JP2003144152A - ターゲット核酸断片の検出方法及びターゲット核酸断片の検出キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 特殊な技術や複雑な操作を必要とせず
に、誰でもが簡便かつ迅速に小型の装置を用いて実施す
ることのできるターゲット核酸断片の検出方法、及び省
スペースで自動化が可能なターゲット核酸断片の検出キ
ットを提供する。 【解決手段】 上記課題は、ターゲット核酸断片の特定
の塩基配列に基づくポリメラーゼ伸長反応の際に生成す
る二本鎖核酸断片を、電気化学的活性インターカレータ
の存在下で電気化学応答の増加として適時検出する方
法、及びその方法を使用した検出キットによって解決さ
れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウイルス、細菌等によ
る感染症の臨床検査、及び個人の遺伝的な特徴による遺
伝的疾患の検査等に有効である、特定の塩基配列を有す
るターゲット核酸断片を検出する方法に係り、特に、タ
ーゲット核酸を鋳型とするポリメラーゼ伸長反応により
生成する二本鎖核酸断片の検出を、当該ポリメラーゼ伸
長反応により生成する二本鎖核酸断片に電気化学活性イ
ンターカレータを作用させ、電極を用いて電気化学応答
の変化を測定することで行うことにより、ターゲット核
酸断片の存在量またはターゲット核酸断片の塩基配列を
簡便かつ高感度に検出する方法、及び当該方法を使用す
るターゲット核酸断片の検出キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、ウイルス、細菌等による感染
症の臨床検査においては、血液等の体液、糞便、喀痰等
を試料として検体の培養を行い、ウイルス、細菌等の病
原体を同定することが行われている。しかしながらこれ
らの方法は、検体を培養するのに非常に長い時間を必要
としたり、ウイルス、細菌の種類によっては培養自体が
うまく行かないという問題もある。また、検体を培養す
るには特別の技術を要する点でも、必ずしも迅速、簡便
に満足のいく結果が得られる方法ではない。

【０００３】また、抗原抗体反応を利用してウイルス、
細菌等の病原体を同定する方法も行われている。この方
法は、検査の自動化も可能であり、迅速性、簡便性の点
では良い方法である。しかしながら、病原体を抗原とし
て検出する抗原検出方法においては、試料中に存在する
病原体の量が不足することにより、病原体を検出できな
い場合があり、感度的に問題がある。また、病原体の種
類に固有な抗原部位を決定することが困難であるという
問題もある。一方、病原体の感染により、体内で産生さ
れた抗体を検出する抗体検出法においては、病原体の感
染から抗体が産生されるまでに時間が必要で、その期間
は検出できないという問題がある。

【０００４】これらに対して、ウイルス、細菌等の病原
体の種類に固有な塩基配列を持つ核酸断片（ターゲット
核酸断片）を、塩基配列の相補性を利用して検出する方
法は、病原体を直接に同定することを可能にする方法で
あり、ＤＮＡプローブ法またはＰＣＲ（ポリメラーゼチ
ェーンリアクション）法などの遺伝子検査法として普及
している。例えば、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）遺伝子
検査法は、Ｃ型肝炎のインターフェロン（ＩＮＦ）治療
におけるＩＮＦ投与の検討、治癒のモニタリングにおい
て、ＨＣＶ量を直接知ることのできる方法として威力を
発揮している。

【０００５】今後さらに、ウイルス、細菌等の病原体の
遺伝子的特長（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）が明らかにされ、そ
の遺伝子的特徴を利用した新しい治療薬が開発されるこ
とが期待できる。その場合には、病原体の同定のみなら
ず、その病原体の遺伝子的特徴を知ることが非常に重要
である。まさに遺伝子検査法はその需要を満たすことの
できる検査方法である。

【０００６】一方、病原体の同定に限らず、遺伝子検査
法では個人の遺伝子的な特徴を直接検出することが可能
なので、遺伝子疾患の原因である遺伝子の変異の検出、
癌や糖尿病などの生活習慣病などの病気にかかりやすさ
を左右している遺伝子的要因の検出にも用いることがで
きる。特に、ヒトゲノムの全塩基配列が決定された後
は、ポストゲノム研究として、今まで以上に遺伝子的特
長と疾患の関係が明らかにされていき、さらに遺伝子的
特長を利用した治療薬が開発されていくことが期待でき
る。ポストゲノム研究の進展に伴って、今後ますます遺
伝子検査法の需要が大きくなっていくことが予想され
る。

【０００７】しかしながら、現在行われている遺伝子検
査法には特殊な技術、複雑な操作、及び特殊な装置等が
必要であり、遺伝子検査法を実施できる施設は、大規模
な検査センターなどに限られている。ウイルス、細菌等
による感染症の検査においても、また個人の遺伝子的特
長の検査においても、診断、治療の指針の決定がその場
で、できるだけ速く行えればより効力を発揮する。その
ためには、誰でもが簡単な操作で実施でき、検査結果を
迅速に得ることのできる新しい遺伝子検査法が必要であ
る。

【０００８】これまでも簡便性、迅速性の向上を目指し
て、ターゲット核酸断片を鋳型としたポリメラーゼ伸長
反応の進行の検出を利用した遺伝子検査法が開発されて
いる。ターゲット核酸断片の特定核酸領域をＰＣＲによ
り増幅する際、増幅産物の生成の過程を蛍光強度の変化
としてリアルタイムで検出する方法（Ｒｅａｌ Ｔｉｍ
ｅ ＰＣＲ法）は、ＰＣＲ後に増幅産物を電気泳動し、
結果を解析するという工程を必要としないことから迅速
性の点で良い方法であり、ＴａｑＭａｎプローブ法（Ｐ
Ｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、およびＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｅａｃｏｎ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）とし
て商品化されている。これらの方法は、ＦＲＥＴ（Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇ
ｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用した方法で、実施には蛍
光強度の変化を測定することのできる装置と、蛍光色素
とそのクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が組み合わせ
て標識された特殊なハイブリダイゼーションプローブを
用意する必要がある点で問題があり、未だ特殊技術の域
を出ていない。

【０００９】また、インターカレータ性蛍光物質の存在
下でターゲット核酸断片の特定核酸領域をＰＣＲで増幅
し、その際の蛍光強度の変化を検出する方法（ＩＭ−Ｐ
ＣＲ：Ｉｎｔｅｒｃａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉ
ｎｇ ＰＣＲ法）が「医学のあゆみ Ｖｏｌ.１７３，Ｎ
ｏ.１２，１９９５」に記載されている。この方法は、
Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法としては、特別なハイブリ
ダイゼーションプローブを必要としない点で良いが、や
はり実施には蛍光強度の変化を測定することのできる装
置が必要である。また、ターゲット核酸断片の特定核酸
領域のＰＣＲ増幅の有無にかかわらず、インターカレー
タ性蛍光物質は系内に存在する核酸断片全てに結合する
ので、特異性の点でも問題がある。

