JP2003114227A - β−ラクタムペニシリンを検出、またはその量を決定するための方法およびキット - Google Patents
β−ラクタムペニシリンを検出、またはその量を決定するための方法およびキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 牛乳および食肉中の、一般的なβ−ラクタム
抗生物質の迅速な検出方法を開発すること。 【解決手段】 本発明は、主な第１世代β−ラクタムに
わたる広範な特異性を有し、そして残留β−ラクタム抗
生物質の存在について牛乳および食肉などを試験するた
めに使用することができる。
抗生物質の迅速な検出方法を開発すること。 【解決手段】 本発明は、主な第１世代β−ラクタムに
わたる広範な特異性を有し、そして残留β−ラクタム抗
生物質の存在について牛乳および食肉などを試験するた
めに使用することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、β−ラクタムペニ
シリンを検出、またはその量を測定するための方法およ
びキット、ならびにそれに有用なハプテン、免疫原、結
合体および抗体に関する。
シリンを検出、またはその量を測定するための方法およ
びキット、ならびにそれに有用なハプテン、免疫原、結
合体および抗体に関する。
【０００２】「検出（する）」とは、基質の存在または
非存在を定性的に分析することを意味する。
非存在を定性的に分析することを意味する。
【０００３】「測（決）定（する）」とは、基質の量を
定量的に分析することを意味する。
定量的に分析することを意味する。
【０００４】本発明は、主な第１世代β−ラクタムペニ
シリン（例えば、アンピシリン、ペニシリンＧ、アモキ
シリン、クロキサシリン、ジクロキサシリンおよびオキ
サシリン）全般に広範な適用を有することを意図し、こ
れらの特定のβ−ラクタムペニシリンに限定することを
意図しない。
シリン（例えば、アンピシリン、ペニシリンＧ、アモキ
シリン、クロキサシリン、ジクロキサシリンおよびオキ
サシリン）全般に広範な適用を有することを意図し、こ
れらの特定のβ−ラクタムペニシリンに限定することを
意図しない。
【０００５】抗生物質は、動物管理において、予防的お
よび治療的な目的の両方で日常的に使用されている。β
−ラクタムクラスの抗生物質は、一般的に、食肉および
乳業産業において成長促進剤として使用されている。ペ
ニシリン類としても知られるこのクラスは、酪農牛の乳
房炎を処置するために使用され、これにより牛乳の収量
およびウシの生産寿命を上昇させる。また、β−ラクタ
ムは、家禽およびブタの成長を促進するために動物の食
餌中に含ませることができる。疾患予防を通じて、また
はそのような動物の天然の消化管叢の活性を阻害するこ
とにより、抗生物質は、そのような促進剤を使用しない
場合よりも早く動物を売買のできるサイズに到達させ
る。
よび治療的な目的の両方で日常的に使用されている。β
−ラクタムクラスの抗生物質は、一般的に、食肉および
乳業産業において成長促進剤として使用されている。ペ
ニシリン類としても知られるこのクラスは、酪農牛の乳
房炎を処置するために使用され、これにより牛乳の収量
およびウシの生産寿命を上昇させる。また、β−ラクタ
ムは、家禽およびブタの成長を促進するために動物の食
餌中に含ませることができる。疾患予防を通じて、また
はそのような動物の天然の消化管叢の活性を阻害するこ
とにより、抗生物質は、そのような促進剤を使用しない
場合よりも早く動物を売買のできるサイズに到達させ
る。
【０００６】しかしながら、β−ラクタムの残留物が食
肉中および乳製品中に存在する場合に問題が生じ得る。
抗生物質を用いる場合、ヒトがβ−ラクタムに連続的に
暴露されることによる、病原性細菌の耐性株の発生に起
因し、疾患の処置に使用される薬物の効力の減少が生じ
得る。また、消費食物中にβ−ラクタムが存在すること
により、ペニシリン感受性のヒトにおいてアレルギー性
反応が生じ得る。また、これらの抗生物質を含有する乳
製品は、加工の際に使用される細菌培養物を妨害しう
る。
肉中および乳製品中に存在する場合に問題が生じ得る。
抗生物質を用いる場合、ヒトがβ−ラクタムに連続的に
暴露されることによる、病原性細菌の耐性株の発生に起
因し、疾患の処置に使用される薬物の効力の減少が生じ
得る。また、消費食物中にβ−ラクタムが存在すること
により、ペニシリン感受性のヒトにおいてアレルギー性
反応が生じ得る。また、これらの抗生物質を含有する乳
製品は、加工の際に使用される細菌培養物を妨害しう
る。
【０００７】結果として、牛乳および食肉におけるβ−
ラクタムの投与中止時期および最大残留基準値（ＭＲ
Ｌ）に関して欧州共同体全体で厳格なガイドラインが課
せられている。牛乳および食肉のサンプルは、それらを
このＥＣの法律に確実に適合させるため、日常的に試験
されている。β−ラクタムのような抗生物質について試
験するために種々の方法が使用されている。これらの試
験の多くは、細菌阻害試験に基づいているが、これらは
時間がかかり、そして個々のβ−ラクタムに対して特異
的かもしれない。牛乳および食肉中のβ−ラクタムの迅
速な検出方法の開発は、その方法が一般的、すなわち、
全部でないにしても大多数のβ−ラクタム抗生物質を検
出する方法であれば、特に価値があるだろう。
ラクタムの投与中止時期および最大残留基準値（ＭＲ
Ｌ）に関して欧州共同体全体で厳格なガイドラインが課
せられている。牛乳および食肉のサンプルは、それらを
このＥＣの法律に確実に適合させるため、日常的に試験
されている。β−ラクタムのような抗生物質について試
験するために種々の方法が使用されている。これらの試
験の多くは、細菌阻害試験に基づいているが、これらは
時間がかかり、そして個々のβ−ラクタムに対して特異
的かもしれない。牛乳および食肉中のβ−ラクタムの迅
速な検出方法の開発は、その方法が一般的、すなわち、
全部でないにしても大多数のβ−ラクタム抗生物質を検
出する方法であれば、特に価値があるだろう。
【０００８】
【従来の技術】一般的なβ−ラクタムの検出のためのイ
ムノアッセイを作製するために、β−ラクタム感作動物
において抗体を惹起させるために多数の試みが行われて
いる。このようなプロセスの第１段階は、動物宿主中に
おいて免疫応答を誘発する免疫原を作製することであ
る。このことは、キャリアタンパク質への結合の間にβ
−ラクタム環をインタクトなままで維持し得ないことが
問題となっている。開環ラクタムに基づく公知の結合方
法は、例えば、ＵＳ−Ａ−４，３４７，３１２、ＵＳ−
Ａ−５，１２８，２４０中、ｄｅ Ｈａａｎら、１９８
５中およびＦａｇｈｉｈｉ Ｓｈｉｒａｚｉら、１９９
１中に開示されている。これは開環形のβ−ラクタム環
に対して感受性であり、必ずしも一般的な環構造に対し
て感受性でない抗血清の産生を生じるかもしれない。
ムノアッセイを作製するために、β−ラクタム感作動物
において抗体を惹起させるために多数の試みが行われて
いる。このようなプロセスの第１段階は、動物宿主中に
おいて免疫応答を誘発する免疫原を作製することであ
る。このことは、キャリアタンパク質への結合の間にβ
−ラクタム環をインタクトなままで維持し得ないことが
問題となっている。開環ラクタムに基づく公知の結合方
法は、例えば、ＵＳ−Ａ−４，３４７，３１２、ＵＳ−
Ａ−５，１２８，２４０中、ｄｅ Ｈａａｎら、１９８
５中およびＦａｇｈｉｈｉ Ｓｈｉｒａｚｉら、１９９
１中に開示されている。これは開環形のβ−ラクタム環
に対して感受性であり、必ずしも一般的な環構造に対し
て感受性でない抗血清の産生を生じるかもしれない。
【０００９】あるいは、例えば、ＥＰ−Ａ−３０９，２
９９中およびＵｓｌｅｂｅｒら、１９９４に開示されて
いるように、閉環β−ラクタムの遊離カルボキシル基を
エステル化することができる。この様式で結合したβ−
ラクタム抗生物質に対して惹起された抗血清はアシル側
鎖に対して特異的であり、イソキサゾリルペニシリンの
場合のように類似の側鎖を有する場合にのみ、他のβ−
ラクタム抗生物質と交差反応する。さらに、別法では、
ＥＰ−Ａ−３０９，２９９およびｄｅ Ｌｅｕｗら、１
９９７に開示されているように、６−アミノペニシラン
酸の６−アミノ基により結合させることができる。この
ような場合、β−ラクタム環が結合の間にインタクトな
ままであるならば、抗体は主な第１世代β−ラクタムと
高い交差反応性を示す。β−ラクタムペニシリンについ
てのさらに可能性の高い結合部位は、例えば、Ｎａｇａ
ｋｕｒａら、１９９１に開示されるように、ペニシリン
のＤ−α−アミノアセトアミド基のα−アミノ基を介す
るものである。Ｎａｇａｋｕｒａら、１９９１に開示さ
れる細胞株であるＡｂｐ４およびＡｂｐ７は、ＭＢＳ
（マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド）クロスリンカーを用いるハプテンおよび結合体に関
