ES2251559T3 - Metodo y kit para la cuantificacion de penicilinas beta-lactamicas. - Google Patents
Metodo y kit para la cuantificacion de penicilinas beta-lactamicas.Info
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Abstract
Un hapteno comprende un derivado de penicilina 6-[D-a-aminoacetamida] entrecruzado al grupo c-amino con un fenildicarbaldehído sustituido o no sustituido seleccionado del grupo que contiene ftalaldehído sustituido o no sustituido, isoftalaldehído sustituido o no sustituido y tereftalaldehído sustituido o no sustituido.
Description
Método y kit para la cuantificación de
penicilinas \beta-lactámicas.
La presente invención está relacionada con un
método y un kit para la detección o la determinación cuantitativa
de penicilinas \beta-lactámicas, así como,
haptenos, inmunogénicos, conjugados y anticuerpos útiles en la
misma.
Por "detección" se entiende el análisis
cualitativo de la presencia o ausencia de una sustancia.
Por "determinación" se entiende el análisis
cuantitativo de la cantidad de una sustancia.
La presente invención pretende tener una amplia
aplicabilidad entre la mayoría de las penicilinas
\beta-lactámicas de primera generación tales como
ampicilina, penicilina G, amoxicilina, cloxacilina, dicloxacilina y
oxacilina, pero no pretende limitarse a estas penicilinas
\beta-lactamicas específicamente.
Habitualmente los antibióticos son empleados en
la crianza de animales para propósitos profilácticos y
terapéuticos. Los antibióticos de la clase
\beta-lactámicos son usados comúnmente en la
industria cárnica y de lácteos, como estimuladores de crecimiento.
Dicha clase, conocida también como penicilina es utilizada en el
tratamiento de mastitis en vacas lecheras, incrementando así el
rendimiento en la producción de leche y la vida productiva de las
vacas. Los \beta-lactámicos también pueden
incluirse en la dieta animal, con el propósito de aumentar el
crecimiento en aves y cerdos. Mediante la prevención de enfermedades
o por razón de la inhibición de la actividad de la flora
intestinal, los antibióticos hacen que los animales alcancen
mejores tamaños más rápidamente para su comercialización que sin el
uso de estimuladores de crecimiento.
Sin embargo, se pueden presentar problemas cuando
los residuos de los \beta-lactámicos están
presentes en productos cárnicos y lácteos. De esta forma la
continua exposición a algunos antibióticos
\beta-lactámicos en humanos también pueden llevar
a una reducción en la eficiencia de algunos medicamentos utilizados
para el tratamiento de enfermedades, debido al desarrollo de
resistencia en las bacterias patógenas. La presencia de
\beta-lactácmicos en alimentos de consumo puede
también ocasionar reacciones alergénicas en humanos sensibles a la
penicilina. Los productos lácteos que contienen esta clase de
antibióticos pueden también interferir en cultivos bacterianos
usados en el proceso.
Como resultado, estrictas directrices han sido
impuestas en toda la Comunidad Europea para estimar el tiempo de
retirada y los niveles máximos recomendados (NMR) de los
\beta-lactámicos en leche y carne. De forma
rutinaria, se obtienen muestras de leche y carne para asegurar que
cumplen con la legislación de la C.E. Varios métodos son usados
para probar la presencia de antibióticos del tipo
\beta-lactámicos. Muchas de estas pruebas se
basan en ensayos de inhibición de crecimiento microbiano, las cuales
demandan tiempo y pueden ser específicas para cada clase de
antibiótico \beta-lactámico. El desarrollo de un
método de detección rápida de \beta-lactámicos
en leche y carne puede ser especialmente
valioso si el método fuera genérico, esto es, si detectara la mayoría, si no todos los antibióticos \beta-lactámicos.
valioso si el método fuera genérico, esto es, si detectara la mayoría, si no todos los antibióticos \beta-lactámicos.
Han sido realizados muchos intentos para
desarrollar anticuerpos en animales sensibles a
\beta-lactámicos, con el objeto de producir un
inmunoensayo para la detección de
\beta-lactámicos en general. La primera etapa de
este proceso es producir un inmunógeno que pueda inducir una
respuesta inmune en el animal huésped. Esto presenta un problema
debido a la incapacidad para que el anillo
b-lactámico permanezca intacto durante su
conjugación con la proteína portadora. Métodos de conjugación
conocidos basados el anillo lactámico abierto se presentan, por
ejemplo, en el documento
US-A-4,347,312,
US-A-5,128,240, en de Haan et
al, 1985 y en Faghihi Shirazi et al, 1991.
