これ
らのタンパク質を使用すると、特に、低コストで、簡
易、迅速、高感度の信頼し得る様式で、本発明の方法を
実行し得る。さらに、ＡＲＡＰ１１フラグメント、特
に、ＡＲＡＰ１１のアミノ酸８１３〜１３９０を有する
フラグメントは、簡単に取り扱え、クローニングし得る
が、なおＡＲＡＰ１１の機能的特性を示すという利点を
有する。
【００２１】ＡＲＡＰ１１は、ヒトアンドロゲン受容体
や、アンドロゲンとその受容体間の相互作用を増強する
他の核内受容体に対するコアクチベーターである。ＡＲ
ＡＰ１１の配列の一部分は、すでにＧｅｎｂａｎｋ Ｘ
Ｍ ００５２５３においてＰｒｏ２０００として記載さ
れている。ただし、そこには機能はなにも報告されてい
ない。今では、すでにＧｅｎｂａｎｋから既知の配列と
比較して、ＡＲＡＰ１１のアミノ酸配列が公知配列より
も大きく、つまり、Ｎ末端領域にさらに別のアミノ酸を
有することが確認された。さらに、核内受容体間（特
に、一方がＡＲで他方がＡＲＡＰ１１）の相互作用なら
びにＡＲ介在性トランス活性化の増強を確認し得た。Ａ
ＲＡＰ１１は、核内受容体にステロイドが結合した後、
転写作用を増強または抑制し、さらに、以前はホルモン
作用がないとみなされた分子と核内受容体の結合および
活性化を促進することによってコメディエーターとして
機能するタンパク質である。
【００２２】タンパク質ＡＲＡＰ１１は、アンドロゲン
受容体および、エストロゲン受容体α、エストロゲン受
容体β、プロゲステロン受容体Ａ、プロゲステロン受容
体Ｂ、糖質コルチコイド受容体、鉱質コルチコイド受容
体、甲状腺ホルモン受容体、ビタミンＤ受容体、ペルオ
キシソーム増殖因子活性化受容体、レチン酸受容体、レ
チノイドＸ受容体およびオーファン受容体など、さらに
別の核内受容体のコアクチベーターである。従って、本
発明の方法では、これらの受容体を用いるのが好まし
い。何故なら、それによって、本発明の方法の利点が特
に好都合に達成され得るからである。
【００２３】本発明の方法において、上記タンパク質の
フラグメントをコードするベクターもまた使用し得る。
上記タンパク質に関連した用語「フラグメント」とは、
全長が上記タンパク質よりも短い１または複数のアミノ
酸を含み、核内受容体またはコモジュレーターの機能的
特性を示すものを指すと理解する。
【００２４】すでに上記で説明したように、本発明の方
法の工程ａ）では、特定タンパク質をコードするＤＮＡ
を含む二つのベクターで形質移入した細胞を用いる。従
って、これらの細胞は、これら両方の異なるタンパク質
を発現し得る。
【００２５】特に、細胞は、株化細胞および／または真
核細胞、特に、前立腺細胞、神経細胞、グリア細胞、繊
維芽細胞、血球、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、上皮細
胞または筋細胞である。株化細胞を用いると、本発明の
方法を特に低コストかつ迅速に実行し得る。真核細胞、
特に、上記の真核細胞を用いると、本発明の方法を用い
て都合よく特に証拠性の高い結果を獲得し得る。
【００２６】本発明の方法の一好適実施態様では、真核
性発現ベクター、例えば、ｐＣＭＸまたはｐＳＧ５を用
いる。このベクターを、特に、上記の株化細胞および／
または真核細胞に用いる場合、本発明の方法を、特に、
好都合に、迅速に実行でき、特に証拠性の高い結果が得
られる。
【００２７】当業者には、上記のタンパク質をコードす
るＤＮＡをベクター内に挿入し、これを細胞に導入し、
得られた細胞を、これらのタンパク質を発現し得るよう
な適当な条件下で培養するための方法とそれに必要な物
質が公知である。
【００２８】本発明の方法の工程ｂ）によれば、核内受
容体またはそのフラグメントがコモジュレーターまたは
そのフラグメントの存在下で誘発する転写活性を測定す
ることができる。これは、例えば、レポーター遺伝子を
検出することにより行い得る。
【００２９】レポーター遺伝子は、この配列の活性を検
出可能にするため、他の遺伝子または調節配列と連結さ
れる遺伝子または遺伝子フラグメントである。レポータ
ー遺伝子は、例えば、呈色反応により光度測定法で、で
きるだけ簡単に検出できる遺伝子生成物を産生する。よ
く用いられるレポーター遺伝子は、β−ガラクトシダー
ゼに対する遺伝子、アルカリ性ホスファターゼに対する
遺伝子、クロラムフェニコール−アセチルトランスフェ
ラーゼに対する遺伝子、カテコール−ジオキシゲナーゼ
に対する遺伝子、「緑色蛍光タンパク質」の遺伝子なら
びに細胞を発光させ得る種々のルシフェラーゼに対する
遺伝子である。
【００３０】そのようなレポーター遺伝子も、同様に、
ベクター、特に真核性発現ベクターを用いて細胞内に導
入し得る。レポーター遺伝子をコードするＤＮＡを含む
ベクター例は、ベクターＭＭＴＶルシフェラーゼで、物
質のアンドロゲン作用の測定に用いられる。
【００３１】ホルモン作用、特に、アンドロゲン／抗ア
ンドロゲン作用を有する物質は、レポーター遺伝子活性
の上昇ないしは低下によって識別することができる。工
程ｂ）における、受容体またはそのフラグメントと、コ
モジュレーターまたはそのフラグメントとの間の相互作
用に及ぼす試験物質の影響の測定は、同様に、例えば、
二重ハイブリッド系、免疫沈降、ＧＳＴプルダウンアッ
セイ、ＦＲＥＴ分析およびＡＢＣＤアッセイによるタン
パク質−タンパク質相互作用の測定ならびにゲル保持ア
ッセイによるタンパク質−タンパク質−ＤＮＡ相互作用
の測定により行い得る。
【００３２】さらに、ＡＲＡＰ１１は、高齢になると一
部発症するアンドロゲン誘発性疾患の指標として非常に
良好に使用し得ることが認められた。例えば、前立腺
癌、勃起能力機能障害、不妊、脱毛症、アクネまたは性
機能低下などの関連アンドロゲン誘発性疾患ならびに、
例えば、睾丸性女性化症などのアンドロゲン耐性症候群
は、ＡＲとＡＲＡＰ１１間の共同調節機序の欠損に基づ
くものである。従って、そのような障害患者でのＡＲお
よびＡＲＡＰ１１の相対濃度の測定は、一つの方法であ
る。この測定は、好都合なことに、体液、体細胞または
体組織を用いて体外で行われる。これは、それぞれの患
者で両分子の相対量を測定する定量的方法を用いること
により可能になる。その方法では、例えば、ＡＲおよび
ＡＲＡＰ１１に対する抗体またはそれらのｍＲＮＡに対
する核酸プローブを使用し得る。この比較比を測定する
のに幾つかの方法があり、これらの方法は、当業者にと
って公知である。同様に、当業者には、これに適した物
質および、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ試験、免疫染
色、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、ノーザンブロ
ット、ＤＮＡチップまたはタンパク質チップなどの装置
も周知である。さらに、通常の方法でＡＲＡＰ１１−ｃ
ＤＮＡを用いて、ＰＣＲアッセイのプローブを構築し得
る。このアッセイを用いて、特定の患者で正常なＤＮＡ
配列の変異を検出し、またはノーザンブロットアッセイ
の転写物ないしはｉｎ ｓｉｔｕハイブリッダイゼーシ
ョンアッセイのＤＮＡを生成させ得る。
【００３３】その際、ＡＲ対ＡＲＡＰ１１の測定比は、
健常者の場合よりも大きくまたは小さくなり得る。健常
者での正常値は、例えば、多数の健常被験者でＡＲ対Ａ
ＲＡＰ１１の比を算出することによって簡単に測定し得
る。正常値を検査すべき患者のＡＲ対ＡＲＡＰ１１の算
出比と比較することにより、算出比の値が正常値よりも
大きいか、小さいかを確認し得る。
【００３４】ＡＲＡＰ１１および／またはＡＲの濃度
は、例えば、ＡＲＡＰ１１濃度は睾丸中で非常に高く、
それに反して肝臓、心臓、胸腺および前立腺で低くな
り、組織によって異なり得るので、評価には、様々な組
織の濃度を考慮しなければならない。すなわち、試験値
および正常値は、同じ組織に由来すべきである。
【００３５】ＡＲとＡＲＡＰ１１間の共同調節機序の欠
損は、ＡＲＡＰ１１濃度だけを測定する別の方法で測定
し得る。その方法では、ＡＲ濃度が少なくとも、ほぼ一
定であることに由来する。この場合、正常値より低いＡ
ＲＡＰ１１濃度が測定されたら、ＡＲ対ＡＲＡＰ１１比
が変動したことを意味し、これは同様に、指標として共
同調節機序障害を示す。
【００３６】従って、ＡＲＡＰ１１に特異的なプローブ
を用いてＡＲＡＰ１１発現変化を測定し、それを用いて
ＡＲに対する比を測定し得る。そのような変化は、種々
の病像に因果関係的に付随するか、または続発症として
発生し得る。
【００３７】このようなＡＲ／ＡＲＡＰ１１比ないしは
