JP2003144141A - ＲＮＡｉ効果が増強したＥＳ細胞 - Google Patents

ＲＮＡｉ効果が増強したＥＳ細胞

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 個体での遺伝子機能解析に用いることが可能
な、ＲＮＡｉ効果が増強されたＥＳ細胞並びに哺乳動物
個体を取得すること。 【解決手段】 ＥＳ細胞に遺伝子操作を施すことにより
得られる、増強したＲＮＡｉ効果を有するＥＳ細胞。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＲＮＡｉ効果が増
強したＥＳ細胞、より詳細には、ＥＳ細胞に遺伝子操作
を施すことにより得られる増強したＲＮＡｉ効果を有す
るＥＳ細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】これまで、個体レベルにおけるＤＮＡの
機能解明においては、遺伝子ノックアウト動物を作成
し、その表現系を解析するという方法で行われてきた。
しかしながら、このノックアウト法は多大な労力と時間
がかかり、数多くの遺伝子機能解析には実用的ではな
い。従って、これまでのノックアウト法より有効かつ簡
便な、動物個体での遺伝子機能抑制方法を開発すること
が望まれている。
【０００３】ＲＮＡｉ（RNA interference）とは、ある
遺伝子（標的遺伝子とも称する）の一部をコードするｍ
ＲＮＡの一部を二本鎖にしたＲＮＡ（double stranded
RNA：dsRNA）を細胞へ導入すると、標的遺伝子の発現が
抑制される現象を言う。１９９８年、生体内へのＤｓＲ
ＮＡの導入が導入遺伝子と同じ遺伝子の発現に対して抑
制作用を持つことが、線虫において発見された（Fire e
t al., Nature, 391, 806-811, 1998）。
【０００４】その後、ＲＮＡｉは、真菌類、植物Nicoti
ana tabaccumとOryza sativa、プラナリア、トリパノソ
ーマTrypanosoma brucei（Ngo, H., Tschudi, C., Gul
l, K., and Ullu, E.）、ハエDrosophila melanogaster
（Kennerdell and Carthew, 1998）及び脊椎動物である
ゼブラフィッシュでも観察され、ＲＮＡｉは種を越えて
普遍的に存在する現象であると考えられるようになっ
た。
【０００５】ＲＮＡｉの技術的応用については、線虫に
おいて、遺伝子ノックアウト技術として確立し、線虫全
ゲノム配列決定計画により得られた全塩基配列情報を用
いたゲノム機能解析の主要な手段として利用されている
（Fraser et al., Nature, 408, 325-330, 2000; Goncz
y et al., Nature 408, 331-336, 2000）。哺乳動物の
ゲノム機能解析においても，遺伝子ノックアウトより時
間的、労力的に負担の少ない方法として、効率的な遺伝
子発現抑制の方法として期待されている。
【０００６】哺乳類では、マウスの初期胚（wianny and
Zernikca-Goetz, Nature Cell Biol., 2, 70-75, 200
0）にｄｓＲＮＡをインジェクションする実験おいてＲ
ＮＡｉ効果が初めて報告されたが、その効果は初期胚に
限られ、誕生した時にはＲＮＡｉ効果が消失していた。
この理由としては、１細胞期受精卵に導入したｄｓＲＮ
Ａが胚の分割増殖に依存して希釈され、ＲＮＡｉに必要
な濃度を維持できなくなっていると考えられているが、
その他、哺乳類には生物学的に線虫と異なるメカニズム
が存在する可能性もある。
【０００７】本発明者らは、導入したｄｓＲＮＡの細胞
内濃度を維持することを目的として、逆向き反復配列を
含む遺伝子を哺乳類発現ベクターの下流に連結した遺伝
子を構築し、受精卵へ導入し、胚をマウス卵管へ移植す
ることによりｄｓＲＮＡ発現ベクター遺伝子導入マウス
を作成した。このマウスにおいては、標的遺伝子発現の
抑制された表現型を示す個体が観察されたが、その取得
効率は数％であり、ＲＮＡｉ効果を用いてマウス個体に
おいて遺伝子機能解析を行うためにはさらなる改良が望
まれる。
【０００８】ＲＮＡｉ関連遺伝子を同定する試みとして
は、線虫のＲＮＡｉに対する感受性を欠く変異体を選択
することにより、４つのＲＮＡｉ関連遺伝子座、rde-1
〜rde-4（rde；RNA intereference-deficient）が同定
された。Rde-1遺伝子は1,020個のアミノ酸からなる蛋白
質（RDE-1）をコードする。線虫のゲノム中には少なく
とも22個のrde-1遺伝子に相同な塩基配列を持つ遺伝子
があり、遺伝子ファミリーを形成しいている。それらは
アラビドシスのzwille（= pinhead）やargonaute1、シ
ョウジョウバエのstingやpiwi、ウサギのeIF2C遺伝子と
も相同性を示す。
【０００９】ＲＮＡｉ関連遺伝子を同定するもう一つの
方法として、既存の線虫突然変異株に対するＲＮＡｉ感
受性が調べられた。その結果、２つのミューテーター株
（トランスポゾン転移頻度が高くなるような変異を持つ
株）mut-2とmut-7においては、主として生殖系列におけ
るＲＮＡｉの活性が顕著に減少していることがわかっ
た。Mut-7産物の配列はバクテリアのRnaseDやヒトのWer
ner-syndrome蛋白質3',5'ヌクレアーゼドメインと相同
性を示す。いくつかの実験より、ＲＮＡｉにおけるｍＲ
ＮＡの分解は、mut-7産物をはじめとする多くの蛋白質
を含む複合体の触媒作用によって起こる可能性が示唆さ
れている。
【００１０】このほかに線虫においては、卵形成異常を
示すego-1変異体の原因遺伝子がＲＮＡｉにおいても重
要な役割をはたしていることが示唆されている。EGO-1
蛋白質はトマトのRNA-directed RNA polymerase（RdR
P）やアカパンカビのgene quellingに働くQDE-1と相同
な配列を持つ。
【００１１】さらに、HannonらはショウジョウバエのRN
aseIIIファミリーに属するヌクレアーゼの一つがdsRNA
を22ヌクレオチドのRNA断片に切断する活性を持ち、Ｒ
ＮＡｉの活性に必要であることを報告している。Dicer
と名付けられたこのヌクレアーゼは2つのRNaseIIIモチ
ーフとN末端にヘリカーゼドメインを持つ。DicerにはRN
aseIIIモチーフのほかにPAZドメインと呼ばれる領域が
ある。PAZドメインはＲＮＡｉに関与することが予想さ
れるいくつかの因子（Piwi, Argo,Zwille/Pinhead）に
共通に含まれる。その機能は今のところ明らかになって
いないが、蛋白質-蛋白質相互作用に働くものと考えら
れている。上記の通り、ＲＮＡｉに関与する因子の報告
はあるが、それらを実際に利用してＲＮＡｉ効果を生体
内で増強したという報告はない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、個体での遺
伝子機能解析に用いることが可能な、ＲＮＡｉ効果が増
強されたＥＳ細胞並びに哺乳動物個体を取得することを
解決すべき課題とした。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討し、より高いＲＮＡｉ効果を導
き出すことを目的として培養細胞（ＥＳ細胞）を用いて
ＲＮＡｉ効果の検討を行った。まずは、ＥＳ細胞におい
てＲＮＡｉ効果を確認し、その後、ＲＮＡｉ効果の高感
受性化の達成を図ることとした。
【００１４】具体的には、先ず、ニワトリベータグロビ