【００１０】一方、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を、イン
ターカレータを用いて電気化学応答として測定している
例が、「２０００年電気化学秋季大会，講演予稿集，２
Ｆ１７」及び「２００１年電気化学秋季大会，講演予稿
集，１Ｋ１１」に記載されている。これらの方法は、蛍
光強度の変化を測定する必要がなく、簡便性および省ス
ペースの点で優れている。しかしながら、実施の形態に
おいて、インターカレータが酸化還元活性を有する縫い
込み型インターカレータでなく、またＰＣＲによるＤＮ
Ａ増幅の検出が電気化学応答の減少を測定することで実
施される点で、検出感度と測定の再現性において問題が
残る。その点で、ターゲット核酸断片を鋳型としたポリ
メラーゼ反応により生成する二本鎖核酸断片の検出を、
酸化還元活性を有する縫い込み型インターカレータの存
在下に、電気化学応答の増加を測定することで実施す
る、本発明のターゲット核酸断片の検出方法とは異なる
ものである。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、特殊な技術
や複雑な操作を必要とせずに、誰でもが簡便かつ迅速に
小型の装置を用いて実施することのできるターゲット核
酸断片の検出方法を提供することを課題とする。またこ
れらの目的を達成するために、省スペースで自動化が可
能なターゲット核酸断片を検出する方法の提供も課題と
するものである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために、ターゲット核酸断片の特定の塩基配列
に基づくポリメラーゼ伸長反応により生成する二本鎖核
酸断片を、電気化学的活性インターカレータの存在下で
電気化学応答の増加として適時検出することで、簡便
性、迅速性に優れたターゲット核酸断片の検出を行える
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１３】即ち、本発明は、少なくとも一部の塩基配
列が既知であるターゲット核酸断片に対し、当該ターゲ
ット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプライ
マー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン酸
（ｄＮＴＰ）、及び少なくとも一種のポリメラーゼの存
在下に、前記ターゲット核酸断片を鋳型にして前記プラ
イマーの３’末端を起点とするポリメラーゼ伸長反応に
より生成する二本鎖核酸断片を適時検出することで、前
記ターゲット核酸断片の存在量またはターゲット核酸断
片の塩基配列を検出する方法において、前記ポリメラー
ゼ伸長反応により生成する二本鎖核酸断片の検出を、当
該二本鎖核酸断片に電気化学活性インターカレータを作
用させ、電気化学応答の変化を測定することにより行う
ことを特徴とするターゲット核酸断片の検出方法であ
る。

【００１４】また、本発明の別の形態での、ターゲット
核酸断片検出方法の好ましい形態は以下の通りである。 (イ) 電気化学応答の変化の測定が、電気化学応答の増
加を測定することによる。 (ロ) 電気化学活性インターカレータが、酸化還元活性
を有する縫い込み型インターカレータである。 (ハ) ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、及び逆転写酵素（リバーストランスクリプター
ゼ）からなるグループから選択されるポリメラーゼであ
る。 (ニ) 電気化学応答の測定が、サイクリックボルタンメ
トリーまたはディファレンシャルパルスボルタンメトリ
ーである。

【００１５】また、本発明の別の形態は、検出するター
ゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種のプラ
イマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシド３リン
酸（ｄＮＴＰ）、少なくとも一種のポリメラーゼを含有
するポリメラーゼ伸長反応試薬、及び気化学活性縫い込
み型インターカレータの各要素を含むキットにある。

【００１６】以下に本発明の実施の形態について詳細に
説明する。 (Ａ) ターゲット核酸断片：本発明において検出の対象
となるターゲット核酸断片とは、少なくとも一部の塩基
配列が既知であるポリヌクレオチドであり、動物、微生
物、細菌、植物などすべての生物から単離されるゲノミ
ックＤＮＡ断片が対象となり得る。またウイルスから単
離可能なＲＮＡ断片またはＤＮＡ断片、およびｍＲＮＡ
を鋳型として合成されたｃＤＮＡ断片も対象とすること
が可能である。ターゲット核酸断片はできる限り精製さ
れ、核酸断片以外の余分な成分が取り除かれていること
が望ましい。例えば、動物（例えば人間）の血液から単
離したゲノミックＤＮＡ断片を対象とする場合または血
液中に存在するの感染細菌やウイルスの核酸（ＤＮＡま
たはＲＮＡ）断片を対象とする場合、単離の過程で破壊
された白血球細胞膜、赤血球中から溶出したヘモグロビ
ン、および血液中存在するその他の一般化学物質は、十
分に取り除いておく必要がある。特にヘモグロンビン
は、続いておこなうポリメラーゼ伸長反応を阻害する。

【００１７】(Ｂ) ターゲット核酸断片と相補的なプラ
イマー：本発明において使用するターゲット核酸断片と
相補的なプライマーは、ターゲット核酸断片の塩基配列
が既知である目的の部位に対して相補的な塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドである。このターゲット核酸断
片と相補的なプライマーがターゲット核酸断片の目的の
部位にハイブリダイゼーションすることで、プライマー
の３’末端を起点に、ターゲット核酸を鋳型としポリメ
ラーゼ伸長反応が進行する。即ち、本発明においてはプ
ライマーがターゲット核酸断片の目的の部位を認識して
特異的にハイブリダイゼーションするか否かがポイント
となる。本発明で使用するプライマーの好ましい塩基数
は５〜６０塩基である。特に好ましいくは１５〜４０塩
基である。プライマーの塩基数は少なすぎると、ターゲ
ット核酸断片の目的の部位との特異的性が低下するだけ
でなく、ターゲット核酸断片とのハイブリッド自体が安
定に形成できない。また、プライマーの塩基数は多すぎ
ると、プライマー間またはプライマー内で塩基間の水素
結合により二本鎖を形成してしまい、やはり特異性が低
下する。

