JP4320188B2 - 一塩基置換検出方法及び一塩基置換検出用キット - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において特に有用な一塩基置換検出方法及びその方法を用いた一塩基置換検出用キットに関し、特に遺伝子配列における一塩基置換（point mutation）を簡便且つ迅速に検出する一塩基置換検出方法及び一塩基置換検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノム配列が解読された今日の研究目標の１つは、遺伝子の同定、機能の解析、さらに遺伝子発現や機能に影響して個体差を決める遺伝子の多様性である。ここで、核酸塩基配列中の一塩基の違いから生じる遺伝子の個体差のことを一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；ＳＮＰ) と呼び、遺伝子中に点在するＳＮＰが各種疾患と強く関連することが明らかとなっている。
【０００３】
現在、この一塩基置換を検出する方法としては、制限酵素で切断したＤＮＡ断片をゲルにより分離した後、色素でＤＮＡ断片を染色・検出するという電気泳動法が挙げられる。この方法は汎用されているものの、分離や染色に必要な時間が長く、迅速性に欠けるという欠点がある。
【０００４】
また、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップと呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板も、一塩基置換の検出に利用され始めている。このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多数のＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖やｃＤＮＡ等が集積されていることから、一度に多数の遺伝子検査が可能であり、臨床検査現場等への適用が期待されている。しかしながら、核酸塩基のミスマッチ形成に由来するＤＮＡ二本鎖の安定性を原理とする手法であるため、塩基配列によってはその温度制御が困難であり、さらに放射性物質や蛍光色素を被検体自体に修飾する前処理が必要である等の問題がある。
【０００５】
さらに、被検体の増幅と検出を同時に行うリアルタイムＰＣＲ法が、核酸増幅法による一段階の迅速な定量測定の技術として、近年普及しつつある。しかしながら、増幅反応における複雑な温度制御、プローブの導入も含めた各遺伝子配列に適用するプライマーの設計が複雑である上に、増幅装置や条件によって結果が異なる場合も少なくなく、再現性の面においても課題を残している。
【０００６】
このように、従来の遺伝子変異を検出する技術は、精密な温度制御、煩雑な被検体の前処理、測定までの時間が長い等の問題があり、簡便且つ迅速に遺伝子検査を行うことが不可能であった。
【０００７】
一方、下記非特許文献１には、ミスマッチ塩基対に結合する分子リガンドを固定化した表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance；ＳＰＲ）センサーを利用した新規な一塩基置換検出方法が提案されている。この文献記載の方法によれば、ＳＮＰを持つ２種類のＤＮＡからミスマッチ塩基対を含むヘテロＤＮＡを作成し、このＤＮＡ溶液をナフチリジン二量体が固定化されたＳＰＲセンサーチップ上に流してＳＰＲ信号強度を検出することにより、一塩基置換を迅速に検出することができる。
【０００８】
【非特許文献１】
中谷和彦，山東信介，齋藤烈 著，「表面プラズモン共鳴を利用した合成リガンドによるＤＮＡ中グアニン−グアニンミスマッチの検出法（Scannnig of guanine-guanine mismatches in DNA by synthetic ligands using surface plasmon resonance）」，ネイチャーバイオテクノロジー（Nature Biotechnology），２００１年１月，第１９号，ｐ．５１−５５
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この非特許文献１に記載の技術では、一塩基置換を検出するために予めミスマッチ塩基対を含むヘテロＤＮＡを作成する必要があり、ＳＰＲセンサーを用いる必要もあるため、より簡便且つ迅速に遺伝子検査を行う方法が望まれている。
【００１０】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、工程数を極力減らし、簡便且つ迅速に遺伝子の一塩基置換を検出する一塩基置換検出方法及び一塩基置換検出用キットを提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するために、本発明に係る一塩基置換検出方法は、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と相補的であり、且つ該一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用核酸を調製する工程と、上記標的核酸と上記検出用核酸とで二本鎖核酸を形成する工程と、上記二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターを添加し、上記一塩基置換部位と水素結合を形成させる工程と、上記レセプターの蛍光強度を測定する工程とを有する。
【００１２】
ここで、上記レセプターは、複素環式芳香族基を有し、上記一塩基置換部位との水素結合形成及び上記対応塩基の周囲の塩基とのスタッキング相互作用により安定化されることで、上記一塩基置換部位と対を形成するものが望ましい。具体的には、ナフチリジン誘導体、キノリン誘導体、プテリジン誘導体、クマリン誘導体及びインダゾール誘導体からなる群の少なくとも１つであり、例えば２−アミノ−７−メチルナフチリジン又は２−アミノ−４−オキソプテリジンである。
【００１３】
また、本発明に係る一塩基置換検出用キットは、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と相補的であり、且つ上記一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた、上記一本鎖の標的核酸とで二本鎖核酸を形成する一本鎖の検出用核酸と、上記二本鎖核酸に添加して、上記一塩基置換部位と水素結合を形成する水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターとを備え、上記レセプターは、プテリジン誘導体、クマリン誘導体及びインダゾール誘導体からなる群の少なくとも１つであり、該レセプターを上記一塩基置換部位との水素結合形成及び上記対応塩基の周囲の塩基とのスタッキング相互作用により安定化させることで、上記一塩基置換部位と対を形成させて、該レセプターの蛍光強度を測定する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
一般に、水素結合を利用する核酸塩基認識では、レセプター分子の水素結合様式や数を変化させることで、比較的容易に高い塩基選択性を獲得できる特徴を持つ。この際、完全水溶液中では水素結合形成に基づく認識機能の発現は期待できないため、従来の研究の多くは、クロロホルム中のような無極性溶媒環境下に限定されていたが、溶媒中の核酸が変性、沈殿する要因ともなっていた。