Esto conduce a la producción de un antisuero
sensible a la forma abierta del anillo
\beta-lactámico, el cual no necesariamente debe
ser sensible a la estructura genérica del anillo.
Alternativamente, por ejemplo, el grupo carboxilo
libre del anillo \beta-lactámico cerrado puede
ser esterificado, como se expone en el documento
EP-A-309,299 y en Usleber et
al, 1994. Los antisueros producidos, de esta manera, para los
antibióticos \beta-lactámicos conjugados, son
específicos para encadenar el lado acilo y únicamente producir
reacción cruzada con otros antibióticos
\beta-lactámicos si ellos tienen cadenas
laterales similares, como es el caso de la penicilina isoxazolil.
Posteriormente de forma alternativa, la conjugación puede ocurrir
por la vía del grupo 6-amino del ácido
6-aminopenicilámico, como se presenta en el
documento EP-A-309,299 y de Leuw
et al, 1997. En estos casos donde el anillo
\beta-lactámico permanece intacto durante la
conjugación, los anticuerpos despliegan una alta reactividad
cruzada con el principal \beta-lactámico de
primera generación. Un sitio posterior para la conjugación
potencial de la penicilina \beta-lactámica es por
vía del grupo \alpha-amino del grupo de la
penicilina
D-\alpha-aminoacetamida, como se
expone en, por ejemplo, Nagakura et al, 1991. Las líneas
celulares expuestas en Nagakura et al, 1991, Abp4 y Abp7,
involucran haptenos y conjugados que usan un MBS
(maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida)
como encadenador y el documento concluye que una de las líneas
celulares (Abp4) reconoce el anillo de tiazolidina mientras que la
otra línea celular (Abp7) reconoce la cadena lateral acilo. Abp4
reacciona de forma cruzada con penicilina G, ácido
6-aminopenicilánico y ciertas cefalosporinas,
mientras que Abp7 es altamente específica, mostrando una pequeña o
no reactividad cruzada con las principales
\beta-lactámicas de primera generación.
El documento DE 4 013 004 se relaciona por si
misma con el uso de haptenos marcados en ELISA.
La presente invención describe la conjugación de
un hapteno novedoso (derivado de ampicilina) en el grupo a amino
del grupo D-\alpha-aminoacetamida
de la penicilina con un material transportador que le confiere
antigenicidad para producir un inmunógeno.
Describe también como los anticuerpos generados
por este inmunógeno son empleados en el desarrollo de un ensayo
genérico el cual puede ser usado para pruebas en leche y carne y
semejantes para detectar la presencia de antibióticos
\beta-lactámicos.
En un primer aspecto la invención proporciona un
hapteno que comprende un enlace cruzado de penicilina derivada
6-[D-\alpha-aminoacetamida] en el
grupo a-amino con un fenildicarbaldehído sustituido
o no sustituido seleccionado del grupo que consiste en ftalaldehído
sustituido o no sustituido, un isoftalaldehído sustituido o
insustituido y un tereftalaldehído sustituido o insustituido.
Una penicilina derivada
6-[D-\alpha-aminoacetamida]
representativa tiene la siguiente fórmula estructural:
\vskip1.000000\baselineskip
Y el sitio de la conjugación es identificado por
una flecha.
Preferiblemente el fenildicarbaldehído es un
sustituido o insustituido tereftalaldehído, de preferencia un
insustituido tereftalaldehído. Las sustituciones apropiadas incluyen
la adición de los grupos funcionales aldehído, tioisocianato y
N-hidroxisuccinamida en la posición orto y para.
Los haptenos son preparados haciendo reaccionar
un fenildicarbaldehído sustituido o no sustituido con una
penicilina derivada
6-[D-\alpha-aminoacetamida] en un
solvente adecuado, del cual son ejemplos apropiados la
dimetilformamida y el dimetilsulfóxido.