ＡＲＡＰ１１の測定は、例えば、アンドロゲン抵抗性症
候群が目的細胞中のＡＲ−とＡＲＡＰ１１優勢間の平衡
障害により得るというＡＲＡＰ１１の同定および特性決
定に基づく驚くべき知見に拠る。ＡＲＡＰ１１が高すぎ
ると、ＡＲ系の過敏症が起こり、通常はアンドロゲン作
用を持たない分子と反応し得るようになる。逆に、あら
ゆるレベルでＡＲＡＰ１１が欠失するかまたは機能不全
であると、アンドロゲン抵抗性が生じる。高すぎるＡＲ
ＡＰ１１が検出された患者では、臨床条件下でそれぞれ
の患者のＡＲＡＰ１１力価を低下させるため、例えば、
アンチセンス−または類似の薬剤など、ダウンレギュレ
ーションする薬剤の適用が支持されるだろう。同じこと
をＡＲとＡＲＡＰ１１間の相互作用を阻止できる分子に
よっても達成し得る。患者のＡＲＡＰ１１が低すぎれ
ば、このように、活性ＡＲＡＰ１１の力価を高めるた
め、それ自体公知の種々の機序を介してＡＲＡＰ１１
ｃＤＮＡ、ＡＲＡＰ１１ タンパク質またはＡＲＡＰ１
１ ＤＮＡを患者に供給し得る。低分子医薬品により、
または特異的なＡＲＡＰ１１プロモータータンパク質を
用いる自己合成刺激により、ＡＲＡＰ１１の濃度または
活性を上昇させることも可能である。
【００３８】本発明の方法に関する上記の説明から明ら
かなように、タンパク質ＡＲＡＰ１１は本方法を実行す
るのに最も適している。従って、本発明の対象は、さら
に、配列番号２のアミノ酸配列を有するＡＲＡＰ１１ま
たはこのタンパク質のアミノ酸８１３〜１３９０を有す
るＡＲＡＰ１１フラグメントである。
【００３９】本願のさらなる対象は、ＡＲＡＰ１１また
はそのフラグメント（特にアミノ酸８１３〜１３９０を
有するフラグメント）をコードするＤＮＡならびにそれ
とハイブリダイズするＤＮＡである。用語「ハイブリダ
イズするＤＮＡ」は、通常の条件下、特に、ＤＮＡの融
点下、２０℃でコーディングＤＮＡとハイブリダイズす
るＤＮＡを示す。
【００４０】以下の実施例は、本発明を詳しく説明する
ものであるが、それに限定されない。 実施例１：ＡＲＡＰ１１によるアンドロゲン受容体シグ
ナルの同時活性化 ヒト胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ）およびプローブ（図１）
としてアミノ酸３２５〜９１９をコードするヒトＡＲフ
ラグメントを使用して、通常の２ハイブリッド酵母系を
用いてアンドロゲンの存在下でスクリーニングを行っ
た。製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の使用説明書通りに
スクリーニングしたクローン数は６×１０7であった。
独立したクローン数は、製造業者の記述によれば、３．
５×１０6であった。その中から３５０陽性クローンを
選択し、βガラクトシダーゼアッセイを用いて試験し
た。そのアッセイでは、ｌａｃＺ陽性クローンとして２
４０クローンが確認された。これらのクローンの挿入体
をＰＣＲにより増幅した。制限フラグメント分析および
配列決定を用いて、少なくとも１７の種々のクローンを
同定した。その内の一つは、１１６９ｂｐの包括的イン
サート（３２４３ｂｐ〜４４１２ｂｐ）を有するクロー
ンであった。このインサートは、ＯＲＦ（オープンリー
ディングフレーム）の１部をコードする。この配列は、
すでにＰｒｏ２０００（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｘ
Ｍ００５２５３）に記載したＯＲＦのほぼ完全な部分も
含む。
【００４１】通常のＰＣＲ方法を用いて、次ぎに、コー
ディングＡＲＡＰ１１−ｃＤＮＡを完全長でクローンニ
ングした。コーディングＡＲＡＰ１１−ｃＤＮＡは、１
３９０アミノ酸から構成されるタンパク質（配列番号
２）をコードし、３６２アミノ酸のタンパク質を表す、
これまでに知られていたＰｒｏ２０００配列を著しく超
える。５’と３’の非翻訳領域を合わせて、ここに記載
の配列は、４４１２ｂｐの長さを有する（配列番号
１）。
【００４２】図２は、ノーザンブロット分析を用いるそ
れ自体公知の方法で算出したＡＲＡＰ１１の組織分布を
示す。種々のヒト組織から単離したポリＡ＋ＲＮＡ（２
μｇ）をホルムアルデヒド含有アガロースゲルを用いて
分離し、ナイロン膜上にブロットした後、標識ＡＲＡＰ
１１−ｃＤＮＡフラグメントとハイブリダイズさせた。
図２ａと２ｂに記載の実験には、ＡＲＡＰ１１のｃＤＮ
Ａ配列の３１１１〜４２１７ｂｐのフラグメントを用
い、図２ｃに記載の実験には、２０６５〜２４７６ｂｐ
のフラグメントを用いた。洗浄後、膜をフィルム上に置
き、２４時間（図２ａと２ｃ）または８日間（図２ｂ）
露光後、現像した。図２から読み取れるように、ＡＲＡ
Ｐ１１の発現は睾丸中で非常に強く、それに対して肝
臓、心臓、胸腺および前立腺では弱くしか検出されなか
った。その際、二つの転写物（６．０ｋｂと５．２ｋ
ｂ）が認められた。
【００４３】ＡＲＡＰ１１のｃＤＮＡ配列の２０６５〜
２４７６ｂｐの４１１ｂｐからなるフラグメントのプロ
ーブを用いても、睾丸中に二つの同じ大きさの転写物が
検出されたため、検出された転写物は、図２ａと２ｂで
３１１１〜４２１７のプローブで検出された転写物と同
一であると考えられ得る。これは、ＧｅｎｂａｎｋにＸ
Ｍ００５２５３で寄託されたＰｒｏ２０００の配列が不
完全であり、５’領域が２４８０ｂｐだけ長いことを証
明するものである。
【００４４】ＰＣＲを用いて得られた、アミノ酸８１３
〜１３９０のＡＲＡＰ１１フラグメントをコードするＡ
ＲＡＰ１１−ｃＤＮＡを通常の方法でベクターＣＭＸに
入れてクローニングし、ｐＳＧ５−ＡＲおよびＭＭＴＶ
ルシフェラーゼを用いて同様に通常の方法でＳＨ−ＳＹ
５Ｙ細胞内に形質移入した。
【００４５】図３から読み取れるように、ＳＨ−ＳＹ５
Ｙ細胞でのＡＲＡＰ１１−ｃＤＮＡの一過性形質移入
は、特に１０-10〜１０-12Ｍの低アンドロゲン濃度でＡ
Ｒシグナル作用の強い同時活性化をもたらした。そのた
め、ウェルを設けた細胞培養シャーレのウェル当り３×
１０5細胞を１μｇコアクチベーター（ＡＲＡＰ１１−
３もしくはＡＲＡＰ１１−１、それぞれＡＲＡＰ１１の
アミノ酸８１３〜１３９０をコードする）のＣＭＸ、な
いしは対照プラスミドとして１μｇのＣＭＸ、１．５μ
ｇのＭＭＴＶルシフェラーゼプラスミドおよび０．７５
μｇのｐＳＧ５ＡＲプラスミドで形質移入し、２４時間
後、アンドロゲンとして上記濃度のジヒドロキシテスト
ステロン（ＤＨＴ）で処理した。さらに２４時間後に形
質移入細胞を収穫し、レポーター遺伝子のルシフェラー
ゼ活性を測定した。さらに、標準化のため、総細胞タン
パク質量を測定した。形質移入沈積物および物質濃度ご
とに、実験一回とそれぞれ４回の測定を行った。偏差は
ＳＤとして記載した。全シグナルで、ＤＨＴなしの該当
対照値を差し引いた。活性は、相対単位で記載してあ
る。
【００４６】実施例２：ラット睾丸中のＡＲＡＰ１１の
測定 図４は、ラット睾丸中のＡＲＡＰ１１とβ−アクチンの
発現を示す。ラット睾丸組織からポリＡ＋ＲＮＡ（４μ
ｇ）を単離し、ホルムアルデヒド含有アガロースゲルで
分離し、ナイロン膜上に移し、標識化ＡＲＡＰ１１−ｃ
ＤＮＡフラグメント（２２２６〜４２２８ｂｐ）か標識
化β−アクチンｃＤＮＡ（ラット）のいずれかとハイブ
リダイズさせた。洗浄後、膜をフィルム上に置き、５日
間露光後、現像した。ラットの睾丸組織中にＲＮＡ転写
物（６．０ｋｂ）が認められた。レーン１に３週齢ラッ
トの単離ＲＮＡ、レーン２に６週齢ラットの単離ＲＮＡ
およびレーン３に２年齢ラットの単離ＲＮＡをアプライ
した。ＡＲＡＰ１１遺伝子発現の明らかな年齢に起因す
る依存性が認められる。このとき、β−アクチン遺伝子
の発現は変化を示さない。出生後６週間でＡＲＡＰ１１
の発現が明らかに低下し（５０％超）、老齢ラット（２
年）ではさらに極僅かのＡＲＡＰ１１遺伝子の発現しか
確認できない。コモジュレーターＡＲＡＰ１１の遺伝子
発現変化の類似した挙動が、病像で予期し得る。
【００４７】
【発明の効果】本発明によれば、低コストで簡易、迅
速、高感度の信頼し得る様式で、環境関連的または薬理
学的に重要な物質がホルモン作用を誘発するかどうかを
試験することができる。