【００１５】
そこで、本実施の形態では、図１に概念的に示すように、ＳＮＰに関連する標的塩基１１を含む一本鎖の標的核酸１０とハイブリダイゼーションさせる一本鎖の検出用核酸２０のうち、標的塩基１１に対応する位置の塩基を予め除き、脱塩基部位２１としておく。そして、これらの標的核酸１０及び検出用核酸２０をハイブリダイゼーションさせることで標的塩基１１の周辺に意図的に疎水場空間を構築した後、この疎水場空間に水素結合型のレセプター分子３０を挿入する。
【００１６】
このように、核酸塩基を除いて構築された疎水場空間内に水素結合性のレセプター分子３０を挿入し、標的塩基１１と水素結合を形成させることで、完全水溶液中においても効果的に核酸塩基認識を行い、標的塩基１１の変異を検出することができる。
【００１７】
ここで、本実施の形態で分析可能な標的核酸１０としては、例えばヒトや植物由来のＤＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられるが、特に限定されず、必要に応じて希釈、濃縮、増幅を行う。
【００１８】
また、水素結合性を有するレセプター分子３０としては、水素結合部位を有し、発蛍光性であるような試薬が望ましい。具体的には、水素結合部位を少なくとも一段、好ましくは複数段有し、脱塩基部位に隣接する核酸塩基とスタッキングできるような複素環式芳香族基を有する試薬が望ましい。特に水溶性を有する試薬が好ましいが、非水溶性の場合には有機溶媒を微量用いることにより、対応が可能である。このようなレセプター分子としては、例えばナフチリジン誘導体、キノリン誘導体、プテリジン誘導体、クマリン誘導体、インダゾール誘導体等が挙げられる。
【００１９】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【００２０】
【実施例】
以下の実施例では、レセプター分子として、以下の化学式に示すようなナフチリジン誘導体である（ａ）２−アミノ−７−メチルナフチリジン（ＡＭＮＤ）と、プテリジン誘導体である（ｂ）２−アミノ−４−オキソプテリジン（プテリン）とを準備した。このうち、プテリンは和光純薬株式会社から購入し（Cat.No.539-32611）、ＡＭＮＤは、文献「E.V.Brown, J. Org. Chem., Vol.30, p1607, 1965」を参考にして、１，１−ジメトキシブタノンから合成した。
【００２１】
【化１】
【００２２】
この２つのレセプター分子は発蛍光性を有し、後述するように、検出用ＤＮＡの脱塩基部位に挿入されたときに標的塩基と相互作用し、標的塩基の違いに基づき蛍光強度が変化するため、蛍光強度を測定することで一塩基置換を検出することができる。
【００２３】
ここで、ＤＮＡとレセプター分子とを混合する際、レセプター分子は、該レセプター分子を含有する溶液の形態で混合してもよく、粉末や固形状の形態で混合してもよい。また、蛍光測定は、ＵＶランプを用いて目視で行ってもよく、蛍光分光器、蛍光顕微鏡、デンシトメーター等の機器を用いてもよい。
【００２４】
また、レセプター分子による一塩基置換検出の効果を検証するために、以下のような検出用ＤＮＡ（配列Ａ）と標的ＤＮＡ（配列Ｂ）とをモデル配列として、株式会社日本遺伝子研究所に受注して合成した。
（配列Ａ）５'−ＴＣＣＡＧＸＧＣＡＡＣ−３'（配列番号１）
（配列Ｂ）３'−ＡＧＧＴＣＮＣＧＴＴＧ−５'（配列番号２〜５）
ここで、上記配列中、Ｘは脱塩基部位（AP site）であり、具体的には以下の化学式に示すようなテトラヒドロフラニル残基（dSpacer）を示す。また、ＮはＧ（配列番号２），Ｃ（配列番号３），Ａ（配列番号４），Ｔ（配列番号５）の何れかを示す。
【００２５】
【化２】
【００２６】
実施例１
ＤＮＡ融解温度（Ｔｍ）の測定
実施例１では、二本鎖が一本鎖に解離する融解温度（melting temprature；Ｔｍ）を測定し、レセプター分子の添加前後におけるＴｍ値の変化から、ＤＮＡとの相互作用を検討した。具体的には、脱塩基部位を含む一本鎖の検出用ＤＮＡ（上記配列Ａ）と被検体となる一本鎖の標的ＤＮＡ溶液（上記配列Ｂ）とがアニーリングした二本鎖ＤＮＡ溶液が３０μＭ、イオン強度調節剤としてＮａＣｌが１００ｍＭ、緩衝剤として１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、レセプター分子としてＡＭＮＤ又はプテリンがそれぞれ５８０μＭ、２９０μＭとなるようにＭilliＱ水を加えて調製したＤＮＡ溶液を毎秒１．５℃の割合で加熱してＴｍ値を測定した。
【００２７】
ここで、一本鎖ＤＮＡの濃度は、文献「Puglisi J.D. et al., Methods in enzymology, Vol.180, p304-p325, 1989」を参考にして、モル吸光係数算出法を用いて吸光度で調整した。この際、脱塩基部位を含む一本鎖ＤＮＡ（上記配列Ａ）のモル吸光係数は、ＴＣＧＧＡの吸光係数とＧＣＡＡＣの吸光係数との和とした。また、アニーリングは、サーマルサイクラーを用いて７５℃で１０分間加熱した後、毎秒３℃の割合で５℃まで冷却し、毎秒１℃の割合で２０℃まで再度加熱することにより行った。
【００２８】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＮがＧ，Ｃ，Ａ，Ｔである場合のそれぞれについて、レセプター分子の添加前のＴｍ値（Ｔｍ（−））、添加後のＴｍ値（Ｔｍ（＋））及びその変化量（ΔＴｍ）の測定結果を以下の表１に示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
表１に示すように、ＡＭＮＤを添加した場合には、標的塩基ＮがＡ＜Ｇ＜Ｔ＜Ｃの順でＴｍ値が上昇しており、ＡＭＮＤのピリミジン塩基選択性が確認できる。一方、プテリンを添加した場合には、標的塩基ＮがＧである場合にＴｍ値が有意に上昇しており、プテリンのグアニン選択性が確認できる。
【００３１】
また、Ｎ＝Ｃである二本鎖ＤＮＡを３０μＭ含むＤＮＡ溶液にＡＭＮＤを添加した場合のＴｍ値のＡＭＮＤ濃度依存性について検討した。結果を図２に示す。図２に示すように、ＡＭＮＤ添加によるＴｍ値の上昇は比較的低濃度から生じ、５００μＭの濃度以上でほぼ完全に上昇が飽和に達している。
【００３２】
実施例２
ＣＤスペクトルの測定
実施例２では、二本鎖のＣＤスペクトルを測定し、レセプター分子の添加前後におけるＣＤスペクトルの変化から、ＤＮＡとの相互作用を検討した。具体的には、脱塩基部位を含む一本鎖ＤＮＡ（上記配列Ａ）と被検体となる一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列Ｂ）とがアニーリングした二本鎖ＤＮＡ溶液が３０μＭ、ＮａＣｌが１００ｍＭ、ＥＤＴＡが１ｍＭ、カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、レセプター分子としてＡＭＮＤが７２．５μＭとなるようにＭilliＱ水を加えて調製したＤＮＡ溶液について、ＣＤスペクトルを測定した。
