JP2003159092A - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents
Ｌ−アミノ酸の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来よりもさらに改良された発酵法によるＬ
−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造
法、及びそれに用いる菌株を提供する。 【解決手段】 Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ
−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌にグルコース
６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子を導入し、
グルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性を増強するこ
とによって、これらのＬ−アミノ酸生産能を向上させ
る。
−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造
法、及びそれに用いる菌株を提供する。 【解決手段】 Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ
−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌にグルコース
６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子を導入し、
グルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性を増強するこ
とによって、これらのＬ−アミノ酸生産能を向上させ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるＬ−
アミノ酸の製造法、特にＬ−リジン及びＬ−グルタミン
酸の製造法に関する。Ｌ−リジンは飼料添加物等とし
て、Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いら
れている。
アミノ酸の製造法、特にＬ−リジン及びＬ−グルタミン
酸の製造法に関する。Ｌ−リジンは飼料添加物等とし
て、Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いら
れている。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸
等のＬ−アミノ酸は、これらのＬ−アミノ酸生産能を有
するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属
するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されて
いる。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるた
めに、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異
株が用いられている。
等のＬ−アミノ酸は、これらのＬ−アミノ酸生産能を有
するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属
するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されて
いる。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるた
めに、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異
株が用いられている。
【０００３】また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ
酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸
の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例
えば、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌におい
て、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバッ
ク阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺
伝子（変異型lysC）、ジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼ遺伝子（dapB）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺
伝子（dapA）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
遺伝子（lysA）遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子（ddh）（WO96/40934）、lysA及びddh
（特開平9−322774号）、lysC、lysA及びホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）（特開平1
0-165180号）、変異型lysC、dapB、dapA、lysA及びアス
パラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（aspC）
（特開平10-215883号）を導入することにより、同細菌
のＬ−リジン生産能が向上することが知られている。
酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸
の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例
えば、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌におい
て、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバッ
ク阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺
伝子（変異型lysC）、ジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼ遺伝子（dapB）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺
伝子（dapA）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
遺伝子（lysA）遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子（ddh）（WO96/40934）、lysA及びddh
（特開平9−322774号）、lysC、lysA及びホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）（特開平1
0-165180号）、変異型lysC、dapB、dapA、lysA及びアス
パラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（aspC）
（特開平10-215883号）を導入することにより、同細菌
のＬ−リジン生産能が向上することが知られている。
【０００４】また、エシェリヒア属細菌においては、da
pA、変異型lysC、dapB、ジアミノピメリン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子（ddh）（又はテトラヒドロジピコリン酸
スクシニラーゼ遺伝子（dapD）及びスクシニルジアミノ
ピメリン酸デアシラーゼ遺伝子（dapE））を順次増強す
るとＬ−リジン生産能が向上することが知られている
（WO 95/16042）。尚、WO 95/16042ではテトラヒドロジ
ピコリン酸スクシニラーゼがスクシニルジアミノピメリ
ン酸トランスアミナーゼと誤記されている。一方、コリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌にお
いて、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グ
ルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝
子の導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に効果的で
あったことが報告されている（特公平7-121228号）。ま
た、特開昭61-268185号公報には、コリネバクテリウム
属細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含
む組換え体ＤＮＡを保有した細胞が開示されている。さ
らに、特開昭63-214189号公報には、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸
シンターゼ遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタ
ミン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
pA、変異型lysC、dapB、ジアミノピメリン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子（ddh）（又はテトラヒドロジピコリン酸
スクシニラーゼ遺伝子（dapD）及びスクシニルジアミノ
ピメリン酸デアシラーゼ遺伝子（dapE））を順次増強す
るとＬ−リジン生産能が向上することが知られている
（WO 95/16042）。尚、WO 95/16042ではテトラヒドロジ
ピコリン酸スクシニラーゼがスクシニルジアミノピメリ
ン酸トランスアミナーゼと誤記されている。一方、コリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌にお
いて、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グ
ルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝
子の導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に効果的で
あったことが報告されている（特公平7-121228号）。ま
た、特開昭61-268185号公報には、コリネバクテリウム
属細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含
む組換え体ＤＮＡを保有した細胞が開示されている。さ
らに、特開昭63-214189号公報には、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸
シンターゼ遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタ
ミン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
【０００５】しかし、グルコース ６−リン酸イソメラ
ーゼをコードする遺伝子の構造はコリネ型細菌では報告
されておらず、グルコース ６−リン酸イソメラーゼを
コードする遺伝子をコリネ型細菌の育種に利用すること
も知られていない。
ーゼをコードする遺伝子の構造はコリネ型細菌では報告
されておらず、グルコース ６−リン酸イソメラーゼを
コードする遺伝子をコリネ型細菌の育種に利用すること
も知られていない。
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来よりも
さらに改良された発酵法によるＬ−リジン又はＬ−グル
タミン酸等のＬ−アミノ酸の製造法、及びそれに用いる
菌株を提供することを課題とする。
さらに改良された発酵法によるＬ−リジン又はＬ−グル
タミン酸等のＬ−アミノ酸の製造法、及びそれに用いる
菌株を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、グルコース６
−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子をコリネ型細
菌に導入し、グルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性
を増強することにより、Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン
酸の生産量を増大させることができることを見出し、本
発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下のと
おりである。
を解決するために鋭意検討を行った結果、グルコース６
−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子をコリネ型細
菌に導入し、グルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性
を増強することにより、Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン
酸の生産量を増大させることができることを見出し、本
発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下のと
おりである。
【０００７】（１）細胞中のグルコース ６−リン酸イ
ソメラーゼ活性が増強され、かつＬ−アミノ酸生産能を
有するコリネ型細菌。 （２）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン及びＬ−グルタ
ミン酸から選ばれる（１）のコリネ型細菌。 （３）前記グルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性の