【００４８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JENAPHARM GmbH & Co. KG <120> A Method for Testing Hormonal Effects of a Susbstance <130> PF3174 <140> <141> <150>DE 101 21 710.2 <151>2001-5-4 <150>DE 101 61 325.3 <151>2001-12-13 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 4412 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (45)..(4214) <400> 1 gatctctctc cggtcgcgca cgccgaggcc agtagggaga gaag atg gtg gtt ctc 56 Met Val Val Leu 1 cgc agc agc ttg gag ctg cac aac cac tcc gcg gcc tcg gcc acg ggc 104 Arg Ser Ser Leu Glu Leu His Asn His Ser Ala Ala Ser Ala Thr Gly 5 10 15 20 tcc ttg gac ctg tcc agt gac ttc ctc agt ctg gag cac atc ggc cgg 152 Ser Leu Asp Leu Ser Ser Asp Phe Leu Ser Leu Glu His Ile Gly Arg 25 30 35 agg cgg ctc cgc tcg gcc ggc gcg gcg cag aag aaa ccc gcg gcg acc 200 Arg Arg Leu Arg Ser Ala Gly Ala Ala Gln Lys Lys Pro Ala Ala Thr 40 45 50 aca gcc aaa gcg ggc gat ggg tca tca gtt aag gaa gtt gaa acc tac 248 Thr Ala Lys Ala Gly Asp Gly Ser Ser Val Lys Glu Val Glu Thr Tyr 55 60 65 cac cgg aca cgt gct tta aga tct ttg aga aaa gat gca cag aat tct 296 His Arg Thr Arg Ala Leu Arg Ser Leu Arg Lys Asp Ala Gln Asn Ser 70 75 80 tca gat tct agt ttt gag aag aat gtg gaa ata acg gag caa ctt gct 344 Ser Asp Ser Ser Phe Glu Lys Asn Val Glu Ile Thr Glu Gln Leu Ala 85 90 95 100 aat ggc agg cat ttt aca agg cag ttg gcc aga cag cag gct gat aaa 392 Asn Gly Arg His Phe Thr Arg Gln Leu Ala Arg Gln Gln Ala Asp Lys 105 110 115 aaa aaa gaa gag cac aga gaa gac aaa gtg att cca gtt act cgg tca 440 Lys Lys Glu Glu His Arg Glu Asp Lys Val Ile Pro Val Thr Arg Ser 120 125 130 ttg agg gct aga aac atc gtt caa agt aca gaa cac tta cat gaa gat 488 Leu Arg Ala Arg Asn Ile Val Gln Ser Thr Glu His Leu His Glu Asp 135 140 145 aat ggt gat gtt gaa gtg cgt cga agt tgt agg att aga agt cgt tat 536 Asn Gly Asp Val Glu Val Arg Arg Ser Cys Arg Ile Arg Ser Arg Tyr 150 155 160 agt ggt gta aac cag tcc atg ctg ttt gac aaa ctt ata act aac act 584 Ser Gly Val Asn Gln Ser Met Leu Phe Asp Lys Leu Ile Thr Asn Thr 165 170 175 180 gct gaa gct gta ctt caa aaa atg gat gac atg aag aag atg cgt aga 632 Ala Glu Ala Val Leu Gln Lys Met Asp Asp Met Lys Lys Met Arg Arg 185 190 195 cag cga atg aga gaa ctt gaa gac ttg gga gtg ttt aat gaa aca gaa 680 Gln Arg Met Arg Glu Leu Glu Asp Leu Gly Val Phe Asn Glu Thr Glu 200 205 210 gaa agc aat ctt aat atg tac aca aga gga aaa cag aaa gat att caa 728 Glu Ser Asn Leu Asn Met Tyr Thr Arg Gly Lys Gln Lys Asp Ile Gln 215 220 225 aga act gat gaa gaa aca act gat aat caa gaa ggc agt gtg gag tca 776 Arg Thr Asp Glu Glu Thr Thr Asp Asn Gln Glu Gly Ser Val Glu Ser 230 235 240 tct gaa gag ggt gaa gac caa gaa cat gaa gat gat ggt gaa gat gaa 824 Ser Glu Glu Gly Glu Asp Gln Glu His Glu Asp Asp Gly Glu Asp Glu 245 250 255 260 gat gat gaa gat gat gat gat gat gac gat gat gat gat gat gat gat 872 Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 265 270 275 gat gaa gat gat gaa gat gaa gaa gat gga gaa gaa gag aat cag aag 920 Asp Glu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Asp Gly Glu Glu Glu Asn Gln Lys 280 285 290 cga tat tat ctt aga cag aga aaa gct act gtt tac tat cag gct cca 968 Arg Tyr Tyr Leu Arg Gln Arg Lys Ala Thr Val Tyr Tyr Gln Ala Pro 295 300 305 ttg gaa aaa cct cgt cac cag aga aag ccc aac ata ttt tat agt ggc 1016 Leu Glu Lys Pro Arg His Gln Arg Lys Pro Asn Ile Phe Tyr Ser Gly 310 315 320 cca gct tct cct gca aga cca aga tac cga tta tct tcc gca gga cca 1064 Pro Ala Ser Pro Ala Arg Pro Arg Tyr Arg Leu Ser Ser Ala Gly Pro 325 330 335 340 aga agt cct tac tgt aaa cga atg aac agg cga agg cat gca atc cac 1112 Arg Ser Pro Tyr Cys Lys Arg Met Asn Arg Arg Arg His Ala Ile His 345 350 355 agt agt gac tcg act tca tct tcc tcc tct gaa gat gaa cag cac ttt 1160 Ser Ser Asp Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Glu Gln His Phe 360 365 370 gag agg cgg agg aaa agg agt cgt aat agg gct atc aat agg tgc ctc 1208 Glu Arg Arg Arg Lys Arg Ser Arg Asn Arg Ala Ile Asn Arg Cys Leu 375 380 385 cca cta aat ttt cgg