【００３３】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＮがＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔである場合のそれぞれについて、ＡＭＮＤの添加前（破線）及び添加後（実線）のＣＤスペクトルの結果を図３（ａ）〜（ｄ）に示す。図３に示すように、標的塩基ＮがＣ，Ｔのときに選択的にＣＤスペクトルが変化していることが確認される。これは実施例１におけるＡＭＮＤのピリミジン塩基選択性の結果を支持するものであった。
【００３４】
また、Ｎ＝Ｃである二本鎖ＤＮＡを３０μＭ含むＤＮＡ溶液にＡＭＮＤを添加した場合のＣＤスペクトルのＡＭＮＤ濃度依存性について検討した。結果を図４に示す。なお、図４には、二本鎖ＤＮＡ溶液に７２．５μＭのＡＭＮＤを添加する前（破線）と添加した後（実線）の吸光度と、５８０μＭのＡＭＮＤの吸光度とを併せて示している。図４に示すように、ＡＭＮＤ濃度の上昇に応じて、特に２４５ｎｍ付近及び２８０ｎｍ付近でモル楕円率θが上昇しており、３０μＭの濃度以上でほぼ完全に上昇が飽和に達している。
【００３５】
波長が２７８．５ｎｍのときのＡＭＮＤ濃度とモル楕円率θとの関係を図５に示す。図５に示すように、ＡＭＮＤ添加によるモル楕円率θの上昇は３０μＭの濃度以上でほぼ完全に飽和に達している。この結果、ＡＭＮＤの標的塩基Ｎへの結合定数Ｋ１１は１０６Ｍ−１以上と求められ、ＡＭＮＤが脱塩基部位Ｘに安定に取り込まれていることが分かる。
【００３６】
実施例３
立体構造の検討
実施例３では、標的塩基ＮがＣ，Ｔ，Ａ，Ｇである場合のそれぞれについて、ＡＭＮＤ添加後のＡｍｂｅｒ力場（Macro Model）による最安定化構造を検討した。シミュレーション結果を図６（ａ）〜（ｄ）に示す。図６に示すように、標的塩基ＮがＣの場合にはＡＭＮＤ分子が隣接するグアニン残基と重なっているのに対し、それ以外の場合には隣接するグアニン残基からずれていることが確認できる。この結果から、ＡＭＮＤの塩基選択性が標的塩基Ｎとの水素結合形成、及び隣接する核酸塩基とのスタッキング相互作用に由来するものであることが推察される。
【００３７】
実施例４
蛍光スペクトルの測定
実施例４では、レセプター分子添加後の蛍光強度の減少値（−ΔＦ.Ｉ.）を測定した。具体的には、脱塩基部位を含む一本鎖ＤＮＡ（上記配列Ａ）と被検体となる一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列Ｂ）とがアニーリングした二本鎖ＤＮＡ溶液が６０μＭ、ＮａＣｌが１００ｍＭ、ＥＤＴＡが１ｍＭ、カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、レセプター分子としてＡＭＮＤ又はプテリンがそれぞれ６０μＭ、１５μＭとなるようにＭilliＱ水を加えて調製したＤＮＡ溶液について、蛍光強度を測定した。蛍光測定は、光路長１ｍｍの蛍光測定用セルを用い、反射蛍光測定により行った。
【００３８】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＮがＧ，Ｃ，Ａ，Ｔである場合のそれぞれについて、ＡＭＮＤ、プテリンの添加後における蛍光強度の減少値をそれぞれ図７、図８に示す。ここで、図７は励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４０２ｎｍであり、図８は励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４４５ｎｍである。図７、８に示すように、ＡＭＮＤを添加した場合には、標的塩基ＮがＣ，Ｔといったピリミジン塩基のときに選択的に消光しており、プテリンを添加した場合には、標的塩基ＮがＧのときに選択的に消光している。
【００３９】
実施例５
実際の配列での検討１
実施例５では、実際のｐ５３関連遺伝子の１７７番アミノ酸における一塩基置換を検出する効果を検証するために、以下のような配列を株式会社日本遺伝子研究所に受注して合成した。ここで、下記配列中、Ｘは脱塩基部位（AP site）であり、ＳはＧ（グアニン）又はＣ（シトシン）を示す。
（配列Ｃ）５'−ＣＴＧＣＣＳＣＣＡＣＣ−３'（配列番号６，７）
（配列Ｄ）３'−ＧＡＣＧＧＸＧＧＴＧＧ−５'（配列番号８）
上記配列Ｃにおいて、脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基Ｓは、正常型ではＣ（配列番号６）であり、変異型ではＧ（配列番号７）である。これにより、１７７番アミノ酸はプロリンからアルギニンに変異する。本実施例では、このＣからＧへの変異を検出するために脱塩基部位Ｘを設け、構築された疎水場空間にレセプター分子を導入した。なお、レセプター分子としては、標的塩基ＳがＣであるときに選択的に消光するＡＭＮＤを用いた。
【００４０】
具体的には、被検体となる１Ｍの一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列Ｃ）と脱塩基部位を含む１Ｍの一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列Ｄ）とをそれぞれ２５μｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌを５０μｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を５０μｌ、１２５μＭ ＡＭＮＤを５０μｌ混合し、ＭilliＱ水を加えて全量を２５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液について、サーマルサイクラーでアニーリング処理を行ったものと行わなかったものとを準備し、蛍光強度を測定した。蛍光測定は、光路長１ｍｍの蛍光測定用セルを用い、反射蛍光測定により行った。
【００４１】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＳがＣ，Ｇである場合のそれぞれについて、ＤＮＡを加えなかった場合の蛍光強度（Ｆ０）と、加えた場合の蛍光強度（Ｆ）との比（Ｆ／Ｆ０）を図９に示す。ここで、図９における励起波長は３５０ｎｍであり、蛍光波長は４００ｎｍである。また、サンプル０１はアニーリング処理を行わなかったＤＮＡ溶液であり、サンプル０２，０３はアニーリング処理を行ったＤＮＡ溶液である。図９に示すように、標的塩基ＳがＣである場合に著しく消光しているため、消光の有無を検出することで、標的塩基ＳがＣ（シトシン）であるかＧ（グアニン）であるかを知ることができる。
【００４２】
アニーリング処理を行わなかったＤＮＡ溶液をプラスチック製の透明チューブに入れ、励起波長３０２ｎｍのＵＶランプを用いて蛍光を目視検出した結果を図１０に示す。図１０に示すように、標的塩基ＳがＣである場合に著しく消光しており、目視でも確認可能である。
【００４３】
実施例６
実際の配列での検討２
実施例６では、実際のｐ５３関連遺伝子の１７５番アミノ酸における一塩基置換を検出する効果を検証するために、以下のような配列を株式会社日本遺伝子研究所に受注して合成した。ここで、下記配列中、Ｘは脱塩基部位（AP site）であり、ＲはＧ（グアニン）又はＡ（アデニン）を示す。
（配列Ｅ）５'−ＧＡＧＧＣＲＣＴＧＣＣ−３'（配列番号９，１０）