ン遺伝子インスレーター配列の一部（２４０塩基対）、
ＣＭＶエンハンサー、ヒトＥＦ１αプロモーターの下流
に種々のＲＮＡｉに関与する遺伝子を連結し、その後に
ＳＶ４０ポリＡ付加シグナルを持ち、さらにｌｏｘＰ配
列ではさんだピューロマイシン耐性遺伝子を構築した。
そして、この遺伝子をＥＧＦＰ発現ＥＳ細胞株へ導入し
た。この細胞株を用いてＥＧＦＰｄｓＲＮＡ発現遺伝子
の一過性発現時におけるＥＧＦＰ蛍光を検討したとこ
ろ、ＲＮＡｉ関連遺伝子導入前のコントロールＥＳ細胞
株と比較して、ＥＧＦＰ蛍光が減少した細胞群の比率が
上昇することを見い出した。即ち、本発明者らは、ＲＮ
Ａｉに関与する遺伝子を導入したことにより、ＲＮＡｉ
高感受性ＥＳ細胞株を取得することに成功し、本発明を
完成するに至った。
【００１５】さらに、このＲＮＡｉ高感受性ＥＳ細胞株
をマウスブラストシスト胚に導入し、子宮へ移植すると
いう常法に従い、トランスジェニックマウスを作成し
た。このトランスジェニックマウスはＲＮＡｉ高感受性
であり、ＥＧＦＰ蛍光の減少がより強く観察されるもの
である。即ち、本発明により作製したＲＮＡｉ高感受性
ＥＳ細胞は、マウスブラストシスト胚へ導入することに
より、そのＥＳ細胞の性質を持つマウス個体の作成が可
能である。
【００１６】即ち、本発明によれば、ＥＳ細胞に遺伝子
操作を施すことにより得られる、増強したＲＮＡｉ効果
を有するＥＳ細胞が提供される。本発明の好ましい態様
によれば、ＥＳ細胞にＲＮＡｉ関連遺伝子を導入するこ
とにより得られるＥＳ細胞；ＲＮＡｉ関連遺伝子が、配
列特異的な中間体の形成に関与する因子をコードする遺
伝子、標的遺伝子発現抑制段階に関与する因子をコード
する遺伝子、RNA依存RNAポリメラーゼをコードする遺伝
子、またはヘリカーゼをコードする遺伝子である、ＥＳ
細胞；ＲＮＡｉ関連遺伝子が、線虫rde-1又はrde-4遺伝
子、カビqde-2遺伝子、アラビドシスago-1遺伝子、Dice
r遺伝子又はそのホモログ遺伝子、PAZ/Piwiファミリー
の蛋白等をコードする遺伝子、線虫Mut-7遺伝子、線虫r
de-2遺伝子、カビqde-1遺伝子、線虫ego-1遺伝子、アラ
ビドシスsgs2/sde1遺伝子、カビqde-3遺伝子、線虫smg-
2遺伝子、クラミドマスmut6遺伝子、またはアラビドシ
スsde3遺伝子である、ＥＳ細胞；ＲＮＡｉ関連遺伝子
が、線虫rde-1遺伝子又は線虫Mut-7遺伝子である、ＥＳ
細胞；ＲＮＡｉ関連遺伝子を宿主細胞内で発現可能な状
態で有する発現ベクターをＥＳ細胞に導入することによ
り得られる、ＥＳ細胞；哺乳動物細胞で発現可能な標的
遺伝子の逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子をさらに
有している、ＥＳ細胞；逆向き反復配列を含む組み換え
遺伝子が、哺乳動物細胞で作動可能なプロモーター配列
の下流に標的遺伝子の逆向き反復配列を含む、ＥＳ細
胞；逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子が、プロモー
ター配列の上流にエンハンサー配列を含む、ＥＳ細胞；
逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子が、さらにインス
レーター配列又はその一部を含む、ＥＳ細胞；逆向き反
復配列を含む組み換え遺伝子が、標的遺伝子の逆向き反
復配列の下流にポリＡ付加シグナル配列を含む、ＥＳ細
胞；標的遺伝子が、外来性レポータータンパク質または
その変異タンパク質の遺伝子である、ＥＳ細胞；外来性
レポータータンパク質が、Enhanced green fluorescent
protien（EGFP）である、ＥＳ細胞；及び受託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１８５７４またはＦＥＲＭ Ｐ−１８５７５
を有するＥＳ細胞；が提供される。
【００１７】本発明の別の側面によれば、上記した本発
明のＥＳ細胞から派生した非ヒト哺乳動物個体又はその
子孫又はその一部が提供される。好ましくは、非ヒト哺
乳動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、
ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ
およびサルから成る群から選ばれる非ヒト哺乳動物であ
る。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。（１）ＲＮＡｉ関連遺伝子について 本発明のＥＳ細胞は、増強したＲＮＡｉ効果を有するこ
とを特徴とするものであり、ＥＳ細胞に遺伝子操作を施
すことにより得られる。遺伝子操作としては、ＥＳ細胞
にＲＮＡｉ効果を増強させる遺伝子（即ち、ＲＮＡｉ関
連遺伝子）を導入すること、あるいはＥＳ細胞に存在す
るＲＮＡｉ効果を抑制する遺伝子の発現を抑制するため
の遺伝子操作などが挙げられる。
【００１９】ＲＮＡｉ感受性を上昇させる可能性がある
遺伝子、即ち、ＲＮＡｉ効果を増強させる遺伝子として
は以下のものがある。ＲＮＡｉは線虫で発見されたが、
その後ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウスで
も報告されている。一方、植物ではpost-transcription
al gene silencing（PTGS）、カビにおいてはgene quil
lingと報告された現象と同様のメカニズムが存在するこ
とが明らかとなっている。
【００２０】ＲＮＡｉメカニズム第1段階の、配列特異
的な中間体の形成に関与する因子として、以下のものが
考えられている。線虫rde-1、rde-4（rde；RNA interef
erence-deficient）遺伝子（Tabara, H., Sarkissian,
M., Kelly, W.G., Fleenor, J., Grishok, A., Timmon
s, L., Fire, A., Mello, C.C. : Cell. 99, 123-132,
1999 ）。
【００２１】Rde-1遺伝子はpiwi/sting/avgonaute/Zwil
le/eIF2C 遺伝子ファミリーに属す。Rde-1のカビホモロ
グとしては、qde-2遺伝子（Catalanptto, C., Azzalin,
G., Macino, G. and Cogoni, C., Nature 404, 245 16
Mar. 2000）が、アラビドシスホモログとしてはago-1
が報告されている。
【００２２】DicerはショウジョウバエのRNaseIIIファ
ミリーに属するヌクレアーゼの1つであり、線虫、アラ
ビドシス、ヒト、分裂酵母などにホモログが発見されて
いる（Bernstein, E., Caudy, A., A., Hamond S. M.,
Hannon, G.J. : Nature, 409,363-366, 2001）。
【００２３】その他の配列特異的中間体のコンポーネン
トとしてはDicerに相互作用するPAZ/Piwiファミリーの
蛋白等（Hammond, S., M., Boettcher, D., Caudy, A.,
Kobayashi, R., Hannon, G., J., Science, 2001, 29
3, 1146-1150）が挙げられる。
【００２４】一方、標的遺伝子発現抑制段階に関与する
因子として、以下のものが考えられる。線虫Mut-7（Ket
ting, R. F., Harverkamp, T. H. A., van Luenen, H.