増強が、前記細菌細胞内のグルコース ６−リン酸イソ
メラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めることに
よるものである前記（１）のコリネ型細菌。 （４）前記グルコース ６−リン酸イソメラーゼをコー
ドする遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である（３）の
コリネ型細菌。 （５）前記（１）〜（４）のいずれかのコリネ型細菌を
培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せ
しめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴
とするＬ−アミノ酸の製造法。 （６）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン及びＬ−グルタ
ミン酸から選ばれる（５）の方法。
ソメラーゼ活性が増強され、かつＬ−アミノ酸生産能を
有するコリネ型細菌。 （２）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン及びＬ−グルタ
ミン酸から選ばれる（１）のコリネ型細菌。 （３）前記グルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性の
増強が、前記細菌細胞内のグルコース ６−リン酸イソ
メラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めることに
よるものである前記（１）のコリネ型細菌。 （４）前記グルコース ６−リン酸イソメラーゼをコー
ドする遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である（３）の
コリネ型細菌。 （５）前記（１）〜（４）のいずれかのコリネ型細菌を
培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せ
しめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴
とするＬ−アミノ酸の製造法。 （６）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン及びＬ−グルタ
ミン酸から選ばれる（５）の方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】＜１＞本発明のコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、
細胞中のグルコース６−リン酸イソメラーゼ活性が増強
されたコリネ型細菌である。Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ
−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イ
ソロイシン、Ｌ−セリン等が挙げられる。これらの中で
は、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸が好ましい。以
下、本発明の実施の形態を、主としてＬ−リジン生産能
又はＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌につ
いて説明するが、本発明は、目的とするＬ−アミノ酸固
有の生合成系がホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼよりも下流に位置するものについては同様に適用さ
れ得る。
細胞中のグルコース６−リン酸イソメラーゼ活性が増強
されたコリネ型細菌である。Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ
−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イ
ソロイシン、Ｌ−セリン等が挙げられる。これらの中で
は、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸が好ましい。以
下、本発明の実施の形態を、主としてＬ−リジン生産能
又はＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌につ
いて説明するが、本発明は、目的とするＬ−アミノ酸固
有の生合成系がホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼよりも下流に位置するものについては同様に適用さ
れ得る。
【００１０】本発明でいうコリネ型細菌としては、バー
ジーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群
の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子
形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌と
して統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacterio
l., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非
常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリ
ウム属細菌を含む。Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸の
製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株としては、
例えば以下に示すものが挙げられる。
ジーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群
の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子
形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌と
して統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacterio
l., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非
常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリ
ウム属細菌を含む。Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸の
製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株としては、
例えば以下に示すものが挙げられる。
【００１１】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC15806
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032
（ブレビバクテリウム・ディバリカタム） ATCC14020
（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869
〔コリネバクテリウム・リリウム） ATCC15990
（ブレビバクテリウム・フラバム） ATCC14067
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC14066
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)
【００１２】これらを入手するには、例えばアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受ける
ことができる。すなわち、各微生物ごとに対応する登録
番号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を
受けることができる。各微生物に対応する登録番号はア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタロ
グに記載されている。また、AJ12340株は、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にブダペスト条約に
基づいて寄託されている。
・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受ける
ことができる。すなわち、各微生物ごとに対応する登録
番号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を
受けることができる。各微生物に対応する登録番号はア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタロ
グに記載されている。また、AJ12340株は、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にブダペスト条約に
基づいて寄託されている。
【００１３】また、上記菌株以外にも、これらの菌株か
ら誘導されたＬ−リジン生産能又はＬ−グルタミン酸生
産能を有する変異株等も、本発明に利用できる。この様
な人工変異株としては次の様なものがある。Ｓ−（２−
アミノエチル）−システイン（以下、「AEC」と略記す
る）耐性変異株（例えば、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）、特公昭56-19
14号、特公昭56-1915号、特公昭57-14157号、特公昭57-
14158号、特公昭57-30474号、特公昭58-10075号、特公
昭59-4993号、特公昭61-35840号、特公昭62-24074号、
特公昭62-36673号、特公平5-11958号、特公平7-112437
号、特公平7-112438号参照）、その成長にＬ−ホモセリ
ン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭48-28078
号、特公昭56-6499号）、AECに耐性を示し、更にＬ−ロ
イシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ
酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第38254
72号）、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−
アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナロ
グ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに
耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸
酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の
耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭50-53588号、
特開昭50-31093号、特開昭52-102498号、特開昭53-9394
号、特開昭53-86089号、特開昭55-9783号、特開昭55-97
59号、特開昭56-32995号、特開昭56-39778号、特公昭53
-43591号、特公昭53-1833号）、イノシトールまたは酢
酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9784
号、特開昭56-8692号）、フルオロピルビン酸または34
℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異
株（特開昭55-9783号、特開昭53-86090号）、エチレン
グリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビ
バクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異
株（米国特許第4411997号）。
ら誘導されたＬ−リジン生産能又はＬ−グルタミン酸生
産能を有する変異株等も、本発明に利用できる。この様
な人工変異株としては次の様なものがある。Ｓ−（２−
アミノエチル）−システイン（以下、「AEC」と略記す
る）耐性変異株（例えば、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）、特公昭56-19
14号、特公昭56-1915号、特公昭57-14157号、特公昭57-
14158号、特公昭57-30474号、特公昭58-10075号、特公
昭59-4993号、特公昭61-35840号、特公昭62-24074号、
特公昭62-36673号、特公平5-11958号、特公平7-112437
号、特公平7-112438号参照）、その成長にＬ−ホモセリ
ン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭48-28078
号、特公昭56-6499号）、AECに耐性を示し、更にＬ−ロ
イシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ
酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第38254
72号）、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−
アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナロ
グ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに
耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸
酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の
耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭50-53588号、
特開昭50-31093号、特開昭52-102498号、特開昭53-9394
号、特開昭53-86089号、特開昭55-9783号、特開昭55-97
59号、特開昭56-32995号、特開昭56-39778号、特公昭53
-43591号、特公昭53-1833号）、イノシトールまたは酢
酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9784
号、特開昭56-8692号）、フルオロピルビン酸または34
℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異
株（特開昭55-9783号、特開昭53-86090号）、エチレン
グリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビ
バクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異
株（米国特許第4411997号）。
【００１４】また、Ｌ−スレオニン生産能を有するコリ
ネ型細菌としては、コリネバクテリウム・アセトアシド
フィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,94
9号参照）等が、Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリ
ネ型細菌としてはブレビバクテリウム・フラバム AJ121
49（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参照）等が挙
げられる。
ネ型細菌としては、コリネバクテリウム・アセトアシド
フィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,94
9号参照）等が、Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリ
ネ型細菌としてはブレビバクテリウム・フラバム AJ121
49（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参照）等が挙
げられる。
【００１５】＜２＞グルコース ６−リン酸イソメラー
ゼ活性の増強 コリネ型細菌細胞中のグルコース ６−リン酸イソメラ
ーゼ活性を増強するには、グルコース ６−リン酸イソ
メラーゼをコードする遺伝子断片を、該細菌で機能する
ベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結
して組み換えＤＮＡを作製し、これをＬ−リジン又はＬ
−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に導入して
形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のグルコース
６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子のコピー
数が上昇する結果、グルコース６−リン酸イソメラーゼ
活性が増強される。グルコース ６−リン酸イソメラー
ゼは、エシェリヒア・コリではpgi遺伝子にコードされ
ている。
ゼ活性の増強 コリネ型細菌細胞中のグルコース ６−リン酸イソメラ
ーゼ活性を増強するには、グルコース ６−リン酸イソ
メラーゼをコードする遺伝子断片を、該細菌で機能する
ベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結
して組み換えＤＮＡを作製し、これをＬ−リジン又はＬ
−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に導入して
形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のグルコース
６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子のコピー
数が上昇する結果、グルコース６−リン酸イソメラーゼ
活性が増強される。グルコース ６−リン酸イソメラー
ゼは、エシェリヒア・コリではpgi遺伝子にコードされ
ている。
【００１６】グルコース ６−リン酸イソメラーゼ遺伝
子は、コリネ型細菌の遺伝子を用いることも、エシェリ
ヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用す
ることができる。エシェリヒア・コリのpgi遺伝子の塩
基配列は既に明らかにされている（Froman, B.E. et a
l., Mol.Gen.Genet. 217, 126-131(1989), Genbank/EMB
L/DDBJ accetion No. X15196）ので、その塩基配列に基
づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号１及
び２に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ染
色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：polymerase
chain reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet.
5,185(1989)参照）によって、pgi遺伝子を取得すること
ができる。コリネ型細菌等の他の微生物のグルコース
６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子も、同様に
して取得され得る。
子は、コリネ型細菌の遺伝子を用いることも、エシェリ
ヒア属細菌等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用す
ることができる。エシェリヒア・コリのpgi遺伝子の塩
基配列は既に明らかにされている（Froman, B.E. et a
l., Mol.Gen.Genet. 217, 126-131(1989), Genbank/EMB
L/DDBJ accetion No. X15196）ので、その塩基配列に基
づいて作製したプライマー、例えば配列表配列番号１及
び２に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ染
色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：polymerase
chain reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet.
5,185(1989)参照）によって、pgi遺伝子を取得すること
ができる。コリネ型細菌等の他の微生物のグルコース
６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子も、同様に
して取得され得る。
【００１７】染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miur
a Biochem.Biophys.Acta, 72,619,(1963)、生物工学実
験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９
９２年参照）等により調製することができる。
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miur
a Biochem.Biophys.Acta, 72,619,(1963)、生物工学実
験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９
９２年参照）等により調製することができる。
【００１８】ＰＣＲ法により増幅されたグルコース ６
−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子は、エシェリ
ヒア・コリ及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自
律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを
調製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておく
と、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞
内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミ
ドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能な
ものが好ましく、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG2
99、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子は、エシェリ
ヒア・コリ及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自
律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを
調製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておく
と、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞
内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミ
ドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能な
ものが好ましく、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG2
99、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
【００１９】コリネ型細菌の細胞内において自律複製可
能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報
参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。このようなシャトルベクターとし
ては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクタ
ーを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっ
こ内に示した。
能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報
参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。このようなシャトルベクターとし
ては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクタ
ーを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっ
こ内に示した。
【００２０】グルコース ６−リン酸イソメラーゼをコ
ードする遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連
結して組み換えＤＮＡを調製するには、グルコース ６
−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の末端に合う
ような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通であ
る。
ードする遺伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連
結して組み換えＤＮＡを調製するには、グルコース ６
−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の末端に合う
ような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通であ
る。
【００２１】上記のように調製した組み換えＤＮＡをコ
リネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている
形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア
・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容
菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増
す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53,159
(1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告
されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセ
ルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wil
son,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）があ
る。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵
母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞
を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまた
はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ
受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Mole
c. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.