（配列Ｆ）３'−ＣＴＣＣＧＸＧＡＣＧＧ−５'（配列番号１１）
上記配列Ｅにおいて、脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基Ｒは、正常型ではＧ（配列番号９）であり、変異型ではＡ（配列番号１０）である。これにより、１７５番アミノ酸はアルギニンからヒスチジンに変異する。本実施例では、このＧからＡへの変異を検出するために脱塩基部位Ｘを設け、構築された疎水場空間にレセプター分子を導入した。なお、レセプター分子として標的塩基ＲがＧであるときに選択的に消光するプテリンを用いた以外は、実施例５と同様にして行った。
【００４４】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＲがＧ，Ａである場合のそれぞれについて、ＤＮＡを加えなかった場合の蛍光強度（Ｆ０）と、加えた場合の蛍光強度（Ｆ）との比（Ｆ／Ｆ０）を図１１に示す。ここで、図１１における励起波長は３６０ｎｍであり、蛍光波長は４４０ｎｍである。また、サンプル０１はアニーリング処理を行わなかったＤＮＡ溶液であり、サンプル０２はアニーリング処理を行ったＤＮＡ溶液である。図１１に示すように、標的塩基ＲがＧである場合に消光しているため、消光の有無を検出することで、標的塩基ＲがＧ（グアニン）であるかＡ（アデニン）であるかを知ることができる。
【００４５】
アニーリング処理を行わなかったＤＮＡ溶液について、励起波長３０２ｎｍのＵＶランプを用いることで、蛍光を目視検出した結果を図１２に示す。図１２に示すように、対応塩基ＲがＧである場合に消光しており、目視でも確認可能である。
【００４６】
このように、本実施の形態における一塩基置換検出方法によれば、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的ＤＮＡと、この標的ＤＮＡと相補的であり、且つ一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用ＤＮＡとで二本鎖核酸を形成させ、この二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプター分子を添加して一塩基置換部位と水素結合を形成させ、このレセプター分子の蛍光強度変化を測定することにより、一塩基置換を効果的に検出することができる。
【００４７】
特に、被検体となる標的ＤＮＡのラベル化や熱制御等の煩雑な操作が原則的に不要であるため工程数が非常に少なく、また、原理上二本鎖ＤＮＡ自体の熱的な安定性に依存しないため、検出までの時間が非常に短時間であり、再現性にも優れている。また、ＵＶランプを用いた目視による確認も可能であるため、特別な設備を持たない状況下においても検出が可能である。
【００４８】
さらに、脱塩基部位を含む検出用ＤＮＡを基板に多数集積したＤＮＡマイクロアレイを作製し、一塩基置換検出用キットとして用いることで、従来の欠点を克服したハイスループットな診断が可能となる。
【００４９】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明に係る一塩基置換検出方法によれば、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と、この標的核酸と相補的であり、且つ一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させ、この二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターを添加して一塩基置換部位と水素結合を形成させ、このレセプターの蛍光強度変化を測定することにより、一塩基置換を簡便且つ迅速に検出することができる。
【００５０】
また、本発明に係る一塩基置換検出用キットによれば、従来の欠点を克服したハイスループットな診断が可能となる。
【００５１】
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：人工的に合成された11-merのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。６番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
配列番号２：人工的に合成された配列
配列番号３：人工的に合成された配列
配列番号４：人工的に合成された配列
配列番号５：人工的に合成された配列
配列番号６：人工的に合成された配列
配列番号７：人工的に合成された配列
配列番号８：人工的に合成された11-merのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。６番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
配列番号９：人工的に合成された配列
配列番号１０：人工的に合成された配列
配列番号１１：人工的に合成された11-merのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。６番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施の形態における一塩基検出の原理を説明する図である。
【図２】標的塩基がシトシンである場合のＴｍ値のＡＭＮＤ濃度依存性を示す図である。
【図３】標的塩基がアデニン、シトシン、グアニン、チミンである場合のＡＭＮＤの添加前後のＣＤスペクトルを示す図である。
【図４】標的塩基がシトシンである場合のＣＤスペクトルのＡＭＮＤ濃度依存性を示す図である。
【図５】標的塩基がシトシンである場合のＡＭＮＤ濃度とモル楕円率との関係を示す図である。
【図６】ＡＭＮＤ添加後のＡｍｂｅｒ力場（Macro Model）による最安定化構造を示す図であり、
【図７】ＡＭＮＤ添加後の蛍光強度の減少値を示す図である。
【図８】プテリン添加後の蛍光強度の減少値を示す図である。
【図９】標的塩基がシトシン、グアニンである場合のＡＭＮＤ添加後の蛍光スペクトルを示す図である。
【図１０】標的塩基がシトシン、グアニンである場合のＡＭＮＤ添加後の蛍光を示す図である。
【図１１】標的塩基がシトシン、グアニンである場合のプテリン添加後の蛍光スペクトルを示す図である。
【図１２】標的塩基がシトシン、グアニンである場合のプテリン添加後の蛍光を示す図である。
【符号の説明】
１０ 標的核酸、１１ 標的塩基、２０ 検出用核酸、２１ 脱塩基部位、３０ レセプター分子
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において特に有用な一塩基置換検出方法及びその方法を用いた一塩基置換検出用キットに関し、特に遺伝子配列における一塩基置換（point mutation）を簡便且つ迅速に検出する一塩基置換検出方法及び一塩基置換検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノム配列が解読された今日の研究目標の１つは、遺伝子の同定、機能の解析、さらに遺伝子発現や機能に影響して個体差を決める遺伝子の多様性である。ここで、核酸塩基配列中の一塩基の違いから生じる遺伝子の個体差のことを一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；ＳＮＰ) と呼び、遺伝子中に点在するＳＮＰが各種疾患と強く関連することが明らかとなっている。