G. A.M., Plasterk, R. H. A. : Cell. 99, 1）はRnase
Dに相同な配列を持つ3', 5'エクソヌクレアーゼであ
る。また、線虫rde-2（Tabara, H., Sarkissian, M., K
elly, W.G., Fleenor, J., Grishok, A., Timmons, L.,
Fire, A., Mello, C.C. :Cell. 99, 123-132, 1999 ）
もこの段階に関与する。
【００２５】また、RNA依存RNAポリメラーゼとしては、
カビにおいてqde-1、線虫においてego-1、アラビドシス
においてsgs2/sde1等のホモログが報告されている（Mat
zke,M., A., MatzkeA., J., M., Pruss, G., and Vanc
e, V., Curr. Opin. Genet. Dev. 11, 221, 2001）。し
かしながら、その正確な役割はまだ明らかになっていな
い。
【００２６】さらに、変異株の解析から、ヘリカーゼに
分類される酵素がＲＮＡｉに関与していることも報告さ
れている。カビではqde-3（Cogoni, C., Macino, G., S
cience, 286, 2342-2344, 1999）、線虫ではsmg-2（Dom
eier, M., E., Morse, D., P., Knight, S., W., Porte
iko,M., Bass, B., L., Mango, S., E., Science, 289,
1928-1931, 2000）、クラミドマスではmut6（Wu-Schar
f, D., Jeong, B., Zhang, C., Cerutti, H., Science,
290, 1159-1162, 2000）、アラビドシスではsde3（dal
may, T., Horsefield, R., Braunstein, T., H., Baulc
ombe, D., C.,EMBO J., 20, 2069- 2078）等である。
【００２７】DsRNAをプロセスする他の経路の存在も示
唆されている。PTGSの植物ウイルス抑制因子である、HC
-Pro（helper component proteinase）はPTGSに必要なs
iRNA（短鎖抑制RNA）の蓄積を阻害する（Mallory M.,
F., Matzke, A., Matzke, M.,Curr. Biol., 11, 1119,
2001、Llave, C., Kasschau, K., D., Carrington, C.,
Proc. Natul. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13401, 200
1）。このように、ＲＮＡｉ感受性を減少させる因子の
場合は、遺伝子操作によりその発現を抑制することによ
り、ＲＮＡｉ感受性を上昇させることが可能と推定され
る。
【００２８】RNA-directed DNA methylaseもＲＮＡｉに
おける標的mRNAにガイドするRNAに類似の低分子RNAに分
解されるdsRNAを必要とする（Mette, M., F., Aufsatz,
W., van der Winden, J., Matzke, M., A., Matzke,
A., J., M., EMBO J. 19, 5194, 2000）。
【００２９】（２）ＲＮＡｉ関連遺伝子のＥＳ細胞への
導入 本発明のＥＳ細胞（Embryonic Stem Cells）は、例え
ば、以下のような操作により作製することができる。即
ち、ＲＮＡｉ関連遺伝子を取得し、これをＥＳ細胞内で
発現可能な状態で有する発現ベクターを構築する。次い
で、この発現ベクターを発生学的に全能性を持つ、未分
化な細胞であるＥＳ細胞に導入する。そして、導入した
ＲＮＡｉ関連遺伝子の発現によりＲＮＡｉ効果が増強さ
れたＥＳ細胞を単離する。
【００３０】ＲＮＡｉ関連遺伝子を含む発現ベクターと
しては、ＲＮＡｉ関連遺伝子をＥＳ細胞内で発現させる
ことができるものであればその種類は特に限定されな
い。発現べクターの構築は当業者であれば適宜行うこと
ができる。一般的には、哺乳動物で作動可能なプロモー
ター配列の下流にＲＮＡｉ関連遺伝子が存在する。この
ような構成をとることにより、哺乳動物の細胞内におい
てＲＮＡｉ関連遺伝子を発現させることが可能になる。
また、発現ベクターは、プロモーター配列の上流にエン
ハンサー配列を含んでいてもよい。さらに、発現ベクタ
ーは、インスレーター配列又はその一部を含んでいても
よい。発現ベクターの構築のために使用することができ
るプロモーター配列、エンハンサー配列、インスレータ
ー配列としては、例えば、標的遺伝子の逆向き反復配列
を含む組み換え遺伝子について本明細書中後記するもの
の中から好適なものを選択して使用することもできる。
【００３１】ＲＮＡｉ関連遺伝子を有する発現ベクター
のＥＳ細胞への導入は、エレクトロポレーション法など
を用いて常法にしたがって行うことができる。なお、Ｅ
Ｓ細胞とは動物胚盤胞の内部細胞塊より樹立された発生
学的全能性を持つ未分化な細胞であり、初期胚に戻して
やると宿主胚の細胞と渾然一体となり発生を続けるとい
う性質を有する。本発明で用いるＥＳ細胞の種類は特に
限定されず、ＥＳ細胞の由来する動物も特に限定されな
いが、好ましくは哺乳動物であり、例えば、ヒトでもよ
いし、あるいはマウス、ラット、ハムスター、モルモッ
ト、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、
ヤギおよびサルなどの非ヒト哺乳動物でもよい。
【００３２】ＲＮＡｉ関連遺伝子を有する発現ベクター
を導入するＥＳ細胞は、生殖細胞への分化能を失わない
ように未分化の状態で培養維持することが好ましい。そ
のためには、培地に適当な栄養細胞をフィーダー細胞と
して加え、また、ヒトＬＩＦ(Leukemia InhibitoryFact
or)を添加し、さらに牛胎児血清、ヌクレオシド、非必
須アミノ酸、２−メルカプトエタノールなどを添加して
培養することが好ましい。栄養細胞としては、ＳＴＯ細
胞かマウス胎児繊維芽細胞などが適当である。エレクト
ロポレーション法でＥＳ細胞に発現ベクターを挿入する
には、ＥＳ細胞を一定の濃度になるように緩衝液に浮遊
させ、適当な制限酵素で処理して線状化したRNAi関連遺
伝子を有する発現ベクターを添加し、適当なエレクトロ
ポレーション装置を用いて適当な条件下でエレクトロポ
レーションを行うことが好ましい。緩衝液としては、Ｐ
ＢＳ等を用いてpHを７.０に調整するのが好ましい。
【００３３】ＲＮＡｉ関連遺伝子を有する発現ベクター
を導入した後、ＥＳ細胞を、上記の培地で24時間程度培
養し、その後選別に用いる薬剤（例えば 抗生物質な
ど）を含む培地と交換する。薬剤添加培地は１日ごとに
新しいものに交換することが好ましく、約１週間培養を
続ける。その後、発現ベクターを導入して得られた薬剤
耐性のクローンを拾い上げ、所望の性質を有するクロー
ンを単離する。単離したＥＳ細胞が、実際に増強したＲ
ＮＡｉ効果を有しているか否かは、適当なＲＮＡｉ評価
系において確認することができる。
【００３４】（３）逆向き反復配列を含む組み換え遺伝
子を用いたＲＮＡｉ評価系 ＲＮＡｉは、哺乳動物細胞で発現可能な標的遺伝子の逆
向き反復配列を含む組み換え遺伝子を用いて評価するこ
とができる。即ち、このような構造を有する組み換え遺
伝子を哺乳動物の細胞に導入することにより、細胞内で
標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができ、
これによりＲＮＡｉ（ＲＮＡinterference）効果により
標的遺伝子の発現を抑制することが可能になる。このよ
うなＲＮＡｉ評価系をＥＳ細胞を用いて構築した後、Ｒ
ＮＡｉ関連遺伝子を有する発現ベクターを該ＥＳ細胞に
導入し、ＲＮＡｉ効果による標的遺伝子の抑制の程度が
増強するかどうかを評価することができる。
【００３５】逆向き反復配列とは、標的遺伝子並びにそ
の逆向きの配列が適当な配列を介して並列している配列
を言う。具体的には、標的遺伝子が、以下に示すｎ個の
塩基配列から成る２本鎖を有する場合、 ５’−Ｘ1Ｘ2．．．．．．Ｘn-1Ｘn−３’ ３’−Ｙ1Ｙ2．．．．．．Ｙn-1Ｙn−５’ その逆向き配列は以下の配列を有する。 ５’−ＹnＹn-1．．．．．．Ｙ2Ｙ1−３’ ３’−ＸnＸn-1．．．．．．Ｘ2Ｘ1−５’ （ここで、Ｘで表される塩基とＹで表される塩基におい
