JP2003174885A

JP2003174885A - 新規タンパク質、それをコードする遺伝子及び新規モノクローナル抗体

Info

Publication number: JP2003174885A
Application number: JP2001378395A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Ishikawa; 義典石川; Masahiro Goto; 政広後藤; Yukitaka Sakamoto; 亨宇坂元; Akio Hirohashi; 説雄廣橋
Original assignee: National Cancer Center Japan
Current assignee: National Cancer Center Japan
Priority date: 2001-12-12
Filing date: 2001-12-12
Publication date: 2003-06-24

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】ガンの診断、転移抑制に有用なタンパク質及
び該タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体
を提供すること。【解決手段】分子中に特定のアミノ酸配列を含み、若
しくは分子中に前記特定のアミノ酸配列に示される１又
は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されている
アミノ酸配列を含み、かつ細胞間接着阻害性を示すタン
パク質、該タンパク質をコードする遺伝子及び該タンパ
ク質に特異的に結合するモノクローナル抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、がん細胞に強発現
して細胞間接着の阻害作用を示す膜タンパクディスアド
ヘリン、ディスアドヘリンをコードする遺伝子、ディス
アドヘリンに特異的に結合するモノクローナル抗体及び
これらの用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】通常、生物の正常細胞は、一定の秩序を
持って増殖を繰り返すが、環境に応じて増殖は次第に収
束する。これに対して、がん細胞は通常の細胞と異なり
無限に増殖を繰り返して悪性腫瘍を形成し、やがて正常
組織へ浸潤するようになる。

【０００３】また、成長した悪性腫瘍は次第に最初に増
殖したがん細胞塊から細胞が離れ、リンパ管や血管に入
って全身を循環し、体内の離れたところに広がって第２
の腫瘍（転移腫瘍）を形成するという性質があり、それ
によりがんの治療を一層困難なものとしている。

【０００４】転移が起こるのは、隣接しあう細胞同士の
結合（細胞−細胞間接着）が弱まり、細胞の運動能が高
まるためであるが、この細胞−細胞間接着にはＥ−カド
ヘリンが大きく関わっている。

【０００５】Ｅ−カドヘリンは膜タンパクのラージファ
ミリーメンバーであり、カルシウム依存ホモフィリック
な細胞−細胞接着において介在し、Ｅ−カドヘリンはカ
テニンを介してアクチン細胞骨格と間接的に結合するこ
とにより、正常な組織構成を維持するという重要な役割
を果たしている。

【０００６】このＥ−カドヘリン−カテニン複合体の機
能減少が、がんの発生、浸潤、転移に相関する報告例も
いくつかあり、ヒト腫瘍における該複合体の不活性化の
メカニズムについても報告例がある（Ｂｅｈｒｅｎｓ，
Ｊ．，Ｍａｒｅｅｅｌ，Ｍ．Ｍ．，ＶａｎＲｏ
ｙ，Ｆ．Ｍ．，&Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ｗ．（１９
８９）ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ１３０，６７−７７）
（Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｃ．&Ｏｂｒｉｎｋ，Ｂ．（１９９
１）ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１４，３１９−２
７）。

【０００７】このように、細胞−細胞間接着機能が低下
することにより細胞の運動能が高まり、転移しやすくな
るということがわかっている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、転移は
非常に複雑なプロセスを経て成立するため、全てのがん
においてその全容を解明するには至っておらず、この転
移因子発現パターンについても個々のがんにおいて特異
的に発現するものがほとんどである。そのため現時点で
は様々ながん細胞の転移に対して、各転移個所において
局所的な対応を取らざるを得ず、全てのがんに対する包
括的な処置方法としては効果的なものは未だ確立されて
いない。

【０００９】本発明はこのような状況を鑑みてなされた
ものであり、がん細胞の浸潤、転移抑制に効果的に用い
られうる新規なタンパク質及びそれをコードする遺伝子
を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は以下
に示すがん細胞に強発現してＥ−カドヘリンのダウンレ
ギュレート作用を示すタンパク質ディスアドヘリン、該
ディスアドヘリンをコードする遺伝子、該ディスアドヘ
リンに特異的に結合するモノクローナル抗体、該遺伝子
を含むベクター、該ベクターにより形質転換された形質
転換体、ディスアドヘリンの製造方法及びその用途を提
供するものである。

【００１１】（１）分子中に配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列を含み、若しくは分子中に前記配列番号２に示
される１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換
されているアミノ酸配列を含み、かつがん細胞に強発現
して細胞間接着阻害性を示すタンパク質、（２）がん細
胞膜で発現して前記細胞間接着阻害性を有する膜タンパ
ク質であることを特徴とする（１）に記載のタンパク
質、（３）Ｅ−カドヘリンのダウンレギュレート作用を
示す（１）に記載のタンパク質、（４）前記Ｅ−カドヘ
リンのダウンレギュレート作用は前記タンパク質のｍＲ
ＮＡ転写後に示すことを特徴とする（３）に記載のタン
パク質、（５）アクチン結合性を示す（４）に記載のタ
ンパク質、（６）膜結合型ムチン特有のスレオニン−セ
リン−プロリン−リッチ細胞外ドメインを有する（１）
から（５）のうちいずれか１項に記載のタンパク質、
（７）配列番号２のアミノ酸番号１〜２１に示されるア
ミノ酸配列とマウスＲＩＣ遺伝子から生じるタンパク質
のシグナルペプチド領域を示すアミノ酸配列とが８１％
の相同性を有することを特徴とする（１）に記載のタン
パク質、（８）配列番号２のアミノ酸番号２２〜１４５
に示されるアミノ酸配列とマウスＲＩＣ遺伝子から生じ
るタンパク質の細胞外ドメイン領域を示すアミノ酸配列
とが２６％の相同性を有することを特徴とする（７）に
記載のタンパク質、（９）配列番号２のアミノ酸番号１
４６〜１６２に示されるアミノ酸配列とマウスＲＩＣ遺
伝子から生じるタンパク質の膜貫通ドメイン領域を示す
アミノ酸配列とが１００％の相同性を有することを特徴
とする（７）又は（８）に記載のタンパク質、（１０）
配列番号２のアミノ酸番号１６３〜１７８に示されるア
ミノ酸配列とマウスＲＩＣ遺伝子から生じるタンパク質
の細胞内領域を示すアミノ酸配列とが６９％の相同性を
有することを特徴とする（７）から（９）のうちいずれ
か１項に記載のタンパク質、（１１）配列番号１に示す
塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部
若しくは全部からなる遺伝子、（１２）分子中に配列番
号２に記載のアミノ酸配列若しくは配列番号２に示され
る１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換さ
れ、かつ細胞間接着阻害性を示すタンパク質をコードす
る塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一
部若しくは全部を含むことを特徴とする（１１）に記載
の遺伝子、（１３）分子中に配列番号２に記載のアミノ
酸配列若しくは配列番号２に示される１又は数個のアミ
ノ酸が付加、欠失若しくは置換され、かつ細胞間接着阻
害性を示すタンパク質をコードする塩基配列又はその相
補的配列並びにこれらの配列の一部若しくは全部を含む
遺伝子の一部又は全てを含む発現ベクター、（１４）分
子中に配列番号２に記載のアミノ酸配列若しくは配列番
号２に示される１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若し
くは置換され、かつ細胞間接着阻害性を示すタンパク質
をコードする塩基配列又はその相補的配列並びにこれら
の配列の一部若しくは全部を含む遺伝子の一部又は全て
を含む発現ベクターにより形質転換される形質転換体、
（１５）分子中に配列番号２のアミノ酸配列若しくは配
列番号２に示される１又は数個のアミノ酸が付加、欠失
若しくは置換され、かつ細胞間接着阻害性を示すタンパ
ク質と特異的に結合するモノクローナル抗体、（１６）
被検体内から採取された組織、細胞を用いるがんの診断
方法であって、前記組織、細胞と分子中に配列番号２に
記載のアミノ酸配列若しくは配列番号２に示される１又
は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換され、かつ
細胞間接着阻害性を示すタンパク質と特異的に結合する
モノクローナル抗体を反応させ、分子中に配列番号２に
記載のアミノ酸配列若しくは配列番号２に示される１又
は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換され、かつ
細胞間接着阻害性を示すタンパク質と該モノクローナル
抗体との抗原抗体反応に基づいて診断することを特徴と
するがんの診断方法、（１７）被検体のがん組織、細胞
に発現した分子中に配列番号２に記載のアミノ酸配列若
しくは配列番号２に示される１又は数個のアミノ酸が付
加、欠失若しくは置換され、かつ細胞間接着阻害性を示
すタンパク質を標的として、分子中に配列番号２に記載
のアミノ酸配列若しくは配列番号２に示される１又は数
個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換され、かつ細胞
間接着阻害性を示すタンパク質と特異的に結合するモノ
クローナル抗体を用いたミサイル療法を行うことを特徴
とするがんの処置方法、（１８）がん処置後の予後診断
方法であって、被検体内からがん処置部の組織、細胞を
取り出し、分子中に配列番号２に示すアミノ酸配列若し
くは配列番号２に示される１又は数個のアミノ酸が付
加、欠失若しくは置換され、かつ細胞間接着阻害性を示
すタンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体を
反応させ、分子中に配列番号２に記載のアミノ酸配列若
しくは配列番号２に示される１又は数個のアミノ酸が付
加、欠失若しくは置換され、かつ細胞間接着阻害性を示
すタンパク質と該モノクローナル抗体との抗原抗体反応
に基づいて診断することを特徴とするがんの予後診断方
法、（１９）分子中に配列番号２に示されるアミノ酸配
列を含み、若しくは分子中に前記配列番号２に示される
１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されて
いるアミノ酸配列を含み、かつ細胞間接着阻害性を示す
タンパク質を具備することを特徴とするがん診断マーカ
ー、（２０）分子中に配列番号２に示されるアミノ酸配
列を含み、若しくは分子中に前記配列番号２に示される
１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されて
いるアミノ酸配列を含み、かつ細胞間接着阻害性を示す
タンパク質を具備する診断マーカーによりがんの検出を
行うことを特徴とするがんの検出方法、（２１）分子中
に配列番号２に記載のアミノ酸配列若しくは配列番号２
に示される１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは
置換され、かつ細胞間接着阻害性を示すタンパク質と特
異的に結合するモノクローナル抗体に抗がん剤、細胞毒
若しくはアイソトープを結合させ、（１）から（６）の
うちいずれか１項に記載のタンパク質と特異的に結合さ
せることによりがん細胞の浸潤、転移を抑制する薬剤組
成物、（２２）配列番号１に示す塩基配列又はその相補
的配列並びにそれらの配列の一部若しくは全部からなる
遺伝子を含む複数の遺伝子断片を具備することを特徴と
するがん細胞スクリーニングキット、（２３）分子中に
配列番号２に記載のアミノ酸配列若しくは配列番号２に
示される１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置
換され、かつ細胞間接着阻害性を示すタンパク質と特異
的に結合するモノクローナル抗体を更に具備することを
特徴とするがん細胞スクリーニングキット、（２４）体
内から組織、細胞を採取し、該組織、細胞に分子中に配
列番号２に記載のアミノ酸配列若しくは配列番号２に示
される１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換
され、かつ細胞間接着阻害性を示すタンパク質のＲＮＡ
が含まれているか解析を行うことにより診断を行うがん
の診断方法、（２５）配列番号２のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列の一部又は全てを含むベクターで形質転
換された形質転換体を培養し、該培養物中に該アミノ酸
配列を含むタンパク質を生成し、これを採取することを
特徴とするタンパク質の製造方法。