M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,
A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。本発明の実施例
で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−
２０７７９１号公報参照）である。
リネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている
形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア
・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容
菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増
す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53,159
(1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告
されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセ
ルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wil
son,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）があ
る。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵
母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞
を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまた
はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ
受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Mole
c. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.
M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,
A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。本発明の実施例
で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−
２０７７９１号公報参照）である。
【００２２】グルコース ６−リン酸イソメラーゼをコ
ードする活性の増強は、グルコース６−リン酸イソメラ
ーゼをコードする遺伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に
多コピー存在させることによっても達成できる。コリネ
型細菌に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にグルコース
６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子を多コピー
で導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配
列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮ
Ａ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブ
ＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・
リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９
８５号公報に開示されているように、グルコース ６−
リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子をトランスポゾ
ンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピ
ー導入することも可能である。いずれの方法によっても
形質転換株内のグルコース ６−リン酸イソメラーゼを
コードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、グルコー
ス ６−リン酸イソメラーゼ活性が増強される。
ードする活性の増強は、グルコース６−リン酸イソメラ
ーゼをコードする遺伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に
多コピー存在させることによっても達成できる。コリネ
型細菌に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にグルコース
６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子を多コピー
で導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配
列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮ
Ａ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブ
ＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・
リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９
８５号公報に開示されているように、グルコース ６−
リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子をトランスポゾ
ンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピ
ー導入することも可能である。いずれの方法によっても
形質転換株内のグルコース ６−リン酸イソメラーゼを
コードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、グルコー
ス ６−リン酸イソメラーゼ活性が増強される。
【００２３】グルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性
の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮ
Ａ上又はプラスミド上のグルコース ６−リン酸イソメ
ラーゼをコードする遺伝子のプロモーター等の発現調節
配列を強力なものに置換することによっても達成され
る。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモータ
ー、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダ
ファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が強力
なプロモーターとして知られている。これらのプロモー
ターへの置換により、グルコース ６−リン酸イソメラ
ーゼをコードする遺伝子の発現が強化されることによっ
てグルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性が増強され
る。
の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮ
Ａ上又はプラスミド上のグルコース ６−リン酸イソメ
ラーゼをコードする遺伝子のプロモーター等の発現調節
配列を強力なものに置換することによっても達成され
る。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモータ
ー、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダ
ファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が強力
なプロモーターとして知られている。これらのプロモー
ターへの置換により、グルコース ６−リン酸イソメラ
ーゼをコードする遺伝子の発現が強化されることによっ
てグルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性が増強され
る。
【００２４】また、本発明のコリネ型細菌は、グルコー
ス ６−リン酸イソメラーゼ活性に加えて、他のアミノ
酸生合成経路又は解糖系等の酵素遺伝子を強化すること
によって、それらの酵素活性が増強されてもよい。例え
ば、Ｌ−リジンの製造に利用可能な遺伝子の例として
は、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィ
ードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナー
ゼαサブユニット蛋白質又はβサブユニット蛋白質をコ
ードする遺伝子（WO94/25605国際公開パンフレット）、
コリネホルム細菌由来の野生型ホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60-87788号公報）、
コリネホルム細菌由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合
成酵素をコードする遺伝子（特公平6-55149号公報）等
が知られている。
ス ６−リン酸イソメラーゼ活性に加えて、他のアミノ
酸生合成経路又は解糖系等の酵素遺伝子を強化すること
によって、それらの酵素活性が増強されてもよい。例え
ば、Ｌ−リジンの製造に利用可能な遺伝子の例として
は、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィ
ードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナー
ゼαサブユニット蛋白質又はβサブユニット蛋白質をコ
ードする遺伝子（WO94/25605国際公開パンフレット）、
コリネホルム細菌由来の野生型ホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60-87788号公報）、
コリネホルム細菌由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合
成酵素をコードする遺伝子（特公平6-55149号公報）等
が知られている。
【００２５】また、Ｌ−グルタミン酸の製造に利用可能
な遺伝子の例としては、解糖系のホスフォフルクトキナ
ーゼ（ＰＦＫ、特開昭６３−１０２６９２号）、アナプ
レロティック経路のホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ（ＰＥＰＣ、特開昭６０−８７７８８号、特開
昭６２−５５０８９号）、ＴＣＡ回路のクエン酸合成酵
素（ＣＳ、特開昭６２−２０１５８５号、特開昭６３−
１１９６８８号）、アコニット酸ヒドラターゼ（ＡＣ
Ｏ、特開昭６２−２９４０８６号）、イソクエン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ、特開昭６２−１６６８９０
号、特開昭６３−２１４１８９号）、アミノ化反応を触
媒するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、特開昭
６１−２６８１８５号）等がある。