て、添え字の数字が同じものは互いに相補的な塩基であ
る）
【００３６】逆向き反復配列は上記２種の配列が適当な
配列を介して配列である。逆向き反復配列としては、標
的遺伝子の配列が逆向き配列の上流にある場合と、逆向
き配列が標的遺伝子の配列の上流にある場合の２つの場
合が考えられる。本発明で用いる逆向き反復配列は上記
の何れでもよいが、好ましくは、逆向き配列が標的遺伝
子の配列の上流に存在する。標的遺伝子の配列とその逆
向き配列の間に存在する配列は、ＲＮＡに転写された際
にヘアピンループを形成する領域である。この領域の長
さは、ヘアピンループを形成できる限り特には限定され
ないが、一般的には、０ｂｐから７００ｂｐであり、好
ましくは０〜３００ｂｐ程度、より好ましくは０〜１０
０ｂｐ程度である。この配列の中には制限酵素部位が存
在していてもよい。
【００３７】本発明で用いる標的遺伝子としては任意の
遺伝子を使用できる。組み換え遺伝子を用いてトランス
ジェニック動物を作成し、ＲＮＡｉによる遺伝子ノック
アウトを意図する場合には、標的遺伝子は発現を抑制す
ることを意図する遺伝子（ノックアウトを意図する遺伝
子）である。このような標的遺伝子としては、クローニ
ングはされているが機能が未知の遺伝子も含まれる。
【００３８】あるいは、標的遺伝子は、外来性レポータ
ータンパク質またはその変異タンパク質の遺伝子であっ
てもよい。このような外来性レポータータンパク質また
はその変異タンパク質の遺伝子を標的遺伝子として使用
した場合は、組み換え遺伝子を用いたトランスジェニッ
ク技術においてＲＮＡｉ効果を容易に検出及び評価する
ことができる。外来性レポータータンパク質としては、
エンハンスド・グリーン・フルオレッセント・プロテイ
ン（Enhanced green fluorescent protien）、グリーン
・フルオレッセント・プロテイン（Green fluorescent
protien）、エクオリン、クロラムフェニコール・アセ
チルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシ
フェラーゼ、β−グルクロニダーゼなどが挙げられる。
【００３９】外来性レポータータンパク質の変異タンパ
ク質としては、上記した野生型のレポータータンパク質
のアミノ酸配列中に１〜複数個（例えば１〜２０個、好
ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個）のアミ
ノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するタンパ
ク質であって、好ましくは野生型のレポータータンパク
質と同等以上の機能を維持している。レポータータンパ
ク質の変異タンパク質の遺伝子として具体的には、レポ
ータータンパク質の遺伝子中の塩基配列の一部が欠損し
た遺伝子、レポーター遺伝子の塩基配列が他の塩基配列
で置換された遺伝子、レポーター遺伝子の一部に他の塩
基配列が挿入された遺伝子などが用いられる。欠損、置
換または付加を受ける塩基の数は、特に限定されない
が、通常、１ないし６０個程度、好ましくは１から３０
個程度、より好ましくは１ないし１０個程度である。な
お、これらの変異遺伝子は、レポーター遺伝子としての
機能を維持していることが望ましい。
【００４０】変異タンパク質の遺伝子は、化学合成、遺
伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任
意の方法で作製することができる。具体的には、天然型
レポータータンパク質をコードするＤＮＡに対して変異
原となる薬剤を接触作用させたり、紫外線を照射した
り、あるいはＰＣＲ法などの遺伝子工学的手法を用いる
ことにより変異タンパク質をコードする遺伝子を取得す
ることができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特
異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる
手法であることから特に有用であり、Molecular Clonin
g: A laboratoryMannual, 2nD ED., Cold Spring Harbo
r Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、及びCu
rrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1
〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法
に準じて実施することができる。
【００４１】本発明で用いることができる組み換え遺伝
子では、哺乳動物で作動可能なプロモーター配列の下流
に標的遺伝子の逆向き反復配列が存在する。このような
構成をとることにより、哺乳動物の細胞内において標的
遺伝子の逆向き反復配列を発現させることが可能にな
る。即ち、本発明で用いることができる組み換え遺伝子
では、標的遺伝子の逆向き反復配列は上記プロモーター
の制御下に置かれるように配置されている。
【００４２】本発明で用いるプロモーター配列は、哺乳
動物で作動可能であれば特に限定されない。このように
非ヒト動物で発現可能なプロモーターとしては、例え
ば、ウィルス（例、サイトメガロウィルス、モロニー白
血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルスなど）由来
遺伝子プロモーター、各種哺乳動物（例えば、ヒト、ウ
サギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、
マウスなど）由来のプロモーターなどが用いられる。各
哺乳動物由来のプロモーターとしては、例えば、アルブ
ミン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチン
キナーゼ、コラーゲンＩ型およびII型、サイクリックＡ
ＭＰ依存タンパクキナーゼβサブユニット（ザ・ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Jour
nal of Biological Chemistry）, Vol.271, No.3, pp16
38-1644, 1996）、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパ
ミンβ−水酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖（ザ・
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Th
e Journal of Biological Chemistry）, Vol.270, No.4
3, pp25739-25745, 1995および同 Vol.272, No.40, pp2
5112-25120,1997）、メタロチオネイン、メタロプロテ
ィナーゼ１組織インヒビター、平滑筋αアクチン、ポリ
ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、
αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミ
エリン基礎タンパク、血清アミロイドＰコンポーネン
ト、レニンなどのプロモーターが用いられる。
【００４３】上記以外にも、例えば、Molecular Medici
ne臨時増刊号、マニュアル疾患モデルマウス；山村研
一、勝木元也、相沢慎一編、中山書店等の文献に記載さ
れているプロモーターも使用することができる。本発明
で用いるのに好ましいプロモーターとしては、本明細書
の実施例で使用したヒトEF1αプロモーターが挙げられ
るが、それ以外にも以下のものが挙げられる。
【００４４】（１）βアクチンプロモーター 一般的にはＣＭＶエンハンサーとβアクチンプロモータ
ーの組み合わせとして使用される。例えば、pCAGGS;chi
cken beta-actin promoter and cytomegalo virus enha
ncer. beta-actin intron and bovine globin poly-ade
nylation signalなど。引用文献としては、H. Niwa, K.