【００１８】本発明の方法を用いてターゲット核酸断片
の存在を検出する場合、ターゲット核酸断片の異なる部
位に対して、それぞれの部位に相補的なプライマーを複
数使用することも可能である。このようにターゲット核
酸断片を複数の部位で認識することで、ターゲット核酸
断片の存在の検出において、特異性が向上する。また、
ターゲット核酸断片の一部を増幅（例えばＰＣＲ法）す
る場合には、その増幅法に応じて複数のプライマーを設
計することも可能である。本発明の方法を用いてターゲ
ット核酸断片の塩基配列を検出する場合、特に変異また
は多型の有無を検出する場合は、目的の変異または多型
の部分を含むように、変異または多型に対応する塩基の
種類でプライマーを設計する。そうすることで、ターゲ
ット核酸断片の変異または多型の有無により、ターゲッ
ト核酸断片へのプライマーのハイブリダイゼーションの
有無に差異が生じ、結果的にポリメラーゼ伸長反応の差
異として検出することが可能になる。また、変異または
多型に対応する部分をプライマーの３’末端付近に設定
することでポリメーラーゼの反応部位の認識に差異が生
じ、結果的にポリメラーゼ伸長反応の差異として検出す
ることも可能である。

【００１９】(Ｃ) ポリメラーゼ：本発明において使用
するポリメラーゼは、ターゲット核酸がＤＮＡの場合
は、ターゲット核酸断片の一本鎖に変性された部分にプ
ライマーがハイブリダイゼーションすることで形成され
た二本鎖の部分を起点として、５’→３’の方向に、デ
オキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）を材料とし
て、ターゲット核酸断片を鋳型にして相補的な伸長反応
を触媒するＤＮＡポリメラーゼである。具体的に使用さ
れるＤＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ等がある。ＤＮＡポリメラーゼは目的
に応じて選択または組み合わせることが可能である。例
えば、ターゲット核酸断片の一部を増幅（例えばＰＣＲ
法）する場合には、耐熱性に優れたＴａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼを用いることが有効である。また、「ＢＩＯ
ＩＮＤＵＳＴＲＹ，Ｖｏｌ.１８，Ｎｏ.２，２００１」
に記載されている増幅法（ＬＡＭＰ法：Ｌｏｏｐ−ｍｅ
ｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ）を用いてターゲット核酸断片
の一部を増幅する場合には、５’→３’方向へのヌクレ
アーゼ活性がなく、かつ鋳型上の二本鎖ＤＮＡを１本鎖
ＤＮＡとして遊離させながら伸長反応を触媒する鎖置換
型のＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメ
ラーゼを使用することが有効である。その他、目的に応
じて、３’→５’方向へのヘキソキナーゼ活性を持つ、
ＤＮＡポリメラーゼα、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及
びＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを併用することも可能であ
る。

【００２０】また、ＲＮＡウイルスのゲノミック核酸ま
たはｍＲＮＡがターゲット核酸断片である場合には、逆
転写活性を有するリバーストランスクリプターゼを使用
することが可能である。さらにリバーストランスクリプ
ターゼとＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを併用することも
可能である。

【００２１】(Ｄ) ポリメラーゼ伸長反応：本発明にお
いて対象となるポリメラーゼ伸長反応には、前記(Ａ)に
記載されているようなターゲット核酸断片の１本鎖に変
性された部分の一部に特異的にハイブリダイゼーション
した、前記(Ｂ)に記載されているようなターゲット核酸
断片と相補的なプライマーの３’末端を起点として、デ
オキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）を材料とし
て、前記(Ｃ)に記載されているようなポリメラーゼを触
媒として、ターゲット核酸断片を鋳型にして進行する相
補的な核酸の伸長反応の全てが含まれる。

【００２２】以下に、例として代表的なポリメラーゼ伸
長反応、およびポリメラーゼ伸長反応を伴うターゲット
核酸断片の目的部位の増幅反応の例を示す。ターゲット
核酸断片を鋳型にして、５’→３’の方向へのポリメラ
ーゼ伸長反応を一度だけ行う場合が最も単純である。こ
のポリメラーゼ伸長反応は等温の条件で実施することが
できる。この場合には、ポリメラーゼ伸長反応の結果と
して生成する二本鎖核酸断片の量は、最初のターゲット
核酸断片の量に比例する。即ち定量的にターゲット核酸
断片の存在を検出するのに適した方法である。

【００２３】ターゲット核酸の量が少ない場合は、ポリ
メラーゼ伸長反応を利用した何らかの手段でターゲット
核酸の目的部分を増幅することが好ましい。ターゲット
核酸の増幅には、これまで開発、発明されてきた各種の
方法を使用することができる。ターゲット核酸の増幅法
で最も一般的で普及している方法はＰＣＲ（ポリメラー
ゼチェーンリアクション）法である。ＰＣＲ法では、反
応液の温度の上げ下げを周期的にコントロールすること
により、ディネイチャー（核酸断片を二本鎖から１本鎖
に変性する工程）→アニーリング（１本鎖に変性した核
酸断片にプライマーをハイブイリダイズさせる工程）→
ポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）伸長反応
→ディネイチャーの周期的な工程を繰り返すことで、タ
ーゲット核酸断片の目的部分を増幅する方法である。最
終的に、ターゲット核酸断片の目的部位は初期量の１０
０万倍にも増幅し得る。そのためＰＣＲ法の増幅過程で
のポリメラーゼ伸長反応で生成する二本鎖核酸断片の蓄
積量も多くなり、検出が容易になる。しかしながらＰＣ
Ｒ法を用いた場合には、ターゲット核酸断片の目的部位
は指数的に増幅するために、ターゲット核酸断片の初期
量を定量的に検出することは一般には困難である。

【００２４】ＰＣＲ法を用いたターゲット核酸断片の初
期量の定量的な検出は、予めターゲット核酸断片の初期
量と増幅の周期数（サイクル数）において生成している
二本鎖核酸断片の量との関係を求めておき（検量線を作
成しておき）、実際の検査時、ＰＣＲにより生成する二
本鎖核酸断片の量を、増幅の周期数に応じて適時に、ま
たはリアルタイムに測定し、求めておいたターゲット核
酸断片の初期量と増幅の周期数（サイクル数）において
生成している二本鎖核酸断片の量との関係（検量線）を
用いることにより可能である。

【００２５】特開平５−１３０８７０号公報に記載され
ている、エクソヌクレアーゼを用いたサイクリングアッ
セイ法もポリメラーゼ伸長反応を利用した、ターゲット
核酸断片の目的部位の増幅法の一つである。この方法は
ターゲット核酸断片の目的部位に特異的にハイブリダイ
ゼーションしたプライマーを起点とした、ポリメラーゼ
伸長反応とともに、５’→３’エクソヌクレアーゼを作
用させて、プライマーを逆方向から分解する方法であ
る。分解したプライマーの代わりに新たなプライマーが
ハイブリダイゼーションし、再度ＤＮＡポリメラーゼに
よる伸長反応が進行する。このポリメラーゼによる伸長
反応と、この先に伸長した鎖を外すエクソヌクレーアゼ
による分解反応が順次、周期的に繰り返される。ここ
で、ポリメラーゼによる伸長反応とエクソヌクレーアゼ
による分解反応は等温条件で実施することが可能であ
る。このサイクリングアッセイ法においても繰り返され
るポリメラーゼ伸長反応で生成する二本鎖核酸断片の蓄
積量も多くなり、検出が容易になる。