【０００３】
現在、この一塩基置換を検出する方法としては、制限酵素で切断したＤＮＡ断片をゲルにより分離した後、色素でＤＮＡ断片を染色・検出するという電気泳動法が挙げられる。この方法は汎用されているものの、分離や染色に必要な時間が長く、迅速性に欠けるという欠点がある。
【０００４】
また、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップと呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板も、一塩基置換の検出に利用され始めている。このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多数のＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖やｃＤＮＡ等が集積されていることから、一度に多数の遺伝子検査が可能であり、臨床検査現場等への適用が期待されている。しかしながら、核酸塩基のミスマッチ形成に由来するＤＮＡ二本鎖の安定性を原理とする手法であるため、塩基配列によってはその温度制御が困難であり、さらに放射性物質や蛍光色素を被検体自体に修飾する前処理が必要である等の問題がある。
【０００５】
さらに、被検体の増幅と検出を同時に行うリアルタイムＰＣＲ法が、核酸増幅法による一段階の迅速な定量測定の技術として、近年普及しつつある。しかしながら、増幅反応における複雑な温度制御、プローブの導入も含めた各遺伝子配列に適用するプライマーの設計が複雑である上に、増幅装置や条件によって結果が異なる場合も少なくなく、再現性の面においても課題を残している。
【０００６】
このように、従来の遺伝子変異を検出する技術は、精密な温度制御、煩雑な被検体の前処理、測定までの時間が長い等の問題があり、簡便且つ迅速に遺伝子検査を行うことが不可能であった。
【０００７】
一方、下記非特許文献１には、ミスマッチ塩基対に結合する分子リガンドを固定化した表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance；ＳＰＲ）センサーを利用した新規な一塩基置換検出方法が提案されている。この文献記載の方法によれば、ＳＮＰを持つ２種類のＤＮＡからミスマッチ塩基対を含むヘテロＤＮＡを作成し、このＤＮＡ溶液をナフチリジン二量体が固定化されたＳＰＲセンサーチップ上に流してＳＰＲ信号強度を検出することにより、一塩基置換を迅速に検出することができる。
【０００８】
【非特許文献１】
中谷和彦，山東信介，齋藤烈 著，「表面プラズモン共鳴を利用した合成リガンドによるＤＮＡ中グアニン−グアニンミスマッチの検出法（Scannnig of guanine-guanine mismatches in DNA by synthetic ligands using surface plasmon resonance）」，ネイチャーバイオテクノロジー（Nature Biotechnology），２００１年１月，第１９号，ｐ．５１−５５
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この非特許文献１に記載の技術では、一塩基置換を検出するために予めミスマッチ塩基対を含むヘテロＤＮＡを作成する必要があり、ＳＰＲセンサーを用いる必要もあるため、より簡便且つ迅速に遺伝子検査を行う方法が望まれている。
【００１０】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、工程数を極力減らし、簡便且つ迅速に遺伝子の一塩基置換を検出する一塩基置換検出方法及び一塩基置換検出用キットを提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するために、本発明に係る一塩基置換検出方法は、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と相補的であり、且つ該一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用核酸を調製する工程と、上記標的核酸と上記検出用核酸とで二本鎖核酸を形成する工程と、上記二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターを添加し、上記一塩基置換部位と水素結合を形成させる工程と、上記レセプターの蛍光強度を測定する工程とを有する。
【００１２】
ここで、上記レセプターは、複素環式芳香族基を有し、上記一塩基置換部位との水素結合形成及び上記対応塩基の周囲の塩基とのスタッキング相互作用により安定化されることで、上記一塩基置換部位と対を形成するものが望ましい。具体的には、ナフチリジン誘導体、キノリン誘導体、プテリジン誘導体、クマリン誘導体及びインダゾール誘導体からなる群の少なくとも１つであり、例えば２−アミノ−７−メチルナフチリジン又は２−アミノ−４−オキソプテリジンである。
【００１３】
また、本発明に係る一塩基置換検出用キットは、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と相補的であり、且つ上記一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた、上記一本鎖の標的核酸とで二本鎖核酸を形成する一本鎖の検出用核酸と、上記二本鎖核酸に添加して、上記一塩基置換部位と水素結合を形成する水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターとを備え、上記レセプターは、プテリジン誘導体、クマリン誘導体及びインダゾール誘導体からなる群の少なくとも１つであり、該レセプターを上記一塩基置換部位との水素結合形成及び上記対応塩基の周囲の塩基とのスタッキング相互作用により安定化させることで、上記一塩基置換部位と対を形成させて、該レセプターの蛍光強度を測定する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
一般に、水素結合を利用する核酸塩基認識では、レセプター分子の水素結合様式や数を変化させることで、比較的容易に高い塩基選択性を獲得できる特徴を持つ。この際、完全水溶液中では水素結合形成に基づく認識機能の発現は期待できないため、従来の研究の多くは、クロロホルム中のような無極性溶媒環境下に限定されていたが、溶媒中の核酸が変性、沈殿する要因ともなっていた。
【００１５】
そこで、本実施の形態では、図１に概念的に示すように、ＳＮＰに関連する標的塩基１１を含む一本鎖の標的核酸１０とハイブリダイゼーションさせる一本鎖の検出用核酸２０のうち、標的塩基１１に対応する位置の塩基を予め除き、脱塩基部位２１としておく。そして、これらの標的核酸１０及び検出用核酸２０をハイブリダイゼーションさせることで標的塩基１１の周辺に意図的に疎水場空間を構築した後、この疎水場空間に水素結合型のレセプター分子３０を挿入する。
【００１６】
このように、核酸塩基を除いて構築された疎水場空間内に水素結合性のレセプター分子３０を挿入し、標的塩基１１と水素結合を形成させることで、完全水溶液中においても効果的に核酸塩基認識を行い、標的塩基１１の変異を検出することができる。