するものであり、文献には、細胞株の内の１つ（Ａｂｐ
４）はチアゾリジン環を認識し、一方、細胞株の他方
（Ａｂｐ７）はアシル側鎖を認識すると結論付けてい
る。Ａｂｐ４は、ペニシリンＧ、６−アミノペニシラン
酸および特定のセファロスポリンと交差反応し、他方、
Ａｂｐ７は非常に特異的であり、主な第１世代β−ラク
タムとはほとんどまたは全く交差反応性を示さない。
９９中およびＵｓｌｅｂｅｒら、１９９４に開示されて
いるように、閉環β−ラクタムの遊離カルボキシル基を
エステル化することができる。この様式で結合したβ−
ラクタム抗生物質に対して惹起された抗血清はアシル側
鎖に対して特異的であり、イソキサゾリルペニシリンの
場合のように類似の側鎖を有する場合にのみ、他のβ−
ラクタム抗生物質と交差反応する。さらに、別法では、
ＥＰ−Ａ−３０９，２９９およびｄｅ Ｌｅｕｗら、１
９９７に開示されているように、６−アミノペニシラン
酸の６−アミノ基により結合させることができる。この
ような場合、β−ラクタム環が結合の間にインタクトな
ままであるならば、抗体は主な第１世代β−ラクタムと
高い交差反応性を示す。β−ラクタムペニシリンについ
てのさらに可能性の高い結合部位は、例えば、Ｎａｇａ
ｋｕｒａら、１９９１に開示されるように、ペニシリン
のＤ−α−アミノアセトアミド基のα−アミノ基を介す
るものである。Ｎａｇａｋｕｒａら、１９９１に開示さ
れる細胞株であるＡｂｐ４およびＡｂｐ７は、ＭＢＳ
（マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド）クロスリンカーを用いるハプテンおよび結合体に関
するものであり、文献には、細胞株の内の１つ（Ａｂｐ
４）はチアゾリジン環を認識し、一方、細胞株の他方
（Ａｂｐ７）はアシル側鎖を認識すると結論付けてい
る。Ａｂｐ４は、ペニシリンＧ、６−アミノペニシラン
酸および特定のセファロスポリンと交差反応し、他方、
Ａｂｐ７は非常に特異的であり、主な第１世代β−ラク
タムとはほとんどまたは全く交差反応性を示さない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、免疫原を作
製するための、ペニシリンのＤ−α−アミノアセトアミ
ド基のαアミノ基で、抗原性付与キャリア物質へと結合
した新規なハプテン（アンピシリン誘導体）の結合体を
記載している。また、この免疫原に対して作製された抗
体を一般的なアッセイの開発においてどのように使用す
るかも記載しており、これはβ−ラクタム抗生物質の存
在について牛乳および食肉などを試験するために使用さ
れ得る。
製するための、ペニシリンのＤ−α−アミノアセトアミ
ド基のαアミノ基で、抗原性付与キャリア物質へと結合
した新規なハプテン（アンピシリン誘導体）の結合体を
記載している。また、この免疫原に対して作製された抗
体を一般的なアッセイの開発においてどのように使用す
るかも記載しており、これはβ−ラクタム抗生物質の存
在について牛乳および食肉などを試験するために使用さ
れ得る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】第１の局面において、本
発明は、α−アミノ基で置換型または非置換型フェニル
ジカルボアルデヒド（これは、置換型もしくは非置換型
フタルアルデヒド、置換型もしくは非置換型イソフタル
アルデヒドおよび置換型もしくは非置換型テレフタルア
ルデヒドからなる群から選択される）と架橋した６−
［Ｄ−α−アミノアセトアミド］ペニシリン誘導体を含
有するハプテンを提供する。
発明は、α−アミノ基で置換型または非置換型フェニル
ジカルボアルデヒド（これは、置換型もしくは非置換型
フタルアルデヒド、置換型もしくは非置換型イソフタル
アルデヒドおよび置換型もしくは非置換型テレフタルア
ルデヒドからなる群から選択される）と架橋した６−
［Ｄ−α−アミノアセトアミド］ペニシリン誘導体を含
有するハプテンを提供する。
【００１２】代表的な６−［Ｄ−α−アミノアセトアミ
ド］ペニシリン誘導体は、以下の構造式：
ド］ペニシリン誘導体は、以下の構造式：
【化１】
を有する。結合部位は矢印によって示されている。
【００１３】好ましくは、フェニルジカルボアルデヒド
は置換型または非置換型テレフタルアルデヒドであり、
最も好ましくは非置換型テレフタルアルデヒドである。
適切な置換としては、アルデヒド、チオイソシアネート
およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド官能基のパラ−お
よびオルト位での付加が挙げられる。
は置換型または非置換型テレフタルアルデヒドであり、
最も好ましくは非置換型テレフタルアルデヒドである。
適切な置換としては、アルデヒド、チオイソシアネート
およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド官能基のパラ−お
よびオルト位での付加が挙げられる。
【００１４】ハプテンは、適切な溶媒（なかでも、ジメ
チルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドは適切な
例である）中で置換型または非置換型フェニルジカルボ
アルデヒドを６−［Ｄ−α−アミノアセトアミド］ペニ
シリン誘導体と反応させることにより製造される。
チルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドは適切な
例である）中で置換型または非置換型フェニルジカルボ
アルデヒドを６−［Ｄ−α−アミノアセトアミド］ペニ
シリン誘導体と反応させることにより製造される。
【００１５】さらなる局面において、本発明は、抗原性
付与キャリア物質に結合した本発明のハプテンを含む免
疫原に関する。好ましくは、キャリア物質はタンパク
質、タンパク質フラグメント、合成ポリペプチドまたは
半合成ポリペプチドである。
付与キャリア物質に結合した本発明のハプテンを含む免
疫原に関する。好ましくは、キャリア物質はタンパク
質、タンパク質フラグメント、合成ポリペプチドまたは
半合成ポリペプチドである。
【００１６】なおさらなる局面において、本発明は本発
明の免疫原に対して惹起された抗体に関し、この抗体は
インタクトなβ−ラクタム環の少なくとも１つの構造エ
ピトープと結合することができる。好ましくは、抗体は
支持体上に固定される。
明の免疫原に対して惹起された抗体に関し、この抗体は
インタクトなβ−ラクタム環の少なくとも１つの構造エ
ピトープと結合することができる。好ましくは、抗体は
支持体上に固定される。
【００１７】さらに、本発明は、抗体を製造するプロセ
スを提供し、このプロセスは、本発明の免疫原を反復投
与することにより動物（好ましくは脊椎動物、最も好ま
しくは哺乳動物）を免疫感作すること、および免疫感作
した動物から得られた血清抗体を回収することを含む。
好ましくは、このプロセスはさらに、前記の血清抗体を
支持体（好ましくは、固体支持体、最も好ましくはポリ
スチレン固体支持体）に固定することを含む。好ましく
は、抗体はポリクローナル抗体である。あるいは、抗体
はモノクローナル抗体である。
スを提供し、このプロセスは、本発明の免疫原を反復投
与することにより動物（好ましくは脊椎動物、最も好ま
しくは哺乳動物）を免疫感作すること、および免疫感作
した動物から得られた血清抗体を回収することを含む。
好ましくは、このプロセスはさらに、前記の血清抗体を
支持体（好ましくは、固体支持体、最も好ましくはポリ
スチレン固体支持体）に固定することを含む。好ましく
は、抗体はポリクローナル抗体である。あるいは、抗体
はモノクローナル抗体である。
【００１８】なおさらなる局面において、本発明は検出
用標識物質に共有結合した本発明のハプテンを含む結合
体に関する。好ましくは、標識物質は、酵素、発光物
質、放射活性基質またはそれらの混合物から選択され
る。好ましくは、標識物質は酵素であり、好ましくはペ
ルオキシダーゼであり、最も好ましくは西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）である。あるいは、またはさら
には、蛍光物質は生物発光、化学発光または蛍光物質で
あり得る。
用標識物質に共有結合した本発明のハプテンを含む結合
体に関する。好ましくは、標識物質は、酵素、発光物
質、放射活性基質またはそれらの混合物から選択され
る。好ましくは、標識物質は酵素であり、好ましくはペ
ルオキシダーゼであり、最も好ましくは西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）である。あるいは、またはさら
には、蛍光物質は生物発光、化学発光または蛍光物質で
あり得る。
【００１９】なおさらなる局面において、本発明はサン