【００２６】近年、新しいターゲット核酸断片の目的部
位の増幅法として、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔ
ｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎｏｆ ＤＮＡ）法が「ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，Ｖｏ
ｌ.１８，Ｎｏ.２，２００１」に記載されている。この
方法は、ターゲット核酸断片の少なくとも６個所の特定
部位を相補的に認識する少なくとも４種のプライマー
と、５’→３’方向へのヌクレアーゼ活性がなく、かつ
鋳型上の二本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡとして遊離させな
がら伸長反応を触媒する鎖置換型のＢｓｔ ＤＮＡポリ
メラーゼを使用することで、等温条件でターゲット核酸
断片の目的部位を、特別な構造とって増幅する方法であ
る。このＬＡＭＰ法の増幅効率は高く、ポリメラーゼ伸
長反応で生成する二本鎖核酸断片の蓄積量も多くなり、
検出が容易になる。

【００２７】ターゲット核酸断片がＲＮＡ断片の場合
は、逆転写活性を有するリバーストランスクリプターゼ
を使用し、ＲＮＡ鎖を鋳型にして伸長反応を行うことが
可能である。さらにリバーストランスクリプターゼとＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを併用して、ＲＴ（リバース
トランスクリプション）反応に引き続いてＰＣＲ反応を
行う、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いることができる。このＲＴ
反応またはＲＴ−ＰＣＲ反応で生成する二本鎖核酸断片
を検出することで、ターゲット核酸断片のＲＮＡ断片の
存在量を検出することができる。この方法は、ＲＮＡウ
イルスの存在量を検出する場合に有効である。

【００２８】(Ｅ) 電気化学活性インターカレータ：本
発明で使用する電気化学活性インターカレータは、前記
(Ｄ)に示したようなポリメラーゼ伸長により生成する二
本鎖核酸断片にインターカレーションし、印加電圧に応
じて電気応答を示す。このような、電気化学活性インタ
ーカレータとして好ましいインターカレータは、酸化還
元活性を有する縫い込み型インターカレータである。酸
化還元活性を有する縫い込み型インターカレータとして
は、特開平９−２８８０８０号公報および文献（Ｊ.Ｃ
ｈｅｍ.Ｓｏｃ.Ｃｏｍｍｕｎ.，１１１１，１９９８）
に記載のインターカレータを用いることが特に好まし
い。

【００２９】さらに、該インターカレータとしては、下
記式(１)で表されるものも好ましく用いることができ
る。下記の式(１)で表されるインターカレータは、印加
電圧が４００乃至６００ｍＶの範囲にピーク電流値を有
する特徴を持つ。

【００３０】

【化１】

【００３１】上記の式(１)において、Ｎ−置換−イミノ
基は、縫い込み型インターカレータに可溶性を付与する
基であり、ＲおよびＲ¹は、互いに独立に、水素原子、
そして、置換基を有していてもよい炭素原子数が１乃至
３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４のアシル基、炭
素原子数が６乃至２０のアリール基、および炭素原子数
が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２
３のアラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは
基を表す。炭素原子数が１乃至３のアルキル基として
は、メチル基もしくはエチル基であることが好ましく、
メチル基であることが特に好ましい。炭素原子数が２乃
至４のアシル基としては、アセチル基であることが好ま
しい。炭素原子数が６乃至２０のアリール基としては、
フェニル基もしくはナフチル基であることが好ましく、
フェニル基であることが特に好ましい。炭素原子数が１
乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３の
アラルキル基としては、ベンジル基であることが好まし
い。ＲおよびＲ¹は、同一の原子もしくは基であること
が好ましく、メチル基であることが特に好ましい。

【００３２】置換基としては、ヒドロキシル基、ハロゲ
ン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、カルボキシル基、炭素原
子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃至６の
アルキルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のハロゲン化
アルキル基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、お
よび炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基からなる群よ
り選ばれる原子もしくは基を挙げることができる。置換
基の数は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原
子数が１乃至６のアルキルアミノ基、炭素原子数が１乃
至６のハロゲン化アルキル基、あるいは炭素原子数が１
乃至６のアルコキシ基については、１乃至１２個である
ことが好ましく、１乃至３個であることさらに好まし
く、１個であることが特に好ましい。炭素原子数が６乃
至１２のアリール基については、その数は１乃至７個で
あることが好ましく、１乃至３個であることがさらに好
ましく、１個であることが特に好ましい。

【００３３】ＹおよびＹ¹は、互いに独立に、−ＮＨ−
ＣＯ−基もしくは−ＣＯ−ＮＨ−基を表し、−ＮＨ−Ｃ
Ｏ−基であることが好ましい。これらの基のカルボニル
基もしくはイミノ基が、それぞれ、ＥおよびＥ¹と結合
する。

【００３４】ＥおよびＥ¹は、互いに独立に、一つの結
合手を有するフェロセンを表す。当該フェロセンは、置
換基を有していても有していなくてもよい。置換基を有
している場合には、同一であることが好ましい。以下
に、置換基を有するフェロセンの具体例を示す。置換基
の位置は、シクロペンタジエニル基の何れの位置であっ
てもよい。

【００３５】

【化２】

【００３６】ＸおよびＺは、互いに独立に、水素原子、
ハロゲン原子、あるいは炭素原子数１乃至６のアルキル
基を表すが、水素原子であることが好ましい。炭素原子
数１乃至６のアルキル基の好ましい例としては、前記記
載のＲ（もしくはＲ¹）と同様である。

【００３７】ｍ、ｎ、ｋおよびｐは、縫い込み型インタ
ーカレータのリンカー部分の長さを決定するものであ
り、各々、１乃至６の整数を表す。但し、ｍとｎとの
和、およびｋとｐとの和は、各々、４乃至８である。ｍ
とｋ、およびｎとｐとは、それぞれ、同一の数であるこ
とが好ましく、ｍ、ｎ、ｋおよびｐは、何れも３である
ことが特に好ましい。

【００３８】上述の導電性基で標識された縫い込み型イ
ンターカレータは、例えば、特開平９−２８８０８０号
公報に記載の方法によって簡便に収率良く製造すること
ができる。