aaa gat gaa tta aaa ggc att tat aaa gat cga 1256 Pro Leu Asn Phe Arg Lys Asp Glu Leu Lys Gly Ile Tyr Lys Asp Arg 390 395 400 atg aaa att gga gca agc ctt gcc gat gtt gat cca atg caa cta gat 1304 Met Lys Ile Gly Ala Ser Leu Ala Asp Val Asp Pro Met Gln Leu Asp 405 410 415 420 tct tca gta cga ttt gat agt gtt ggt ggc ctg tct aat cat ata gca 1352 Ser Ser Val Arg Phe Asp Ser Val Gly Gly Leu Ser Asn His Ile Ala 425 430 435 gct cta aaa gag atg gtg gtg ttt cca tta ctt tat cca gaa gtc ttt 1400 Ala Leu Lys Glu Met Val Val Phe Pro Leu Leu Tyr Pro Glu Val Phe 440 445 450 gaa aaa ttt aaa att caa ccc cca aga ggt tgt ttg ttt tat ggg cca 1448 Glu Lys Phe Lys Ile Gln Pro Pro Arg Gly Cys Leu Phe Tyr Gly Pro 455 460 465 cct gga act gga aag act ctg gtt gcc aga gca ctt gcc aat gag tgc 1496 Pro Gly Thr Gly Lys Thr Leu Val Ala Arg Ala Leu Ala Asn Glu Cys 470 475 480 agt caa ggg gat aaa aga gta gca ttt ttc atg agg aaa ggt gct gat 1544 Ser Gln Gly Asp Lys Arg Val Ala Phe Phe Met Arg Lys Gly Ala Asp 485 490 495 500 tgt cta agt aaa tgg gta gga gaa tct gaa aga cag cta cga ttg ctg 1592 Cys Leu Ser Lys Trp Val Gly Glu Ser Glu Arg Gln Leu Arg Leu Leu 505 510 515 ttt gat cag gcc tat cag atg cgc cca tca att att ttt ttt gac gaa 1640 Phe Asp Gln Ala Tyr Gln Met Arg Pro Ser Ile Ile Phe Phe Asp Glu 520 525 530 att gat ggt ctg gct cca gta cgg tca agc agg caa gat cag att cac 1688 Ile Asp Gly Leu Ala Pro Val Arg Ser Ser Arg Gln Asp Gln Ile His 535 540 545 agt tct att gtt tcc acc ctg cta gct ctt atg gat gga ttg gac agc 1736 Ser Ser Ile Val Ser Thr Leu Leu Ala Leu Met Asp Gly Leu Asp Ser 550 555 560 aga ggg gaa att gtg gtc att ggt gct acg aac agg cta gat tct ata 1784 Arg Gly Glu Ile Val Val Ile Gly Ala Thr Asn Arg Leu Asp Ser Ile 565 570 575 580 gat cct gct tta cga agg cct ggt cgc ttt gat aga gaa ttc ctc ttt 1832 Asp Pro Ala Leu Arg Arg Pro Gly Arg Phe Asp Arg Glu Phe Leu Phe 585 590 595 agc ctg cct gat aaa gag gct cga aaa gag att cta aag att cac acc 1880 Ser Leu Pro Asp Lys Glu Ala Arg Lys Glu Ile Leu Lys Ile His Thr 600 605 610 agg gat tgg aat ccc aaa cca ctg gac aca ttt tta gaa gag cta gca 1928 Arg Asp Trp Asn Pro Lys Pro Leu Asp Thr Phe Leu Glu Glu Leu Ala 615 620 625 gaa aac tgt gtt gga tac tgt gga gca gat att aaa tca ata tgt gct 1976 Glu Asn Cys Val Gly Tyr Cys Gly Ala Asp Ile Lys Ser Ile Cys Ala 630 635 640 gaa gct gct tta tgt gct tta cga cga cgc tac cca cag atc tat acc 2024 Glu Ala Ala Leu Cys Ala Leu Arg Arg Arg Tyr Pro Gln Ile Tyr Thr 645 650 655 660 act agt gag aaa ctg cag ttg gat ctc tct tca att aat atc tca gct 2072 Thr Ser Glu Lys Leu Gln Leu Asp Leu Ser Ser Ile Asn Ile Ser Ala 665 670 675 aag gat ttc gag gta gct atg caa aag atg ata cca gcc tcc caa aga 2120 Lys Asp Phe Glu Val Ala Met Gln Lys Met Ile Pro Ala Ser Gln Arg 680 685 690 gct gtg aca tca cct ggg cag gca ctg tcc acc gtt gtg aaa cca ctc 2168 Ala Val Thr Ser Pro Gly Gln Ala Leu Ser Thr Val Val Lys Pro Leu 695 700 705 ctg caa aac act gtt gac aag att tta gaa gcc ctg cag aga gta ttt 2216 Leu Gln Asn Thr Val Asp Lys Ile Leu Glu Ala Leu Gln Arg Val Phe 710 715 720 cca cat gca gaa ttc aga aca aat aaa aca tta gac tca gat att tct 2264 Pro His Ala Glu Phe Arg Thr Asn Lys Thr Leu Asp Ser Asp Ile Ser 725 730 735 740 tg t cct ctg cta gaa agt gac ttg gct tac agt gat gat gat gtt cca 2312 Cys Pro Leu Leu Glu Ser Asp Leu Ala Tyr Ser Asp Asp Asp Val Pro 745 750 755 tca gtt tat gaa aat gga ctt tct cag aaa tct tct cat aag gca aaa 2360 Ser Val Tyr Glu Asn Gly Leu Ser Gln Lys Ser Ser His Lys Ala Lys 760 765 770 gac aat ttt aat ttt ctt cat ttg aat aga aat gct tgt tac caa cct 2408 Asp Asn Phe Asn Phe Leu His Leu Asn Arg Asn Ala Cys Tyr Gln Pro 775 780 785 atg tct ttt cga cca aga ata ttg ata gta gga gaa cca gga ttt ggg 2456 Met Ser Phe Arg Pro Arg Ile Leu Ile Val Gly Glu Pro Gly Phe Gly 790 795 800 caa ggt tct