Por otra parte, en la presente invención se
relaciona con un inmunógeno comprometiendo el hapteno de la
presente invención encadenado a un material transportador que le
confiere antigenicidad. Preferiblemente el material transportador
es una proteína, un fragmento de proteína, un polipéptido sintético
o un polipéptido semisintético.
En un aspecto aun adicional, la presente
invención se relaciona con anticuerpos producidos en contra del
inmunógeno de la presente invención, siendo capaces los anticuerpos
de conectar con por lo menos un epítope estructural de un anillo
\beta-lactámico intacto. Preferiblemente, los
anticuerpos son fijados a un sustrato de refuerzo.
La invención también proporciona un proceso de
preparación de los anticuerpos, comprendiendo el proceso los pasos
de inmunización de animales no-humanos,
preferiblemente un animal vertebrado y aún más preferiblemente un
mamífero, mediante la administración repetida de un inmunógeno de la
presente invención; y recolectando los anticuerpos en el suero
resultante proveniente del animal inmunizado. De preferencia el
proceso también comprende la fijación de anticuerpos de dicho suero
en un sustrato de refuerzo, preferiblemente un soporte sólido, más
preferiblemente aun un soporte sólido de poliestireno. Los
anticuerpos son policlonales preferiblemente. Los anticuerpos
pueden ser monoclonales alternativamente.
Además, la presente invención comprende un
conjugado comprimido de hapteno de la presente invención enlazado
covalentemente por un agente detectable marcado. Preferiblemente, el
agente marcado es seleccionado de una enzima, una sustancia
luminiscente, una sustancia radiactiva o mezcla de las dos.
Preferiblemente, el agente marcado es una enzima, preferiblemente
una peroxidasa, se prefiere aún más una peroxidasa de rábano
picante (PRP). Alternativamente o adicionalmente, la sustancia
luminiscente puede ser un material bioluminiscente o
quimioluminiscente o fluorescente.
Por otra parte, la presente invención comprende
un método para la detección o la determinación cuantitativa de
penicilina \beta-lactámica en una muestra,
comprendiendo el método el contacto de la muestra con el conjugado
de la presente invención o una mezcla de éste, y con los anticuerpos
de la presente invención o una mezcla de éstos; detectando o
determinando la cantidad de conjugado ligado; y deduciendo de una
curva de calibración la presencia o la cantidad de penicilina
\beta-lactámica en la muestra.
Los anticuerpos son policlonales
preferiblemente.
Por otra parte la invención incluye un kit para
la detección o determinación cuantitativa de penicilina
\beta-lactámica, incluyendo el kit el conjugado
de la presente invención, o una mezcla de éstos, y los anticuerpos
de la presente investigación o una mezcla de los mismos. El kit
puede incluir opcionalmente instrucciones para el uso de dicho
conjugado(s) y dichos anticuerpos para la detección o
determinación cuantitativa de penicilina
\beta-lactámica en una muestra.
Preferiblemente, la muestra es una solución, tal
como un fluido biológico, incluyendo leche; o un corte de tejido
celular, como carne.
En el método y el kit de la presente invención
los respectivos entrecruzadores (del inmunógeno y el conjugado),
entrecruzados la posición a-amina, pueden ser los
mismos o diferentes.
Por otra parte, la presente invención involucra
el uso de conjugados de acuerdo con la presente invención o una
mezcla de ellos, con los anticuerpos o una mezcla de éstos de
acuerdo con la presente invención, para analizar muestras tales
como leche o carne, para detectar o determinar la cantidad de
antibióticos \beta-lactámicos.
La presente invención se refiere a haptenos
novedosos, los cuales son empleados en la preparación de
inmunógenos novedosos por conjugación con material transportador
convencional que le confiere antigenicidad. El inmunógeno
resultante es luego administrado a animales, preferentemente
huéspedes vertebrados, prefiriéndose aun más huéspedes mamíferos,
para obtener unos antisueros policlonales ávidos los cuales luego
serán usados para desarrollar un inmunoensayo genérico para las
penicilinas \beta-lactámicas, empleando un
conjugado (agente hapténico marcado), o una mezcla de ellos, como
reactivo de detección.