Yamanami, J. Miyazaki, Gene, 108, (1991)193-199を
参照。
【００４５】（２）ＣＭＶプロモーター 一般的には、ＣＭＶエンハンサーとＣＭＶプロモーター
の組み合わせとして使用される。引用文献としては、Ja
net A. Sawicki et al Experimental Cell Research 24
4, 367-369 (1998)を参照。
【００４６】（３）メタロチオネインプロモーター 引用文献としては、Establishment of Transgenic Mice
Carrying Human Fetus-Specific CYP3A7 Yong Li, et
al, Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol.
329, No. 2, 235-240, 1996を参照。
【００４７】（４）Apolipoprotein E プロモーター 胎児肝臓での発現を意図したプロモーター。引用文献と
しては、Simonet et al., 1993, J. Biol. Chem., 268,
8221-8229を参照。 （５）導入したい遺伝子本来のプロモーター この場合は、ゲノムそのものを導入することによりトラ
ンスジェニックマウスを作成する場合が挙げられる。引
用文献としては、Okamoto M., et al., J. Exp. Med.,
175, 71 (1992)を参照。
【００４８】本発明で用いることができる組み換え遺伝
子は、プロモーター配列の上流にエンハンサー配列を含
んでいてもよい。使用できるエンハンサー配列としては
上記したＣＭＶエンハンサーなどが挙げられる。
【００４９】本発明で用いることができる組み換え遺伝
子は、インスレーター配列又はその一部を含んでいても
よい。インスレーター配列とは，トランスジェニック動
物においては，「位置効果」からの遺伝子発現の抑制か
ら守る遺伝子配列のことである。近隣のシスエレメント
の影響に対するバリアとして期待されている。インスレ
ーター配列又はその一部の位置は特に限定されないが、
導入遺伝子（即ち、標的遺伝子の逆向き反復配列）の
５’側（上流）に存在することが、効果の面から好まし
い。最も好ましくは、インスレーター配列又はその一部
は、プロモーター配列の上流（又はエンハンサー配列が
存在する場合にはその上流）に存在する。
【００５０】本発明で使用できるインスレーター配列と
しては、本明細書の実施例で使用したニワトリベータグ
ロビン由来インスレーター配列の他にも以下のものが挙
げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】（１）ショウジョウバエscsおよびscs'配
列 Rebecca Kellum and Paul Schedl, Cell, Vol. 64, 941
-950, March 8, 1991 （２）ショウジョウバエgypsyトランスポゾンのインス
レーター配列 Holdrige, C., and D. Dorsett, 1991 Mol. Cell. Bio
l. 11: 1894-1900 （３）ウニアリルサルファターゼインスレータ配列 Koji Akasaka, et. al., Cellular and Molecular Biol
ogy 45 ( 5 ), 555-565,1999 （４）ヒトＴ細胞レセプターα/δ遺伝子座BEADエレメ
ント Zhong, X. P., and M. S. Krangel, 1997 Proc. Natul.
Acad. Sci. USA （５）ヒトアポリポ蛋白B-100（apoB）マトリックスア
タッチメント部位 Namciu et al, 1998, Mol. Cell. Biol. 18: 2382-2391
【００５２】本発明で用いることができる組み換え遺伝
子は、標的遺伝子の逆向き反復配列の下流にポリＡ付加
シグナル配列を含んでいてもよい。ポリＡ付加シグナル
配列を挿入することにより、目的とするメッセンジャー
ＲＮＡの転写を終結することができる。ポリＡ付加シグ
ナル配列の具体例としては、SV40ポリＡ付加シグナルな
どが挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【００５３】上記した方法により作製された細胞の具体
例として、クローンｄ２ ＧＦＰ・ｒ６＃５は受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１８５７４として、クローンＧＦＰ・ｒ
１９＃４は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８５７５として、
平成１３年１０月３１日付けで独立行政法人産業技術総
合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば
市東一丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。こ
れらの細胞は、マウス胚性幹細胞としての万能性を有
し、ＥＧＦＰ蛋白質を発現して緑色蛍光を発し、線虫の
遺伝子rde-1を発現してＲＮＡｉ高感受性を示す。
【００５４】（４）ＲＮＡｉ効果が増強された非ヒト哺
乳動物個体 本発明においては、上記により取得されたＲＮＡｉ効果
が増強されたＥＳ細胞を動物胚へ注入し、仮親の子宮に
移植して生殖系列のキメラ動物を得ることができる。こ
のキメラ動物を正常な動物と交配させるとヘテロ接合体
動物（＋／−）が得られ、ヘテロ接合体同士を交配させ
るとホモ接合体動物（−／−）を得ることができる。こ
の方法により、ＲＮＡｉ効果が増強されている哺乳動物
個体を得ることができる。哺乳動物個体の種類は非ヒト
哺乳動物であれば特に限定されず、具体例としては、マ
ウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イ
ヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびサル
などを挙げることができる。
【００５５】ＲＮＡｉ効果が増強されている哺乳動物の
作製は、具体的には以下のように行なうことができる。
まず、動物の胚に、ヘテロ接合体ＥＳ細胞を注入し、in
vitroで培養した後、仮親の子宮に移植する。ここで、
動物の胚は、８細胞期胚−胚盤胞が用いることが好まし
い。ＥＳ細胞は通常10〜15個程度を注入する。こうし
て、ＥＳ細胞を注入された胚は、in vitroで培養した
後、仮親の子宮に移植する。上記の方法によって妊娠し
た仮親から生まれた子のうちキメラ動物を選ぶ。キメラ
の寄与率の高いキメラ動物は生殖系列のキメラ動物であ
る可能性が高いが、キメラ動物を正常動物と交配するこ
とにより、生殖系列のキメラ動物であることの確認が可
能である。このようにして生殖系列のキメラ動物である
ヘテロ接合体動物が得られ、ヘテロ接合体同士の交配に
よりホモ接合体動物を得ることができる。このようにし
て得られた動物は、ＲＮＡｉ効果が増強されているとい
う特徴を有する。
【００５６】ＲＮＡｉ関連遺伝子が胚芽細胞を含むすべ
ての細胞の染色体上に組み込まれたトランスジェニック
哺乳動物の遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫は、
同様に該遺伝子を有する。導入遺伝子を相同染色体の両
方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物
を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を安定に
保持し、また、該遺伝子を有することを確認して、通常
の飼育環境で繁殖継代することができる。以下の実施例
により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に
よって限定されるものではない。
【００５７】
【実施例】実施例１：d2EGFP ＥＳ細胞の樹立及びＲＮ
Ａｉ効果測定系の構築 標的遺伝子をEGFPとした場合、EGFPの半減期が24時間以
上であるので、EGFPの翻訳レベルが減少しても、EGFP d
sRNA導入前に翻訳された持ち込みのEGFPにマスクされて
いるうちにＲＮＡｉ効果自体が見えなくなっている可能
性がある。そこで、EGFP蛋白の半減期が2時間になるよ
うに改良を施したEGFP（d2EGFP、クロンテック社pd2EGF
P-1）を用いて、新たにＥＳ細胞トランスフェクタント
を樹立した。樹立に用いたd2EGFP発現ベクターは、クロ
ンテック社pd2EGFP-1マルチクローニングサイト中のBam
HIサイトに、pUC19 5', 3' INS240CE EGFP（特願2001-
046089号明細書に記載のもの；構築方法は以下に記載す
る）の5' インスレーター配列、CMVエンハンサー配列、
EF-1α配列を含むBam HIフラグメントを正向きに挿入す