【００１２】本発明者らは、マウスハイブリドーマから
産生したモノクローナル抗体から特に様々ながん細胞に
強く反応する新規なモノクローナル抗体ＮＣＣ−３Ｇ１
０を作製し、そのがん細胞における作用を様々ながん細
胞を用いて試験したところ、このＮＣＣ−３Ｇ１０と特
異的に結合する膜タンパクを見出し、さらにこのｃＤＮ
Ａをクローニングし、その塩基配列を同定した。

【００１３】また本発明者らは、該タンパク質のがん細
胞における作用について、遺伝子導入系を用いマウス実
験系に応用し、様々な細胞で該タンパク質によるＥ−カ
ドヘリンのダウンレギュレート作用を見出した。

【００１４】そして本発明者らは、このがん細胞に特異
的に発現する新規タンパク質をディスアドヘリンと命名
した。

【００１５】今後、このディスアドヘリンをマーカーと
してがんの検出や処置あるいは診断（予後診断を含む）
等を行ったり、モノクローナル抗体ＮＣＣ−３Ｇ１０に
様々な抗がん手段を付加してミサイル療法に用いたりす
ることにより、がん診断、浸潤、転移抑制治療など、様
々ながんの対処方法に利用できる可能性が予測される。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を説明
する。

【００１７】まず、本発明の新規なタンパク質であるデ
ィスアドヘリンについて説明する。

【００１８】ディスアドヘリン（以下、「本発明のタン
パク質」ということもある）は、配列番号２に示される
アミノ酸配列を含み、若しくは分子中に前記配列番号２
に示される１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは
置換されているアミノ酸配列を含み、かつがん細胞に強
発現して細胞間接着阻害性を示すタンパク質であって、
本発明のタンパク質には、他の任意のタンパク質（蛍光
タンパク等）との融合タンパク等も含まれる。

【００１９】ここで言う「強発現」とは、もともと発現
していたタンパク質が更に発現増大することのみなら
ず、本来発現していなかったタンパク質が多少でも発現
することも意味する。

【００２０】本発明のタンパク質はがん細胞膜に発現
し、かつＥ−カドヘリンのダウンレギュレート作用を示
す膜タンパクである。そのダウンレギュレート作用機序
は、Ｅ−カドヘリンのｍＲＮＡ転写後であってタンパク
レベルでその作用を発揮し、細胞骨格のアクチンと結合
することにより、正常細胞ではＥ−カドヘリン、アクチ
ン、カテニンの結合による細胞接着がなされるところ、
がん細胞においてはこの相関関係が崩れてしまい、Ｅ−
カドヘリンのダウンレギュレートがおきてしまうと考え
られる。これにより、細胞間接着阻害性を示すと考えら
れている。

【００２１】さらに、本発明のタンパク質は、膜結合型
ムチン特有のスレオニン−セリン−プロリン−リッチ細
胞外ドメインを有することを特徴としている。このムチ
ンの型糖鎖細胞表面における変化は細胞のがん化の一般
的な特徴であり、その一つであるエピシアリン（ＭＵＣ
１）は高度に糖鎖修飾された細胞外ドメインを介してＥ
−カドヘリンの機能を抑制することが知られているが、
本発明のタンパク質もその構造を有することから、細胞
間の接着を妨げる可能性があると考えられる。

【００２２】本発明のタンパク質は、従来公知の方法に
よりヒトの臓器、細胞株等から単離することができる。
また、ペプチドとして利用する場合は、本発明によって
提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によって調整
することできる。また、本発明のタンパク質の製造方法
においては、詳しくは後述する本発明に係る遺伝子、発
現ベクター及び形質転換体を用いて組換えＤＮＡ技術に
より取得することもできる。この場合、該ｃＤＮＡ断片
を適当なベクターに組換え、この組換えベクターを、大
腸菌、あるいはほ乳類細胞等に組み込んで形質転換体と
し、そこから該タンパク質を大量に発現することができ
る。

【００２３】具体的には、例えば大腸菌等の微生物に発
現させる場合、微生物中で複製可能なベクターに、本発
明に係るｃＤＮＡを挿入して発現ベクターを作成し、こ
の発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、次いで該形質
転換体を培養すれば該ｃＤＮＡがコードするタンパク質
を微生物内で大量に発現させることができ、若しくは他
のタンパク質との融合タンパクとして発現させることも
できる。この場合、融合タンパクとして発現した後、適
当なプロテアーゼで切断すれば、ｃＤＮＡがコードする
タンパク部分のみを取得することも可能である。

【００２４】さらに、本発明に係るタンパク質の製造方
法においてはディスアドヘリンをほ乳類細胞で発現させ
ることも可能であり、この場合には、ｃＤＮＡ断片をほ
乳類細胞用発現ベクターに挿入して動物細胞内に導入す
れば、該タンパク質を発現させることが可能となる。

【００２５】本発明のタンパク質は配列番号２のアミノ
酸配列を有するが、このアミノ酸配列はアミノ酸番号１
〜２１に示されるアミノ酸配列とマウスＲＩＣ遺伝子か
ら生じるタンパク質のシグナルペプチド領域を示すアミ
ノ酸配列とが８１％の相同性を有し、アミノ酸番号２２
〜１４５に示されるアミノ酸配列とマウスＲＩＣ遺伝子
から生じるタンパク質の細胞外ドメイン領域を示すアミ
ノ酸配列とが２６％の相同性を有し、アミノ酸番号１４
６〜１６２に示されるアミノ酸配列とマウスＲＩＣ遺伝
子から生じるタンパク質のトランスメンブレンドメイン
領域を示すアミノ酸配列とが１００％の相同性を有し、
アミノ酸番号１６３〜１７８に示されるアミノ酸配列と
マウスＲＩＣ遺伝子から生じるタンパク質の細胞内領域
を示すアミノ酸配列とが６９％の相同性を有している。

【００２６】ここで、ＲＩＣとは、Ｒｅｌａｔｅｄｔ
ｏＩｏｎＣｈａｎｎｅｌｓを意味し、ＦＸＹＤファ
ミリータンパクの一つ（Ｓｗｅａｄｎｅｒ，ｋ．Ｊ．
ａｎｄＲａｅｌ，Ｅ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｉ
ｃｓ６８，４１−５６．）であり、細胞膜のイオン輸
送に関係していると考えられている。発明者らが本発明
のタンパク質をホモロジー検索したところ、上述の通り
マウスＲＩＣ遺伝子から生じるタンパク質との相同性が
見出され、これにより本発明のタンパク質は細胞膜のイ
オン輸送に関係していると推測されるが、細胞外ドメイ
ン領域においてマウスＲＩＣ遺伝子から生じるタンパク
質との相同性が低いため、マウスＲＩＣ遺伝子から生じ
るタンパク質とは機能が異なると考えられる。