En la siguiente tabla están resumidas las
estructuras químicas de la ampicilina y de otras penicilinas
\beta-lactámicas, teniendo en cuenta la fórmula
estructural expuesta abajo:
| Estructuras Químicas de las penicilinas \beta-Lactámicas | |
| Penicilina | R |
| Penicilina G | PhCH_{2}CO |
| Penicilina v | PhOCH_{2}CO |
| Ampicilina | D-PhCH(NH2)CO |
| Amoxicilina | D-(p-Hidroxi)PhCH(NH2)CO |
| Oxacilina | 5-metil-3-fenil-4-isoxazolil-carbonil |
| Cloxacilina | 5-metil-3-(O-chlorofenil)-4-isoxazolil-carbonil |
| Dicloxacilina | 5-metil-3-(O,O'-diclorofenil)-4-isoxazolil-carbonil |
| Ácido 6-Aminopenicilanico | H |
El enfoque de la presente invención es la
preparación de anticuerpos específicos para la totalidad de las
penicilinas \beta-lactámicas. Con el fin de lograr
esta amplia especificidad, la ampicilina es derivatizada a través
del grupo amino empleando un entrecruzador bifuncional tal como un
fenildicarbaldehído sustituido o no sustituido, de preferencia el
tereftalaldehído sustituido o no sustituido (en la figura 1 de los
dibujos acompañantes se muestra el tereftalaldehído no
sustituido).
El anillo b-lactámico de la
ampicilina se conserva durante la derivatización para asegurar que
sean retenidos los epítopes comunes al grupo de la penicilina.
Aunque el hapteno (ampicilina derivada) de la
presente investigación proporciona un epítope estructural definido,
no es en sí mismo inmunogénico y por esto debe ser conjugado con un
adecuado material transportador que le confiera antigenicidad, así
el inmunógeno formado de esta manera podrá lograr una respuesta
inmunogénica cuando se inyecta a un animal huésped. El adecuado
material transportador que le confiere antigenicidad incluye
proteínas y fragmentos de proteína tales como albúminas, proteínas
séricas ejemplo: globulinas, proteínas de lente ocular y
lipoproteínas. Una proteína transportadora ilustrativa incluye
albúmina de suero bovino, ovalbúmina de huevo, gama globulina
bovina, globulina ligada de tiroxina, hemocianina de lapa de
cerradura, etc. Alternativamente, pueden ser empleados los
poli(amino ácidos) sintéticos que tienen un número
suficiente de grupos amino disponibles tales como la lisina ya que
puede que otros materiales poliméricos sintéticos o naturales
soporten grupos funcionales reactivos. En particular,
carbohidratos, levaduras o polisacáridos pueden ser conjugados con
los haptenos para producir un inmunógeno de la presente
invención.
El hapteno (ampicilina derivada) es conjugado
también por un agente marcador como una enzima (por ejemplo,
peroxidasa de rábano picante), una sustancia fluorescente o una
sustancia radioactiva para producir un reactivo de detección para
usar en el inmunoensayo. La sustancia fluorescente puede ser, por
ejemplo, un residuo monovalente de fluoresceína o un derivado de
ésta.
La preparación del hapteno y su conjugación tanto
del material transportador como del agente marcador (por ejemplo
Enzima u otro marcador) se lleva a cabo de acuerdo con el Esquema de
la Reacción 1 como se muestra en la figura 1. Así, por ejemplo, la
ampicilina reacciona con tereftalaldehído en dimetilformamida a
temperatura ambiente durante 18 horas para producir una base
intermedia Schiff.
El intermedio se reacciona con los materiales
transportadores (por ejemplo, seroalbúmina bovina) o con el agente
marcador (p. Ej. Enzima u otro marcador) en una solución tampón de
acetato a un pH 4-5 y posteriormente la base Schiff
se reduce con, por ejemplo, cianoborohidruro de sodio para ceder ya
sea al inmunógeno de la presente invención o al conjugado de la
presente invención, respectivamente.
Con el fin de confirmar que se ha alcanzado la
conjugación adecuada del hapteno con el material transportador,
antes de la inmunización, cada inmunógeno ha sido evaluado usando un
espectrómetro de masas de desorción/ionización UV láser asistido
por matriz, (MALDI MS). En el caso de un material transportador
preferido, la seroalbúmina bovina, son preferibles un mínimo de 6
moléculas transportadoras por hapteno.