【００１７】
ここで、本実施の形態で分析可能な標的核酸１０としては、例えばヒトや植物由来のＤＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられるが、特に限定されず、必要に応じて希釈、濃縮、増幅を行う。
【００１８】
また、水素結合性を有するレセプター分子３０としては、水素結合部位を有し、発蛍光性であるような試薬が望ましい。具体的には、水素結合部位を少なくとも一段、好ましくは複数段有し、脱塩基部位に隣接する核酸塩基とスタッキングできるような複素環式芳香族基を有する試薬が望ましい。特に水溶性を有する試薬が好ましいが、非水溶性の場合には有機溶媒を微量用いることにより、対応が可能である。このようなレセプター分子としては、例えばナフチリジン誘導体、キノリン誘導体、プテリジン誘導体、クマリン誘導体、インダゾール誘導体等が挙げられる。
【００１９】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【００２０】
【実施例】
以下の実施例では、レセプター分子として、以下の化学式に示すようなナフチリジン誘導体である（ａ）２−アミノ−７−メチルナフチリジン（ＡＭＮＤ）と、プテリジン誘導体である（ｂ）２−アミノ−４−オキソプテリジン（プテリン）とを準備した。このうち、プテリンは和光純薬株式会社から購入し（Cat.No.539-32611）、ＡＭＮＤは、文献「E.V.Brown, J. Org. Chem., Vol.30, p1607, 1965」を参考にして、１，１−ジメトキシブタノンから合成した。
【００２１】
【化１】
この２つのレセプター分子は発蛍光性を有し、後述するように、検出用ＤＮＡの脱塩基部位に挿入されたときに標的塩基と相互作用し、標的塩基の違いに基づき蛍光強度が変化するため、蛍光強度を測定することで一塩基置換を検出することができる。
【００２３】
ここで、ＤＮＡとレセプター分子とを混合する際、レセプター分子は、該レセプター分子を含有する溶液の形態で混合してもよく、粉末や固形状の形態で混合してもよい。また、蛍光測定は、ＵＶランプを用いて目視で行ってもよく、蛍光分光器、蛍光顕微鏡、デンシトメーター等の機器を用いてもよい。
【００２４】
また、レセプター分子による一塩基置換検出の効果を検証するために、以下のような検出用ＤＮＡ（配列Ａ）と標的ＤＮＡ（配列Ｂ）とをモデル配列として、株式会社日本遺伝子研究所に受注して合成した。
（配列Ａ）５'−ＴＣＣＡＧＸＧＣＡＡＣ−３'（配列番号１）
（配列Ｂ）３'−ＡＧＧＴＣＮＣＧＴＴＧ−５'（配列番号２〜５）
ここで、上記配列中、Ｘは脱塩基部位（AP site）であり、具体的には以下の化学式に示すようなテトラヒドロフラニル残基（dSpacer）を示す。また、ＮはＧ（配列番号２），Ｃ（配列番号３），Ａ（配列番号４），Ｔ（配列番号５）の何れかを示す。
【００２５】
【化２】
実施例１
ＤＮＡ融解温度（Ｔｍ）の測定
実施例１では、二本鎖が一本鎖に解離する融解温度（melting temprature；Ｔｍ）を測定し、レセプター分子の添加前後におけるＴｍ値の変化から、ＤＮＡとの相互作用を検討した。具体的には、脱塩基部位を含む一本鎖の検出用ＤＮＡ（上記配列Ａ）と被検体となる一本鎖の標的ＤＮＡ溶液（上記配列Ｂ）とがアニーリングした二本鎖ＤＮＡ溶液が３０μＭ、イオン強度調節剤としてＮａＣｌが１００ｍＭ、緩衝剤として１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、レセプター分子としてＡＭＮＤ又はプテリンがそれぞれ５８０μＭ、２９０μＭとなるようにＭilliＱ水を加えて調製したＤＮＡ溶液を毎秒１．５℃の割合で加熱してＴｍ値を測定した。
【００２７】
ここで、一本鎖ＤＮＡの濃度は、文献「Puglisi J.D. et al., Methods in enzymology, Vol.180, p304-p325, 1989」を参考にして、モル吸光係数算出法を用いて吸光度で調整した。この際、脱塩基部位を含む一本鎖ＤＮＡ（上記配列Ａ）のモル吸光係数は、ＴＣＧＧＡの吸光係数とＧＣＡＡＣの吸光係数との和とした。また、アニーリングは、サーマルサイクラーを用いて７５℃で１０分間加熱した後、毎秒３℃の割合で５℃まで冷却し、毎秒１℃の割合で２０℃まで再度加熱することにより行った。
【００２８】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＮがＧ，Ｃ，Ａ，Ｔである場合のそれぞれについて、レセプター分子の添加前のＴｍ値（Ｔｍ（−））、添加後のＴｍ値（Ｔｍ（＋））及びその変化量（ΔＴｍ）の測定結果を以下の表１に示す。
【００２９】
【表１】
表１に示すように、ＡＭＮＤを添加した場合には、標的塩基ＮがＡ＜Ｇ＜Ｔ＜Ｃの順でＴｍ値が上昇しており、ＡＭＮＤのピリミジン塩基選択性が確認できる。一方、プテリンを添加した場合には、標的塩基ＮがＧである場合にＴｍ値が有意に上昇しており、プテリンのグアニン選択性が確認できる。
【００３１】
また、Ｎ＝Ｃである二本鎖ＤＮＡを３０μＭ含むＤＮＡ溶液にＡＭＮＤを添加した場合のＴｍ値のＡＭＮＤ濃度依存性について検討した。結果を図２に示す。図２に示すように、ＡＭＮＤ添加によるＴｍ値の上昇は比較的低濃度から生じ、５００μＭの濃度以上でほぼ完全に上昇が飽和に達している。
【００３２】
実施例２
ＣＤスペクトルの測定
実施例２では、二本鎖のＣＤスペクトルを測定し、レセプター分子の添加前後におけるＣＤスペクトルの変化から、ＤＮＡとの相互作用を検討した。具体的には、脱塩基部位を含む一本鎖ＤＮＡ（上記配列Ａ）と被検体となる一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列Ｂ）とがアニーリングした二本鎖ＤＮＡ溶液が３０μＭ、ＮａＣｌが１００ｍＭ、ＥＤＴＡが１ｍＭ、カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、レセプター分子としてＡＭＮＤが７２．５μＭとなるようにＭilliＱ水を加えて調製したＤＮＡ溶液について、ＣＤスペクトルを測定した。
【００３３】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＮがＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔである場合のそれぞれについて、ＡＭＮＤの添加前（破線）及び添加後（実線）のＣＤスペクトルの結果を図３（ａ）〜（ｄ）に示す。図３に示すように、標的塩基ＮがＣ，Ｔのときに選択的にＣＤスペクトルが変化していることが確認される。これは実施例１におけるＡＭＮＤのピリミジン塩基選択性の結果を支持するものであった。
【００３４】
また、Ｎ＝Ｃである二本鎖ＤＮＡを３０μＭ含むＤＮＡ溶液にＡＭＮＤを添加した場合のＣＤスペクトルのＡＭＮＤ濃度依存性について検討した。結果を図４に示す。なお、図４には、二本鎖ＤＮＡ溶液に７２．５μＭのＡＭＮＤを添加する前（破線）と添加した後（実線）の吸光度と、５８０μＭのＡＭＮＤの吸光度とを併せて示している。図４に示すように、ＡＭＮＤ濃度の上昇に応じて、特に２４５ｎｍ付近及び２８０ｎｍ付近でモル楕円率θが上昇しており、３０μＭの濃度以上でほぼ完全に上昇が飽和に達している。