な遺伝子の例としては、解糖系のホスフォフルクトキナ
ーゼ（ＰＦＫ、特開昭６３−１０２６９２号）、アナプ
レロティック経路のホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ（ＰＥＰＣ、特開昭６０−８７７８８号、特開
昭６２−５５０８９号）、ＴＣＡ回路のクエン酸合成酵
素（ＣＳ、特開昭６２−２０１５８５号、特開昭６３−
１１９６８８号）、アコニット酸ヒドラターゼ（ＡＣ
Ｏ、特開昭６２−２９４０８６号）、イソクエン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ、特開昭６２−１６６８９０
号、特開昭６３−２１４１８９号）、アミノ化反応を触
媒するグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、特開昭
６１−２６８１８５号）等がある。
【００２６】さらに、Ｌ−アミノ酸の生合成経路から分
岐して同アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒す
る酵素の活性が低下または欠損していてもよい。例え
ば、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以
外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホ
モセリンデヒドロゲナーゼがある（WO 95/23864参
照）。また、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐し
てＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒
する酵素としては、αケトグルタール酸デヒドロゲナー
ゼ（αＫＧＤＨ）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセ
チルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロ
キシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチ
ルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナ
ーゼ、等がある。
岐して同アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒す
る酵素の活性が低下または欠損していてもよい。例え
ば、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以
外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホ
モセリンデヒドロゲナーゼがある（WO 95/23864参
照）。また、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐し
てＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒
する酵素としては、αケトグルタール酸デヒドロゲナー
ゼ（αＫＧＤＨ）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセ
チルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロ
キシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチ
ルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナ
ーゼ、等がある。
【００２７】さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する
コリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質
に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量
のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質
の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができ
る（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌とし
ては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ130
29株は、1994年９月２日付けで工業技術院生命工学工業
技術研究所に、受託番号FERM P-14501として寄託され、
１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託
に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与されている。
コリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質
に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量
のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質
の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができ
る（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌とし
ては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ130
29株は、1994年９月２日付けで工業技術院生命工学工業
技術研究所に、受託番号FERM P-14501として寄託され、
１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託
に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与されている。
【００２８】また、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸生
産能を有するコリネ型細菌に、ビオチン作用抑制物質に
対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量の
ビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の
非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を同時生産
させることができる（WO96/06180号参照）。このような
菌株としては、WO96/06180号に記載されているブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993株が挙げら
れる。同株は１９９４年６月３日付けで工業技術院生命
工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14348で寄託さ
れ、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際
寄託に移管され、受託番号FERM BP-5188が付与されてい
る。
産能を有するコリネ型細菌に、ビオチン作用抑制物質に
対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量の
ビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の
非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を同時生産
させることができる（WO96/06180号参照）。このような
菌株としては、WO96/06180号に記載されているブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993株が挙げら
れる。同株は１９９４年６月３日付けで工業技術院生命
工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14348で寄託さ
れ、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際
寄託に移管され、受託番号FERM BP-5188が付与されてい
る。
【００２９】＜３＞Ｌ−アミノ酸の生産
グルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性が増強され、
かつＬ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な
培地で培養すれば、同Ｌ−アミノ酸が培地に蓄積する。
例えば、グルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性が増
強され、かつＬ−リジン酸生産能を有するコリネ型細菌
を好適な培地で培養すれば、Ｌ−リジンが培地に蓄積す
る。また、グルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性が
増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ
型細菌を好適な培地で培養すれば、Ｌ−グルタミン酸が
培地に蓄積する。
かつＬ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な
培地で培養すれば、同Ｌ−アミノ酸が培地に蓄積する。
例えば、グルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性が増
強され、かつＬ−リジン酸生産能を有するコリネ型細菌
を好適な培地で培養すれば、Ｌ−リジンが培地に蓄積す
る。また、グルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性が
増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ
型細菌を好適な培地で培養すれば、Ｌ−グルタミン酸が
培地に蓄積する。
【００３０】さらに、グルコース ６−リン酸イソメラ
ーゼ活性が増強され、かつＬ−リジン及びＬ−グルタミ
ン酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養すれば、
Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸が培地に蓄積する。Ｌ
−リジンとＬ−グルタミン酸を同時に醗酵生産する場合
には、Ｌ−リジン生産菌をＬ−グルタミン酸の生産条件
下で培養してもよいし、あるいはＬ−リジン生産能を有
するコリネ型細菌とＬ−グルタミン酸生産能を有するコ
リネ型細菌を混合培養してもよい（特開平５−３７９３
号公報）。
ーゼ活性が増強され、かつＬ−リジン及びＬ−グルタミ
ン酸生産能を有するコリネ型細菌を培地で培養すれば、
Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸が培地に蓄積する。Ｌ
−リジンとＬ−グルタミン酸を同時に醗酵生産する場合
には、Ｌ−リジン生産菌をＬ−グルタミン酸の生産条件
下で培養してもよいし、あるいはＬ−リジン生産能を有
するコリネ型細菌とＬ−グルタミン酸生産能を有するコ
リネ型細菌を混合培養してもよい（特開平５−３７９３
号公報）。
【００３１】本発明の微生物を用いてＬ−アミノ酸を製