【００３９】本発明においては、下記の式(２)で表わさ
れる酸化還元活性で標識された縫い込み型インターカレ
ータを用いることが特に好ましい。下記の式(２)で表さ
れるインターカレータは、印加電圧１００乃至４００ｍ
Ｖの範囲にピーク電流値を有する性質を持つ。

【００４０】 Ｅ_a−Ｌ_a−Ｘ−Ｌ_b−Ｅ_b （２）

【００４１】ただし、Ｅ_aおよびＥ_bは、互いに独立に、
酸化還元活性を示し、かつ共役系を含む基を表わし、Ｘ
は二価の環状基を表わし、そしてＬ_aおよびＬ_bは、互い
に独立に、それぞれがＥ_aおよびＥ_bの共役系が延長され
る共役系を形成することのない連結基であって、少なく
とも一方の連結基が、本化合物に水溶性を付与する部位
を有する連結基もしくは水溶性を付与する部位に変換し
得る部位を有する連結基である。

【００４２】上記式(２)において、Ｅ_aとＥ_b、そしてＬ
_aとＬ_bとが、それぞれ、互いに同一の基であることが好
ましい。また、Ｌ_a−Ｘ−Ｌ_bで表わされる連結部の主鎖
の最短の結合路を構成する原子の数が１０乃至１００の
間、なかでも１５乃至７０の間、特に２０乃至５０の間
にあることが好ましい。なお、この連結部の主鎖の最短
の結合路を構成する原子の数の計算を、前記のフェロセ
ンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに
適用すると、その原子の数は３２となる。

【００４３】また、Ｅ_aおよびＥ_bは、互いに独立に、そ
れぞれ置換基を有していてもよい、一もしくは二以上の
結合手を持つメタロセン、２，２’−ビピリジン錯体、
シクロブタジエン錯体、シクロペンタジエニル錯体、
１，１０−フェナントロリン錯体、トリフェニルホスフ
ィン錯体、カテコールアミンおよびビオローゲンからな
る群より選ばれる酸化還元活性基であることが好まし
い。

【００４４】上記式(２)の化合物は、特に下記式(３)で
表わされる化合物であることが好ましい。

【００４５】 Ｅ_a−Ｌ_1a−Ｌ_2a−Ｘ−Ｌ_2b−Ｌ_1b−Ｅ_b (３)

【００４６】但し、Ｅ_aおよびＥ_bは、互いに独立に、酸
化還元活性を有し、かつ共役系を含む基を表わし、Ｌ_1a
およびＬ_1bは、互いに独立に、それぞれがＥ_aおよびＥ_b
の共役系が延長される共役系を形成しない基を表わし、
Ｌ_2aおよびＬ_2bは、互いに独立に、水溶性を付与する部
位を有する連結基もしくは水溶性を付与する部位に変換
し得る部位を有する連結基を表わし、そしてＸは二価の
環状基を表わす。

【００４７】Ｌ_1aおよびＬ_1bは、互いに独立に、置換基
を有していてもよい炭化水素基、特に、置換基を有して
いてもよい炭素原子数が１乃至６のアルキレン基あるい
は置換基を有していてもよい炭素原子数が１乃至６のア
ルケニレン基であることが好ましい。

【００４８】Ｌ_2aおよびＬ_2bは、互いに独立に、炭素元
素以外の元素（例、Ｎ、Ｏ、もしくはＳ）を含む連結基
であることが好ましく、特に、置換基を有していてもよ
い、アミド結合基、エステル結合基、エーテル結合基、
チオエーテル結合基、ジイミド結合基、チオジイミド結
合基、チオアミド結合基、イミノ結合基、カルボニル結
合基、チオカルボニル結合基および１，４−ピペラジニ
ル基からなる群より選ばれる基を含む連結基であること
が好ましい。最も好ましいのは、−ＮＨＣＯ−基、もし
くは−ＣＯＮＨ−基である。なお、Ｅ_aとＥ_b、Ｌ_1aとＬ
_1b、そしてＬ_2aとＬ_2bとが、それぞれ、互いに同一の基
であることが有利である。

【００４９】上記式(２)および(３)の縫い込み型インタ
ーカレータを用いると、核酸断片の検出操作において電
極基板付与する電位として、１００乃至４００ｍＶの範
囲内の相対的に低い電位が利用できる。

【００５０】式(２)および式(３)において、Ｘは、置換
基を有していてもよい二価の環状基を表す。二価の環状
基としては、平面性を有する環状基であることが好まし
く、二つの窒素原子に結合手を有するナフタレンジイミ
ド基、２位と６位、もしくは１位と５位（好ましくは２
位と６位）とに結合手を有するアントラセン基、アント
ラセン基と同じ位置に結合手を有するアントラキノン
基、２位と６位とに結合手を有するフルオレン基、２位
と６位とに結合手を有するビフェニレン基、２位と７位
とに結合手を有するフェナントレン基、および２位と７
位とに結合手を有するピレン基からなる群より選ばれる
環状基であることが好ましく、二つの窒素原子に結合手
を有するナフタレンジイミド基であることが特に好まし
い。置換基としては、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃ
ｌ、Ｂｒ等）、あるいは炭素原子数１乃至６のアルキル
基であることが好ましいが、水素原子であることが好ま
しい。炭素原子数１乃至６のアルキル基としては、メチ
ル基、エチル基、もしくはｎ−プロピル基であることが
好ましい。

【００５１】前記式(２)において、Ｌ_aおよびＬ_bは、互
いに独立に、それぞれがＥ_aおよびＥ_bの共役系が延長さ
れる共役系を形成することのない連結基であって、少な
くとも一方の連結基が、本化合物に水溶性を付与する部
位を有する連結基もしくは水溶性を付与する部位に変換
し得る部位を有する連結基である。ここで、「水溶性を
付与する部位に変換し得る部位」とは、たとえば、メチ
ル基を置換基として有するイミノ基のように、硫酸など
の酸と接触した場合に、硫酸塩部位に変換され、水溶性
を示すように変化する部位を有する。勿論、「本化合物
に水溶性を付与する部位」に塩部分のような荷電部分を
持っていてもよい。