【００２７】本発明の遺伝子は、配列番号１に示す塩基
配列若しくはその相補的配列並びにこれらの配列の一部
若しくは全部からなる遺伝子であり、該配列はディスア
ドヘリンの完全長ｃＤＮＡを示す。

【００２８】本発明の遺伝子は、例えば本発明に係るｃ
ＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして既存のゲノ
ムライブラリーから単離することができる本発明に係る
遺伝子（ｃＤＮＡ）は、例えばその塩基配列に基づいて
合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト細
胞から作成したヒトｃＤＮＡライブラリをスクリーニン
グすることにより得ることができる。あるいはこのオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ法を用いて本
発明の遺伝子（ｃＤＮＡ）を合成することも可能であ
る。

【００２９】一般に遺伝子は個体差による多型が認めら
れるので、１または複数個の塩基の付加、欠失または置
換されているｃＤＮＡも当然この発明に含まれる。そし
て、これらの変更によって生じる１又は複数個のアミノ
酸の付加、欠失又は置換されているアミノ酸からなるタ
ンパク質も、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質の活性を有する限り、本発明に含まれるものであ
る。

【００３０】また、本発明の遺伝子又はそれらと相補的
な配列の全て又は一部断片は、がんの遺伝子診断用プロ
ーブとして用いることができる。更にこれら断片を複数
含むキットを作成し、がんの検出、診断に用いることも
できる。

【００３１】次に、本発明のモノクローナル抗体につい
て説明する。

【００３２】本発明のモノクローナル抗体ＮＣＣ−３Ｇ
１０は、上述したディスアドヘリンに特異的に結合する
抗体である。該抗体はＩｇＧｌであって、様々な種類の
がんに反応し、かつ正常細胞に対してはごく限られたも
のにしか反応しないという特性がある。このことから、
様々ながん細胞で発現したディスアドヘリンを、確実に
認識することができ、多種多様ながんを該抗体で検出、
診断若しくは処置することが可能となる。

【００３３】本発明の抗体は、上記タンパク質又はその
部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法により、モ
ノクローナル抗体として得ることができる。

【００３４】また、従来公知の方法により作成したハイ
ブリドーマにモノクローナル抗体を産生させた後、免疫
染色法を用いて様々ながん細胞及び正常細胞と反応さ
せ、がん細胞と高率に反応し、正常細胞では扁平上皮細
胞の基底細胞、内皮細胞及びリンパ球のみと反応すると
いう基準を満たすものを本発明のモノクローナル抗体Ｎ
ＣＣ−３Ｇ１０として選出することができる。

【００３５】例えば、がん細胞を常法に従いマウス等の
動物に免疫し、得られる抗体産生細胞を、骨髄腫細胞等
と融合させる方法が用いられる。免疫に用いられる細胞
としては、例えば培養細胞等があげられる。また、免疫
に用いられる動物としては、例えばほ乳類等が挙げられ
るが、好ましくはマウスやラット等を用いるのが良い。
マウスを用いる場合、がん細胞をマウスに免疫し、通常
の方法に従って脾細胞を調整する。次いで調整した脾細
胞とミエローマ細胞とを融合して、恒常的に抗体を産生
可能なハイブリドーマとする。

【００３６】ハイブリドーマから得られた抗体の種類は
多岐にわたるため、正常細胞を含んだ各種のがん組織を
用い、その結合反応性を公知の種々の方法により測定す
ることにより目的とする抗体を選出することができる。
ここで、反応を測定する方法としては、例えば免疫粘着
反応、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）、免疫染色法等
があげられる。

【００３７】免疫染色法は、正常細胞を含むがん組織切
片上で、直接又は間接的に免疫染色することにより、目
的とする特定のタンパク質や糖鎖に特異的に結合してい
る部位が発色するので、その発色の強度により所望の抗
原の発現を可視化するものである。本発明においては、
特定のがんのみならず、様々ながんに共通して発現する
一つの抗原を認識する抗体を得ることが目的であるた
め、例えば胃がん、大腸がん、肝がん等の組織を用い、
複数回測定を行い染色強度により所望の抗体を選別し
た。

【００３８】また、今回用いた免疫染色法は、組織を検
査の対象とするため、通常の臨床試験においても同様に
行うことが可能であり、該抗体を用いた免疫診断法とし
て用いることができる。

【００３９】このようにして得られた抗体は、今後ディ
スアドヘリンをマーカーとした検出方法・装置に用いら
れることはもちろん、該抗体に抗がん剤や、細胞毒等を
結合させて、がんの処置方法や抗がん剤として用いられ
ることも可能である。

【００４０】本発明のタンパク質及びモノクローナル抗
体の用途としては、ディスアドヘリンそのものをがんの
マーカーとして、ＮＣＣ−３Ｇ１０が認識するか否かに
よりがんを検出・診断するだけでなく、手術により病巣
を除去した後等の再発診断（予後診断）を行うことも可
能である。更に、進行したがんの転移を調べるための検
査にも有効に用いることができる。その場合、ディスア
ドヘリンは様々ながんに発現するタンパク質であるた
め、特定のがんに限定されることなく、幅広い範囲のが
んを対象として検査を行うことが可能である。

【００４１】また、上述したようにがんのミサイル療法
に本発明の抗体を用いることも有効な治療になると考え
られ、またそのための薬剤として利用することも有効で
ある。

【００４２】

【実施例】以下、本発明のタンパク質及びモノクローナ
ル抗体について実施例を用いて説明する。ただし、本発
明はこの実施例に限定されるものではない。

【００４３】<調製例：細胞の調製>実施例で用いた培養
細胞は、予め以下の通り調製した。

【００４４】ヒト肝細胞がんＬｉ−７細胞株（Ｈｉｒｏ
ｈａｓｈｉ，Ｓ．，Ｓｈｉｍｏｓａｔｏ，Ｙ．，Ｋ
ａｍｅｙａ，Ｔ．，Ｋｏｉｄｅ，Ｔ．，Ｍｕｋｏｊ
ｉｍａ，Ｔ，．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．，ａｎｄＫ
ａｇａｙａｍａ，Ｋ．（１９７９）ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓ３９，１８１９−２８）、ＳＶ４０ラージＴ抗
原により不死化したヒト臍帯静脈内皮細胞のＨＵＶＥＣ
Ｔ、大腸がんのＮＣＣＣｏ３１細胞株（Ｙａｓｕｉ，
Ｎ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｏｃｈｉａｉ，
Ａ．，Ｉｎｏ，Ｙ．，Ａｋｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｏ
ｒｉｓａｋａ，Ａ．，Ｋｉｔａｊｉｍａ，Ｍ．，ａｎ
ｄＨｉｒｏｈａｓｈｉ，Ｓ．（１９９７）Ｉｎｖａｓ
ｉｏｎＭｅｔａｓｔａｓｉｓ１７，２５９−６
９）及びＥ−カドヘリンをトランスフェクトしたマウス
Ｌ細胞のＬＥ細胞（Ｓｈｉｍｏｙａｍａ，Ｙ．，Ｔａ
ｋｅｄａ，Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，Ｓ．，Ｋｉ
ｔａｊｉｍａ，Ｍ．，ａｎｄＨｉｒｏｈａｓｈｉ，
Ｓ．（１９９９）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７４，
１１９８７−９４）は５％炭酸ガス存在下３７度で培養
した。

【００４５】ＰＬＣ／ＰＲＦ／５及びＨＴ２９（細胞）
はＡＴＣＣより入手した。また、ヒト肺扁平上皮がん細
胞株ＰＣ１０は東京医科大の早田氏から提供されたもの
を用いた。

【００４６】<実施例１：モノクローナル抗体の作製> ・ハイブリドーマの作製（１）６週齢のＢａｌｂ／ｃマウス腹腔にＬｉ−７細胞
を注入して免疫し、２週間間隔で3回追加免疫を行っ
た。最終免疫後、脾細胞を摘出し、細胞をＲＰＭＩ培地
で2回洗浄し、マウスミエローマ細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ
１４と脾細胞を１：５に混合し、培地で一回洗浄した。

【００４７】次に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
１５００は予め３７℃で温めておき、ＰＥＧと等量のＲ
ＰＭＩを加えて調整した。上記混合した細胞中にＰＥＧ
１ｍｌを1分かけて滴下し、引き続き基本培地（ＲＰＭ
Ｉ）1分間で１ｍｌを滴下し、その後更に７ｍｌを２〜
３分かけて滴下した。このようにして、ＰＥＧとＲＰＭ
Ｉ合計で１０ｍｌとし融合をゆるやかに停止した。次い
で２２００ｒｐｍで5分遠心した後、上清を除去し、ペ
レットをピペットで掻き取るようにほぐし、１５％の割
に牛血清を含むＲＰＭＩ培地で培養した。その後細胞数
を２×１０^５／ウェルになるように、９６ウェルプレー
ト播いた（培地量１００μ１）。