ることにより作製し、pd2EGFP 5' INS240 CE と命名し
た。
【００５８】pUC19 5', 3' INS240CE EGFPは下記の通り
構築した。pUC19 5', 3' INS240 （ニワトリベータグロ
ビン由来インスレーター配列の遺伝子を10本のフラグメ
ントに分けて化学合成後、ＤＮＡ Ligaseで結合させた2
40塩基対のフラグメントをpUC19ベクターのマルチクロ
ーニングサイトへ挿入したベクター）のXhoI 、Afl II
部位へpCE-EGFP-1（文献名：Takada, T., 他、Selectiv
e production of transgenic mice using green fluore
sent protein as a marker. Nature Biotech. 15: 458-
461, 1997）のXhoI - Afl II 間断片を２段階で挿入し
て、ライゲーションし、大腸菌JM109株をトランスフォ
ームして、プラスミドpUC19 5', 3' INS240CE EGFPを得
た。
【００５９】上記で作製したベクターpd2EGFP 5' INS24
0 CEを、制限酵素EcoRI、Bsa Iを用いて切断し、アガロ
ースゲル電気泳動にて大腸菌由来の配列と分離した。得
られた遺伝子断片を用いて、CCE ＥＳ細胞（Tetracarci
nomas and Embryonic Stem Cells: A practical Approa
ch, Robertson EJ. IRL Press: London, pp.71-112,198
7）をエレクトロポレーション法（BTX社製ECM600遺伝子
導入装置）にてトランスフェクションした。トランスフ
ェクションした細胞を250μg/mlネオマイシン存在下で
セレクションし、得られたコロニーについて、蛍光顕微
鏡にてEGFP蛍光が陽性であることを確認後、d2EGFP Ｅ
Ｓ細胞株とした。ＥＳ細胞の培養は、上記Robertson EJ
の方法に従った。
【００６０】ＲＮＡｉ効果の検出は以下の手法で行っ
た。フィーダー細胞上で増殖させた各ＥＳ細胞をトリプ
シン−EDTAで剥がし、ゼラチンコートプレートに2.1×1
0E4個/cm2の濃度でまき込み、培養した。24時間後の細
胞に、EGFP dsRNA発現遺伝子（逆向き反復配列遺伝子）
を持つプラスミドpUC19 5' INS240 EGFP IRを、遺伝子
導入試薬リポフェクタミン2000を用いてトランスフェク
ションした。コントロールとして、HPRT（Hypoxanthine
phosphoribosyltransferase）dsRNA発現遺伝子（逆向
き反復配列遺伝子）を持つプラスミドを用いて同様のト
ランスフェクション操作を行った。24 時間後に、トリ
プシン-EDTAを用いて細胞を回収し、シングルセルにし
た後、FACScan（BD社）により、細胞の蛍光を解析し
た。
【００６１】EGFP dsRNA発現遺伝子（逆向き反復配列遺
伝子）を持つプラスミドpUC19 5' INS240 EGFP IRは特
願2001-046089号明細書に記載されたものを使用した。
即ち、上記で作製したpUC19 5', 3' INS240 CE EGFPのK
pnI 、SalI切断部位へLitmus28EGFPのKpn I-Xho I断片
を挿入後、ライゲーションし、大腸菌SURE2株（ストラ
タジーン社）をトランスホームして、逆向き反復配列を
持つプラスミドpUC19 5'INS240 CE EGFP IRを得た。
【００６２】コントロールとして用いたHPRT dsRNA発現
遺伝子は以下に示す手法で構築した（図１）。Hypoxant
hine phosphoribosyltransferase遺伝子はATCC No.3742
4を購入し、制限酵素Age IおよびBal I で切出し、Litm
us28ベクターへクローニングした。このベクターを鋳型
に用い、制限酵素CpoI または SfiI部位を含むプライマ
ー(配列番号１、配列番号２または配列番号３、配列番
号４)でPCRを行った。PCR条件は93℃ 3min, ( 93℃ 30s
ec, 55℃ 30sec, 72℃ 1min )x25, 72℃ 10minとした。
得られたDNA断片をCpoI or SfiI処理し、アガロースゲ
ルで電気泳動後DNA断片を回収した。また、東京大学大
学院理学研究科の善野助教授より供与されたpSC３ベク
ター（FEBS Letters 479, 79-82, 2000）をCpoI処理
し、アガロースゲルで電気泳動後、DNA断片を回収し
た。HPRT DNA断片−CpoIをpSC３ベクター−CpoIにライ
ゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換して、プラス
ミドpSC3-HPRTCpoIを得た。次にpSC3-HPRTCpoI をSfiI
処理し、アガロースゲルで電気泳動後DNA断片を回収し
た。HPRT DNA断片−SfiI をpSC3-HPRTCpoI−SfiIにライ
ゲーションし、大腸菌SURE2株（ストラタジーン社）を
形質転換して、逆向き反復配列をもつプラスミドpSC3-H
PRTCpoI−SfiIを得た。
【００６３】さらに、プラスミドpSC3-HPRTCpoI−SfiI
をNotI処理し、アガロースゲルで電気泳動後、約1.7kbp
のDNA断片を回収した。次に、pUC19 5'INS240 CE/EGFP
IR（特願2001-046089号明細書に記載、上記の通り）をN
ot I 処理後、EGFP IR 断片を切り出し、セルフライゲ
ーションを行うことで、pUC19 5'INS240 CEpAベクター
を作成した。このpUC19 5'INS240 CE pAベクターをNotI
処理した後、セルフライゲーションを防ぐためBAPによ
り脱リン酸化処理し、フェノール抽出、クロロホルム抽
出、エタノール沈澱を行い、BAPを除去した。
【００６４】pSC3-HPRTCpoI−SfiI −NotIをpUC19 5'IN
S240 CEpAベクター−NotIサイトにライゲーションし、
大腸菌SURE2株（ストラタジーン社）を形質転換して、
逆向き反復配列をもつプラスミドpCE HPRT IRを得た。
【００６５】実施例２：ＲＮＡｉ関連遺伝子を有する発
現ベクターカセットの構築 哺乳動物細胞内で種々のＲＮＡｉ関連遺伝子を発現させ
るため、CMVエンハンサー、EF−1αプロモーターでドラ
イブし、ピューロマイシン耐性遺伝子を持つカセットベ
クターを作製した。即ち、pUC19 5'INS240 CE pAベクタ
ーのEcoRIサイトにSpe I-BssHII-EcoRIリンカー（配列
番号５及び６）を挿入し、SwaIサイトにXbaI-SalI-SwaI
リンカー（配列番号７および８）を挿入することで、pU
C19 5'INS240 CEpA XSSベクターを作成した。（図２）
【００６６】（Ａ）Mut-7発現遺伝子の作製 （１）mut-7遺伝子のクローニング mut-7遺伝子（GENEBANK配列番号；ZK1098）のクローニ
ングは東京大学理学部・杉本助手より供与された酵母発
現用C.elegans cDNAライブラリー(Genes to Cells 3,18
9-202(1998))を用いて行った。このcDNAライブラリーを
大腸菌株XL-10Gold(STRATAGENE)にトランスフォームし
コロニーハイブリダイゼーションを行った。プローブに
はcDNA libraryを鋳型にし、PCRによって増幅したmut-7
cDNAの5'側領域（配列番号９及び１０）のプローブを
用いた。その結果、mut-7 クローンを２クローン取得
し、BssHII/BamHIでcDNA領域を切り出しLitmus28 (New
England Biolabs社)のBssHII/BamHIサイトに挿入し、L2
8/mut-7を作製した。相互のクローン間で、BglII/PstI
を用いた組み替えを行い、アミノ酸変異を持たない完全
長のORFを含むcDNAクローンを取得した。引き続きL28/m
ut-7のSpeI/EcoRI cDNA断片をLitmus38 (New England B
iolabs社)のNheI/EcoRIサイトに挿入することによってL
38/mut-7を得た。
【００６７】（２）ベクターへのmut-7遺伝子の導入 pUC19 5' INS240 CE pAXSSベクターのBssHII/EcoRI サ
イトにL38/mut-7のMluI/EcoRI断片を挿入し、pUC19 5'
INS240 CE/mut-7を得た。このプラスミドを用いて大腸
菌株SCS110（STRATAGENE社）をトランスフォームし、脱
メチル化されたプラスミドを得た。
【００６８】（３）PBS/LoxP/Puroの構築 PLoxP（Kitamoto T. et.al., Biochem. And Biophys. R
es. Commun. 222, 742-747（1996））のBamHIサイトを