【００３５】
波長が２７８．５ｎｍのときのＡＭＮＤ濃度とモル楕円率θとの関係を図５に示す。図５に示すように、ＡＭＮＤ添加によるモル楕円率θの上昇は３０μＭの濃度以上でほぼ完全に飽和に達している。この結果、ＡＭＮＤの標的塩基Ｎへの結合定数Ｋ１１は１０６Ｍ−１以上と求められ、ＡＭＮＤが脱塩基部位Ｘに安定に取り込まれていることが分かる。
【００３６】
実施例３
立体構造の検討
実施例３では、標的塩基ＮがＣ，Ｔ，Ａ，Ｇである場合のそれぞれについて、ＡＭＮＤ添加後のＡｍｂｅｒ力場（Macro Model）による最安定化構造を検討した。シミュレーション結果を図６（ａ）〜（ｄ）に示す。図６に示すように、標的塩基ＮがＣの場合にはＡＭＮＤ分子が隣接するグアニン残基と重なっているのに対し、それ以外の場合には隣接するグアニン残基からずれていることが確認できる。この結果から、ＡＭＮＤの塩基選択性が標的塩基Ｎとの水素結合形成、及び隣接する核酸塩基とのスタッキング相互作用に由来するものであることが推察される。
【００３７】
実施例４
蛍光スペクトルの測定
実施例４では、レセプター分子添加後の蛍光強度の減少値（−ΔＦ.Ｉ.）を測定した。具体的には、脱塩基部位を含む一本鎖ＤＮＡ（上記配列Ａ）と被検体となる一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列Ｂ）とがアニーリングした二本鎖ＤＮＡ溶液が６０μＭ、ＮａＣｌが１００ｍＭ、ＥＤＴＡが１ｍＭ、カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、レセプター分子としてＡＭＮＤ又はプテリンがそれぞれ６０μＭ、１５μＭとなるようにＭilliＱ水を加えて調製したＤＮＡ溶液について、蛍光強度を測定した。蛍光測定は、光路長１ｍｍの蛍光測定用セルを用い、反射蛍光測定により行った。
【００３８】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＮがＧ，Ｃ，Ａ，Ｔである場合のそれぞれについて、ＡＭＮＤ、プテリンの添加後における蛍光強度の減少値をそれぞれ図７、図８に示す。ここで、図７は励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４０２ｎｍであり、図８は励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４４５ｎｍである。図７、８に示すように、ＡＭＮＤを添加した場合には、標的塩基ＮがＣ，Ｔといったピリミジン塩基のときに選択的に消光しており、プテリンを添加した場合には、標的塩基ＮがＧのときに選択的に消光している。
【００３９】
実施例５
実際の配列での検討１
実施例５では、実際のｐ５３関連遺伝子の１７７番アミノ酸における一塩基置換を検出する効果を検証するために、以下のような配列を株式会社日本遺伝子研究所に受注して合成した。ここで、下記配列中、Ｘは脱塩基部位（AP site）であり、ＳはＧ（グアニン）又はＣ（シトシン）を示す。
（配列Ｃ）５'−ＣＴＧＣＣＳＣＣＡＣＣ−３'（配列番号６，７）
（配列Ｄ）３'−ＧＡＣＧＧＸＧＧＴＧＧ−５'（配列番号８）
上記配列Ｃにおいて、脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基Ｓは、正常型ではＣ（配列番号６）であり、変異型ではＧ（配列番号７）である。これにより、１７７番アミノ酸はプロリンからアルギニンに変異する。本実施例では、このＣからＧへの変異を検出するために脱塩基部位Ｘを設け、構築された疎水場空間にレセプター分子を導入した。なお、レセプター分子としては、標的塩基ＳがＣであるときに選択的に消光するＡＭＮＤを用いた。
【００４０】
具体的には、被検体となる１Ｍの一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列Ｃ）と脱塩基部位を含む１Ｍの一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列Ｄ）とをそれぞれ２５μｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌを５０μｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を５０μｌ、１２５μＭ ＡＭＮＤを５０μｌ混合し、ＭilliＱ水を加えて全量を２５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液について、サーマルサイクラーでアニーリング処理を行ったものと行わなかったものとを準備し、蛍光強度を測定した。蛍光測定は、光路長１ｍｍの蛍光測定用セルを用い、反射蛍光測定により行った。
【００４１】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＳがＣ，Ｇである場合のそれぞれについて、ＤＮＡを加えなかった場合の蛍光強度（Ｆ０）と、加えた場合の蛍光強度（Ｆ）との比（Ｆ／Ｆ０）を図９に示す。ここで、図９における励起波長は３５０ｎｍであり、蛍光波長は４００ｎｍである。また、サンプル０１はアニーリング処理を行わなかったＤＮＡ溶液であり、サンプル０２，０３はアニーリング処理を行ったＤＮＡ溶液である。図９に示すように、標的塩基ＳがＣである場合に著しく消光しているため、消光の有無を検出することで、標的塩基ＳがＣ（シトシン）であるかＧ（グアニン）であるかを知ることができる。
【００４２】
アニーリング処理を行わなかったＤＮＡ溶液をプラスチック製の透明チューブに入れ、励起波長３０２ｎｍのＵＶランプを用いて蛍光を目視検出した結果を図１０に示す。図１０に示すように、標的塩基ＳがＣである場合に著しく消光しており、目視でも確認可能である。
【００４３】
実施例６
実際の配列での検討２
実施例６では、実際のｐ５３関連遺伝子の１７５番アミノ酸における一塩基置換を検出する効果を検証するために、以下のような配列を株式会社日本遺伝子研究所に受注して合成した。ここで、下記配列中、Ｘは脱塩基部位（AP site）であり、ＲはＧ（グアニン）又はＡ（アデニン）を示す。
（配列Ｅ）５'−ＧＡＧＧＣＲＣＴＧＣＣ−３'（配列番号９，１０）
（配列Ｆ）３'−ＣＴＣＣＧＸＧＡＣＧＧ−５'（配列番号１１）
上記配列Ｅにおいて、脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基Ｒは、正常型ではＧ（配列番号９）であり、変異型ではＡ（配列番号１０）である。これにより、１７５番アミノ酸はアルギニンからヒスチジンに変異する。本実施例では、このＧからＡへの変異を検出するために脱塩基部位Ｘを設け、構築された疎水場空間にレセプター分子を導入した。なお、レセプター分子として標的塩基ＲがＧであるときに選択的に消光するプテリンを用いた以外は、実施例５と同様にして行った。
【００４４】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＲがＧ，Ａである場合のそれぞれについて、ＤＮＡを加えなかった場合の蛍光強度（Ｆ０）と、加えた場合の蛍光強度（Ｆ）との比（Ｆ／Ｆ０）を図１１に示す。ここで、図１１における励起波長は３６０ｎｍであり、蛍光波長は４４０ｎｍである。また、サンプル０１はアニーリング処理を行わなかったＤＮＡ溶液であり、サンプル０２はアニーリング処理を行ったＤＮＡ溶液である。図１１に示すように、標的塩基ＲがＧである場合に消光しているため、消光の有無を検出することで、標的塩基ＲがＧ（グアニン）であるかＡ（アデニン）であるかを知ることができる。