プル中のβ−ラクタムペニシリンを検出、またはその量
を決定する方法に関し、この方法はサンプルを、本発明
の結合体またはその混合物、および本発明の抗体または
その混合物と接触させること、結合した結合体を検出ま
たはその量を決（測）定すること、校正曲線からサンプ
ル中のβ−ラクタムペニシリンの存在または量を導くこ
とを含む。
プル中のβ−ラクタムペニシリンを検出、またはその量
を決定する方法に関し、この方法はサンプルを、本発明
の結合体またはその混合物、および本発明の抗体または
その混合物と接触させること、結合した結合体を検出ま
たはその量を決（測）定すること、校正曲線からサンプ
ル中のβ−ラクタムペニシリンの存在または量を導くこ
とを含む。
【００２０】好ましくは、抗体はポリクローナルであ
る。
る。
【００２１】さらなる局面において、本発明はβ−ラク
タムペニシリンを検出またはその量を決定するためのキ
ットに関し、このキットは本発明の結合体またはその混
合物、および本発明の抗体またはその混合物を含む。こ
のキットは、必要に応じて、サンプル中のβ−ラクタム
ペニシリンを検出またはその量を決定するための結合体
および抗体の使用に関する使用説明書を含んでいてもよ
い。
タムペニシリンを検出またはその量を決定するためのキ
ットに関し、このキットは本発明の結合体またはその混
合物、および本発明の抗体またはその混合物を含む。こ
のキットは、必要に応じて、サンプル中のβ−ラクタム
ペニシリンを検出またはその量を決定するための結合体
および抗体の使用に関する使用説明書を含んでいてもよ
い。
【００２２】好ましくは、サンプルは生物学的流体（牛
乳を含む）のような溶液または食肉のような細胞組織断
片である。
乳を含む）のような溶液または食肉のような細胞組織断
片である。
【００２３】本発明の方法およびキットにおいて、α−
アミノ位で架橋した（免疫原および結合体の）各クロス
リンカーは、同一または異なっていてもよい。
アミノ位で架橋した（免疫原および結合体の）各クロス
リンカーは、同一または異なっていてもよい。
【００２４】さらなる局面において、本発明は、β−ラ
クタム抗生物質の検出またはその量の測定のために牛乳
および食肉のようなサンプルを試験するために、本発明
の結合体またはそれらの混合物を、本発明の抗体または
それらの混合物とともに使用することに関する。
クタム抗生物質の検出またはその量の測定のために牛乳
および食肉のようなサンプルを試験するために、本発明
の結合体またはそれらの混合物を、本発明の抗体または
それらの混合物とともに使用することに関する。
【００２５】本発明は、従来的な抗原性付与キャリア物
質への結合により、新規な免疫原の製造の際に使用され
る新規なハプテンに関する。次いで、得られた免疫原は
動物（好ましくは脊椎動物宿主、最も好ましくは哺乳動
物宿主）に投与され、次に、結合体（ハプテン−標識薬
剤）またはその混合物を検出薬剤として使用する、β−
ラクタムペニシリンに関する一般的なイムノアッセイを
開発するために使用される、強力な（ａｖｉｄ）ポリク
ローナル抗血清の産生を誘発する。
質への結合により、新規な免疫原の製造の際に使用され
る新規なハプテンに関する。次いで、得られた免疫原は
動物（好ましくは脊椎動物宿主、最も好ましくは哺乳動
物宿主）に投与され、次に、結合体（ハプテン−標識薬
剤）またはその混合物を検出薬剤として使用する、β−
ラクタムペニシリンに関する一般的なイムノアッセイを
開発するために使用される、強力な（ａｖｉｄ）ポリク
ローナル抗血清の産生を誘発する。
【００２６】アンピシリンおよび他のβ−ラクタムペニ
シリンの化学構造を、以下の構造式について以下の表に
まとめる。
シリンの化学構造を、以下の構造式について以下の表に
まとめる。
【００２７】
【化２】
表１：β−ラクタムペニシリンの化学構造
【表１】
【００２８】本発明の目的は、β−ラクタムペニシリン
グループ全体に対して特異的な抗体の製造である。この
広い特異性を達成するために、アンピシリンを置換型も
しくは非置換型フェニルジカルボアルデヒド、好ましく
は置換型もしくは非置換型テレフタルアルデヒド（非置
換型テレフタルアルデヒドを添付の図面の図１に示す）
のような二官能性クロスリンカーを用いてアミノ基を介
して誘導体化する。アンピシリンのβ−ラクタム環を、
ペニシリングループに共通のエピトープが確実に保持さ
れるように誘導体化の間、保護する。
グループ全体に対して特異的な抗体の製造である。この
広い特異性を達成するために、アンピシリンを置換型も
しくは非置換型フェニルジカルボアルデヒド、好ましく
は置換型もしくは非置換型テレフタルアルデヒド（非置
換型テレフタルアルデヒドを添付の図面の図１に示す）
のような二官能性クロスリンカーを用いてアミノ基を介
して誘導体化する。アンピシリンのβ−ラクタム環を、
ペニシリングループに共通のエピトープが確実に保持さ
れるように誘導体化の間、保護する。
【００２９】本発明のハプテン（アンピシリン誘導体）
は規定の構造エピトープを提供するが、それ自体は免疫
原性ではなく、それゆえ、適切な免疫原性付与キャリア
物質に連結されねばならず、その結果、作製された免疫
原が、宿主動物へと注射された場合に免疫原性応答を誘
発する。適切な免疫原性付与キャリア物質としては、ア
ルブミン、グロブリンのような血清タンパク質、眼レン
ズタンパク質（ｏｃｕｌａｒ ｌｅｎｓ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）およびリポプロテインのようなタンパク質およびタ
ンパク質フラグメントが挙げられる。例示的なタンパク
質キャリアとしては、ウシ血清アルブミン、卵オボアル
ブミン、ウシγグロブリン、チロキシン結合グロブリ
ン、キーホールリンペットヘモシアニンなどが挙げられ
る。あるいは、反応性官能基を保有する、他の合成また
は天然のポリマー物質の場合、リジンのような十分な数
の利用可能なアミン基を有する合成ポリ（アミノ酸）が
使用され得る。特に、炭水化物、イーストまたは多糖類
をハプテンへと結合させて本発明の免疫原を作製するこ
とができる。
は規定の構造エピトープを提供するが、それ自体は免疫
原性ではなく、それゆえ、適切な免疫原性付与キャリア
物質に連結されねばならず、その結果、作製された免疫
原が、宿主動物へと注射された場合に免疫原性応答を誘
発する。適切な免疫原性付与キャリア物質としては、ア
ルブミン、グロブリンのような血清タンパク質、眼レン
ズタンパク質（ｏｃｕｌａｒ ｌｅｎｓ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）およびリポプロテインのようなタンパク質およびタ
ンパク質フラグメントが挙げられる。例示的なタンパク
質キャリアとしては、ウシ血清アルブミン、卵オボアル
ブミン、ウシγグロブリン、チロキシン結合グロブリ
ン、キーホールリンペットヘモシアニンなどが挙げられ
る。あるいは、反応性官能基を保有する、他の合成また
は天然のポリマー物質の場合、リジンのような十分な数
の利用可能なアミン基を有する合成ポリ（アミノ酸）が
使用され得る。特に、炭水化物、イーストまたは多糖類
をハプテンへと結合させて本発明の免疫原を作製するこ
とができる。
【００３０】また、ハプテン（アンピシリン誘導体）を
酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、蛍光物
質または放射活性物質のような標識薬剤へと結合させて
イムノアッセイでの使用のための検出試薬を作製する。
蛍光物質は、例えば、フルオレセインまたはその誘導体
の一価の残基であり得る。
酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、蛍光物
質または放射活性物質のような標識薬剤へと結合させて
イムノアッセイでの使用のための検出試薬を作製する。
蛍光物質は、例えば、フルオレセインまたはその誘導体
の一価の残基であり得る。
【００３１】ハプテン、およびキャリア物質または標識
物質（例えば、酵素または他の標識）のいずれかとのそ
の結合体の製造は、図１に記載の反応式にしたがって行
われる。すなわち、例えば、アンピシリンをジメチルホ
ルムアミド中で室温で１８時間、テレフタルアルデヒド
と反応させてシッフ塩基中間体を作製する。中間体を、
キャリア物質（例えば、ウシ血清アルブミン）または標
識薬剤（例えば酵素または標識）のいずれかと酢酸緩衝
液（ｐＨ４〜５）中で反応させ、続いて、例えば、シア
ノホウ化水素ナトリウムを用いるシッフ塩基の還元によ
り、それぞれ、本発明の免疫原または本発明の結合体の
いずれかを得る。
物質（例えば、酵素または他の標識）のいずれかとのそ
の結合体の製造は、図１に記載の反応式にしたがって行
われる。すなわち、例えば、アンピシリンをジメチルホ