制限酵素処理後、ブラント化、セルフライゲーションす
ることによってつぶし、続いてHindIIIサイトにBglIIリ
ンカー（配列番号１１）を挿入してHindIIIサイトをBgl
IIサイトに改変した。このベクターのEcoRV/BglIIサイ
トにpPUR (CLONTECH社)のPvuII/BamHI断片を挿入し、pB
S/loxP/Puroを得た（図３）。
【００６９】（４）pUC19 5'INS240 CE/mut-7/loxP/Pur
oの構築 pUC19 5'INS240 CE/mut-7のXbaI/SalIサイトに、pBS/lo
xP/PuroのSpeI/XhoI断片を挿入し、pUC19 5'INS240 CE/
mut-7/loxP/Puroを得た。このプラスミドをBamHI処理す
ることによって約6.5kbの遺伝子断片を得た。
【００７０】（Ｂ）rde-1発現遺伝子の作製 （１）rde-1遺伝子の取得 rde-1のcDNAクローンは国立遺伝研・小原先生よりGENEB
ANKの遺伝子番号AF180730を元に供与された。このファ
ージクローンから、in vivo excisionによってpBluescr
iptSK-/rde-1を得た。
【００７１】（２）ベクターの構築 pUC19 5'INS240 CEpAXSSのBssHIIサイトにBssHII-NotI-
EcoRV-NheI-KpnIリンカー（配列番号１２及び１３）を
挿入し、SwaIサイトにSwaI-AscI-PacIリンカー（配列番
号１４及び１５）を、またNsiIサイトにNsiI-AscI-PacI
リンカー（配列番号１６及び１７）を挿入した。さら
に、XbaI/SalIサイトに、pBS/loxP/PuroのSpeI/XhoI断
片を挿入し、pUC19 5'INS240 CE/BNENK/loxP/Puroを得
た（図３）。
【００７２】（３）pUC19 5'INS240 CE/rde-1/loxP/Pur
oの構築 pUC19 5'INS240 CE/BNENK/loxP/PuroのKpnI/NotIサイト
にpBluescriptSK-/rde-1のKpnI/NotI断片を挿入し、pUC
19 5'INS240 CE/rde-1/loxP/Puroを得た（図５）。この
プラスミドをPacI処理することによって約7.0kbの遺伝
子断片を得た。
【００７３】実施例３：mut-7発現ＥＳ細胞株の樹立 精製したmut-7発現遺伝子を用いて、エレクトロポレー
ション法により、d2EGFP発現ＥＳ細胞株へ導入した。そ
の後、600ng/mlピューロマイシン存在下でセレクション
を行い、細胞株を得た。さらに細胞からDNAを調製し、m
ut-7遺伝子の存在をサザンハイブリダイゼーションにお
いて、予想される異動度のバンドを得たクローンをポジ
ティブクローンとした。同様な方法で、半減期が24時間
以上である、2箇所のアミノ酸置換（Phe-64 をLeu、Ser
-65をThr）を持つGFPmut1バリアントをEF-1αプロモー
ターでドライブするＥＳ細胞株（Takada, T., Yoshida,
K., Nakamura, K., Nakao, K., Tujimoto, G., Katsuk
i, M., Sugano, S., Expression of Green Fluorescent
Protein in Transgenic Mice. Methods in Enzymology
302:, 233-250, 1999）にmut-7発現遺伝子を導入し、
ポジティブクローンを得た。
【００７４】実施例４：rde-1発現ＥＳ細胞株の樹立 精製したrde-1発現遺伝子を用いて、エレクトロポレー
ション法により、d2EGFP発現ＥＳ細胞へ導入した。その
後、ピューロマイシンに対する薬剤耐性でセレクション
し、細胞株を得た。さらに細胞からDNAを調製し、rde-1
遺伝子の存在をサザンハイブリダイゼーションにおい
て、予想される異動度のバンドを得たクローンをポジテ
ィブクローンとした。同様な方法で、ＥＳ細胞株（Taka
da, T., Yoshida, K., Nakamura, K., Nakao, K., Tuji
moto, G., Katsuki, M., Sugano, S., Expression of G
reen Fluorescent Protein in Transgenic Mice. Metho
ds in Enzymology 302:, 233-250, 1999）にrde-1発現
遺伝子を導入し、ポジティブクローンを得た。
【００７５】得られたrde-1発現ＥＳ細胞のうち、クロ
ーンｄ２ ＧＦＰ・ｒ６＃５は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１８５７４として、クローンＧＦＰ・ｒ１９＃４は受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８５７５として、平成１３年１０
月３１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許
生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番
地１ 中央第６）に寄託されている。
【００７６】実施例５：ＲＮＡｉ関連遺伝子発現ＥＳ細
胞株のＲＮＡｉ効果解析 フィーダー細胞上で増殖させた各ＥＳ細胞をトリプシン
−ＥＤＴＡで剥がし、ゼラチンコートプレートに2.1×1
0E4個/cm2の濃度でまき込み、培養した。24時間後の細
胞に、EGFP dsRNA発現遺伝子（逆向き反復配列遺伝子）
を持つプラスミドpUC19 5' INS240 EGFP IRを、遺伝子
導入試薬リポフェクタミン2000を用いてトランスフェク
ションした。コントロールとして、HPRT（Hypoxanthine
phosphoribosyltransferase）dsRNA発現遺伝子（逆向
き反復配列遺伝子）を持つプラスミドを用いて同様のト
ランスフェクション操作を行った。24 時間後に、トリ
プシン-EDTAを用いて細胞を回収し、シングルセルにし
た後、FACScan（BD社）により、細胞の蛍光を解析し
た。
【００７７】クローンｄ２ＧＦＰ・ｒ６＃５において、
蛍光減少細胞がコントロール細胞に比較し、10%増加す
る結果を得た（図６）。また、EGFP ＥＳ細胞株にrde-1
遺伝子を導入して取得した細胞株であるクローンＧＦＰ
・ｒ１９＃４において、遺伝子導入を行っていないコン
トロール細胞株に比べ、蛍光減少細胞群が28%上昇する
結果を得た（図７）。
【００７８】実施例６：ＥＳ細胞からのキメラマウス作
成 フィーダー細胞上で増殖させた各ＥＳ細胞をトリプシン
−EDTAで剥がした後、ゼラチンコートプレート上でフィ
ーダー細胞を接着除去し、インジェクション用培地（DM
EM 20% FBS）に懸濁した。ＥＳ細胞をC57BL/6とBDF1を
交配して得た受精卵、ブラストシスト胚へインジェクシ
ョンし、偽妊娠MCHマウスの子宮へ移植し、キメラマウ
スを得た。
【００７９】
【発明の効果】本発明により、新規遺伝子の遺伝子機能
を、胎児、実験動物個体で解析する場合、従来のノック
アウト法よりも迅速に結果を得ることができる、さら
に、ＲＮＡｉ効果を用いた疾病等の関連遺伝子の解析、
医薬品の標的遺伝子の解析等において、これまでのマウ
スよりもより確実に遺伝子の抑制が可能となり、産業上
大いに貢献すると考えられる。
【００８０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> GenCom <120> ES cell having an enhanced RNAi effect <130> A11602MA <160> 17
【００８１】 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 1 ggccatatag gccccgaccc gcagtcccag cgtcg 35
【００８２】 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 2 ggcctacatg gccttaggct ttgtatttgg cttttcca 38
【００８３】 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 3 cggtccgatg ccgacccgca gtcccagcgt cg 32
【００８４】 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 4 cggaccgtta ggctttgtat ttggcttttc ca 32
【００８５】 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 5 aattgactag tgcgcgcatg 20