造するのに用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン
及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常
の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、廃糖
蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノールやイノ
シトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエ
ン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
造するのに用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン
及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常
の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、廃糖
蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノールやイノ
シトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエ
ン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００３２】窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモ
ニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、
コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有
機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いること
が できる。
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモ
ニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、
コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有
機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いること
が できる。
【００３３】無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。
【００３４】培養は、振とう培養、通気撹拌培養等によ
る好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培
養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御
する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるい
はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用するこ
とができる。
る好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培
養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御
する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるい
はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用するこ
とができる。
【００３５】発酵液からのＬ−アミノ酸の採取は、通常
のＬ−アミノ酸の製造法と同様にして行うことができ
る。例えば、Ｌ−リジンは、通常イオン交換樹脂法、沈
澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施
できる。また、Ｌ−グルタミン酸を採取する方法も常法
によって行えばよく、例えばイオン交換樹脂法、晶析法
等によることができる。具体的には、Ｌ−グルタミン酸
を陰イオン交換樹脂により吸着、分離させるか、または
中和晶析させればよい。Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン
酸の両方を製造する場合、これらを混合物として用いる
場合には、これらのアミノ酸を相互に分離することは不
要である。
のＬ−アミノ酸の製造法と同様にして行うことができ
る。例えば、Ｌ−リジンは、通常イオン交換樹脂法、沈
澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施
できる。また、Ｌ−グルタミン酸を採取する方法も常法
によって行えばよく、例えばイオン交換樹脂法、晶析法
等によることができる。具体的には、Ｌ−グルタミン酸
を陰イオン交換樹脂により吸着、分離させるか、または
中和晶析させればよい。Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン
酸の両方を製造する場合、これらを混合物として用いる
場合には、これらのアミノ酸を相互に分離することは不
要である。
【００３６】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００３７】＜１＞エシェリヒア・コリJM109株のpgi遺
伝子のクローニング エシェリヒア・コリのpgi遺伝子の塩基配列は既に明ら
かにされている（Froman, B.E. et al., Mol.Gen.Gene
t. 217, 126-131(1989), Genbank/EMBL/DDBJ accetion
No. X15196）。報告されている塩基配列に基づいて配列
表配列番号１及び２に示すプライマーを合成し、エシェ
リヒア・コリJM109株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣ
Ｒ法によりピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を増幅し
た。
伝子のクローニング エシェリヒア・コリのpgi遺伝子の塩基配列は既に明ら
かにされている（Froman, B.E. et al., Mol.Gen.Gene
t. 217, 126-131(1989), Genbank/EMBL/DDBJ accetion
No. X15196）。報告されている塩基配列に基づいて配列
表配列番号１及び２に示すプライマーを合成し、エシェ
リヒア・コリJM109株の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣ
Ｒ法によりピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を増幅し
た。
【００３８】合成したプライマーの内、配列番号１は、
Froman, B.E. et al., Mol.Gen.Genet. 217, 126-131(1
989)に記載されているpgi遺伝子の塩基配列の１番目か
ら２４番目の塩基に至る配列に相当し、配列番号２は、
２５７３番目から２５５０番目の塩基に至る配列に相当
する。
Froman, B.E. et al., Mol.Gen.Genet. 217, 126-131(1
989)に記載されているpgi遺伝子の塩基配列の１番目か
ら２４番目の塩基に至る配列に相当し、配列番号２は、
２５７３番目から２５５０番目の塩基に至る配列に相当
する。
【００３９】エシェリヒア・コリJM109株の染色体ＤＮ
Ａの調製は常法によった（生物工学実験書、日本生物工
学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）。また、
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ法最前線（関谷剛男ほか編、共立
出版社、１９８９年）１８５頁に記載されている標準反
応条件を用いた。
Ａの調製は常法によった（生物工学実験書、日本生物工
学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）。また、
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ法最前線（関谷剛男ほか編、共立
出版社、１９８９年）１８５頁に記載されている標準反
応条件を用いた。
【００４０】生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、
SmaIで切断したプラスミドｐＨＣ４（特開平５−７４９
１号参照）と、ライゲーションキット（宝酒造社製）を
用いて連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピ
テントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ク
ロラムフェニコール５μg/mlを含むＬ培地（バクトトリ
プトン10g/L、バクトイーストエキストラクト 5g/L、Na
Cl 5g/L、寒天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、
出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離
し、形質転換株を得た。取得した形質転換体よりプラス
ミドを抽出し、ベクターに pgi遺伝子が結合したプラ
スミドｐＨＣ４ｐｇｉを得た。
SmaIで切断したプラスミドｐＨＣ４（特開平５−７４９
１号参照）と、ライゲーションキット（宝酒造社製）を
用いて連結した後、エシェリヒア・コリJM109のコンピ
テントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、ク
ロラムフェニコール５μg/mlを含むＬ培地（バクトトリ
プトン10g/L、バクトイーストエキストラクト 5g/L、Na
Cl 5g/L、寒天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、
出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離
し、形質転換株を得た。取得した形質転換体よりプラス
ミドを抽出し、ベクターに pgi遺伝子が結合したプラ
スミドｐＨＣ４ｐｇｉを得た。
【００４１】ｐＨＣ４を保持するエシェリヒア・コリ
は、プライベートナンバーAJ12617と命名され、１９９
１年４月２４日に、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１２２１
５として寄託され、１９９１年８月２６日に、ブタペス
ト条約に基く国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−３５３２が付与されている。
は、プライベートナンバーAJ12617と命名され、１９９
１年４月２４日に、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１２２１
５として寄託され、１９９１年８月２６日に、ブタペス
ト条約に基く国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−３５３２が付与されている。
【００４２】次に、クローニングされたＤＮＡ断片がグ
ルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードしていることを確認するため、ＪＭ１０９