cac ttg gca cca gct gtc att cat gct ttg gaa aag ttt 2504 Gln Gly Ser His Leu Ala Pro Ala Val Ile His Ala Leu Glu Lys Phe 805 810 815 820 act gta tat aca tta gac att cct gtt ctt ttt gga gtt agt act aca 2552 Thr Val Tyr Thr Leu Asp Ile Pro Val Leu Phe Gly Val Ser Thr Thr 825 830 835 tcc cct gaa gaa aca tgt gcc cag gtg att cgt gaa gct aag aga aca 2600 Ser Pro Glu Glu Thr Cys Ala Gln Val Ile Arg Glu Ala Lys Arg Thr 840 845 850 gca cca agt ata gtg tat gtt cct cat atc cac gtg tgg tgg gaa ata 2648 Ala Pro Ser Ile Val Tyr Val Pro His Ile His Val Trp Trp Glu Ile 855 860 865 gtt gga ccg aca ctt aaa gcc aca ttt acc aca tta tta cag aat att 2696 Val Gly Pro Thr Leu Lys Ala Thr Phe Thr Thr Leu Leu Gln Asn Ile 870 875 880 cct tca ttt gct cca gtt tta cta ctt gca act tct gac aaa ccc cat 2744 Pro Ser Phe Ala Pro Val Leu Leu Leu Ala Thr Ser Asp Lys Pro His 885 890 895 900 tcc gct ttg cca gaa gag gtg caa gaa ttg ttt atc cgt gat tat gga 2792 Ser Ala Leu Pro Glu Glu Val Gln Glu Leu Phe Ile Arg Asp Tyr Gly 905 910 915 gag att ttt aat gtc cag tta ccg gat aaa gaa gaa cgg aca aaa ttt 2840 Glu Ile Phe Asn Val Gln Leu Pro Asp Lys Glu Glu Arg Thr Lys Phe 920 925 930 ttt gaa gat tta att cta aaa caa gct gct aag cct cct ata tca aaa 2888 Phe Glu Asp Leu Ile Leu Lys Gln Ala Ala Lys Pro Pro Ile Ser Lys 935 940 945 aag aaa gca gtt ttg cag gct ttg gag gta ctc cca gta gca cca cca 2936 Lys Lys Ala Val Leu Gln Ala Leu Glu Val Leu Pro Val Ala Pro Pro 950 955 960 cct gag cca aga tca ctg aca gca gaa gaa gtg aaa cga cta gaa gaa 2984 Pro Glu Pro Arg Ser Leu Thr Ala Glu Glu Val Lys Arg Leu Glu Glu 965 970 975 980 caa gaa gaa gat aca ttt aga gaa ctg agg att ttc tta aga aat gtt 3032 Gln Glu Glu Asp Thr Phe Arg Glu Leu Arg Ile Phe Leu Arg Asn Val 985 990 995 aca cat agg ctt gct att gac aag cga ttc cga gtg ttt act aag cct 3080 Thr His Arg Leu Ala Ile Asp Lys Arg Phe Arg Val Phe Thr Lys Pro 1000 1005 1010 gtt gac cct gat gag gtt cct gat tat gtc act gta ata aag caa cca 3128 Val Asp Pro Asp Glu Val Pro Asp Tyr Val Thr Val Ile Lys Gln Pro 1015 1020 1025 atg gac ctt tca tct gta atc agt aaa att gat cta cac aag tat ctg 3176 Met Asp Leu Ser Ser Val Ile Ser Lys Ile Asp Leu His Lys Tyr Leu 1030 1035 1040 act gtg aaa gac tat ttg aga gat att gat cta atc tgt agt aat gcc 3224 Thr Val Lys Asp Tyr Leu Arg Asp Ile Asp Leu Ile Cys Ser Asn Ala 1045 1050 1055 1060 tta gaa tac aat cca gat aga gat cct gga gat cgt ctt att agg cat 3272 Leu Glu Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Pro Gly Asp Arg Leu Ile Arg His 1065 1070 1075 aga gcc tgt gct tta aga gat act gcc tat gcc ata att aaa gaa gaa 3320 Arg Ala Cys Ala Leu Arg Asp Thr Ala Tyr Ala Ile Ile Lys Glu Glu 1080 1085 1090 ctt gat gaa gac ttt gag cag ctc tgt gaa gaa att cag gaa tct aga 3368 Leu Asp Glu Asp Phe Glu Gln Leu Cys Glu Glu Ile Gln Glu Ser Arg 1095 1100 1105 aag aaa aga ggt tgt agc tcc tcc aaa tat gcc ccg tct tac tac cat 3416 Lys Lys Arg Gly Cys Ser Ser Ser Lys Tyr Ala Pro Ser Tyr Tyr His 1110 1115 1120 gtg atg cca aag caa aat tcc act ctt gtt ggt gat aaa aga tca gac 3464 Val Met Pro Lys Gln Asn Ser Thr Leu Val Gly Asp Lys Arg Ser Asp 1125 1130 1135 1140 cca gag cag aat gaa aag cta aag aca ccg agt act cct gtg gct tgc 3512 Pro Glu Gln Asn Glu Lys Leu Lys Thr Pro Ser Thr Pro Val Ala Cys 1145 1150 1155 agc act cct gct cag ttg aag agg aaa att cgc aaa aag tca aac tgg 3560 Ser Thr Pro Ala Gln Leu Lys Arg Lys Ile Arg Lys Lys Ser Asn Trp 1160 1165 1170 tac tta ggc acc ata aaa aag cga agg aag att tca cag gca aag gat 3608 Tyr Leu Gly Thr Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ile Ser Gln Ala Lys Asp 1175 1180 1185 gat agc cag aat gcc ata gat cac aaa att gag agt gat aca gag gaa 3656 Asp Ser Gln Asn Ala Ile Asp His Lys Ile Glu Ser Asp Thr Glu Glu 1190 1195 1200 act caa gac aca agt gta gat cat aat gag acc gga aac aca