【００５２】Ｌ_aおよびＬ_bは、互いに独立に、Ｅ_aおよ
びＥ_bに隣接する側に、置換基を有していてもよい炭化
水素基（前記式(３)のＬ_1aとＬ_1bに相当する基）を有
し、一方、Ｘに隣接する側に炭素元素以外の元素を含む
連結基（前記式(３)のＬ_2aとＬ_2bに相当する基）とから
なる連結基であることが好ましい。従って、Ｌ_aおよび
Ｌ_bは、それぞれ、前記式(３)の−Ｌ_1a−Ｌ_2a−、そし
て−Ｌ_2b−Ｌ_1b−に該当する連結基であることが望まし
い。ここで、Ｌ_1aとＬ_1bは、互いに独立に、置換基を有
していてもよい炭素原子数が１乃至６のアルキレン基あ
るいは置換基を有していてもよい炭素原子数が２乃至６
のアルケニレン基であることが好ましく、一方、Ｌ_2aと
Ｌ_2bとは、互いに独立に、Ｎ、Ｏ、もしくはＳを含む連
結基であることが望ましい。

【００５３】Ｌ_1aおよびＬ_1bの置換基としては、ヒドロ
キシル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、
シアノ基、ニトロ基、ホルミル基、ホルミルアミノ基、
炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃
至６のアルキルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のハロ
ゲン化アルキル基、炭素原子数が５乃至７のシクロアル
キルアミノ基、炭素原子数が２乃至１２のジアルキルア
ミノ基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、炭素原
子数が１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃
至１８のアラルキル基、１乃至６のアルキル基を有する
炭素原子数が７乃至１８のアラルキルアミノ基、炭素原
子数が２乃至７のアルカノイル基、炭素原子数が２乃至
７のアルカノイルアミノ基、炭素原子数が３乃至１０の
Ｎ−アルカノイル−Ｎ−アルキルアミノ基、アミノカル
ボニル基、炭素原子数が２乃至７のアルコキシカルボニ
ル基、Ｓ、ＮおよびＯからなる群より選ばれるヘテロ原
子を１乃至４個含む炭素原子数２乃至１０の複素環基、
並びに置換基として炭素原子数１乃至６のアルキル基、
炭素原子数１乃至６のアルコキシ基、もしくはハロゲン
原子を１乃至５個有していてもよい環構成炭素原子数の
数が６乃至１２のアリール基からなる群より選ばれる原
子もしくは基である。置換基の数は、炭素原子数が１乃
至６のアルキレン基では、１乃至１２個であることが好
ましく、１乃至３個であることが特に好ましい。炭素原
子数が１乃至６のアルケニレン基については、その数は
１乃至１０個であることが好ましく、１乃至３個である
ことが特に好ましい。

【００５４】Ｌ_2aとＬ_2bとは、互いに独立に、それぞ
れ、置換基を有していてもよい、アミド結合基、エステ
ル結合基、エーテル結合基、チオエーテル結合基、ジイ
ミド結合基、チオジイミド結合基、チオアミド結合基、
イミノ結合基、カルボニル結合基、チオカルボニル結合
基および１，４−ピペラジニル基からなる群より選ばれ
る基を一個もしくは複数個含む連結基であることが好ま
しく、特に好ましいのはアミド基（−ＮＨＣＯ−基、も
しくは−ＣＯＮＨ−基）である。

【００５５】Ｌ_2aとＬ_2bの置換基の例としては、炭素原
子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４の
アシル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基および
炭素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数
が７乃至２３のアラルキル基からなる群より選ばれる基
で置換されていてもよい。炭素原子数が１乃至３のアル
キル基としては、メチル基もしくはエチル基であること
が好ましく、メチル基であることが特に好ましい。炭素
原子数が２乃至４のアシル基としては、アセチル基であ
ることが好ましい。炭素原子数が６乃至２０のアリール
基としては、フェニル基もしくはナフチル基であること
が好ましく、フェニル基であることが特に好ましい。炭
素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が
７乃至２３のアラルキル基としては、ベンジル基である
ことが好ましい。

【００５６】Ｌ_2aとＬ_2bがイミノ結合基である場合、そ
の置換基としては、メチル基であることが特に好まし
い。従って、Ｌ_2aとＬ_2bは、それぞれ独立に、Ｎ−メチ
ル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基、１，４−ジ（ｎ
−プロピレニル）−ピペラジニル基であることがさらに
好ましく、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ
基であることが特に好ましい。

【００５７】Ｅ_aおよびＥ_bは、酸化還元活性を有し、こ
れによって導電性を付与する基であり、互いに独立に、
置換基を有していてもよい、一つ以上の結合手を持つメ
タロセン、２，２’−ビピリジン錯体、シクロブタジエ
ン錯体、シクロペンタジエニル錯体、１，１０−フェナ
ントロリン錯体、トリフェニルホスフィン錯体、カテコ
ールアミン、あるいはビオローゲンなどであることが好
ましい。置換基を有していてもよい一つの結合手を持つ
フェロセンであることが特に好ましい。Ｅ_aおよびＥ_bは
互いに同一の基であることが好ましい。次に、置換基を
有するフェロセンの具体例を示す。置換基の位置は、シ
クロペンタジエニル基の何れの位置であってもよい。

【００５８】

【化３】

【００５９】上記の式(２)および(３)の縫い込み型イン
ターカレータとして有利に用いることのできる化合物
は、例えば、公知のジアミン化合物を原料として、公知
の方法（特開平９−２８８０８０号公報）に準じる製造
方法によって簡便に製造することができる。

【００６０】また式(２)および(３)の化合物は、公知の
ジアミン化合物を出発物質とする下記の式で代表される
合成ルートによっても安価に、かつ収率良く製造するこ
とができる。

【００６１】

【化４】

【００６２】(Ｇ) 電極：本発明で電気化学応答の測定
に使用する電極は通常、外部に出力する端子を備えてい
るものを用いる。電極の材料としては、金以外にも、グ
ラファイト、グラシーカーボン等の炭素電極、白金、パ
ラジウム、ロジウム等の貴金属電極、酸化チタン、酸化
スズ、酸化マンガン、酸化鉛等の酸化物電極、Ｓｉ、Ｇ
ｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ等の半導体電極、チタンなどの電子
伝導体を挙げることができるが、金もしくはグラシーカ
ーボンを用いることが特に好ましい。これらの電子伝導
体は、導電性高分子によって被覆されていても、単分子
膜によって被覆されていてもよい。電極は、例えば、電
極がグラシーカーボンである場合には、電極を過マンガ
ン酸カリウムで処理するなどの方法で表面処理しておく
ことが好ましい。

【００６３】本発明で用いられる電極は、底面に電極を
備えたウエル（穴）が基体に規則的に配置された電極、
および先端に電極を備えている棒状の基体を規則的に配
置したものも好ましく使用できる。また、導電性を持た
ない基体上に単数または複数の電極が配置されたもので
あっても良い。その場合、電極は、導電性を持たない基
体上に、互いに接しないように、かつ規則的に配置され
ていることが好ましい。例えば、板上の基体上に電極が
規則的に配置された電極も好ましく使用できる。