【００４８】播きこみ後の培地の交換は、2日目にＨＡ
Ｔ培地１００μ１を加え、計２００μｌ／ウェルとした
後、３，４日目にＨＡＴ培地を交換し、その後は6日目
と9日目に培地を交換して、１１日目に培養上清１００
μｌ取り、公知の免疫染色法によりスクリーニングを行
った。

【００４９】次に、上述の通りスクリーニングし、がん
細胞と高率に反応したハイブリドーマを限界希釈による
クローニングと免疫染色法によるスクリーニングを繰り
返し、所望のハイブリドーマを得た。・細胞染色ダルベッコイーグル改変培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬＣ
ｏｐ）９ｍｌに１００％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬＣｏｐ）１ｍｌを加えて５％ＣＯ _２存在
下３７度で、ＨＵＶＥＣＴ、ＮＣＣＣｏ３１、ＬＥ細
胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５及びＨＴ２９、ＰＣ１０細胞を
２日ないし３日間培養したものを本抗体と反応させた。・免疫染色のための細胞及び組織切片の作製調製例で得られた各培養細胞をガラス上で培養し、４
℃、２％スクロースを含有した２％パラホルムアルデヒ
ドリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で固定して、試験
用の細胞を調製した。カバーグラスの細胞の染色のため
には、一次抗体ＮＣＣ−３Ｇ１０抗体と反応させた後、
ＦＩＴＣ標識された２次抗体と反応させた。抗体の希釈
は、２％正常ブタ血清を用いた。２次抗体と反応させて
インキュベートした後、アクチンとの２重染色のために
ローダミン標識ファロイジンで染色した。その後、カバ
ークラスを充分な量のＰＢＳで洗浄し、ＰｅｒｍａＦｌ
ｕｏｒ（ＬｉｐｓｈａｗＩｍｍｕｎｏｎ，Ｐｉｔｔｓ
ｂｕｒｇ，ＰＡ）で封入した。また、臨床材料として
得られたホルマリンパラフィン切片は、以下の手順で染
色バスケットに漬けて脱パラフィンを行った。キシレン
（５分）、キシレン（５分）、１００％エタノール（５
分）、１００％エタノール（５分）、次いで、１００％
メタノールで２０分間処理し、内在性ペルオキシターゼ
の失活処理を行った。更に、オートクレーブ処理による
抗原の不活性処理を行い、ＰＢＳですすいだ後、一次抗
体ＮＣＣ−３Ｇ１０抗体と反応させた。インキュベート
後ＰＢＳですすいだ。さらに、ビオチン化二次抗体、ア
ビディン・ビオチン・ペルオキシターゼ複合体と反応さ
せた。抗原の局在を可視化するために、ベンチジン反応
を行い１００％エタノール（５分）、１００％エタノー
ル（５分）、キシレン（５分）、キシレン（5分）。キ
シレン（５分）、で透徹した後マリノールで封入した。

【００５０】続いて、ディスアドへリンとカドへリンと
の関係を調べる目的で、Ｃｙ２標識したＮＣＣ−３Ｇ１
０（ディスアドへリン抗体）とビオチン化したＨＥＣＤ
−１（抗Ｅ−カドへリン抗体）、アビジン標識―ローダ
ミンを用いた組織の二重染色を行った。また、ディスア
ドへリン抗原はＴ細胞にも存在している可能性があるこ
とから、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３抗体（Ｎｏｖｏｃ
ａｓｔｒａｌａｂＬＴＤ，ＵＫ）とＢ細胞マーカーで
あるＣＤ７９ａ抗体（ＤＡＫＯ．ＪａｐａｎＬＴＤ）と
を用いてどちらのリンパ球に局在するのかを免疫染色を
行い同定した。陰性コントロールでは、組織切片に一次
抗体の変わりに２％正常ブタ血清を用いた。

【００５１】このようにして得られた組織切片または細
胞の蛍光染色は、ＺｅｉｓｓＡｘｉｐｈｏｔＰｈｏ
ｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ又はＺｅｉｓｓＬＳＭ４１
０Ｃｏｎｆｏｃａｌｌａｓｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（共にＣａｒｌＺｅｉｓｓ，
Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察を行った。こ
れらの結果を図１に示す。

【００５２】同じく図１に、ＮＣＣ−３Ｇ１０のがん細
胞表面における免疫染色の状態を示す。（Ａ）では浸潤
性の膀胱がん、（Ｂ）では浸潤性大腸がんの細胞膜で反
応していることがわかる。（Ｃ）では食道の扁平上皮細
胞の基底細胞、内皮細胞及びリンパ球と反応している。
ただし、本発明の抗体が正常細胞と反応するのは上記の
ようなごく限られた細胞である。（Ｄ）はＣｙ２標識Ｎ
ＣＣ−３Ｇ１０とビオチン化ＨＥＣＤ−１（抗カドへリ
ン抗体）とを用いた２重染色法により、浸潤性乳管がん
への反応の違いを見たものである。矢印部分では、ディ
スアドへリンのみが、接着能を失った浸潤細胞にも反応
していることを示している。

【００５３】このように、本発明の抗体ＮＣＣ−３Ｇ１
０はがん細胞表面の抗原を認識し、該抗体は細胞表面の
みならず、細胞同士の接着能力を失ってばらばらになっ
た細胞の表面及び周囲でも反応を示していた。

【００５４】また、該抗体はＣＤ３陽性リンパ球とは反
応したが、ＣＤ７９ａ陽性リンパ球とは反応しなかった
ことから、ＮＣＣ−３Ｇ１０陽性となったリンパ球はＴ
細胞であると推測された。

【００５５】<実施例２：ＮＣＣ−３Ｇ１０を用いたデ
ィスアドヘリンの単離> ・ｃＤＮＡスクリーニング次いで上記実施例１で得られた抗体と特異的に反応する
タンパク質（ディスアドヘリン）を同定するため、上記
抗体を用いてｃＤＮＡスクリーニングを行い、ディスア
ドヘリンの完全長ｃＤＮＡを得た。ＴＲＩｚｏｌ試薬
（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍ
Ｄ，ＵＳＡ）を用いて調製例で調整したＮＣＣ−ＣＯ３
１細胞から全ＲＮＡの抽出を行い、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ―
ｄＴ３０<Ｓｕｐｅｒ>（宝酒造）を用いてｐｏｌｙ
（Ａ）⁺ＲＮＡを精製した。次にこのｐｏｌｙ（Ａ）⁺Ｒ
ＮＡを鋳型としてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素
（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍ
Ｄ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡを合成後、Ｌｉｇａｔｉ
ｏｎｈｉｇｈｋｉｔ（東洋紡）を用いてλｇｔ１１
ファージに組み込み発現ライブラリーを作製した。ＮＣ
Ｃ−３Ｇ１０を用いてこの発現ライブラリー約４０万ク
ローンの免疫スクリーニングを行い、ＮＣＣ−３Ｇ１０
のエピト―プを含む部分ｃＤＮＡクローンを得た。さら
にこの部分ｃＤＮＡをラジオアイソトープ標識した後プ
ローブとして用いて、ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー
（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍ
Ｄ，ＵＳＡ）のスクリーニングを行い、完全長ｃＤＮＡ
（以下「Ｌ３ｃＤＮＡ」という）クローンを得た。この
Ｌ３ｃＤＮＡをＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏ
ｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いて塩基配列を調
べ、塩基配列の確定およびアミノ酸配列変換にはＧｅｎ
ｅｔｙｘ−ＭａｃＧｅｎｅｔｉｃＩｎｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＳｏｆｔｗａｒｅ（Ｓ
ｏｆｔｗａｒｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｔｏｋｙ
ｏ，Ｊａｐａｎ）、ホモロジ―サーチにはＭＰｓｅａ
ｒｃｈ、タンパク質のトポロジーの推定にはＰＳＯＲＴ
ＩＩｐｒｏｇｒａｍｓをそれぞれ用いて解析した。

【００５６】これら解析の結果を図２及び図３に示す。
図２はディスアドヘリンの完全長ｃＤＮＡ配列及びアミ
ノ酸配列部分を示し、下線部は疎水領域を示す。また、
図３は膜貫通ドメイン前後のアミノ酸配列の相同性を示
している。

【００５７】図２に示すように、単離されたＬ３ｃＤＮ
Ａは８７２ｂｐの塩基対の、ポリ（Ａ）末端を持つ完全
なオープンリーディングフレームを有し、１７８個のア
ミノ酸をコードすることがわかった。

【００５８】また、部分ｃＤＮＡをプローブとして別の
完全長ｃＤＮＡ（Ｌ６４ｃＤＮＡ）クローンも単離でき
たが、この塩基配列は、下記に示すような６０ｂｐから
なる塩基配列をＬ３ｃＤＮＡの開始コドン（メチオニ
ン）の前に更に追加したものである。