gga gag 3704 Thr Gln Asp Thr Ser Val Asp His Asn Glu Thr Gly Asn Thr Gly Glu 1205 1210 1215 1220 tct tcg gtg gaa gaa aat gaa aaa cag caa aat gcc tct gaa agc aaa 3752 Ser Ser Val Glu Glu Asn Glu Lys Gln Gln Asn Ala Ser Glu Ser Lys 1225 1230 1235 ctg gaa ttg aga aat aat tca aat act tgt aat ata gag aat gag ctt 3800 Leu Glu Leu Arg Asn Asn Ser Asn Thr Cys Asn Ile Glu Asn Glu Leu 1240 1245 1250 gaa gac tct agg aag act aca gca tgt aca gaa ttg aga gac aag att 3848 Glu Asp Ser Arg Lys Thr Thr Ala Cys Thr Glu Leu Arg Asp Lys Ile 1255 1260 1265 gct tgt aat gga gat gct tct agc tct cag ata ata cat att tct gat 3896 Ala Cys Asn Gly Asp Ala Ser Ser Ser Gln Ile Ile His Ile Ser Asp 1270 1275 1280 gaa aat gaa gga aaa gaa atg tgt gtt ctg cga atg act cga gct aga 3944 Glu Asn Glu Gly Lys Glu Met Cys Val Leu Arg Met Thr Arg Ala Arg 1285 1290 1295 1300 cgt tcc cag gta gaa cag cag cag ctc atc act gtt gaa aag gct ttg 3992 Arg Ser Gln Val Glu Gln Gln Gln Leu Ile Thr Val Glu Lys Ala Leu 1305 1310 1315 gca att ctt tct cag cct aca ccc tca ctt gtt gtg gat cat gag cga 4040 Ala Ile Leu Ser Gln Pro Thr Pro Ser Leu Val Val Asp His Glu Arg 1320 1325 1330 tta aaa aat ctt ttg aag act gtt gtt aaa aaa agt caa aac tac aac 4088 Leu Lys Asn Leu Leu Lys Thr Val Val Lys Lys Ser Gln Asn Tyr Asn 1335 1340 1345 ata ttt cag ttg gaa aat ttg tat gca gta atc agc caa tgt att tat 4136 Ile Phe Gln Leu Glu Asn Leu Tyr Ala Val Ile Ser Gln Cys Ile Tyr 1350 1355 1360 cgg cat cgc aag gac cat gat aaa aca tca ctt att cag aaa atg gag 4184 Arg His Arg Lys Asp His Asp Lys Thr Ser Leu Ile Gln Lys Met Glu 1365 1370 1375 1380 caa gag gta gaa aac ttc agt tgt tcc aga tgatgatgtc atggtatcga 4234 Gln Glu Val Glu Asn Phe Ser Cys Ser Arg 1385 1390 gtattcttta tattcagttc ctatttaagt catttttgtc atgtccgcct aattgatgta 4294 gtatgaaacc ctgcatcttt aaggaaaaga ttaaaatagt aaaataaaag tatttaaact 4354 ttcctgatat ttatgtacat attaagataa atgtcatgtg taagataact gataaata 4412 <210> 2 <211> 1390 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Val Leu Arg Ser Ser Leu Glu Leu His Asn His Ser Ala Ala 1 5 10 15 Ser Ala Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ser Asp Phe Leu Ser Leu Glu 20 25 30 His Ile Gly Arg Arg Arg Leu Arg Ser Ala Gly Ala Ala Gln Lys Lys 35 40 45 Pro Ala Ala Thr Thr Ala Lys Ala Gly Asp Gly Ser Ser Val Lys Glu 50 55 60 Val Glu Thr Tyr His Arg Thr Arg Ala Leu Arg Ser Leu Arg Lys Asp 65 70 75 80 Ala Gln Asn Ser Ser Asp Ser Ser Phe Glu Lys Asn Val Glu Ile Thr 85 90 95 Glu Gln Leu Ala Asn Gly Arg His Phe Thr Arg Gln Leu Ala Arg Gln 100 105 110 Gln Ala Asp Lys Lys Lys Glu Glu His Arg Glu Asp Lys Val Ile Pro 115 120 125 Val Thr Arg Ser Leu Arg Ala Arg Asn Ile Val Gln Ser Thr Glu His 130 135 140 Leu His Glu Asp Asn Gly Asp Val Glu Val Arg Arg Ser Cys Arg Ile 145 150 155 160 Arg Ser Arg Tyr Ser Gly Val Asn Gln Ser Met Leu Phe Asp Lys Leu 165 170 175 Ile Thr Asn Thr Ala Glu Ala Val Leu Gln Lys Met Asp Asp Met Lys 180 185 190 Lys Met Arg Arg Gln Arg Met Arg Glu Leu Glu Asp Leu Gly Val Phe 195 200 205 Asn Glu Thr Glu Glu Ser Asn Leu Asn Met Tyr Thr Arg Gly Lys Gln 210 215 220 Lys Asp Ile Gln Arg Thr Asp Glu Glu Thr Thr Asp Asn Gln Glu Gly 225 230 235 240 Ser Val Glu Ser Ser Glu Glu Gly Glu Asp Gln Glu His Glu Asp Asp 245 250 255 Gly Glu Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 260 265 270 Asp Asp Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Asp Gly Glu Glu 275 280 285 Glu Asn Gln Lys Arg Tyr Tyr Leu Arg Gln Arg Lys Ala Thr Val Tyr 290 295 300 Tyr Gln Ala Pro Leu Glu Lys Pro Arg His Gln Arg Lys Pro Asn Ile 305 310 315 320 Phe Tyr Ser Gly Pro Ala Ser Pro Ala Arg Pro Arg Tyr Arg Leu Ser 325 330 335 Ser Ala Gly Pro Arg Ser Pro Tyr Cys Lys Arg Met Asn Arg Arg Arg 340 345 350 His Ala Ile His Ser Ser Asp Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp 355 360 365 Glu Gln