【００６４】(Ｆ) キット：本発明のターゲット核酸の
検出は、少なくとも一部の塩基配列が既知であるターゲ
ット核酸断片を含む液体を供給することのできる開口
部、ターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一
種のプライマー、少なくとも一種のデオキシヌクレオシ
ド３リン酸（ｄＮＴＰ）、及び少なくとも一種のポリメ
ラーゼを保持することのできる少なくとも一つの反応セ
ル部、電気化学活性縫い込み型インターカレータを保持
し、電極を備えている検出部、及び前記開口部、反応セ
ル部、検出部の間を連結し、液体を移動させることので
きる細管または溝を備えているカートリジを用いて実施
することが可能である。

【００６５】図１には、本発明におけるカートリッジ形
態のキットの一例を示した。キット（１０）において、
開口部（３１）からターゲット核酸を含有する試料液を
供給することができる。開口部（３１）は細管（４１）
によって、反応セル（３２）と連結されている。反応セ
ル（３２）には、予めターゲット核酸断片の一部と相補
的な少なくとも一種のプライマー（８１）、少なくとも
一種のデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）（８
２）、及び少なくとも一種のポリメラーゼ（８３）が保
持されている。さらに、反応セル（３２）は細管（４
２）によって、検出部（３３）と連結されている。検出
部（３３）には予め電気化学活性縫い込み型インターカ
レータ（８５）が保持され、電極（５１）が備えられて
いる。反応セル（３２）でポリメラーゼ伸長反応が進行
した試料液は、細管（４２）を移動して、検出部（３
３）に供給される。検出部（３３）に供給された試料液
中の、ポリメラーゼ伸長反応により生成した二本鎖核酸
断片に対して、電気化学活性縫い込み型インターカレー
タ（８５）が作用し、濃縮されることで、電極（５１）
で電気化学応答の変化として検出される。上記キット
（１０）において、開口部（３１）と反応セル（３２）
の間、及び反応セル（３２）と検出部（３３）の間の液
体の移動は、遠心力、電気泳動または電気浸透などを用
いることが可能である。また、反応セル（３２）、細管
（４１，４２）、検出部（３３）は、基体（２１）と蓋
（２２）によって密封されていることが望ましい。

【００６６】図１に示したようなキット（１０）を使用
する場合、図２に示したように、反応セル（３２）およ
び検出部（３３）の温度をコントロールすることのでき
る部分（６１，６２）と、電気化学応答の変化を検出す
る部分（７１）を備えている装置を併せて使用すること
が望ましい。

【００６７】本発明で使用することのできるカートリッ
ジ形態のキットは、図１に示されているものに限らな
い。反応セル内に電極を備えて、ポリメラーゼ反応と、
該ポリメラーゼ反応により生成する二本鎖核酸断片の電
気化学活性縫い込み型インターカレータを用いた検出と
を、同じスペース内で実施することを可能にするカート
シッジ形態であっても良い。

【００６８】また、１つのカートリッジ上に「開口部−
細管−反応セル−細管−検出部」の組を平行に並べて、
または同心円の半径方向に並べて、複数組設置すること
も可能である。この場合、例えば反応セルに保持する、
ターゲット核酸断片の一部と相補的な少なくとも一種の
プライマーの塩基配列を、ターゲットとする核酸の種類
に応じて変更することで、同時に複数種のターゲット核
酸を検出することが可能なキットを提供できる。

【００６９】以下、実施例にて本発明を詳細に説明す
る。しかしながら、本実施例により本発明の技術的範囲
が限定されるものではない。

【００７０】

【実施例】実施例１ Ｙ染色体短腕上のＳＲＹ遺伝子関
連部位の検出 (１) ターゲット核酸断片試料液の調整 男性、女性、各々１人づつから採取した血液検体に対し
て、市販の核酸抽出、精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を
用いて、抽出、精製したゲノミック核酸断片を１ｍＬの
精製蒸留水中に回収することで、ターゲット核酸断片試
料液を調整した。

【００７１】(２) プライマーの調整 プライマーは、Ｙ染色体短腕上のＳＲＹ遺伝子を特異的
に認識できるように設計した塩基配列を持つ、オリゴヌ
クレオチドのプライマーのセット（プライマー１、プラ
イマー２）として合成した。 ＜プライマーの塩基配列＞ プライマー１：５’−ＧＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴ
ＧＧＧＡＴＡＣＡＣＧＴＧ−３’ プライマー２：５’−ＣＴＧＴＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴ
ＧＣＧＧＴＧ−３’

【００７２】(３) ポリメラーゼ伸長反応によるターゲ
ット核酸断片の増幅 以下に示す反応液の組成で、ＰＣＲによるターゲット核
酸断片の増幅を実施した。ＰＣＲは、［デネイチャー：
９４℃・３０秒、アニーリング：６５℃・３０秒、ポリ
メラーゼ伸長反応：７２℃・１分］を３０サイクル繰り
返することで実施した。 ＜反応液の組成＞ 精製水 ３６．５μＬ １０×ＰＣＲバッファー ５μＬ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μＬ Ｔａｑ ＦＰ（ニッポンジーン社製） ０．５μＬ ２０μＭ プライマー ２μＬ ３０ｎｇ／μＬ ターゲット核酸断片試料液 ２μＬ

【００７３】(４) 電気化学的応答の変化の測定 前記(３)のポリメラーゼ伸長反応によるターゲット核酸
断片の増幅反応に、ターゲット核酸断片を含まない試料
液を用いた場合（コントロール）、男性から採取した血
液から調整したターゲット核酸試料液を用いた場合（サ
ンプルＭ）、及び女性から採取した血液から調整したタ
ーゲット核酸試料液を用いた場合（サンプルＦ）の、各
々の反応後の液を用いて、以下に示す組成の検出液を調
整した。 ＜検出液の組成＞ ポリメラーゼ伸長反応後の液 １００μＬ 電気化学活性縫い込み型インターカレータ（下記式(４)） ０．０２５ｍｇ ０．１Ｍ塩化カリウム−０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０） ４００μＬ

【００７４】

【化５】

【００７５】上記検出液に、電極（面積１．０ｍｍ²）
を接触し、印加電圧１００乃至７００ｍＶの範囲で、デ
ィファレンシャル・パルス・ボルタンメトリー（ＤＰ
Ｖ）測定を行った。次いで、印加電圧２６０ｍＶでの応
答電流値を求めたところ、コントロール、サンプルＭ、
サンプルＦについて、各々−０．４μＡ、−３．５μ
Ａ、及び−０．４μＡであった。ＤＰＶ測定は、パルス
振幅５０ｍＶ、パルス幅５０ｍＳおよびスキャン速度１
００ｍＶ／秒にて行った。