Con el fin de generar un antisuero policlonal, el
inmunógeno es mezclado con el Adyuvante de Freund y la mezcla es
inyectada a un animal huésped, tal como un conejo, oveja, ratón,
cerdo de Guinea o caballo. Se realizan inyecciones posteriores y
el suero se muestrea para evaluar el título del anticuerpo. Cuando
el título óptimo ha sido alcanzado, el animal huésped es marcado
para luego obtener el adecuado volumen de antisuero específico. El
grado de purificación requerido del anticuerpo depende de la
aplicación que se le quiera dar. Para muchos propósitos, no se
requiere toda su purificación, sin embargo, en otros casos, tales
como cuando el anticuerpo ha sido inmovilizado en un soporte
sólido, los pasos de la purificación deben ser dados para remover
el material no deseado y reducir o eliminar el ligador no
específico.
Los anticuerpos generados con ampicilina son
útiles como reactivos en ensayos bioquímicos para determinar la
presencia de penicilinas \beta-lactámicas en
fluidos biológicos tales como la leche y productos alimenticios
tales como la carne.
en las figuras:
La Figura 1 muestra el Esquema de la Reacción 1,
el cual es el esquema de la reacción general de acuerdo con la
presente invención para la preparación de un hapteno y de su
subsiguiente conjugación con un material transportador o un agente
marcador, para formar un inmunógeno de acuerdo con la presente
invención o un conjugado de acuerdo con la presente
investigación.
La Figura 2 ilustra esquemáticamente un ensayo de
valoración competitivo de ELISA sobre una placa de
microvaloración.
La Figura 3 es una curva calibración para una
ELISA competitiva; y
La Figura 4 es una curva de calibración generada
empleando cada penicilina beta-lactámica como un
patrón en un ELISA.
Se adicionaron 183 mg (1.364 mmoles) de
terefthalaldehído con corriente de nitrógeno a una solución de 500
mg (1.24 mmole) de trihidrato de ampicilina en 10 µl de
dimetilformaldehído a 20ºC. La mezcla fue protegida de la luz y
agitada durante 24 horas a temperatura ambiente. Para confirmar si
la reacción fue completa, se determinó por medio de una
cromatografía de capa fina (CCF) (80% cloroformo, 20% metanol v/v)
la cual muestra la no presencia de material inicial y la formación
de una nueva mancha menos polar que la ampicilina. La solución de
hapteno se guardo en nitrógeno a -20ºC (solución estable por 1
año).
La solución de hapteno preparada en el ejemplo 1
se adicionó a una solución de 200 mg de suero de seroalbúmina
bovina (BSA) en 10 \mul de solución tampón 0.1 M de acetato de
sodio, pH 4.1. La mezcla se protegió de la luz y se agito durante
4 horas a temperatura ambiente. La reducción de la base Schiff se
cumplió con la adición de 30 mg cianoborohidruro de sodio.
La mezcla se agitó por 90 minutos y luego se
adicionaron 5 mg de borohidruro de sodio. Después de agitarse por
algo más de 10 minutos, la mezcla fue dializada contra una solución
tampón fosfato salina, a un pH 7.2, a 4ºC por 24 horas (3
cambios). El grado de conjugación del hapteno con el BSA fue
evaluada por MALDI MS, el cual reveló una proporción de conjugación
de 6.3 de moléculas de hapteno por una molécula de BSA.
La conjugación del hapteno con HPR del ejemplo 1
fue llevada a cabo de una manera similar a la descrita para la
preparación del inmunógeno. 40 \mul de solución de hapteno
preparado en el ejemplo 1 se adicionaron a 20 mg PRP (peroxidasa
de rábano picante) en 2 \mul de solución tampón acetato de sodio
0.1 M con un pH entre 4-5. La mezcla se mantuvo
protegida de la luz agitándose durante 4 horas a temperatura
ambiente. Se adicionaron (0.7 mg) de Cianoborohidruro de sodio a la
mezcla y se agitaron por 90 minutos. El conjugado fue purificado
usando dos columnas PD-10 (Pharmacia Biotech) y
dializado durante la noche, protegida de la luz, contra agua
doblemente desionizada a una temperatura de
2-8ºC.