【００５９】

【化１】

【００６０】しかしながら、オープンリーディングフレ
ームについては何の影響も無いため、Ｌ３ｃＤＮＡ同様
のタンパク質をコードしている。

【００６１】このＬ３ｃＤＮＡは２つの疎水領域を有
し、（１）シグナルペプチド、（２）スレオニン−セリ
ン−プロリン−リッチな細胞外ドメイン、（３）膜貫通
ドメイン、及び（４）細胞内領域に対応していることも
分かった。特に、マウスＲＩＣ遺伝子から生じるタンパ
ク質との相同性は上記４つのドメインにおいて、（１）
から順に８１％、２６％、１００％、６９％の相同性を
示した。このことから、ディスアドヘリンはマウスＲＩ
Ｃ遺伝子がコードするタンパク質と同じような働きをす
るものと考えられるが、（２）細胞外ドメインの相同性
が低いため、ＲＩＣ遺伝子から生じるタンパク質と異な
る機能を持つ可能性がある。

【００６２】また、図３に示すように、ディスアドヘリ
ン及びマウスＲＩＣは塩素イオンチャネルのＭａｔ−８
や、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼ及びプロテインキ
ナーゼＣの主な細胞膜基質であるＰｈｏｓｐｈｏｌｅｍ
ｍａｎ（ＰＬＭ）、さらにＮａ⁺、Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼγ
サブユニットなどのイオンチャネルと非常に類似してい
ることが分かった。

【００６３】<実施例３：ディスアドヘリンのタンパク
解析（ウェスタンブロッティング）次にディスアドへリ
ンの蛋白発現を分析するためにウェスタンブロッティン
グ法を用いてディスアドへリンの解析を行った。

【００６４】大腸菌でＧＳＴ融合タンパクとして発現さ
せたディスアドへリンをＮＣＣ−３Ｇ１０で反応させ
た。陰性コントロールとしては一次抗体の代わりに２％
正常ブタ血清を用いた。

【００６５】前述の各がん細胞株を、ｌｙｓｉｓｂｕ
ｆｆｅｒ（１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．
４、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ×１００，Ｃａｃｌ₂、
１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド、１
０μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌペプスタ
チンＡ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン）２００μｌで
溶解し、１５０００回転, ３０分間遠心分離を行った。
その後上清をＴｒｉｔｏｎ×１００溶性分画として回収
し、ペレットを５０μｌｌａｅｍｍｌｉサンプルバッフ
ァーで再度懸濁した。１５０００回転，３０分間遠心分
離をかけ、この上清をＴｒｉｔｏｎ×１００不溶分画と
してサンプルに用いた。

【００６６】このようにして得られた（タンパク）サン
プルを２０μｇ各レーンにつきアプライし、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を
行った。

【００６７】さらに、泳動後、ゲル内の蛋白を電気的に
ポリビニルデンフロライド膜（以下ＰＶＤＦ膜）に移し
取った。

【００６８】ＰＶＤＦ膜及びＷａｔｍａｎ３ＭＭ濾紙
を、分離ゲルより大きめに切っておき、プラスチック容
器にＰＶＤＦ膜を入れ、膜が完全に浸る程度にメタノー
ルを加えた。その後過剰のメタノールを捨てた後、ブロ
ッティングバッファー１（Ｔｒｉｓｂａｓｅ３．０
３ｇ（２５ｍＭ），メタノール２００ｍｌ（２０％），
０．１％ＳＤＳと蒸留水を加えて１０００ｍｌとする）
２０から５０ｍｌに浸し、１５分以上振とうする。セミ
ドライブロッティング装置上にブロッティングバッファ
ー２０〜５０ｍｌに浸した濾紙2枚を置く。ブロッティ
ングバッファー１に浸しておいたＰＶＤＦ膜を重ねる。
次いで分離ゲルを重ね、次いでブロッティングバッファ
ー１２０〜５０ｍｌに浸した濾紙2枚を重ねる。ブロッ
ティング装置（バイオラド社）をセットし、１３Ｖ／ゲ
ルで３０分間転写を行い、転写後、ＰＶＤＦ膜をスキム
ミルクに浸し、非特異的蛋白の吸着を抑制する。該膜に
一次抗体を反応させた後、インキュベートし、引き続き
ペルオキシターゼ標識抗マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎ
ｄ）を結合させてインキュベートした。その後、ペルオ
キシターゼ標識バンドはＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）を用いて可視化した。その結果を図４に示す。図4
はウェスタンブロッティングによるディスアドへリンの
解析結果を示す。Ａ）はＧＳＴ融合タンパクとして大腸
菌で発現させたディスアドへリンにＮＣＣ−３Ｇ１０を
結合させた状態（レーン２）と、陰性コントロールとし
て一次抗体を結合させない状態（レーン１）を示す。
Ｂ）は各種がん細胞の界面活性剤抽出液として電気泳動
及びＰＶＤＦ膜へ転写したものを上記同様にディスアド
へリン抗体で検出したものである。レーン1〜７に用い
た細胞は以下の通りである。レーン１：Ｌｉ−７細胞、
レーン２：ＰＣ−１０、レーン３：ＨＴ２９、レーン
４：ＮＣＣ−ＣＯ３１、レーン５：ＨＵＶＥＣＴ、レー
ン６：ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、レーン７：Ｌ３−ＨＳＶ／
ｐｃＤＮＡ３（詳細は後述）をトランスフェクトしたＰ
ＬＣ／ＰＲＦ／５（ＡＬ３−１（後述））。

【００６９】また、これら得られたタンパク質から質量
を同定した。

【００７０】図４Ａレーン２に示すように、大腸菌内で
発現したＧＳＴ融合タンパクの場合には４５ｋＤであ
り、図４Ｂレーン７のほ乳類細胞で発現したタンパク質
の場合には５５ｋＤという結果を得た。どちらもＮＣＣ
−３Ｇ１０で認識された。また、いくつかの細胞株で
は、ＮＣＣ−３Ｇ１０で認識されるタンパク質には５０
〜５５ｋＤというわずかながら分子量に差異が見られた
（図４Ｂ）。この差異は、Ｏ−グリコシル化の程度の違
いと考えられ、シーケンスデータ及びグリコシル化検出
試薬で検証した。 <実施例４：ディスアドヘリンのＲＮＡ解析（ノザンブ
ロッティング）>ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯＢＲ
Ｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用い
て調製例で調整した細胞から全ＲＮＡの抽出を行った。

【００７１】全ＲＮＡ２０μｇにＲＮＡゲルローディン
グバッファー（Ａｍｂｉｏｎ）を加えて６５℃で１５分
間加熱、氷上で急冷後、１％アガロース・ホルムアルデ
ヒドゲル電気泳動を行った。次に毛細管法を利用して、
ゲル中のＲＮＡは２０×ＳＳＣを用いてニトロセルロー
ス膜に一晩転写し、湿潤状態でＵＶクロスリンクをして
ＲＮＡの膜への固定を行った。

【００７２】ＲＮＡを転写、固定した膜はｒｅａｄｙ−
ｐｒｉｍｅＤＮＡ標識システム（ＡｍｅｒｓｈａｍＰ
ｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，
Ｓｗｅｄｅｍｎ）によりＰ３２と反応させて標識したＬ
３ｃＤＮＡをプローブとして、また、Ｅ−カドへリンの
第５細胞外サブドメイン（ＥＣ５）に位置する１７２ｂ
ｐのヌクレオチドシーケンスを増幅し、Ｅ−カドへリン
特異的反応に対するプローブとして、またＲＮＡ量の補
正にグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼｃ
ＤＮＡをプローブとして、ハイブリダイゼーション及び
オートラジオグラフィーを行った。ハイブリダイゼーシ
ョン後の洗いには０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液
を用い６５℃、３０分間、２回行った。次に膜をＸＡＲ
（コダック）Ｘ線フィルムと共に、増感紙を用いて−８
０℃にて一晩曝写を行った後、現像定着した。ＲＮＡの
定量はデンシトメーターを用いて判定した。 <実施例５：ｃＤＮＡのトランスフェクション>ＰＣＲ法
によりＬ３ｃＤＮＡを鋳型としてオープンリーディング
フレームを完全に含むように増幅した。その際ストップ
コドン（ＴＧＡ）を除き、下流にＨＳＶタグ配列（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ストップコドン
（ＴＡＧ）とつなげて、ほ乳動物発現ベクターｐｃＤＮ
Ａ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ
Ａ）にサブクローニングを行った。得られたＬ３ＨＳＶ
／ｐｃＤＮＡ３は、塩基配列の誤りがないことをシーケ
ンサーを用いて確認した。

【００７３】リポフェクタミン試薬（ＬｉｆｅＴｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＬ３ＨＳＶ／ｐｃＤＮＡ
３あるいはｐｃＤＮＡ３ベクター単独をＰＬＣ／ＰＲＦ
／５及びＬＥ細胞にトランスフェクトした。薬剤選択は
ジェネティシン（Ｇ４１８；ＧＩＢＣＯＢＲＬＣｏ
ｐ）を用いて行い、免疫蛍光染色及び免疫ブロッティン
グ法によりスクリーニングして、ディスアドへリン安定
発現クローンを選出した。免疫蛍光染色は実施例１、免
疫ブロッティング法は実施例３に準じる。このようにし
て得られたトランスフェクタントをＡＬ３−１，６，７
と命名した。同様にベクター単独を導入したｍｏｃｋト
ランスフェクタントをＡＶ１，１１と命名した。