【００７６】実施例１は、男性に特有に存在するＹ染色
体短腕上のＳＲＹ遺伝子関連部位を特異的に検出できる
ことを示している。この実施例１の結果より、本発明の
ポリメラーゼ伸長反応の進行により生成する二本鎖核酸
断片に対して、電気化学活性インターカレータを作用さ
せ、電気化学応答の増加を測定する方法により、ターゲ
ット核酸断片の存在を検出することが可能であることが
わかる。

【００７７】実施例２ アルデヒド脱水素酵素遺伝子
（ＡＬＤＨ２遺伝子）関連部位の１塩基多型（ＳＮＰ
ｓ）検出 (１) ターゲット核酸断片試料液の調整 予め塩基配列のシーケンシングにより、ＡＬＤＨ２遺伝
子関連部位の特定の１塩基種が異なることにより、ＡＬ
ＤＨ２活性型またはＡＬＤＨ２不活性型であることが既
知である、各々１人から採取した血液検体をもとに、実
施例１の(２)に記載されている方法と同様にして、ター
ゲット核酸断片試料液を、各々サンプルＡＬＤＨ２活性
型、及びサンプルルＡＬＤＨ２不活性型として調整し
た。

【００７８】(２) プライマーの設計 プライマーは、１２番染色体上のＡＬＤＨ２遺伝子関連
部位のなかで、ＡＬＤＨ２の活性を決定する特定部分に
ついて、ＡＬＤＨ２活性型の塩基配列に特異的なプライ
マーとして設計した塩基配列を持つ、オリゴヌクレオチ
ドのプライマー（プライマー１）と、前記特定部位の下
流の塩基配列に特異的なプライマーとして設計した塩基
配列を持つ、オリゴヌクレオチドのプライマー（プライ
マー２）のセットとして合成した。 ＜プライマーの塩基配列＞ プライマー１：５’−ＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＴＧＡＡ
ＧＴＧＡＡＡＡＣＴＧ−３’ （下線部のＧＡＡの塩基配列がＡＡＡになるとＡＬＤＨ
２不活性型となる） プライマー２：５’−ＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＣ
ＡＧＣＡＧ−３’

【００７９】(３) 電気化学応答の変化の測定 ポリメラーゼ伸長反応によるターゲット核酸断片の増幅
（ＰＣＲ）は実施例１の(３)に、及びポリメラーゼ伸長
反応を行った後の反応液に対する電気化学的応答の測定
は実施例１の(４)に記載されている方法と同様にして、
印加電圧２６０ｍＶでの応答電流値を求めたところ、コ
ントロール、サンプルＡＬＤＨ２活性型、及びサンプル
ＡＬＤＨ２不活性型について、各々−０．２μＡ、−
３．８μＡ、及び−０．２μＡであった。

【００８０】実施例２は、１２番染色体上のＡＬＤＨ２
遺伝子関連部位のなかで、ＡＬＤＨ２の活性を決定する
特定部分の塩基配列違いを特異的に検出できることを示
している。この実施例２の結果より、本発明のポリメラ
ーゼ伸長反応の進行により生成する二本鎖核酸断片に対
して、電気化学活性インターカレータを作用させ、電気
化学応答の増加を測定する方法により、ターゲット核酸
断片の塩基配列を検出することが可能であることがわか
る。

【００８１】

【発明の効果】本発明によれば、ウイルス、細菌等によ
る感染症の臨床検査、及び個人の遺伝的な特徴による遺
伝的疾患の検査等に有効な、特定の塩基配列を有するタ
ーゲット核酸断片の検出の、簡便かつ迅速な方法および
キットが提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は本発明のカートリッジ形態でのキット
の例を示す斜視図である。

【図２】 図２は本発明のカートリッジ形態でのキット
を使用する場合のシステム構成を示す斜視図である。

【符号の説明】

１０…カートリッジ形態のキット ２１…基体 ２２…蓋 ３１…開口部 ３２…反応セル ３３…検出部 ４１，４２…細管 ５１…電極 ６１、６２…温度コントロール装置 ７１…電気化学的電流検出器 ８１、８２、８３…プライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラー
ゼ ８５…電気化学活性縫込み型インターカレータ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA02 HA19 4B063 QA01 QA11 QQ42 QR32 QR62 QS03 QS25 QS36 QX04

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも一部の塩基配列が既知である
   ターゲット核酸断片に対し、前記ターゲット核酸断片の
   一部と相補的な少なくとも一種のプライマー、少なくと
   も一種のデオキシヌクレオシド３リン酸、および少なく
   とも一種のポリメラーゼの存在下に、前記ターゲット核
   酸断片を鋳型にして前記プライマーの３’末端を起点と
   するポリメラーゼ伸長反応により生成する二本鎖核酸断
   片を検出することで、前記ターゲット核酸断片の存在量
   またはターゲット核酸断片の塩基配列を検出する方法に
   おいて、前記二本鎖核酸断片に電気化学活性インターカ
   レータを作用させ、電気化学応答の変化を測定すること
   により前記ポリメラーゼ伸長反応により生成する二本鎖
   核酸断片を検出することを特徴とするターゲット核酸断
   片の検出方法。
2. 【請求項２】 電気化学応答の変化が、電気化学応答の
   増加である請求項１に記載のターゲット核酸断片の検出
   方法。
3. 【請求項３】 電気化学活性インターカレータが、酸化
   還元活性を有する縫い込み型インターカレータである請
   求項１または２に記載のターゲット核酸断片の検出方
   法。
4. 【請求項４】 ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ
   Ｉ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｂｓｔ Ｄ
   ＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素からなるグループか
   ら選択される請求項１、２または３のいずれかに記載の
   ターゲット核酸断片の検出方法。
5. 【請求項５】 電気化学応答の測定が、サイクリックボ
   ルタンメトリーまたはディファレンシャルパルスボルタ
   ンメトリーである請求項１、２、３または４のいずれか
   に記載のターゲット核酸断片の検出方法。
6. 【請求項６】 検出するターゲット核酸断片の一部と相
   補的な少なくとも一種のプライマー、少なくとも一種の
   デオキシヌクレオシド３リン酸、少なくとも一種のポリ
   メラーゼを含有するポリメラーゼ伸長反応試薬、及び電
   気化学活性縫い込み型インターカレータの各要素を含む
   ターゲット核酸断片の検出キット。