Una solución acuosa del inmunógeno del ejemplo 2
fue formulada con el Adyuvante Completo de Freund (FCA) hasta
formar una emulsión consistente en 2 mg/ml de inmunógeno en 50%
(v/v) FCA. Tres ovejas fueron inmunizadas con 0.25 \mul de esta
emulsión, siendo inyectados subcutáneamente en cuatro lugares en el
flanco de cada animal. Subsecuentes inmunizaciones (refuerzos) que
contenían 1mg/µl de inmunógeno emulsificado en 50% (v/v) Adyuvante
Incompleto de Freund (FIA) y que fueron administradas de la misma
manera cada mes por un año. Se tomaron muestras de sangre desde
los 7 a 14 días después de cada refuerzo.
Cada muestra fue procesada para obtener el
antisuero el cual fue luego purificado por precipitación de ácido
caprílico y de sulfato de amonio para obtener una fracción de
inmunoglobulina G (IgG). La fracción de IgG fue evaluada por una
microvaloración de ELISA competitiva en placa, como se describe más
adelante.
Una valoración en forma de tablero de ajedrez fue
realizada para determinar las optimas concentraciones de capturas
de anticuerpos de conjugados (ampicilina HRP). Se prepararon
diluciones seriales de la fracción de IgG de cada antisuero para
ser analizado (se preparan de acuerdo con el ejemplo 4) en Tris 10
mM, pH 8.5. Los pocillos de la placa de microvaloración de una
placa de microtitulación de poliestireno de 96 pozos de
enlazamiento mejorado fueron cubiertos con esta dilución (como se
muestra en la figura 2) por incubación a 37ºC durante 2 horas (125
\mul/pocillo). La placa fue lavada 4 veces con Tris solución
Tampón salina (pH 7.4) con Tween 20 Trade Mark) (TBST) y secada. Se
adicionan 50 µl de solución de ampicilina 10 ng/ml (rango medio de
ensayo) en TBST al pocillo adecuado (Figure 2). Se adicionan 50 µl
de TBST al pocillo remanente (control). Se preparan diluciones
seriales del conjugado (ampicilina-HRP) en Tris
solución Tampón a pH 7.2 con EDTA, D-manitol,
sacarosa, timerosal y BSA y se adicionan 75 \mul de cada dilución
a los pocillos, como se muestra en la figura 2. La placa se incuba
a 37ºC durante 2 horas. El exceso de conjugado desligado fue
removido con lavados en 6 series de 10 minutos con TBST. En cada
pocillo de la placa se adicionan 125 \mul de la solución sustrato
de tetrametilbenzidina (TMB), la cual luego se incuba en la
oscuridad durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente. La
reacción se termina adicionando 125 \mul 0.2 M H2SO4 en cada
pocillo. Se mide la absorbancia a 450 nm usando un lector de placa
de microvaloración. Una dilución de 1/1000 de anticuerpo capturado
en combinación con una dilución del conjugado 1/15000 produce una
absorbancia superior aceptable de 2.15 y una significante caída en
la absorbancia entre las concentraciones de 0 y 10 ng/ml al 80% de
antígeno.
Luego se cubrió una placa de microvaloración con
la fracción IgG de un antisuero de antipenicilina a la dilución de
llenado óptimo 1/1000 en Tris, pH 8.5, como se describe arriba. Se
prepara una solución estándar de ampicilina (sal de sodio) en TBST
y se aplica en las siguientes concentraciones: 0, 1, 5, 10, 50,
100, 200, 500 ng/ml. Los datos generados dan como resultado una
sensible curva de calibración, ilustrada en la figura 3 donde B es
la absorbancia medida a 450 nm por xng/ml de ampicilina y B0 es la
absorbancia medida a 450 nm para 0 ng/ml de ampicilina.
Se preparan soluciones patrón de benzilpenicilina
(penicilina G-PenG), amoxicilina (Amox),
cloxacilina (Clox), dicloxacilina (Diclox) y oxacilina (Oxa) en
TBST a 0, 1, 5, 10, 50, 100, 200 y 500 ng/ml. Se hace una curva de
Calibración empleando cada patrón de penicilina
\beta-lactámica en el inmunoensayo de ampicilina
(Figura 4) y estas son usadas para determinar la reactividad
cruzada del inmunoensayo con cada penicilina. Los resultados de
este estudio se presentan en la tabla 2, la reactividad cruzada se
calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:
% CR =
IC50_{amp}/IC50_{pen}X100
Donde %CR es el porcentaje de reactividad
cruzada, IC50amp es la concentración de ampicilina la cual causa
un 50% de desplazamiento en la señal y IC50pen es la concentración
de penicilina \beta-lactámica, para la cual %CR
esta siendo evaluado, la cual causa un 50% de desplazamiento de la
señal.