ルムアミド中で室温で１８時間、テレフタルアルデヒド
と反応させてシッフ塩基中間体を作製する。中間体を、
キャリア物質（例えば、ウシ血清アルブミン）または標
識薬剤（例えば酵素または標識）のいずれかと酢酸緩衝
液（ｐＨ４〜５）中で反応させ、続いて、例えば、シア
ノホウ化水素ナトリウムを用いるシッフ塩基の還元によ
り、それぞれ、本発明の免疫原または本発明の結合体の
いずれかを得る。
【００３２】キャリア物質に対するハプテンの適切な結
合が達成されていることを確認するために、免疫感作の
前に各免疫原をマトリックス支援ＵＶレーザー脱離／イ
オン化質量分析（ＭＡＬＤＩ ＭＳ）を用いて評価す
る。好ましいキャリア物質であるウシ血清アルブミンの
場合、キャリア分子１つあたり最小６分子のハプテンが
好ましい。
合が達成されていることを確認するために、免疫感作の
前に各免疫原をマトリックス支援ＵＶレーザー脱離／イ
オン化質量分析（ＭＡＬＤＩ ＭＳ）を用いて評価す
る。好ましいキャリア物質であるウシ血清アルブミンの
場合、キャリア分子１つあたり最小６分子のハプテンが
好ましい。
【００３３】ポリクローナル抗血清を作製するために、
免疫原をフロイントアジュバントと混合し、この混合物
を宿主動物（例えば、ウサギ、ヒツジ、マウス、モルモ
ットまたはウマ）に注射する。さらに注射（追加免疫）
を行い、抗体力価の評価のために血清をサンプリングす
る。最適な力価に達していた場合、次いで、宿主動物を
放血させて適切な量の特異抗血清を得る。必要とされる
抗体精製の程度は、意図される適用に依存する。多くの
目的には、精製は全く必要ではないが、しかし、固体支
持体上に抗体が固定されるような場合では、望ましくな
い物質を取り除き、そして非特異的な結合を減少または
排除するために精製工程が採用される。
免疫原をフロイントアジュバントと混合し、この混合物
を宿主動物（例えば、ウサギ、ヒツジ、マウス、モルモ
ットまたはウマ）に注射する。さらに注射（追加免疫）
を行い、抗体力価の評価のために血清をサンプリングす
る。最適な力価に達していた場合、次いで、宿主動物を
放血させて適切な量の特異抗血清を得る。必要とされる
抗体精製の程度は、意図される適用に依存する。多くの
目的には、精製は全く必要ではないが、しかし、固体支
持体上に抗体が固定されるような場合では、望ましくな
い物質を取り除き、そして非特異的な結合を減少または
排除するために精製工程が採用される。
【００３４】アンピシリンに対して作製された抗体は、
牛乳のような生物学的流体中、および食肉のような食料
品中のβ−ラクタムペニシリンの存在を決定するための
生化学アッセイにおける試薬として有用である。
牛乳のような生物学的流体中、および食肉のような食料
品中のβ−ラクタムペニシリンの存在を決定するための
生化学アッセイにおける試薬として有用である。
【００３５】
【実施例】実施例１
ハプテンの製造
テトラフタルアルデヒド（１８３ｍｇ、１．３６４ｍｍ
ｏｌ）を、アンピシリントリヒドレートのジメチルホル
ムアミド溶液（５００ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）１０ｍ
ｌに、窒素下で２０℃で添加した。混合物を光から保護
し、２４時間、室温で攪拌した。反応が完了したことを
確認するために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
（８０％クロロホルム、２０％メタノール ｖ／ｖ）を
行った。その結果、これは残存開始物質を示さず、アン
ピシリンよりも極性の低い、新規なスポットの形成が示
された。ハプテン溶液は窒素下で、−２０℃で保存した
（１年間安定）。
ｏｌ）を、アンピシリントリヒドレートのジメチルホル
ムアミド溶液（５００ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）１０ｍ
ｌに、窒素下で２０℃で添加した。混合物を光から保護
し、２４時間、室温で攪拌した。反応が完了したことを
確認するために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
（８０％クロロホルム、２０％メタノール ｖ／ｖ）を
行った。その結果、これは残存開始物質を示さず、アン
ピシリンよりも極性の低い、新規なスポットの形成が示
された。ハプテン溶液は窒素下で、−２０℃で保存した
（１年間安定）。
【００３６】実施例２
免疫原（ハプテン−ウシ血清アルブミン）の製造
実施例１で製造したハプテン溶液を、ウシ血清アルブミ
ン（２００ｍｇ）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４．１）溶液１０ｍｌに滴下した。混合物を光から保
護し、室温で４時間攪拌した。シアノホウ化水素ナトリ
ウム３０ｍｇを添加することにより、シッフ塩基の還元
を達成した。混合物を９０分間攪拌し、ホウ化水素ナト
リウム５ｍｇを添加した。さらに１０分間攪拌した後、
混合物をリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７，２）に対し
て４℃で２４時間透析した（３回交換）。ハプテン対Ｂ
ＳＡの結合の程度をＭＡＬＤＩ ＭＳで評価すると、Ｂ
ＳＡ１分子に対してハプテン６．３分子の結合比を示し
た。
ン（２００ｍｇ）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４．１）溶液１０ｍｌに滴下した。混合物を光から保
護し、室温で４時間攪拌した。シアノホウ化水素ナトリ
ウム３０ｍｇを添加することにより、シッフ塩基の還元
を達成した。混合物を９０分間攪拌し、ホウ化水素ナト
リウム５ｍｇを添加した。さらに１０分間攪拌した後、
混合物をリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７，２）に対し
て４℃で２４時間透析した（３回交換）。ハプテン対Ｂ
ＳＡの結合の程度をＭＡＬＤＩ ＭＳで評価すると、Ｂ
ＳＡ１分子に対してハプテン６．３分子の結合比を示し
た。
【００３７】実施例３
結合体（ハプテン−ＨＲＰ）の製造
実施例１のハプテンのＨＲＰへの結合は、免疫原の製造
についての記載と同様に行った。実施例１で製造したハ
プテン溶液（４０μｌ）を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ４〜５）０．２ｍｌ中のＨＲＰ（西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ）２０ｍｇに添加した。混合物を光か
ら保護し、室温で４時間攪拌した。シアノホウ化水素ナ
トリウム（０．７ｍｇ）を添加し、混合物を９０分攪拌
した。２本のＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて結合体を精製し、一晩、光か
ら保護して脱イオン水に対して２回（ａｇａｉｎｓｔ
ｄｏｕｂｌｅ ｄｅｉｏｎｉｓｅｄ ｗａｔｅｒ）、２
〜８℃で透析した。
についての記載と同様に行った。実施例１で製造したハ
プテン溶液（４０μｌ）を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ４〜５）０．２ｍｌ中のＨＲＰ（西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ）２０ｍｇに添加した。混合物を光か
ら保護し、室温で４時間攪拌した。シアノホウ化水素ナ
トリウム（０．７ｍｇ）を添加し、混合物を９０分攪拌
した。２本のＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて結合体を精製し、一晩、光か
ら保護して脱イオン水に対して２回（ａｇａｉｎｓｔ
ｄｏｕｂｌｅ ｄｅｉｏｎｉｓｅｄ ｗａｔｅｒ）、２
〜８℃で透析した。
【００３８】実施例４
実施例２の免疫原に対して惹起された抗体の製造
実施例２の免疫原の水溶液をフロイント完全アジュバン
ト（ＦＣＡ）とともに調製して５０％（ｖ／ｖ）ＦＣＡ
中２ｍｇ／ｍｌの免疫原からなる乳液を形成した。この
乳液を用いて、各動物のわき腹にそれぞれ４ヵ所、０．
２５ｍｌ皮下注射して、３匹のヒツジを免疫感作した。
続いての免疫感作（追加免疫）は５０％（ｖ／ｖ）フロ
イント不完全アジュバント（ＦＩＡ）中に乳化させた免
疫原１ｍｇ／ｍｌを含んでおり、１年間の間、１ヶ月の
間隔で、同様の方法で投与した。各追加免疫の７〜１４
日後に血液サンプリングを行った。各サンプルを処理し
て抗血清を作製し、これを、カプリル酸および硫酸アン
モニウム沈殿によりさらに精製して免疫グロブリンＧ
（ＩｇＧ）画分を得た。以下に記載の競合ＥＬＩＳＡマ
イクロタイタープレートアッセイによりＩｇＧ画分を評
価した。
ト（ＦＣＡ）とともに調製して５０％（ｖ／ｖ）ＦＣＡ
中２ｍｇ／ｍｌの免疫原からなる乳液を形成した。この