His Phe Glu Arg Arg Arg Lys Arg Ser Arg Asn Arg Ala Ile 370 375 380 Asn Arg Cys Leu Pro Leu Asn Phe Arg Lys Asp Glu Leu Lys Gly Ile 385 390 395 400 Tyr Lys Asp Arg Met Lys Ile Gly Ala Ser Leu Ala Asp Val Asp Pro 405 410 415 Met Gln Leu Asp Ser Ser Val Arg Phe Asp Ser Val Gly Gly Leu Ser 420 425 430 Asn His Ile Ala Ala Leu Lys Glu Met Val Val Phe Pro Leu Leu Tyr 435 440 445 Pro Glu Val Phe Glu Lys Phe Lys Ile Gln Pro Pro Arg Gly Cys Leu 450 455 460 Phe Tyr Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Leu Val Ala Arg Ala Leu 465 470 475 480 Ala Asn Glu Cys Ser Gln Gly Asp Lys Arg Val Ala Phe Phe Met Arg 485 490 495 Lys Gly Ala Asp Cys Leu Ser Lys Trp Val Gly Glu Ser Glu Arg Gln 500 505 510 Leu Arg Leu Leu Phe Asp Gln Ala Tyr Gln Met Arg Pro Ser Ile Ile 515 520 525 Phe Phe Asp Glu Ile Asp Gly Leu Ala Pro Val Arg Ser Ser Arg Gln 530 535 540 Asp Gln Ile His Ser Ser Ile Val Ser Thr Leu Leu Ala Leu Met Asp 545 550 555 560 Gly Leu Asp Ser Arg Gly Glu Ile Val Val Ile Gly Ala Thr Asn Arg 565 570 575 Leu Asp Ser Ile Asp Pro Ala Leu Arg Arg Pro Gly Arg Phe Asp Arg 580 585 590 Glu Phe Leu Phe Ser Leu Pro Asp Lys Glu Ala Arg Lys Glu Ile Leu 595 600 605 Lys Ile His Thr Arg Asp Trp Asn Pro Lys Pro Leu Asp Thr Phe Leu 610 615 620 Glu Glu Leu Ala Glu Asn Cys Val Gly Tyr Cys Gly Ala Asp Ile Lys 625 630 635 640 Ser Ile Cys Ala Glu Ala Ala Leu Cys Ala Leu Arg Arg Arg Tyr Pro 645 650 655 Gln Ile Tyr Thr Thr Ser Glu Lys Leu Gln Leu Asp Leu Ser Ser Ile 660 665 670 Asn Ile Ser Ala Lys Asp Phe Glu Val Ala Met Gln Lys Met Ile Pro 675 680 685 Ala Ser Gln Arg Ala Val Thr Ser Pro Gly Gln Ala Leu Ser Thr Val 690 695 700 Val Lys Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val Asp Lys Ile Leu Glu Ala Leu 705 710 715 720 Gln Arg Val Phe Pro His Ala Glu Phe Arg Thr Asn Lys Thr Leu Asp 725 730 735 Ser Asp Ile Ser Cys Pro Leu Leu Glu Ser Asp Leu Ala Tyr Ser Asp 740 745 750 Asp Asp Val Pro Ser Val Tyr Glu Asn Gly Leu Ser Gln Lys Ser Ser 755 760 765 His Lys Ala Lys Asp Asn Phe Asn Phe Leu His Leu Asn Arg Asn Ala 770 775 780 Cys Tyr Gln Pro Met Ser Phe Arg Pro Arg Ile Leu Ile Val Gly Glu 785 790 795 800 Pro Gly Phe Gly Gln Gly Ser His Leu Ala Pro Ala Val Ile His Ala 805 810 815 Leu Glu Lys Phe Thr Val Tyr Thr Leu Asp Ile Pro Val Leu Phe Gly 820 825 830 Val Ser Thr Thr Ser Pro Glu Glu Thr Cys Ala Gln Val Ile Arg Glu 835 840 845 Ala Lys Arg Thr Ala Pro Ser Ile Val Tyr Val Pro His Ile His Val 850 855 860 Trp Trp Glu Ile Val Gly Pro Thr Leu Lys Ala Thr Phe Thr Thr Leu 865 870 875 880 Leu Gln Asn Ile Pro Ser Phe Ala Pro Val Leu Leu Leu Ala Thr Ser 885 890 895 Asp Lys Pro His Ser Ala Leu Pro Glu Glu Val Gln Glu Leu Phe Ile 900 905 910 Arg Asp Tyr Gly Glu Ile Phe Asn Val Gln Leu Pro Asp Lys Glu Glu 915 920 925 Arg Thr Lys Phe Phe Glu Asp Leu Ile Leu Lys Gln Ala Ala Lys Pro 930 935 940 Pro Ile Ser Lys Lys Lys Ala Val Leu Gln Ala Leu Glu Val Leu Pro 945 950 955 960 Val Ala Pro Pro Pro Glu Pro Arg Ser Leu Thr Ala Glu Glu Val Lys 965 970 975 Arg Leu Glu Glu Gln Glu Glu Asp Thr Phe Arg Glu Leu Arg Ile Phe 980 985 990 Leu Arg Asn Val Thr His Arg Leu Ala Ile Asp Lys Arg Phe Arg Val 995 1000 1005 Phe Thr Lys Pro Val Asp Pro Asp Glu Val Pro Asp Tyr Val Thr Val 1010 1015 1020 Ile Lys Gln Pro Met Asp Leu Ser Ser Val Ile Ser Lys Ile Asp Leu 1025 1030 1035 1040 His Lys Tyr Leu Thr Val Lys Asp Tyr Leu Arg Asp Ile Asp Leu Ile 1045 1050 1055 Cys Ser Asn Ala Leu Glu Tyr Asn Pro Asp Arg Asp Pro Gly Asp Arg 1060 1065 1070 Leu Ile Arg His Arg Ala Cys Ala Leu Arg Asp Thr Ala Tyr Ala Ile 1075 1080 1085 Ile Lys Glu Glu Leu Asp Glu Asp Phe Glu Gln Leu Cys Glu Glu Ile 1090 1095 1100 Gln Glu Ser Arg Lys Lys Arg Gly Cys Ser Ser Ser Lys Tyr Ala Pro 1105 1110 1115 1120 Ser Tyr Tyr His Val Met Pro Lys Gln Asn Ser Thr Leu Val Gly Asp 1125 1130 1135 Lys Arg Ser Asp Pro Glu Gln