El inmunoensayo de ampicilina muestra un nivel
alto de reactividad cruzada con cada una de las penicilinas
\beta-lactámicas (Tabla 2). Por un nivel alto de
reactividad cruzada se entiende una reactividad cruzada mayor que
el 35%, relativa al 100% para la ampicilina.
El inmunoensayo presente es más específico para
ampicilina (100% CR), amoxicilina (87% CR) y benzilpenicilina (72%
CR). Puesto que los niveles máximos recomendados (NMR) para
amoxicilina, ampicilina y benzilpenicilina en leche son 4 mg/kg y
para oxacilina, cloxacilina y dicloxacilina son 30 mg/kg, los
valores IC50 determinados para cada penicilina
\beta-lactámica sugeridos en el ELISA descrito son
adecuados para el uso en el inmunoensayo genérico para
antibióticos \beta-lactámicos en cumplimiento con
la norma CE, 2377/90.
| Inmunoensayo de reactividad cruzada de la ampicilina con penicilinas \beta-lactámicas | |||||||||
| \beta-lactam | Ensayo 1 | Ensayo 2 | Ensayo 3 | Resultados | MRLs | ||||
| Promedio | \mug/Kg | ||||||||
| IC50 | %CR | IC50 | %CR | \beta- | %CR | IC50 | %CR | ||
| ng/ml | ng/ml | lactama | ng/ml | ||||||
| Amp | 1.7 | 100 | 100 | 2.5 | 100 | 2.2 | 100 | 4 | |
| Amox | 1.8 | 94 | 3.0 | 83 | 3.0 | 83 | 2.6 | 87 | 4 |
| PenG | 63 | 3.2 | 78 | 3.4 | 74 | 3.1 | 72 | 4 | |
| Oxa | 4.0 | 42.5 | 7.0 | 36 | 6.6 | 38 | 5.9 | 39 | 30 |
| Cloxa | 3.4 | 50 | 5.8 | 43 | 5.8 | 43 | 5 | 45 | 30 |
| Dicloxa | 3.8 | 45 | 6.0 | 42 | 4.9 | 51 | 4.9 | 46 | 30 |
Un rango de muestras de leche fueron probadas
para la presencia de antibióticos
\beta-lactámicos usando un método antimicrobiano
estándar. Estas muestras con valores asignados fueron luego
analizadas usando el ELISA presente. Las placas de microvaloración
se cubrieron y los reactivos se prepararon como se describe en el
ejemplo 5. El procedimiento del inmunoensayo se adapto como sigue.
Una solución al 1% de leche tampón a pH 7.4 se prepara disolviendo
leche en polvo desnatada en agua destilada y se adicionan 25 µl de
esta solución tampón a los pocillos de las placas. Siguiendo la
adición de la solución tampón de leche, patrones de ampicilina son
cargados (25 \mul por pocillo), después la muestras de leche (25
\mul por pocillo). Ambos patrones y muestras son corridos por
duplicado. Luego fue adicionado el conjugado
(ampicilina-HRP) (75 \mul por pocillo), y la
placa de microvaloración incubada por 2 horas a 37ºC para que la
reacción de competencia se lleve a cabo. Después de la reacción de
competencia, la placa es lavada y revelada usando el mismo
procedimiento como se describe en el Ejemplo 5. Los resultados del
análisis se muestran en la tabla 3, la cual muestra las
concentraciones calculadas para el rango de muestras de leche por
el ELISA genérico para \beta-lactámicas descrito.
El ELISA genérico para \beta-lactámicas descrito
fue usado para analizar muestras de leche las cuales eran negativas
para la presencia de \beta-lactámicos (muestras
1-6), también muestras confirmadas positivas para
\beta-lactámicos (muestras 7 y 8). Los resultados
de ELISA confirmaron que las muestras 1-6 son
negativas y que las muestras 7 y 8 son positivas para el contenido
de antibióticos \beta-lactámicos (ver tabla
3).