乳液を用いて、各動物のわき腹にそれぞれ４ヵ所、０．
２５ｍｌ皮下注射して、３匹のヒツジを免疫感作した。
続いての免疫感作（追加免疫）は５０％（ｖ／ｖ）フロ
イント不完全アジュバント（ＦＩＡ）中に乳化させた免
疫原１ｍｇ／ｍｌを含んでおり、１年間の間、１ヶ月の
間隔で、同様の方法で投与した。各追加免疫の７〜１４
日後に血液サンプリングを行った。各サンプルを処理し
て抗血清を作製し、これを、カプリル酸および硫酸アン
モニウム沈殿によりさらに精製して免疫グロブリンＧ
（ＩｇＧ）画分を得た。以下に記載の競合ＥＬＩＳＡマ
イクロタイタープレートアッセイによりＩｇＧ画分を評
価した。
【００３９】実施例５
競合ＥＬＩＳＡの開発
チェッカー盤力価測定（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ ｔ
ｉｔｒａｉｏｎ）を行って最適な捕獲抗体および結合体
（アンピシリン−ＨＲＰ）の濃度を決定した。（実施例
４に従って製造した）試験する各抗血清のＩｇＧ画分の
段階希釈を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中で製造
した。エンハンスドバインド（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｉ
ｎｄｉｎｇ）９６ウェルポリスチレンマイクロタイター
プレートのウェルを、３７℃で２時間インキュベートす
ることによりこれらの希釈物でコーティングした（１２
５μｌ／ウェル）（図２に示す）。プレートを、Ｔｗｅ
ｅｎ（商標）２０（ＴＢＳＴ）を含むＴｒｉｓ緩衝化生
理食塩水（ｐＨ７．４）で４回洗浄し、軽くたたいて乾
燥させた。アンピシリンのＴＢＳＴ溶液（１０ｎｇ／ｍ
ｌ）５０μｌ（ｍｉｄアッセイ範囲）を適切なウェルに
添加した（図２）。ＴＢＳＴ５０μｌを残りの（コント
ロール）ウェルに添加した。結合体（アンピシリン−Ｈ
ＲＰ）の系列希釈を、ＥＤＴＡ、Ｄ−マンニトール、ス
クロース、チメロサールおよびＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩
衝液（ｐＨ７．２）中に調製し、各希釈物７５μｌを図
２に示すようにウェルに添加した。プレートを３７℃で
２時間インキュベートした。１０分間にわたり、ＴＢＳ
Ｔを用いて６回洗浄することにより過剰の非結合型結合
体を取り除いた。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基
質溶液１２５μｌをプレートの各ウェルに添加し、次い
で、暗所にて室温で１５〜２０分インキュベートした。
０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４１２５μｌを各ウェルに添加する
ことにより反応を終結させた。次いで、マイクロタイタ
ープレートリーダーを用いて吸光度を４５０ｎｍで測定
した。１／１０００の希釈の捕獲抗体を１／１５０００
希釈の結合体と組合わせて許容範囲の最高吸光度２．１
５、および０〜１０ｎｇ／ｍｌ抗原濃度の間で８０％の
顕著な減少を生じた。
ｉｔｒａｉｏｎ）を行って最適な捕獲抗体および結合体
（アンピシリン−ＨＲＰ）の濃度を決定した。（実施例
４に従って製造した）試験する各抗血清のＩｇＧ画分の
段階希釈を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中で製造
した。エンハンスドバインド（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｉ
ｎｄｉｎｇ）９６ウェルポリスチレンマイクロタイター
プレートのウェルを、３７℃で２時間インキュベートす
ることによりこれらの希釈物でコーティングした（１２
５μｌ／ウェル）（図２に示す）。プレートを、Ｔｗｅ
ｅｎ（商標）２０（ＴＢＳＴ）を含むＴｒｉｓ緩衝化生
理食塩水（ｐＨ７．４）で４回洗浄し、軽くたたいて乾
燥させた。アンピシリンのＴＢＳＴ溶液（１０ｎｇ／ｍ
ｌ）５０μｌ（ｍｉｄアッセイ範囲）を適切なウェルに
添加した（図２）。ＴＢＳＴ５０μｌを残りの（コント
ロール）ウェルに添加した。結合体（アンピシリン−Ｈ
ＲＰ）の系列希釈を、ＥＤＴＡ、Ｄ−マンニトール、ス
クロース、チメロサールおよびＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩
衝液（ｐＨ７．２）中に調製し、各希釈物７５μｌを図
２に示すようにウェルに添加した。プレートを３７℃で
２時間インキュベートした。１０分間にわたり、ＴＢＳ
Ｔを用いて６回洗浄することにより過剰の非結合型結合
体を取り除いた。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基
質溶液１２５μｌをプレートの各ウェルに添加し、次い
で、暗所にて室温で１５〜２０分インキュベートした。
０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４１２５μｌを各ウェルに添加する
ことにより反応を終結させた。次いで、マイクロタイタ
ープレートリーダーを用いて吸光度を４５０ｎｍで測定
した。１／１０００の希釈の捕獲抗体を１／１５０００
希釈の結合体と組合わせて許容範囲の最高吸光度２．１
５、および０〜１０ｎｇ／ｍｌ抗原濃度の間で８０％の
顕著な減少を生じた。
【００４０】次いで、マイクロタイタープレートを、上
記で概説したように、Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中１／１
０００の最適コーティング希釈での抗アンピシリン抗血
清のＩｇＧ画分を用いてコーティングした。アンピシリ
ン（ナトリウム塩）の標準溶液をＴＢＳＴ中で調製し、
以下の濃度で適用した：０、１、５、１０、５０、１０
０、２００、５００ｎｇ／ｍｌ。得られたデータによ
り、図３に示される高感度校正曲線を得た。ここで、Ｂ
はｘｎｇ／ｍｌアンピシリンに対する４５０ｎｍで測定
した吸光度であり、Ｂ０は０ｎｇ／ｍｌアンピシリンに
対する４５０ｎｍで測定した吸光度である。
記で概説したように、Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中１／１
０００の最適コーティング希釈での抗アンピシリン抗血
清のＩｇＧ画分を用いてコーティングした。アンピシリ
ン（ナトリウム塩）の標準溶液をＴＢＳＴ中で調製し、
以下の濃度で適用した：０、１、５、１０、５０、１０
０、２００、５００ｎｇ／ｍｌ。得られたデータによ
り、図３に示される高感度校正曲線を得た。ここで、Ｂ
はｘｎｇ／ｍｌアンピシリンに対する４５０ｎｍで測定
した吸光度であり、Ｂ０は０ｎｇ／ｍｌアンピシリンに
対する４５０ｎｍで測定した吸光度である。
【００４１】実施例６
アンピシリンイムノアッセイの各β−ラクタムペニシリ
ンとの交差反応性 ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ−ＰｅｎＧ）、アモ
キシリン（ＡｍｏＸ）、クロキサシリン（Ｃｌｏｘ）、
ジクロキサシリン（Ｄｉｃｌｏｘ）およびオキサシリン
（Ｏｘａ）の標準溶液を、ＴＢＳＴ中０、１、５、１
０、５０、１００、２００および５００ｎｇ／ｍｌで調
製した。各々のβ−ラクタムペニシリン標準をアンピシ
リンイムノアッセイに用いて校正曲線を作製し（図
４）、これらを用いて各ペニシリンでのイムノアッセイ
の交差反応性を決定した。この研究の結果を図２に示
す。交差反応性は、以下の式に従って計算した。 ％ＣＲ＝ＩＣ５０ａｍｐ／ＩＣ５０ｐｅｎ×１００ ［式中、％ＣＲは交差反応性の割合であり、ＩＣ５０
ａｍｐはシグナルの５０％の置き換わりが生じるアンピ
シリンの濃度であり、ＩＣ５０ｐｅｎはβ−ラクタムペ
ニシリンの濃度である。ここで、シグナルの５０％置き
換わりが生じる％ＣＲが算出される。］ アンピシリンイムノアッセイは各々のβ−ラクタムペニ
シリンと高いレベルの交差反応性を示した（表２）。高
いレベルの交差反応性とは、アンピシリンに関して３５
％より高い交差反応性を意味する。本発明のイムノアッ
セイはアンピシリン（１００％ＣＲ）、アモキシリン
（８７％ＣＲ）およびベンジルペニシリン（７２％Ｃ
Ｒ）に対して最も特異的である。牛乳中のアモキシリ
ン、アンピシリンおよびベンジルペニシリンについての
最大推奨濃度（ＭＲＬ）は各々４μｇ／ｋｇであり、オ
キサシリン、シクロキサシリンおよびジシクロキサシリ
ンは、各々３０μｇ／ｋｇであるので、β−ラクタムペ
ニシリンの各々について測定したＩＣ５０値は記載した
ＥＬＩＳＡが、ＥＣ規則２３７７／９０に従ってβ−ラ
クタム抗生物質に対する一般的なイムノアッセイとして
の使用に適していることを示唆する。
ンとの交差反応性 ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ−ＰｅｎＧ）、アモ