株及び、ｐＨＣ４ｐｇｉを保持するＪＭ１０９株のグル
コース ６−リン酸イソメラーゼ活性を、Muramatsu,
N. and Nosoh, Y., Arch. Biochem. Biophys. 144, 245
-252 (1971)に記載の方法により測定した。その結果、
ｐＨＣ４ｐｇｉを保持するＪＭ１０９株は、ｐＨＣ４ｐ
ｇｉを保持しないＪＭ１０９株の約１５倍のグルコース
６−リン酸イソメラーゼ活性を示すことから、pgi遺
伝子が発現していることを確認した。
ルコース ６−リン酸イソメラーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードしていることを確認するため、ＪＭ１０９
株及び、ｐＨＣ４ｐｇｉを保持するＪＭ１０９株のグル
コース ６−リン酸イソメラーゼ活性を、Muramatsu,
N. and Nosoh, Y., Arch. Biochem. Biophys. 144, 245
-252 (1971)に記載の方法により測定した。その結果、
ｐＨＣ４ｐｇｉを保持するＪＭ１０９株は、ｐＨＣ４ｐ
ｇｉを保持しないＪＭ１０９株の約１５倍のグルコース
６−リン酸イソメラーゼ活性を示すことから、pgi遺
伝子が発現していることを確認した。
【００４３】＜２＞コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生
産株へのｐＨＣ４ｐｇｉの導入とＬ−グルタミン酸生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドｐＨＣ４ｐｇｉで形質転換し、得られた形質転換
株を得た。得られた形質転換株AJ13029/pHC4pgiを用い
てＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行
った。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂ
プレート培地にて培養して得たAJ13029/pHC4pgi株の菌
体を、5μg/mlのクロラムフェニコールを含む下記組成
を有するＬ−グルタミン酸生産培地に接種し、31.5℃に
て振とう培養し、培地中の糖が消費されるまで振とう培
養した。得られた培養物を、同じ組成の培地に５％量接
種し、37℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養
した。コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ
13029株に、既に取得されているコリネバクテリウム属
細菌で自律複製可能なプラスミドｐＨＣ４を電気パルス
法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養し
た。
産株へのｐＨＣ４ｐｇｉの導入とＬ−グルタミン酸生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドｐＨＣ４ｐｇｉで形質転換し、得られた形質転換
株を得た。得られた形質転換株AJ13029/pHC4pgiを用い
てＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行
った。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂ
プレート培地にて培養して得たAJ13029/pHC4pgi株の菌
体を、5μg/mlのクロラムフェニコールを含む下記組成
を有するＬ−グルタミン酸生産培地に接種し、31.5℃に
て振とう培養し、培地中の糖が消費されるまで振とう培
養した。得られた培養物を、同じ組成の培地に５％量接
種し、37℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養
した。コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ
13029株に、既に取得されているコリネバクテリウム属
細菌で自律複製可能なプラスミドｐＨＣ４を電気パルス
法により形質転換した菌株を上記と同様にして培養し
た。
【００４４】〔Ｌ−グルタミン酸生産培地〕下記成分
（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製し、115℃で15
分殺菌する。 グルコース 150g ＫＨ2ＰＯ4 2g ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1.5g ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 15mg ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ 15mg 大豆蛋白加水分解液 50ml ビオチン 2mg サイアミン塩酸塩 3mg
（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製し、115℃で15
分殺菌する。 グルコース 150g ＫＨ2ＰＯ4 2g ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1.5g ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 15mg ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ 15mg 大豆蛋白加水分解液 50ml ビオチン 2mg サイアミン塩酸塩 3mg
【００４５】培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸
蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ
−２１０により測定した。このときの結果を表１に示し
た。
蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ
−２１０により測定した。このときの結果を表１に示し
た。
【００４６】
【表１】表１
───────────────────────
菌 株 Ｌ−グルタミン酸生成量(g/L)
───────────────────────
AJ13029/pHC4 ２１．０
AJ13029/pHC4pgi ２３．５
───────────────────────
【００４７】＜３＞コリネ型細菌のＬ−リジン生産株へ
のpHC4pgiの導入とＬ−リジン生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpHC4pgiで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ11082/pHC4pgiを用いてＬ−
リジン生産のための培養を以下のように行った。5μg/m
lのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地
にて培養して得たAJ11082/pHC4pgi株の菌体を、5μg/ml
のクロラムフェニコールを含む下記組成のＬ−リジン生
産培地に接種し、31.5℃にて培地中の糖が消費されるま
で振とう培養した。コントロールとしてコリネバクテリ
ウム属細菌AJ11082株に、既に取得されているコリネバ
クテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミドpHC4を電
気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして
培養した。
のpHC4pgiの導入とＬ−リジン生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpHC4pgiで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ11082/pHC4pgiを用いてＬ−
リジン生産のための培養を以下のように行った。5μg/m
lのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地
にて培養して得たAJ11082/pHC4pgi株の菌体を、5μg/ml
のクロラムフェニコールを含む下記組成のＬ−リジン生
産培地に接種し、31.5℃にて培地中の糖が消費されるま
で振とう培養した。コントロールとしてコリネバクテリ
ウム属細菌AJ11082株に、既に取得されているコリネバ
クテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミドpHC4を電
気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして
培養した。
【００４８】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムAJ11082は、1979年６月18日にアグリカルチュラル・
リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Agri
cultural Research Service Culture Collection）に国
際寄託され、受託番号NRRL B-11470が付与されている。
ムAJ11082は、1979年６月18日にアグリカルチュラル・
リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Agri
cultural Research Service Culture Collection）に国
際寄託され、受託番号NRRL B-11470が付与されている。
【００４９】〔Ｌ−リジン生産培地〕炭酸カルシウム以
外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製
し、115℃で15分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カ
ルシウムを50ｇ加える。 グルコース 100 g （ＮＨ4）2ＳＯ4 55 g ＫＨ2ＰＯ4 1 g ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1 g ビオチン 500 μg チアミン 2000 μg ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 g ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 g ニコチンアミド 5 mg 蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml 炭酸カルシウム 50 g
外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製
し、115℃で15分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カ
ルシウムを50ｇ加える。 グルコース 100 g （ＮＨ4）2ＳＯ4 55 g ＫＨ2ＰＯ4 1 g ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1 g ビオチン 500 μg チアミン 2000 μg ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 g ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 g ニコチンアミド 5 mg 蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml 炭酸カルシウム 50 g