El resultado del ELISA, se muestra en la tabla 3,
demostrando que el inmunoensayo puede ser usado con éxito para
examinar muestras de leche para la presencia de
\beta-lactámicos. Muestras negativas analizadas
por ELISA fueron confirmadas como negativas, y muestras positivas
fueron confirmadas como positivas.
| Muestras de Leche | Absorbancia | CV % | Concentración |
| Calculada (ng/ml) | |||
| 1 | 1.906 | 2.2 | Negativa |
| 2 | 1.826 | 1.7 | Negativa |
| 3 | 2.083 | 1.6 | Negativa |
| 4 | 1.857 | 0.1 | Negativa |
| 5 | 1.754 | 3.1 | Negativa |
| 6 | 1.719 | 0.9 | Negativa |
| 7 | 0.718 | 9.0 | 126.19 |
| 8 | 0.914 | 7.8 | 66.79 |
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Claims (13)
1. Un hapteno comprende un derivado de penicilina
6-[D-\alpha-aminoacetamida]
entrecruzado al grupo \alpha-amino con un
fenildicarbaldehído sustituido o no sustituido seleccionado del
grupo que contiene ftalaldehído sustituido o no sustituido,
isoftalaldehído sustituido o no sustituido y tereftalaldehído
sustituido o no sustituido.
2. Un hapteno de acuerdo con la primera
reivindicación, en el cual el fenildicarbaldehído es un
tereftalaldehído sustituido o no sustituido, se prefiere un
tereftalaldehído no sustituido.
3. Un proceso para preparar un hapteno de acuerdo
con la reivindicación 1 ó 2, donde un fenildicarbaldehído
sustituido o no sustituido reacciona con un derivado de penicilina
6-[D-\alpha-aminoacetamida] en un
solvente adecuado.
4. Un inmunógeno comprende un hapteno de acuerdo
con la reivindicación 1 ó 2 ligado a un material transportador que
le confiere antigenicidad.
5. En un inmunógeno de acuerdo con la
reivindicación 4, donde el material transportador es una proteína,
un fragmento de proteína, un polipéptido sintético, o un
polipéptido semisintético.
6. Los anticuerpos producidos contra un
inmunógeno de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, donde los
anticuerpos son capaces de vincular por lo menos un epítope
estructural de un anillo \beta-lactámico
intacto.
7. Los anticuerpos de acuerdo con la
reivindicación 6, donde los anticuerpos son fijados a un sustrato
de refuerzo.
8. Un proceso de preparación de anticuerpos de
acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, el proceso comprende los
pasos de inmunización en un animal no humano por administraciones
repetidas de un inmunógeno de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5,
y posterior recolección del suero con anticuerpos provenientes del
animal inmunizado.
9. En un proceso de acuerdo con la
reivindicación, donde el posterior proceso comprende la citada
fijación de los anticuerpos del suero a un sustrato de
refuerzo.
10. Un conjugado comprende un hapteno de acuerdo
con la reivindicación 1 ó 2 unido covalentemente a un agente
marcador el cual es detectable.
11. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación
10, donde el agente marcador es seleccionado de una enzima, la
cual es preferiblemente una peroxidasa, más preferible aún la
peroxidasa del rábano picante; una sustancia luminiscente la cual
es preferiblemente seleccionada de una sustancia bioluminiscente,
quimioluminiscente o fluorescente; una sustancia radioactiva, o una
mezcla de estas.
12. Un método para la detección o determinación
cuantitativa de penicilina \beta-lactámica en una
muestra, el método debe comprender el contacto entre la muestra y
el conjugado de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, o una
mezcla de ellas y con los anticuerpos de acuerdo con la
reivindicación 6 ó 7 o una mezcla de ellos; detectando o
determinando la cantidad del conjugado ligado; y deduciendo la
presencia o la cantidad de penicilina
\beta-lactámica en la muestra de la curva de
calibración.
13. Un kit para la detección o determinación
cuantitativa de, penicilina \beta-lactámica, el
kit incluye un conjugado de acuerdo a la reivindicación 10 u 11, o
una mezcla de ellos, y anticuerpos de acuerdo con la reivindicación
6 ó 7 o una mezcla de ellos.
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