キシリン（ＡｍｏＸ）、クロキサシリン（Ｃｌｏｘ）、
ジクロキサシリン（Ｄｉｃｌｏｘ）およびオキサシリン
（Ｏｘａ）の標準溶液を、ＴＢＳＴ中０、１、５、１
０、５０、１００、２００および５００ｎｇ／ｍｌで調
製した。各々のβ−ラクタムペニシリン標準をアンピシ
リンイムノアッセイに用いて校正曲線を作製し（図
４）、これらを用いて各ペニシリンでのイムノアッセイ
の交差反応性を決定した。この研究の結果を図２に示
す。交差反応性は、以下の式に従って計算した。 ％ＣＲ＝ＩＣ５０ａｍｐ／ＩＣ５０ｐｅｎ×１００ ［式中、％ＣＲは交差反応性の割合であり、ＩＣ５０
ａｍｐはシグナルの５０％の置き換わりが生じるアンピ
シリンの濃度であり、ＩＣ５０ｐｅｎはβ−ラクタムペ
ニシリンの濃度である。ここで、シグナルの５０％置き
換わりが生じる％ＣＲが算出される。］ アンピシリンイムノアッセイは各々のβ−ラクタムペニ
シリンと高いレベルの交差反応性を示した（表２）。高
いレベルの交差反応性とは、アンピシリンに関して３５
％より高い交差反応性を意味する。本発明のイムノアッ
セイはアンピシリン（１００％ＣＲ）、アモキシリン
（８７％ＣＲ）およびベンジルペニシリン（７２％Ｃ
Ｒ）に対して最も特異的である。牛乳中のアモキシリ
ン、アンピシリンおよびベンジルペニシリンについての
最大推奨濃度（ＭＲＬ）は各々４μｇ／ｋｇであり、オ
キサシリン、シクロキサシリンおよびジシクロキサシリ
ンは、各々３０μｇ／ｋｇであるので、β−ラクタムペ
ニシリンの各々について測定したＩＣ５０値は記載した
ＥＬＩＳＡが、ＥＣ規則２３７７／９０に従ってβ−ラ
クタム抗生物質に対する一般的なイムノアッセイとして
の使用に適していることを示唆する。
【００４２】表２：アンピシリンイムノアッセイのβ−
ラクタムペニシリンとの交差反応性
ラクタムペニシリンとの交差反応性
【表２】
【００４３】実施例７
一般的イムノアッセイを用いる牛乳中のβ−ラクタム抗
生物質の定性的分析 一定範囲の牛乳サンプルを、標準的な抗菌方法を用いて
β−ラクタム抗生物質の存在について試験した。次い
で、割り当てられた値を有するこれらのサンプルを本発
明のＥＬＩＳＡを用いて試験した。実施例５に記載のよ
うに、マイクロタイタープレートをコーティングし、試
薬を調製した。イムノアッセイ手順を以下のようにして
適合させた。脱脂粉乳を蒸留水に溶解することにより牛
乳緩衝液（ｐＨ７．４）の１％溶液を調製し、この緩衝
液２５μｌをプレートのウェルに添加した。牛乳緩衝液
の添加に続いてアンピシリン標準を加え（１ウェルあた
り２５μｌ）、続いて牛乳サンプル（１ウェルあたり２
５μｌ）をロードした。標準およびサンプルの両方を２
連で行った。次いで、結合体（アンピシリン−ＨＲＰ）
を添加し（１ウェルあたり７５μｌ）、マイクロタイタ
ープレートを３７℃で２時間、競合反応を生じさせるた
めにインキュベートした。競合反応の後、プレートを洗
浄し、実施例５の記載と同様にして発色させた。分析の
結果を表３に示す。これは、記載した一般的なβ−ラク
タムＥＬＩＳＡにより試験した一定範囲の牛乳サンプル
について算出した濃度を示す。記載したβ−ラクタムＥ
ＬＩＳＡを用いて、β−ラクタムの存在に関してネガテ
ィブであることがわかっている牛乳サンプル（サンプル
１〜６）を試験し、ならびにβ−ラクタムポジティブな
サンプル（サンプル７および８）を確認した。ＥＬＩＳ
Ａの結果により、β−ラクタム抗生物質含量に関しては
サンプル１〜６がネガティブであること、ならびにサン
プル７および８がポジティブであることが確認される
（表３を参照のこと）。
生物質の定性的分析 一定範囲の牛乳サンプルを、標準的な抗菌方法を用いて
β−ラクタム抗生物質の存在について試験した。次い
で、割り当てられた値を有するこれらのサンプルを本発
明のＥＬＩＳＡを用いて試験した。実施例５に記載のよ
うに、マイクロタイタープレートをコーティングし、試
薬を調製した。イムノアッセイ手順を以下のようにして
適合させた。脱脂粉乳を蒸留水に溶解することにより牛
乳緩衝液（ｐＨ７．４）の１％溶液を調製し、この緩衝
液２５μｌをプレートのウェルに添加した。牛乳緩衝液
の添加に続いてアンピシリン標準を加え（１ウェルあた
り２５μｌ）、続いて牛乳サンプル（１ウェルあたり２
５μｌ）をロードした。標準およびサンプルの両方を２
連で行った。次いで、結合体（アンピシリン−ＨＲＰ）
を添加し（１ウェルあたり７５μｌ）、マイクロタイタ
ープレートを３７℃で２時間、競合反応を生じさせるた
めにインキュベートした。競合反応の後、プレートを洗
浄し、実施例５の記載と同様にして発色させた。分析の
結果を表３に示す。これは、記載した一般的なβ−ラク
タムＥＬＩＳＡにより試験した一定範囲の牛乳サンプル
について算出した濃度を示す。記載したβ−ラクタムＥ
ＬＩＳＡを用いて、β−ラクタムの存在に関してネガテ
ィブであることがわかっている牛乳サンプル（サンプル
１〜６）を試験し、ならびにβ−ラクタムポジティブな
サンプル（サンプル７および８）を確認した。ＥＬＩＳ
Ａの結果により、β−ラクタム抗生物質含量に関しては
サンプル１〜６がネガティブであること、ならびにサン
プル７および８がポジティブであることが確認される
（表３を参照のこと）。
【００４４】表３に示すＥＬＩＳＡの結果は、このイム
ノアッセイを用いてβ−ラクタムの存在に関して牛乳サ
ンプルを良好にスクリーニングできることを証明してい
る。ＥＬＩＳＡにより試験したネガティブサンプルはネ
ガティブであることが確認され、既知のポジティブサン
プルはポジティブであることが確認された。
ノアッセイを用いてβ−ラクタムの存在に関して牛乳サ
ンプルを良好にスクリーニングできることを証明してい
る。ＥＬＩＳＡにより試験したネガティブサンプルはネ
ガティブであることが確認され、既知のポジティブサン
プルはポジティブであることが確認された。
【００４５】表３
【表３】
【００４６】引用文献
Ｆａｇｈｉｈｉ Ｓｈｉｒａｚｉ Ｍ．、Ｈｕｎｇ Ｔ
Ｖ．、Ｗｏｍｅｒｓｌｅｙ ＤＭ．１９９１．Ｐｏｌｙ
ｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅａｃｔｉｖ
ｅ ｔｏ ｓｏｍｅ Ｂｅｔａ−Ｌａｃｔａｍ ａｎｔ
ｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４６
（２）、８８〜９０。 Ｄｅ Ｈａａｎ Ｐ．、ｄｅ Ｊｏｎｇｅ Ａ．Ｊ．
Ｒ、ＶｅｒｂｒｕｇｇｅＴ．およびＢｏｏｒｓｍａ
Ｄ．Ｍ．、１９８５．Ｔｈｒｅｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｈａｐｔｅｎ ｐ
ｅｎｉｃｉｌｌｉｎ．Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ
ｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎ．７６：４２〜４６。 Ｄｅ Ｌｅｕｗ Ｐ．、Ｋａｐａ Ｇ．およびＰｅｔｚ
Ｍ．、１９９７．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉａ
ｎａｌｙｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ
ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ ｉｎ ｅｇｇ ｙｏｌｋ．
Ｊ．ｏｆ ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ８
０（６）：１２２０〜８。 Ｎａｇａｋｕｒａ Ｎ．、Ｓｏｕｍａ Ｓ．、Ｓｈｉｍ
ｉｚｕ Ｔ．、Ｙａｎａｇｉｈａｒａ Ｙ．、１９９
１．Ａｎｔｉ−ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｔｏ ｖａｒ
ｉｏｕｓ β−ｌａｃｔａｍｓ．Ｊ．ｏｆＡｎｔｉｍｉ
ｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２８：３
５７〜３６８。 Ｕｓｌｅｂｅｒ，Ｅ．、Ｌｏｒｂｅｒ，Ｍ．、Ｓｔｒａ
ｋａ Ｍ．、Ｔｅｒｐｌａｎ Ｇ．、Ｍａｒｔｌｂａｕ
ｅｒ Ｅ．、１９９４．Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｉｓｏｘａｚｏｌｙｌ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｌｋ．Ａｎａｌｙｓ
ｔ、１１９、２７６５−２７６８。
Ｖ．、Ｗｏｍｅｒｓｌｅｙ ＤＭ．１９９１．Ｐｏｌｙ
ｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅａｃｔｉｖ
ｅ ｔｏ ｓｏｍｅ Ｂｅｔａ−Ｌａｃｔａｍ ａｎｔ
ｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４６
（２）、８８〜９０。 Ｄｅ Ｈａａｎ Ｐ．、ｄｅ Ｊｏｎｇｅ Ａ．Ｊ．
Ｒ、ＶｅｒｂｒｕｇｇｅＴ．およびＢｏｏｒｓｍａ
Ｄ．Ｍ．、１９８５．Ｔｈｒｅｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｈａｐｔｅｎ ｐ
ｅｎｉｃｉｌｌｉｎ．Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒ
ｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎ．７６：４２〜４６。 Ｄｅ Ｌｅｕｗ Ｐ．、Ｋａｐａ Ｇ．およびＰｅｔｚ
Ｍ．、１９９７．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃ
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ｎａｌｙｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ
ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ ｉｎ ｅｇｇ ｙｏｌｋ．
Ｊ．ｏｆ ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ８
０（６）：１２２０〜８。 Ｎａｇａｋｕｒａ Ｎ．、Ｓｏｕｍａ Ｓ．、Ｓｈｉｍ
ｉｚｕ Ｔ．、Ｙａｎａｇｉｈａｒａ Ｙ．、１９９
１．Ａｎｔｉ−ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｔｏ ｖａｒ
ｉｏｕｓ β−ｌａｃｔａｍｓ．Ｊ．ｏｆＡｎｔｉｍｉ
ｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２８：３
５７〜３６８。 Ｕｓｌｅｂｅｒ，Ｅ．、Ｌｏｒｂｅｒ，Ｍ．、Ｓｔｒａ
ｋａ Ｍ．、Ｔｅｒｐｌａｎ Ｇ．、Ｍａｒｔｌｂａｕ
ｅｒ Ｅ．、１９９４．Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｉｓｏｘａｚｏｌｙｌ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｌｋ．Ａｎａｌｙｓ
ｔ、１１９、２７６５−２７６８。
【００４７】
【発明の効果】本発明は、置換型または非置換型フェニ
ルジカルボアルデヒドとα−アミノ基で架橋した６−
［Ｄ−α−アミノアセトアミド］ペニシリン誘導体を含
有するハプテンを提供する。さらに、本発明は、抗原性
付与キャリア物質に連結したハプテン、標識物質に結合
した上記のハプテンを含む結合体を含む免疫原、ならび
に上記の免疫原に対して惹起され、そしてインタクトな
β−ラクタム環の構造的エピトープの少なくとも１つと
結合し得る抗体を提供する。本発明はさらに、β−ラク
タム抗体を検出するため、またはその量を決定するため
の方法およびキット、ならびにβ−ラクタム抗体を検出
またはその量を決定するための上記の抗体との結合体の
使用を提供する。本発明は、主な第１世代β−ラクタム
にわたる広範な特異性を有し、そして残存β−ラクタム
抗生物質の存在について牛乳および食肉などを試験する
ために使用することができる。
ルジカルボアルデヒドとα−アミノ基で架橋した６−
［Ｄ−α−アミノアセトアミド］ペニシリン誘導体を含
有するハプテンを提供する。さらに、本発明は、抗原性
付与キャリア物質に連結したハプテン、標識物質に結合
した上記のハプテンを含む結合体を含む免疫原、ならび
に上記の免疫原に対して惹起され、そしてインタクトな
β−ラクタム環の構造的エピトープの少なくとも１つと
結合し得る抗体を提供する。本発明はさらに、β−ラク
タム抗体を検出するため、またはその量を決定するため
の方法およびキット、ならびにβ−ラクタム抗体を検出
またはその量を決定するための上記の抗体との結合体の
使用を提供する。本発明は、主な第１世代β−ラクタム
にわたる広範な特異性を有し、そして残存β−ラクタム
抗生物質の存在について牛乳および食肉などを試験する
ために使用することができる。
【図１】 図１は反応式１に関する。この反応式は、本
発明の免疫原または本発明の結合体を形成するために、
本発明のハプテンを製造し、続いてキャリア物質または
標識薬剤のいずれかに結合させることに関する一般反応
式である。
発明の免疫原または本発明の結合体を形成するために、
本発明のハプテンを製造し、続いてキャリア物質または
標識薬剤のいずれかに結合させることに関する一般反応
式である。
【図２】 図２は、マイクロタイタープレートでの競合
ＥＬＩＳＡ力価アッセイの模式図である。
ＥＬＩＳＡ力価アッセイの模式図である。
【図３】 図３は、競合ＥＬＩＳＡの校正曲線である。
【図４】 図４は、ＥＬＩＳＡにおける標準として各々
のβ−ラクタムペニシリンを用いて作製した校正曲線で
ある。
のβ−ラクタムペニシリンを用いて作製した校正曲線で
ある。
フロントページの続き
(72)発明者 ロバート・アイバン・マッコネル
イギリス、ノーザン・アイルランド、ビー
ティ29・４キューワイ、カウンティ・アン
トリム、クラムリン、ダイヤモンド・ロー
ド、アードモア、ランドックス・ラボラト
リーズ・リミテッド内
(72)発明者 エル・オアード・ベンチク
イギリス、ノーザン・アイルランド、ビー
ティ29・４キューワイ、カウンティ・アン
トリム、クラムリン、ダイヤモンド・ロー
ド、アードモア、ランドックス・ラボラト
リーズ・リミテッド内
(72)発明者 スティーブン・ピーター・フィッツジェラ
ルド
イギリス、ノーザン・アイルランド、ビー
ティ29・４キューワイ、カウンティ・アン
トリム、クラムリン、ダイヤモンド・ロー
ド、アードモア、ランドックス・ラボラト
リーズ・リミテッド内
(72)発明者 ジョン・ビクター・ラモント
イギリス、ノーザン・アイルランド、ビー
ティ29・４キューワイ、カウンティ・アン
トリム、クラムリン、ダイヤモンド・ロー
ド、アードモア、ランドックス・ラボラト
リーズ・リミテッド内
Ｆターム(参考） 4H045 AA11 AA30 CA15 DA75 EA50
FA71
Claims (13)
- 【請求項１】 置換型または非置換型フタルアルデヒ
ド、置換型または非置換型イソフタルアルデヒド、およ
び置換型または非置換型テレフタルアルデヒドからなる
群から選択される置換型または非置換型フェニルジカル
ボアルデヒドとα−アミノ基で架橋した６−［Ｄ−α−
アミノアセトアミド］ペニシリン誘導体を含むハプテ
ン。 - 【請求項２】 フェニルジカルボアルデヒドが置換型ま
たは非置換型テレフタルアルデヒド、好ましくは非置換
型テレフタルアルデヒドである、請求項１に記載のハプ
テン。 - 【請求項３】 置換型または非置換型フェニルジカルボ
アルデヒドを６−［Ｄ−α−アミノアセトアミド］ペニ
シリン誘導体と適切な溶媒中で反応させることを含む、
請求項１または２に記載のハプテンを製造する方法。 - 【請求項４】 抗原性付与キャリア物質に連結された請
求項１または２に記載のハプテンを含有する免疫原。 - 【請求項５】 キャリア物質がタンパク質、タンパク質
フラグメント、合成ポリペプチドまたは半合成ポリペプ
チドである、請求項４に記載の免疫原。 - 【請求項６】 インタクトなβ−ラクタム環の少なくと
も１つの構造エピトープと結合し得る、請求項４または
５に記載の免疫原に対して惹起された抗体。 - 【請求項７】 前記抗体が支持体に固定されている、請
求項６に記載の抗体。 - 【請求項８】 前記方法が、請求項４または５に記載の
免疫原を反復投与することにより動物を免疫感作する工
程、および免疫感作した動物から得られた血清抗体を回
収する工程を含む、請求項６または７に記載の抗体の製
造方法。 - 【請求項９】 前記方法が血清抗体を支持体に固定する
ことをさらに含む、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 検出可能な標識物質に共有結合した請
求項１または２に記載のハプテンを含む結合体。 - 【請求項１１】 前記標識物質が、好ましくはペルオキ
シダーゼ、最も好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ
である酵素、好ましくは生物発光、化学発光または蛍光
物質から選択される発光物質、放射活性物質あるいはそ
れらの混合物から選択される、請求項１０に記載の結合
体。 - 【請求項１２】 サンプルを請求項１０または１１に記
載の結合体またはそれらの混合物と、および請求項６ま
たは７に記載の抗体またはそれらの混合物と接触させる
こと、結合した結合体を検出またはそれらの量を決定す