Asn Glu Lys Leu Lys Thr Pro Ser Thr 1140 1145 1150 Pro Val Ala Cys Ser Thr Pro Ala Gln Leu Lys Arg Lys Ile Arg Lys 1155 1160 1165 Lys Ser Asn Trp Tyr Leu Gly Thr Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ile Ser 1170 1175 1180 Gln Ala Lys Asp Asp Ser Gln Asn Ala Ile Asp His Lys Ile Glu Ser 1185 1190 1195 1200 Asp Thr Glu Glu Thr Gln Asp Thr Ser Val Asp His Asn Glu Thr Gly 1205 1210 1215 Asn Thr Gly Glu Ser Ser Val Glu Glu Asn Glu Lys Gln Gln Asn Ala 1220 1225 1230 Ser Glu Ser Lys Leu Glu Leu Arg Asn Asn Ser Asn Thr Cys Asn Ile 1235 1240 1245 Glu Asn Glu Leu Glu Asp Ser Arg Lys Thr Thr Ala Cys Thr Glu Leu 1250 1255 1260 Arg Asp Lys Ile Ala Cys Asn Gly Asp Ala Ser Ser Ser Gln Ile Ile 1265 1270 1275 1280 His Ile Ser Asp Glu Asn Glu Gly Lys Glu Met Cys Val Leu Arg Met 1285 1290 1295 Thr Arg Ala Arg Arg Ser Gln Val Glu Gln Gln Gln Leu Ile Thr Val 1300 1305 1310 Glu Lys Ala Leu Ala Ile Leu Ser Gln Pro Thr Pro Ser Leu Val Val 1315 1320 1325 Asp His Glu Arg Leu Lys Asn Leu Leu Lys Thr Val Val Lys Lys Ser 1330 1335 1340 Gln Asn Tyr Asn Ile Phe Gln Leu Glu Asn Leu Tyr Ala Val Ile Ser 1345 1350 1355 1360 Gln Cys Ile Tyr Arg His Arg Lys Asp His Asp Lys Thr Ser Leu Ile 1365 1370 1375 Gln Lys Met Glu Gln Glu Val Glu Asn Phe Ser Cys Ser Arg 1380 1385 1390
【図面の簡単な説明】
【図１】 アンドロゲンの存在下でＡＲＡＰ１１と相互
作用可能な、アミノ酸３２５〜９１９にわたるアンドロ
ゲン受容体ドメイン（ＡＲ２）を符号で図示したアンド
ロゲン受容体である。
【図２】 ＡＲＡＰ１１の組織分布を示す。
【図３】 ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞でのアンドロゲン受容体
シグナルの同時活性化を示す。
【図４】 ラット睾丸中のＡＲＡＰ１１およびβ−アク
チンの発現を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 マイク オーベンドルフ ドイツ連邦共和国 Ｄ−99423 ワイマー ル パウル−シュナイダー−シュトラーセ 14 (72)発明者 ジークムント ヴォルフ ドイツ連邦共和国 Ｄ−07745 イェナ グレーテ−ウンライン−シュトラーセ ３ (72)発明者 イェンス シュレーダー ドイツ連邦共和国 Ｄ−07743 イェナ ヤーンシュトラーセ 19 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA31 CA04 DA03 EA04 GA11 HA14 4B063 QA18 QQ08 QQ43 QR33 QR55 QS34 4H045 AA10 BA10 CA40 DA86 EA54 FA74

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ある物質のホルモン作用、特に、アンド
    ロゲンまたは抗アンドロゲン作用の試験方法であって、 ａ）二つのベクター（一方のベクターは、核内受容体タ
    ンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡを
    含み、他方のベクターは、コモジュレーターまたはその
    フラグメントをコードするＤＮＡを含む）で形質移入し
    た細胞を物質に暴露する工程と、 ｂ）核内受容体またはそのフラグメントがコモジュレー
    ターまたはそのフラグメントの存在下で誘発する転写活
    性か、前記核内受容体またはそのフラグメントと前記コ
    モジュレーターまたはそのフラグメント間の相互作用に
    及ぼす該物質の影響か、の少なくともいずれか一方を、
    タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−タ
    ンパク質−ＤＮＡ相互作用により測定する工程と、から
    成る方法。
  2. 【請求項２】コモジュレーターが配列番号２のアミノ酸
    配列を含むＡＲＡＰ１１である、請求項１に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】コモジュレーターのフラグメントがＡＲＡ
    Ｐ１１のアミノ酸８１３〜１３９０を有する、請求項１
    に記載の方法。
  4. 【請求項４】核内受容体がアンドロゲン受容体、エスト
    ロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、プロゲステロ
    ン受容体Ａ、プロゲステロン受容体Ｂ、糖質コルチコイ
    ド受容体、鉱質コルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受
    容体、ビタミンＤ受容体、ペルオキシソーム増殖因子活
    性化受容体、レチン酸受容体、レチノイドＸ受容体およ
    びオーファン受容体から選択される、請求項１乃至３の
    いずれか一項に記載の方法。
  5. 【請求項５】細胞が株化細胞か真核細胞の少なくともい
    ずれかである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の
    方法。
  6. 【請求項６】真核細胞が、前立腺細胞、神経細胞、グリ
    ア細胞、繊維芽細胞、血球、骨芽細胞、破骨細胞、肝細
    胞、上皮細胞または筋細胞から選択される、請求項５に
    記載の方法。
  7. 【請求項７】ベクターが真核性発現ベクターである、請
    求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 【請求項８】ＡＲＡＰ１１またはそのフラグメントか、
    アンドロゲン受容体またはそのフラグメントかの少なく
    ともいずれか一方の濃度を測定する、アンドロゲン受容
    体とＡＲＡＰ１１間の共同調節機序障害の測定方法。
  9. 【請求項９】放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ試験、免疫
    染色、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、ノーザンブ
    ロット、ＤＮＡチップまたはタンパク質チップにより、
    濃度を測定する、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】請求項２に記載のアミノ酸配列を含む、
    アンドロゲン受容体に対してコモジュレーター特性を有
    するタンパク質またはそのフラグメント。
  11. 【請求項１１】前記フラグメントがアミノ酸８１３〜１
    ３９０を有する請求項１０に記載のタンパク質。
  12. 【請求項１２】請求項１０または１１に記載のタンパク
    質をコードするＤＮＡまたはそれとハイブリダイズする
    ＤＮＡ。
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