【００７４】これらトランスフェクタントの状態は電子
顕微鏡画像でも検討した。電子顕微鏡の手順は以下の通
りである。

【００７５】グルタルアルデヒドで固定した細胞をエタ
ノール系列で脱水し、次いで細胞をＬＲホワイト樹脂で
包埋した。超薄切片を作成し、ポリビニルホルマル膜で
処理したニッケルグリッド上に超薄切片を回収して、Ｎ
ＣＣ−３Ｇ１０と共に一昼夜インキュベートした。その
後、切片を５ｎｍ金結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｒｉｔ
ｉｓｈＢｉｏＣｅｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ，Ｃａｒｄｉｆｆ，ＵＫ）で反応した。その後超薄切
片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、ＪＥＯＬ−１
０１０電子顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で８０
ｋＶの電圧を加えて画像を撮影した。

【００７６】図５は、得られたトランスフェクタントＡ
Ｌ３−１，６，７及びＡＶ１，１１の位走査画像であ
り、（Ａ）はＡＶ１を、（Ｂ）はＡＬ３−７の画像であ
る。また、（Ｃ）及び（Ｄ）はＡＬ３−１をＮＣＣ−３
Ｇ１０抗体で蛍光免疫染色の結果を示し、（Ｃ）はＡＶ
１を、（Ｄ）はＡＬ３−７の画像である。ｍｏｃｋトラ
ンスフェクタントＡＶ１では染色されていないのに対
し、ＡＬ３−７では細胞膜に一致してディスアドへリン
が染色されている。

【００７７】図６はＬ３ｃＤＮＡトランスフェクタント
の電子顕微鏡写真である。（Ａ）はＡＶ１では強固な細
胞接着が維持されている（矢印）。一方、ＡＬ３−７の
細胞表面画像（Ｂ）では、表面に絨毛が大量に発生して
いることが分かり、細胞間接着が妨げられていると考え
られる。また、（Ｃ）は免疫電子顕微鏡によるＡＬ３−
１の画像であるが、細胞表面にディスアドへリンが局在
していることが金粒子の存在で明らかである。

【００７８】また、このようにして得られたトランスフ
ェクタント及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を用いて、Ｅ−
カドへリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニ
ン、ディスアドへリンの発現状態をタンパクレベルで、
ウェスタンブロッティングにより解析した。また、Ｅ−
カドへリン及びディスアドへリンの発現をＲＮＡレベル
で、ノザンブロッティングにより比較検討した。尚、ウ
ェスタンブロッティンング、ノザンブロッティングの手
順は上記実施例に準ずる。

【００７９】これらの結果を図７に示す。

【００８０】図７（Ａ）では、Ｌ３ｃＤＮＡトランスフ
ェクタントではＥ−カドへリンとα−カテニンの発現が
著しく減少していることがわかる。

【００８１】しかしながら、ｍＲＮＡの発現レベルは、
図７（Ｂ）に示すように、本実施例の結果ではＥ−カド
へリンとディスアドへリンの発現の量はＬ３ｃＤＮＡト
ランスフェクタントであってもほとんど変わらなかっ
た。このことから、ディスアドへリンはＥ−アドへリン
を転写後、すなわち、タンパクレベルでダウンレギュレ
ートしていると考えられる。 <実施例６：ビーズアッセイ>ＮＣＣ−３Ｇ１０をコート
したラテックスビーズが細胞表面上に付着することでデ
ィスアドへリン分子が凝集する。この時ディスアドへリ
ン分子と結合している他の分子もまた一緒に凝集し、デ
ィスアドへリン分子を介した蛋白の相互作用が推定でき
る。実験ではラテックスビーズにＮＣＣ−３Ｇ１０をコ
ートして、調製例にて得られた細胞と共に培養した。ま
た、同一細胞標本をファロイジン（アクチン特異的結合
試薬）染色することで、アクチンとの関係を検討した。
その結果を図９の画像に示す。（Ａ）はコントロールと
してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でコートしたビーズ
を用いたものであり、（Ｂ），（Ｃ）は該抗体をコート
したビーズを用いたものである。ＮＣＣ−３Ｇ１０によ
りディスアドへリンが周囲に凝集し、さらにアクチンが
ファロイジンにより染色され、ディスアドへリンにより
アクチンもまた凝集されていることが分かる。このよう
に、ディスアドへリンが発現することによりＥ−カドへ
リンとアクチンの相互の関係が崩れることで、Ｅ-カド
へリン分子が不安定となり、Ｅ-カドへリンのダウンレ
ギュレート作用の原因と推察される。

【００８２】<実施例７：免疫組織化学アッセイ>ヒト組
織を常法によりホルマリンで固定し、パラフィン包埋
し、アビジン−ビオチン−ペルオキシタ−ゼ複合体法を
用いて免疫組織化学的に検討を行った。

【００８３】組織はがん細胞膜に染色された細胞の率に
応じて、−：陰性（がん細胞０％）、＋：陽性（がん細
胞<２０％）、＋＋：陽性（がん細胞>２０％）分類され
た。その結果を図１２の表に示す。このことから、ＮＣ
Ｃ−３Ｇ１０の反応によりディスアドへリンの発現状態
を知り、それによりがんの診断が可能となることが分か
る。

【００８４】血管内皮細胞や上述したようにリンパ球と
も陽性を示すが、組織切片のがんの陽性陰性を評価する
上で、これらの細胞が染色されることでインターナルコ
ントロールとして評価できる利点がある。

【００８５】<実施例８：Ｃａ^２＋依存凝集アッセイ>Ｅ
−カドへリンによる細胞間接着能を調べるために、細胞
の凝集アッセイを行った。

【００８６】上述の実施例で得られたトランスフェクタ
ントＡＶ１，ＡＶ１１，ＡＬ３−１，ＡＬ３―６，ＡＬ
３−７及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５をそれぞれＥ−カドへリ
ン活性を維持しつつトリプシンにより単細胞にした。次
いで１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１％ウシ血
清アルブミン含有１５０ｍＭＮａＣｌ及び１．２５ｍ
ＭＣａ^２＋の中で３０分間Ｇｙｒａｔｏｒｙｓｈａｋ
ｉｎｇを用いて８０ｒｐｍ、３７℃で攪拌しながら培養
した。その後、氷上に静置し反応を停止させ、細胞の凝
集率を測定、計算した。凝集率は１−（Ｎ３０／Ｎ０）
で計算した。ここで、Ｎ０及びＮ３０はそれぞれ、赤血
球計算器により計測された最初の単細胞の数（Ｎ０）と
３０分後の数（Ｎ３０）を示す。全てのＮ０とＮ３０の
測定は３箇所を３回繰り返し、平均値を持って値とし
た。

【００８７】この結果を図７（Ｃ）のグラフに示す。こ
のグラフに示すように、ＡＬ３−１、ＡＬ３−６、ＡＬ
３―７、では凝集率が低いことが分かり、Ｅ−カドへリ
ンの不活性を示す。

【００８８】ＬＥ細胞で同様の実験を行ったもので、Ａ
Ｌ３細胞と同様にＥ-カドへリンの発現低下の再現性の
有無を確認した。

【００８９】<実施例９：肝臓への転移試験>ＳＣＩＤマ
ウス（雄、６週齢）（ＣｌｅａＪａｐａｎ，Ｉｎｃ．
Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い、無菌状態で養育し
た。

【００９０】このＳＣＩＤマウスの脾臓に１×１０^６／
５０ｍｌのがん細胞（ＡＬ３トランスフェクタント）又
はコントロールとしてｍｏｃｋトランスフェクタントを
注入した。その後、１〜３週間マウスを育成し、転移の
有無を目視確認した。この作業は少なくとも２回繰り返
した。転移が生じた器官はアセトンで固定し、組織検査
と免疫組織化学分析を行った。

【００９１】図１０に本実験の結果を示す。（Ａ）は転
移したコロニーの数を示すグラフであり、（Ｂ）はＬ３
ｃＤＮＡトランスフェクタントを注入した場合の肝臓へ
の転移を示す画像であり、（Ｃ）はｍｏｃｋトランスフ
ェクタントを注入した場合の結果（転移無し）を示す画
像である。この結果から、ｍｏｃｋトランスフェクタン
ト等と比べてＬ３ｃＤＮＡトランスフェクタントでは転
移コロニーを形成する数が非常に多いことがわかった。
また、図１０（Ｄ）Ｌ３ｃＤＮＡトランスフェクタント
の転移細胞におけるディスアドヘリンの免疫組織化学染
色の画像、及び（Ｅ）同じく転移細胞で発現しているＥ
−カドヘリンの免疫組織化学染色の画像からも分かるよ
うに、腫瘍細胞ではディスアドヘリンのみが染色されて
いる。