ること、ならびにサンプル中のβ−ラクタムペニシリン
の存在または量を校正曲線から演繹することを含む、サ
ンプル中のβ−ラクタムペニシリンを検出あるいはその
量を決定する方法。 - 【請求項１３】 β−ラクタムペニシリンを検出あるい
はその量を決定するためのキットであって、請求項１０
または１１に記載の結合体またはそれらの混合物および
請求項６または７に記載の抗体またはそれらの混合物を
含む、キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01202941 | 2001-08-02 | ||
| EP01202941-9 | 2001-08-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003114227A true JP2003114227A (ja) | 2003-04-18 |
Family
ID=8180744
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002226040A Pending JP2003114227A (ja) | 2001-08-02 | 2002-08-02 | β−ラクタムペニシリンを検出、またはその量を決定するための方法およびキット |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6960653B2 (ja) |
| EP (1) | EP1281971B1 (ja) |
| JP (1) | JP2003114227A (ja) |
| CN (1) | CN1223596C (ja) |
| AT (1) | ATE308757T1 (ja) |
| DE (1) | DE60207016T2 (ja) |
| ES (1) | ES2251559T3 (ja) |
| HK (1) | HK1053352B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008536130A (ja) * | 2005-04-14 | 2008-09-04 | ユニセンサー エッス．アー． | 種々の系列の抗生物質の検出および特定を同時に行なうインビトロ方法およびこの方法による分析キット |
| JP2023502360A (ja) * | 2019-11-15 | 2023-01-24 | エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 患者試料における質量分析測定のためのβ－ラクタム抗生物質の誘導体化 |
| JP2024504411A (ja) * | 2021-01-26 | 2024-01-31 | コミサリア ア レネルジー アトミック エ オ ゼネルジー アルテルナティブ | β－ラクタマーゼ酵素活性の検出 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7953779B1 (en) | 2002-10-08 | 2011-05-31 | Trilogy Development Group, Inc. | Configuration representation and modeling using configuration spaces |
| IL163821A0 (en) * | 2004-08-31 | 2005-12-18 | Ravgalai Ltd Rapax Consortium | Software for management of legal motions Methods and kits for the detection of biotoxic andantibiotic residues |
| CN101153871B (zh) * | 2007-10-31 | 2011-05-11 | 江南大学 | 一种β-内酰胺类药物通用人工抗原的合成方法 |
| CN102455361B (zh) * | 2010-10-21 | 2013-10-16 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测β-内酰胺类抗生素的试剂盒及方法 |
| CN102876769A (zh) * | 2011-07-12 | 2013-01-16 | 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 | 一种检测奶粉中β-内酰胺类抗生素的前处理方法及使用其的检测方法 |
| CN103018449B (zh) * | 2011-09-20 | 2016-02-24 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 检测呋喃它酮代谢物的酶联免疫试剂盒及其方法 |
| WO2013053953A1 (en) * | 2011-10-14 | 2013-04-18 | Université de Liège | Method for measuring beta-lactam antibiotics |
| CN103364546B (zh) * | 2012-04-05 | 2016-03-30 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测呋喃唑酮代谢物的试剂盒及方法 |
| CN102827188B (zh) * | 2012-08-25 | 2014-09-10 | 河北农业大学 | 一种青霉素类药物通用半抗原、人工抗原、广谱单克隆抗体及其制备方法与应用 |
| CN104614529B (zh) * | 2015-01-14 | 2017-01-11 | 北京农学院 | 氨苄青霉噻唑酸检测试剂盒和检测方法 |
| CN106053819A (zh) * | 2016-06-12 | 2016-10-26 | 深圳市计量质量检测研究院 | 一种河豚毒素免疫层析检测卡及其应用 |
| CN106526106A (zh) * | 2016-12-07 | 2017-03-22 | 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 | 一种乳品中β‑内酰胺的检测方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US4596768A (en) * | 1983-11-02 | 1986-06-24 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Antibodies for penicilloic acid their preparation and use |
| US5128240A (en) * | 1984-12-20 | 1992-07-07 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Immunological method of measuring unstable analytes using cross-reactive antibodies |
| GB8722470D0 (en) | 1987-09-24 | 1987-10-28 | Blackmore D J | Production of anti-genic protein-hapten conjugates |
| DE4013004C2 (de) * | 1990-04-24 | 1993-10-21 | Elvira Schecklies | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von niedermolekularen organischen Substanzen |
-
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- 2002-07-18 ES ES02077943T patent/ES2251559T3/es not_active Expired - Lifetime
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- 2002-07-18 DE DE60207016T patent/DE60207016T2/de not_active Expired - Lifetime
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-
2003
- 2003-07-24 HK HK03105332.3A patent/HK1053352B/en not_active IP Right Cessation
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