【００８６】 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 6 aattcatgcg cgcactagtc 20
【００８７】 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 7 attctagatc gtcgacattt 20
【００８８】 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 8 aaatgtcgac gatctagaat 20
【００８９】 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 9 ccgggaagtt ctgaaagcaa 20
【００９０】 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 10 tagccatatc tgcagcaacg 20
【００９１】 <210> 11 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 11 agctcagatc tg 12
【００９２】 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 12 cgcgcagcgg ccgcgatatc agctagcagg tacca 35
【００９３】 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 13 cgcgtggtac ctgctagctg atatcgcggc cgctg 35
【００９４】 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 14 aaatggcgcg ccttaattaa gc 22
【００９５】 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 15 gcttaattaa ggcgcgccat tt 22
【００９６】 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 16 tggcgcgcct taattaactg ca 22
【００９７】 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 17 gttaattaag gcgcgccatg ca 22
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、pCE HPRT IRコンストラクションの構
築を示す。
【図２】図２は、pUC19 5' INS240 CE pAベクターの構
造を示す。
【図３】図３は、pBS/loxP/PUROベクターの構造を示
す。
【図４】図４は、pUC19/5' INS240/CE/mut-7/loxP/PURO
ベクターの構造を示す。
【図５】図５は、pUC19/5' INS240/CE/rde-1/loxP/PURO
ベクターの構造を示す。
【図６】図６は、遺伝子導入ＥＳ細胞株のＲＮＡｉ効果
（１）を示す。d2EGFP発現ＥＳ細胞株d2GFP32にrde-1発
現遺伝子を導入した細胞株へpUC19 5'INS240 CE EGFP
（黒）、pCE HPRT IR（グレー）をトランスフェクト
し、24時間後に回収した細胞のフローサイトメトリー解
析結果である。
【図７】図７は、遺伝子導入ＥＳ細胞株のＲＮＡｉ効果
（２）を示す。EGFP発現ＥＳ細胞株GFP11にrde-1発現遺
伝子を導入した細胞株へpUC19 5' INS240 CE EGFP
（黒）、pCE HPRT IR（グレー）をトランスフェクト
し、24時間後に回収した細胞のフローサイトメトリー解
析結果である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 稔 東京都町田市南大谷914番地 株式会社ジ ェンコム内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA02 FA02 FA06 GA18 HA17 4B065 AA86Y AA90X AB01 AC20 BA01 CA44

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＥＳ細胞に遺伝子操作を施すことにより
    得られる、増強したＲＮＡｉ効果を有するＥＳ細胞。
  2. 【請求項２】 ＥＳ細胞にＲＮＡｉ関連遺伝子を導入す
    ることにより得られる、請求項１に記載のＥＳ細胞。
  3. 【請求項３】 ＲＮＡｉ関連遺伝子が、配列特異的な中
    間体の形成に関与する因子をコードする遺伝子、標的遺
    伝子発現抑制段階に関与する因子をコードする遺伝子、
    RNA依存RNAポリメラーゼをコードする遺伝子、またはヘ
    リカーゼをコードする遺伝子である、請求項１または２
    に記載のＥＳ細胞。
  4. 【請求項４】 ＲＮＡｉ関連遺伝子が、線虫rde-1又はr
    de-4遺伝子、カビqde-2遺伝子、アラビドシスago-1遺伝
    子、Dicer遺伝子又はそのホモログ遺伝子、PAZ/Piwiフ
    ァミリーの蛋白等をコードする遺伝子、線虫Mut-7遺伝
    子、線虫rde-2遺伝子、カビqde-1遺伝子、線虫ego-1遺
    伝子、アラビドシスsgs2/sde1遺伝子、カビqde-3遺伝
    子、線虫smg-2遺伝子、クラミドマスmut6遺伝子、また
    はアラビドシスsde3遺伝子である、請求項２又は３に記
    載のＥＳ細胞。
  5. 【請求項５】 ＲＮＡｉ関連遺伝子が、線虫rde-1遺伝
    子又は線虫Mut-7遺伝子である、請求項４に記載のＥＳ
    細胞。
  6. 【請求項６】 ＲＮＡｉ関連遺伝子を宿主細胞内で発現
    可能な状態で有する発現ベクターをＥＳ細胞に導入する
    ことにより得られる、請求項１から５の何れかに記載の
    ＥＳ細胞。
  7. 【請求項７】 哺乳動物細胞で発現可能な標的遺伝子の
    逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子をさらに有してい
    る、請求項１から６の何れかに記載のＥＳ細胞。
  8. 【請求項８】 逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子
    が、哺乳動物細胞で作動可能なプロモーター配列の下流
    に標的遺伝子の逆向き反復配列を含む、請求項７に記載
    のＥＳ細胞。
  9. 【請求項９】 逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子
    が、プロモーター配列の上流にエンハンサー配列を含
    む、請求項７又は８に記載のＥＳ細胞。
  10. 【請求項１０】 逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子
    が、さらにインスレーター配列又はその一部を含む、請
    求項７から９の何れかに記載のＥＳ細胞。
  11. 【請求項１１】 逆向き反復配列を含む組み換え遺伝子
    が、標的遺伝子の逆向き反復配列の下流にポリＡ付加シ
    グナル配列を含む、請求項７から１０の何れかに記載の
    ＥＳ細胞。
  12. 【請求項１２】 標的遺伝子が、外来性レポータータン
    パク質またはその変異タンパク質の遺伝子である、請求
    項７から１１の何れかに記載のＥＳ細胞。
  13. 【請求項１３】 外来性レポータータンパク質が、Enha
    nced green fluorescent protien（EGFP）である、請求
    項１２に記載のＥＳ細胞。
  14. 【請求項１４】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８５７４ま
    たはＦＥＲＭ Ｐ−１８５７５を有するＥＳ細胞。
  15. 【請求項１５】 請求項１から１４の何れかに記載のＥ
    Ｓ細胞から派生した非ヒト哺乳動物個体又はその子孫又
    はその一部。
  16. 【請求項１６】 非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、
    ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、
    ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびサルから成る群から選
    ばれる非ヒト哺乳動物である、請求項１５に記載の非ヒ
    ト哺乳動物個体又はその子孫又はその一部。
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