【００９２】<実施例１０：予後診断分析>乳がんのステ
ージＩＩに該当する５８名の患者の術後のディスアドヘ
リンの発現を、ＮＣＣ−３Ｇ１０抗体の反応から測定
し、その結果と予後の関係を調べ、図１１に示すように
カプラン−マイヤー法によるグラフを作成した。また、
統計学的意義はＣｏｘ−ｍａｎｔｅｌ検定法により決定
した。

【００９３】グラフに示すように、本発明の抗体に陽性
反応を示す（ディスアドヘリンを発現している）患者と
陰性反応を示す（ディスアドヘリンを発現していない）
患者とでは、陰性反応の患者の方が予後生存率が良いと
いうことが示されている。

【００９４】

【発明の効果】以上説明したように、本発明のタンパク
質は、がん細胞に強発現し、Ｅ−カドヘリンをダウンレ
ギュレートすることにより細胞間接着能を阻害するとい
う性質を有する。また、本発明のモノクローナル抗体は
様々ながん細胞において反応し、本発明のタンパク質に
特異的に結合する。これらの性質を用いることにより、
がんの組織診断等のマーカーや遺伝子診断、あるいはが
んの浸潤、転移診断及び処置、ミサイル療法の治療薬
等、様々な用途に有効に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト組織中の本発明の抗体ＮＣＣ−３Ｇ１０の
免疫組織化学法による膜染色を示す画像である。（Ａ）
は浸潤性膀胱がんにおける陽性染色を示し、（Ｂ）は浸
潤性大腸がんにおける陽性染色を示す。（Ｃ）は正常細
胞におけるＮＣＣ−３Ｇ１０の反応を示す画像である。
（Ｄ）は乳腺における浸潤性乳管がんのＣｙ２標識ＮＣ
Ｃ−３Ｇ１０とビオチン化ＨＥＣＤ−１（抗Ｅ‐カドヘ
リン抗体）、アビジン−ローダミンによる２重蛍光免疫
染色を示し、矢印はＮＣＣ−３Ｇ１０のみに染色された
浸潤がん細胞を示す。

【図２】本発明のタンパク質ディスアドヘリンの完全長
ｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を示す配列表であ
り、＊印はＴＧＡ停止コドンを示し、下線部分は疎水領
域を示す。

【図３】ディスアドヘリン、マウスＲＩＣ及びその他イ
オンチャネルに関連するＭａｔ−８、ヒトＰＬＭ及びヒ
トＮＡ⁺，Ｋ⁺−ＡＴＰアーゼγサブユニットとの膜貫通
ドメイン前後における相同性を示す部分アミノ酸配列表
である。

【図４】ディスアドヘリンのウェスタンブロット解析結
果を示す画像であり、（Ａ）は、大腸菌においてＧＳＴ
融合タンパクとして発現させたディスアドヘリンのネガ
ティブコントロール（レーン１）とＮＣＣ−３Ｇ１０に
反応させたものを示し、（Ｂ）は各がん細胞を溶解して
得たサンプル中のディスアドヘリンの結果を示す。

【図５】（Ａ）はｍｏｃｋトランスフェクタント（ＡＶ
１）の画像を示し、（Ｂ）はＬ３ｃＤＮＡトランスフェ
クタント (ＡＬ３−７)の画像を示す。（Ｃ）はｍｏｃ
ｋトランスフェクタント（ＡＶ１）の免疫染色画像であ
り、（Ｄ）はＬ３ｃＤＮＡトランスフェクタント（ＡＬ
３−７）の免疫染色画像である。

【図６】ｍｏｃｋトランスフェクタントおよびＬ３ｃＤ
ＮＡのトランスフェクタントの電子顕微鏡画像であり、
（Ａ）はｍｏｃｋトランスフェクタント（ＡＶ１）にお
いて、細胞間結合（矢印）により強固な細胞接触が維持
されている状態を示し、（Ｂ）はＬ３ｃＤＮＡトランス
フェクタント（ＡＬ３−７）が大量の絨毛を細胞膜表面
に生じている状態を示し、（Ｃ）は免疫電子顕微鏡によ
りＬ３ｃＤＮＡトランスフェクタント（ＡＬ３−１）に
おいてディスアドヘリンが局在していることを示す。

【図７】Ｌ３ｃＤＮＡトランスフェクタントにおけるＥ
−カドヘリンの発現及び機能を示す画像であり、（Ａ）
親細胞ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ｍｏｃｋトランスフェクタ
ント（ＡＶ１，ＡＶ１１）及びＬ３ｃＤＮＡトランスフ
ェクタント（ＡＬ３−１，６及び７）中のＥ−カドヘリ
ン、カテニン及びディスアドヘリンのタンパク発現を示
すウェスタンブロッティング画像であり、（Ｂ）Ｅ−カ
ドヘリンとディスアドヘリンとのノザンブロット解析結
果であり、（Ｃ）細胞凝集アッセイの結果を示すグラフ
である。

【図８】ＬＥ細胞におけるディスアドヘリンのＥ−カド
ヘリンダウンレギュレート作用を説明する画像及びグラ
フであり、（Ａ）はｍｏｃｋトランスフェクタント（ク
ローンＶ７、Ｖ９）及びＬ３ｃＤＮＡトランスフェクタ
ント（クローン２，２０，６，１６）におけるマウスＥ
−カドヘリン及びディスアドヘリンの発現を示すウェス
タンブロッティング画像であり、（Ｂ）はＥ−カドヘリ
ン機能を調べるための凝集アッセイの結果を示すグラフ
である。

【図９】ビーズアッセイの結果を示す画像であり、
（Ａ）ＢＳＡ又は（Ｂ），（Ｃ）ＮＣＣ−３Ｇ１０でコ
ートしたビーズを用いた画像である。

【図１０】ディスアドヘリントランスフェクタントにお
ける肝臓への転移試験結果であって、（Ａ）はｍｏｃｋ
トランスフェクタント（ＡＶ１，ＡＶ１１）及びＬ３ｃ
ＤＮＡトランスフェクタント（ＡＬ３−１，６，７）及
びＰＬＣ／ＰＲＦ／５における肝臓に転移したコロニー
数を示すグラフであり、（Ｂ）転移を形成したＬ３ｃＤ
ＮＡトランスフェクタントの画像であり、（Ｃ）転移を
形成しなかったｍｏｃｋトランスフェクタント（ＡＶ
１，ＡＶ１１）の画像であり、（Ｄ）は肝臓へ転移した
Ｌ３ｃＤＮＡトランスフェクタントにおけるディスアド
ヘリンの免疫組織化学染色画像であり、（Ｅ）は同じく
転移細胞におけるＥ−カドヘリンの免疫組織化学染色画
像である。

【図１１】カプラン−マイヤー法による、乳がんステー
ジＩＩ期患者の生存曲線を示す

【図１２】ＮＣＣ−３Ｇ１０の反応によるディスアドヘ
リンの発現量を示す表である。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Cancer Center Research Institue <120> Novel Protein and Gene Encoding Thereof <130> 01XA020 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 874 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggacgcagca gccaccgccg cgtccctctc tccacgaggc tgccggctta ggacccccag 60 ctccgacatg tcgccctctg gtcgcctgtg tcttctcacc atcgttggcc tgattctccc 120 caccagagga cagacgttga aagataccac gtccagttct tcagcagact caactatcat 180 ggacattcag gtcccgacac gagccccaga tgcagtctac acagaactcc agcccacctc 240 tccaacccca acctggcctg ctgatgaaac accacaaccc cagacccaga cccagcaact 300 ggaaggaacg gatgggcctc tagtgacaga tccagagaca cacaagagca ccaaagcagc 360 tcatcccact gatgacacca cgacgctctc tgagagacca tccccaagca cagacgtcca 420 gacagacccc cagaccctca agccatctgg ttttcatgag gatgacccct tcttctatga 480 tgaacacacc ctccggaaac gggggctgtt ggtcgcagct gtgctgttca tcacaggcat 540 catcatcctc accagtggca agtgcaggca gctgtcccgg ttatgccgga atcattgcag 600 gtgagtccat cagaaacagg agctgacaac ctgctgggca cccgaagacc aagccccctg 660 ccagctcacc gtgcccagcc tcctgcatcc cctcgaagag cctggccaga gagggaagac 720 acagatgatg aagctggagc cagggctgcc ggtccaagtc tcctacctcc cccaaccctg 780 cccgcccctg aaggctacct ggcgccttgg gggctgtccc tcaagttatc tcctctgcta 840 agacaaaaag taaagcactg tggtctttgc cc 874 <210> 2 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Pro Ser Gly Arg Leu Cys Leu Leu Thr Ile Val Gly Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Thr Arg Gly Gln Thr Leu Lys Asp Thr Thr Ser Ser Ser Ser 20 25 30 Ala Asp Ser Thr Ile Met Asp Ile Gln Val Pro Thr Arg Ala Pro Asp 35 40 45 Ala Val Tyr Thr Glu Leu Gln Pro Thr Ser Pro Thr Pro Thr Trp Pro 50 55 60 Ala Asp Glu Thr Pro Gln Pro Gln Thr Gln Thr Gln Gln Leu Glu Gly 65 70 75 80 Thr Asp Gly Pro Leu Val Thr Asp Pro Glu Thr His Lys Ser Thr Lys 85 90 95 Ala Ala His Pro Thr Asp Asp Thr Thr Thr Leu Ser Glu Arg Pro Ser 100 105 110 Pro Ser Thr Asp Val Gln Thr Asp Pro Gln Thr Leu Lys Pro Ser Gly 115 120 125 Phe His Glu Asp Asp Pro Phe Phe Tyr Asp Glu His Thr Leu Arg Lys 130 135 140 Arg Gly Leu Leu Val Ala Ala Val Leu Phe Ile Thr Gly Ile Ile Ile 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Lys Cys Arg Gln Leu Ser Arg Leu Cys Arg Asn His 165 170 175 Cys Arg