【００４５】
アニーリング処理を行わなかったＤＮＡ溶液について、励起波長３０２ｎｍのＵＶランプを用いることで、蛍光を目視検出した結果を図１２に示す。図１２に示すように、対応塩基ＲがＧである場合に消光しており、目視でも確認可能である。
【００４６】
このように、本実施の形態における一塩基置換検出方法によれば、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的ＤＮＡと、この標的ＤＮＡと相補的であり、且つ一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用ＤＮＡとで二本鎖核酸を形成させ、この二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプター分子を添加して一塩基置換部位と水素結合を形成させ、このレセプター分子の蛍光強度変化を測定することにより、一塩基置換を効果的に検出することができる。
【００４７】
特に、被検体となる標的ＤＮＡのラベル化や熱制御等の煩雑な操作が原則的に不要であるため工程数が非常に少なく、また、原理上二本鎖ＤＮＡ自体の熱的な安定性に依存しないため、検出までの時間が非常に短時間であり、再現性にも優れている。また、ＵＶランプを用いた目視による確認も可能であるため、特別な設備を持たない状況下においても検出が可能である。
【００４８】
さらに、脱塩基部位を含む検出用ＤＮＡを基板に多数集積したＤＮＡマイクロアレイを作製し、一塩基置換検出用キットとして用いることで、従来の欠点を克服したハイスループットな診断が可能となる。
【００４９】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明に係る一塩基置換検出方法によれば、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と、この標的核酸と相補的であり、且つ一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させ、この二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターを添加して一塩基置換部位と水素結合を形成させ、このレセプターの蛍光強度変化を測定することにより、一塩基置換を簡便且つ迅速に検出することができる。
【００５０】
また、本発明に係る一塩基置換検出用キットによれば、従来の欠点を克服したハイスループットな診断が可能となる。
【００５１】
【配列表】
配列番号１：人工的に合成された11-merのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。６番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
配列番号２：人工的に合成された配列
配列番号３：人工的に合成された配列
配列番号４：人工的に合成された配列
配列番号５：人工的に合成された配列
配列番号６：人工的に合成された配列
配列番号７：人工的に合成された配列
配列番号８：人工的に合成された11-merのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。６番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
配列番号９：人工的に合成された配列
配列番号１０：人工的に合成された配列
配列番号１１：人工的に合成された11-merのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。６番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施の形態における一塩基検出の原理を説明する図である。
【図２】標的塩基がシトシンである場合のＴｍ値のＡＭＮＤ濃度依存性を示す図である。
【図３】標的塩基がアデニン、シトシン、グアニン、チミンである場合のＡＭＮＤの添加前後のＣＤスペクトルを示す図である。
【図４】標的塩基がシトシンである場合のＣＤスペクトルのＡＭＮＤ濃度依存性を示す図である。
【図５】標的塩基がシトシンである場合のＡＭＮＤ濃度とモル楕円率との関係を示す図である。
【図６】ＡＭＮＤ添加後のＡｍｂｅｒ力場（Macro Model）による最安定化構造を示す図であり、
【図７】ＡＭＮＤ添加後の蛍光強度の減少値を示す図である。
【図８】プテリン添加後の蛍光強度の減少値を示す図である。
【図９】標的塩基がシトシン、グアニンである場合のＡＭＮＤ添加後の蛍光スペクトルを示す図である。
【図１０】標的塩基がシトシン、グアニンである場合のＡＭＮＤ添加後の蛍光を示す図である。
【図１１】標的塩基がシトシン、グアニンである場合のプテリン添加後の蛍光スペクトルを示す図である。
【図１２】標的塩基がシトシン、グアニンである場合のプテリン添加後の蛍光を示す図である。
【符号の説明】
１０ 標的核酸、１１ 標的塩基、２０ 検出用核酸、２１ 脱塩基部位、３０ レセプター分子
Claims (2)
- 一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と相補的であり、且つ該一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用核酸を調製する工程と、
上記標的核酸と上記検出用核酸とで二本鎖核酸を形成する工程と、
上記二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターを添加し、上記一塩基置換部位と水素結合を形成させる工程と、
上記レセプターの蛍光強度を測定する工程とを有し、
上記レセプターは、２−アミノ−４−オキソプテリジンであり、上記一塩基置換部位との水素結合形成及び上記対応塩基の周囲の塩基とのスタッキング相互作用により安定化されることで、上記一塩基置換部位と対を形成する一塩基置換検出方法。 - 一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と相補的であり、且つ上記一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた、上記一本鎖の標的核酸とで二本鎖核酸を形成する一本鎖の検出用核酸と、
上記二本鎖核酸に添加して、上記一塩基置換部位と水素結合を形成する水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターとを備え、
上記レセプターは、２−アミノ−４−オキソプテリジンであり、該レセプターを上記一塩基置換部位との水素結合形成及び上記対応塩基の周囲の塩基とのスタッキング相互作用により安定化させることで、上記一塩基置換部位と対を形成させて、該レセプターの蛍光強度を測定する一塩基置換検出用キット。
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