【００５０】培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸
蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ
−２１０により測定した。このときの結果を表２に示し
た。
蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ
−２１０により測定した。このときの結果を表２に示し
た。
【００５１】
【表２】表２
───────────────────────
菌 株 Ｌ−リジン生成量(g/L)
───────────────────────
AJ11082/pHC4 ２９．１
AJ11082/pHC4pgi ３３．４
───────────────────────
【００５２】＜４＞コリネ型細菌のＬ−リジン及びＬ−
グルタミン酸生産株へのpHC4pgiの導入とＬ−リジン及
びＬ−グルタミン酸同時生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpHC4pgiで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ12993/pHC4pgiを用いてＬ−
リジン及びＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下の
ように行った。5μg/mlのクロラムフェニコールを含む
ＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ12993/pHC4pg
i株の菌体を、5μg/mlのクロラムフェニコールを含む前
記Ｌ−リジン生産培地に接種して31.5℃にて培養した。
培養を開始してから１２時間後に培養温度を３４℃にシ
フトし、培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。
コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ12993
株に、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で
自律複製可能なプラスミドpHC4を電気パルス法により形
質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
グルタミン酸生産株へのpHC4pgiの導入とＬ−リジン及
びＬ−グルタミン酸同時生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpHC4pgiで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ12993/pHC4pgiを用いてＬ−
リジン及びＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下の
ように行った。5μg/mlのクロラムフェニコールを含む
ＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ12993/pHC4pg
i株の菌体を、5μg/mlのクロラムフェニコールを含む前
記Ｌ−リジン生産培地に接種して31.5℃にて培養した。
培養を開始してから１２時間後に培養温度を３４℃にシ
フトし、培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。
コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ12993
株に、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で
自律複製可能なプラスミドpHC4を電気パルス法により形
質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
【００５３】培養終了後、培養液中のＬ−リジン及びＬ
−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックア
ナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結
果を表３に示した。
−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックア
ナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結
果を表３に示した。
【００５４】
【表３】
表３
───────────────────────────────────
菌 株 Ｌ−リジン生成量(g/L) Ｌ−グルタミン酸生成量(g/L)
───────────────────────────────────
AJ12993/pHC4 １０．０ １８．９
AJ12993/pHC4pgi １２．１ ２０．８
───────────────────────────────────
【００５５】
【発明の効果】本発明により、コリネ型細菌のＬ−リジ
ン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の生産能を向
上させることができる。
ン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の生産能を向
上させることができる。
【００５６】
【配列表】
Sequence Listing
【００５７】
<110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.)
<120> Ｌ−アミノ酸の製造法
<130> P-6530
<141> 1999-07-02
<160> 2
<170> PatentIn Ver. 2.0
【００５８】
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for
amplifying Esherichia coli pgi gene
<400> 1
ggatccattt tcagccttgg caca 24
【００５９】
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for
amplifying Esherichia coli pgi gene
<400> 2
gcatgcgaat tacggcgcgg ggaa 24
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｄ
13/14 Ａ
13/14 13/08
//(Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15
Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｐ 13/06
(Ｃ１２Ｐ 13/06 13/14
Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｐ 13/14
Ｃ１２Ｒ 1:15）
(72)発明者 倉橋 修
神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素
株式会社発酵技術研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA10 BA71 BA72 BA73 BA74
DA05 EA04 FA13 GA11 HA01
4B064 AE07 AE08 AE10 AE19 AE25
CA02 CA19 CC24 DA11
4B065 AA22X AA24X AA26Y AB01
AC14 BA02 CA17 CA43
Claims (6)
- 【請求項１】 細胞中のグルコース ６−リン酸イソメ
ラーゼ活性が増強され、かつＬ−アミノ酸生産能を有す
るコリネ型細菌。 - 【請求項２】 前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−
グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ
−セリンから選ばれる請求項１記載のコリネ型細菌。 - 【請求項３】 前記グルコース ６−リン酸イソメラー
ゼ活性の増強が、前記細菌細胞内のグルコース ６−リ
ン酸イソメラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高め
ることによるものである請求項１記載のコリネ型細菌。 - 【請求項４】 前記グルコース ６−リン酸イソメラー
ゼをコードする遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である
請求項３記載のコリネ型細菌。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載のコ
リネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸
を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取す
ることを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。 - 【請求項６】 前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−
グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ
−セリンから選ばれる請求項５記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18951399A JP2003159092A (ja) | 1999-07-02 | 1999-07-02 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| PCT/JP2000/004342 WO2001002542A1 (fr) | 1999-07-02 | 2000-06-30 | Procede de production d'acide l-amine |
| AU57070/00A AU5707000A (en) | 1999-07-02 | 2000-06-30 | Process for producing l-amino acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18951399A JP2003159092A (ja) | 1999-07-02 | 1999-07-02 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003159092A true JP2003159092A (ja) | 2003-06-03 |
Family
ID=16242540
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18951399A Pending JP2003159092A (ja) | 1999-07-02 | 1999-07-02 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003159092A (ja) |
| AU (1) | AU5707000A (ja) |
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Cited By (4)
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