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｈ０４５ 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 1/68 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (72)発明者坂元亨宇東京都中央区築地５丁目１番１号国立がんセンター内 (72)発明者廣橋説雄東京都中央区築地５丁目１番１号国立がんセンター内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA45 CA04 DA02 DA06 EA04 GA11 HA12 HA15 4B063 QA18 QA20 QQ08 QQ43 QR32 QR55 QS34 4B064 AG01 AG27 CA02 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90X AA92X AA93Y AB01 AB05 AC14 BA02 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C076 AA95 CC27 EE59 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA41 DA76 EA28 EA51 FA72 FA73 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】分子中に配列番号２に示されるアミノ酸
配列を含み、若しくは分子中に前記配列番号２に示され
る１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換され
ているアミノ酸配列を含み、かつがん細胞に強発現して
細胞間接着阻害性を示すタンパク質。
【請求項２】がん細胞膜で発現して前記細胞間接着阻
害性を有する膜タンパク質であることを特徴とする請求
項１に記載のタンパク質。
【請求項３】Ｅ−カドヘリンのダウンレギュレート作
用を示す請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】前記Ｅ−カドヘリンのダウンレギュレー
ト作用は前記タンパク質のｍＲＮＡ転写後に示すことを
特徴とする請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】アクチン結合性を示す請求項４に記載の
タンパク質。
【請求項６】膜結合型ムチン特有のスレオニン−セリ
ン−プロリン−リッチ細胞外ドメインを有する請求項１
から請求項５のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】配列番号２のアミノ酸番号１〜２１に示
されるアミノ酸配列とマウスＲＩＣ遺伝子から生じるタ
ンパク質のシグナルペプチド領域を示すアミノ酸配列と
が８１％の相同性を有することを特徴とする請求項１に
記載のタンパク質
【請求項８】配列番号２のアミノ酸番号２２〜１４５
に示されるアミノ酸配列とマウスＲＩＣ遺伝子から生じ
るタンパク質の細胞外ドメイン領域を示すアミノ酸配列
とが２６％の相同性を有することを特徴とする請求項７
に記載のタンパク質。
【請求項９】配列番号２のアミノ酸番号１４６〜１６
２に示されるアミノ酸配列とマウスＲＩＣ遺伝子から生
じるタンパク質の膜貫通ドメイン領域を示すアミノ酸配
列とが１００％の相同性を有することを特徴とする請求
項７又は８に記載のタンパク質。
【請求項１０】配列番号２のアミノ酸番号１６３〜１
７８に示されるアミノ酸配列とマウスＲＩＣ遺伝子から
生じるタンパク質の細胞内領域を示すアミノ酸配列とが
６９％の相同性を有することを特徴とする請求項７から
請求項９のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１１】配列番号１に示す塩基配列又はその相
補的配列並びにこれらの配列の一部若しくは全部からな
る遺伝子。
【請求項１２】分子中に配列番号２に記載のアミノ酸
配列若しくは配列番号２に示される１又は数個のアミノ
酸が付加、欠失若しくは置換され、かつ細胞間接着阻害
性を示すタンパク質をコードする塩基配列又はその相補
的配列並びにこれらの配列の一部若しくは全部を含むこ
とを特徴とする請求項１１記載の遺伝子。
【請求項１３】分子中に配列番号２に記載のアミノ酸
配列若しくは配列番号２に示される１又は数個のアミノ
酸が付加、欠失若しくは置換され、かつ細胞間接着阻害
性を示すタンパク質をコードする塩基配列又はその相補
的配列並びにこれらの配列の一部若しくは全部を含む遺
伝子の一部又は全てを含む発現ベクター。
【請求項１４】分子中に配列番号２に記載のアミノ酸
配列若しくは配列番号２に示される１又は数個のアミノ
酸が付加、欠失若しくは置換され、かつ細胞間接着阻害
性を示すタンパク質をコードする塩基配列又はその相補
的配列並びにこれらの配列の一部若しくは全部を含む遺
伝子の一部又は全てを含む発現ベクターにより形質転換
される形質転換体。
【請求項１５】分子中に配列番号２に記載のアミノ酸
配列若しくは配列番号２に示される１又は数個のアミノ
酸が付加、欠失若しくは置換され、かつ細胞間接着阻害
性を示すタンパク質と特異的に結合するモノクローナル
抗体。
【請求項１６】被検体内から採取された組織、細胞を
用いるがんの診断方法であって、前記組織と分子中に配
列番号２に記載のアミノ酸配列若しくは配列番号２に示
される１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換
され、かつ細胞間接着阻害性を示すタンパク質と特異的
に結合するモノクローナル抗体を反応させ、分子中に配
列番号２に記載のアミノ酸配列若しくは配列番号２に示
される１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換
され、かつ細胞間接着阻害性を示すタンパク質と該モノ
クローナル抗体との抗原抗体反応に基づいて診断するこ
とを特徴とするがんの診断方法。
【請求項１７】被検体のがん組織、細胞に発現した分
子中に配列番号２に記載のアミノ酸配列若しくは配列番
号２に示される１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若し
くは置換され、かつ細胞間接着阻害性を示すタンパク質
を標的として、分子中に配列番号２に記載のアミノ酸配
列若しくは配列番号２に示される１又は数個のアミノ酸
が付加、欠失若しくは置換され、かつ細胞間接着阻害性
を示すタンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗
体を用いたミサイル療法を行うことを特徴とするがんの
処置方法。
【請求項１８】がん処置後の予後診断方法であって、
被検体内からがん処置部の組織、細胞を取り出し、分子
中に配列番号２に記載のアミノ酸配列若しくは配列番号
２に示される１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しく
は置換され、かつ細胞間接着阻害性を示すタンパク質と
特異的に結合するモノクローナル抗体を反応させ、分子
中に配列番号２に記載のアミノ酸配列若しくは配列番号
２に示される１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しく
は置換され、かつ細胞間接着阻害性を示すタンパク質と
該モノクローナル抗体との抗原抗体反応に基づいて診断
することを特徴とするがんの予後診断方法。
【請求項１９】分子中に配列番号２に示されるアミノ
酸配列を含み、若しくは分子中に前記配列番号２に示さ
れる１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換さ
れているアミノ酸配列を含み、かつ細胞間接着阻害性を
示すタンパク質を具備することを特徴とするがん診断マ
ーカー。
【請求項２０】分子中に配列番号２に示されるアミノ
酸配列を含み、若しくは分子中に前記配列番号２に示さ
れる１又は数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換さ
れているアミノ酸配列を含み、かつ細胞間接着阻害性を
示すタンパク質を具備する診断マーカーによりがんの検
出を行うことを特徴とするがんの検出方法。
【請求項２１】分子中に配列番号２に記載のアミノ酸
配列若しくは配列番号２に示される１又は数個のアミノ
酸が付加、欠失若しくは置換され、かつ細胞間接着阻害
性を示すタンパク質と特異的に結合するモノクローナル
抗体に抗がん剤、細胞毒若しくはアイソトープを結合さ
せ、請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の
タンパク質と特異的に結合させることによりがん細胞の
浸潤、転移を抑制する薬剤組成物。
【請求項２２】配列番号１に示す塩基配列又はその相
補的配列並びにそれらの配列の一部若しくは全部からな
る遺伝子を含む複数の遺伝子断片を具備することを特徴
とするがん細胞スクリーニングキット。
【請求項２３】分子中に配列番号２に記載のアミノ酸
配列若しくは配列番号２に示される１又は数個のアミノ
酸が付加、欠失若しくは置換され、かつ細胞間接着阻害
性を示すタンパク質と特異的に結合するモノクローナル
抗体を更に具備することを特徴とするがん細胞スクリー
ニングキット。
【請求項２４】体内から組織、細胞を採取し、該組
織、細胞に分子中に配列番号２に記載のアミノ酸配列若
しくは配列番号１に示される１又は数個のアミノ酸が付
加、欠失若しくは置換され、かつ細胞間接着阻害性を示
すタンパク質のＲＮＡが含まれているか解析を行うこと
により診断を行うがんの診断方法。
【請求項２５】配列番号２のアミノ酸配列をコードす
る塩基配列の一部又は全てを含むベクターで形質転換さ
れた形質転換体を培養し、該培養物中に該アミノ酸配列
を含むタンパク質を生成し、これを採取することを特徴
とするタンパク質の製造方法。