JP2003192541A - 育毛促進剤及び育毛用の皮膚外用剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】、安全性が高く、使用性に優れ、育毛効果が著
しい養毛促進剤を含有するの医薬品・化粧料を提供する
ことを課題とする。 【解決手段】安全性が高く、使用性に優れ、著しい育毛
促進効果があり禿、薄毛及び脱毛の予防・改善に有用な
育毛用の皮膚外用剤（化粧料や医薬品）を得るために、
血管内皮成長因子産生促進活性（VEGF-A, VEGF１６５,
VEGF-B, VEGF-C,VEGF-D, VEGF-E）、線維芽細胞成長因
子（FGF-1：aFGF, FGF-3, FGF-2：bFGF, FGF-3：int-2,
FGF-4：hst-1/kaposi- FGF, FGF-5, FGF-6：hst-2, FGF
-7, FGF-8,FGF-9, FGF-10）産生促進活性、内皮細胞増
殖促進活性や管腔形成促進活性のあるローヤルゼリーや
ローヤルゼリーから得られた分子量５７キロダルトンの
糖蛋白質を育毛用の皮膚外用剤に含有させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、育毛促進剤及び育
毛用の皮膚外用剤に関し、更にその作用メカニズムがロ
ーヤルゼリーによる血管内皮増殖因子(VEGF)産生促進活
性、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）産生促進活性、内皮
細胞分裂促進活性及び／又は、管腔形成促進活性により
判断されるものに関する。

【０００２】

【従来の技術】何時までも豊富で黒い髪の毛を維持する
と言うことは、若く見せるために老若男女誰しもが願う
ところである。しかしながら、加齢現象や遺伝的素因、
更には社会的ストレス等が原因となり、徐々に髪の毛が
脱落していき薄毛や禿の原因となっている。脱毛には大
きく分けて生理的な自然脱毛と病的に起こる異常脱毛が
ある。自然脱毛は１日に５０〜８０本ぐらいであり、１
００本を超える異常脱毛は、ストレスの蓄積、神経の使
い過ぎ、頭皮の手入れ不足、頭皮の血行不足、ホルモン
バランスの乱れ、動物性食品のとりすぎ、栄養不足、食
事のバランスのかたよりが原因とされている。こういっ
た脱毛症を防ぐため各種メーカーが凌ぎを削って育毛剤
の開発に力を入れてきた。これまでに開発されたものと
して、ミノキシジルやサンザシ、イチョウやショウガ等
の生薬抽出エキス、パントテニルエチルエーテルやアロ
キサジン、アデノシンー３’、５’ーサイクリックモノ
フォスフェート（ｃ−ＡＭＰ）等の育毛剤がある。

【０００３】しかしながら、これまで開発されてきた育
毛剤は、発毛促進作用が不充分であったり、皮膚刺激等
の副作用を引き起こす場合があり、今のところ十分に効
果があり安全であるようなものが得られていないのが現
状であった。それ故、発毛促進作用に優れ、且つ、安全
性が高い養毛促進剤や養毛剤の開発が望まれていた。

【０００４】一方、毛周期（ヘアーサイクル）は、３つ
の時期からなり、しっかり毛を生やしている時期が成長
期（Anagen）、成長が停止し毛が退縮する時期が退行期
（Catagen）、毛包に毛が存在せず、発毛を停止してい
る時期が休止期（Telogen）と呼ばれている。成長期で
はその初期（Early Anagen）で毛球は最も表皮に近づ
き、最盛期では最も離れる。通常、頭髪では、成長期が
数年、退行期が２〜３週間、休止期が数ヶ月であり、８
５％が成長期、１４％が休止期といわれている。毛根部
の下端には、球根状に膨らんだ毛球部があり、毛髪発生
にとって大切な部分である。 毛球部の底の部分は凹ん
でおり、間葉系の細胞からなる毛乳頭が局在し、毛細血
管が張りめぐらされている。この毛細血管から毛髪の成
長に必要な栄養分や酸素を毛母細胞に供給し、毛母細胞
が増殖・分化し、毛成長する仕組みになっている。この
様に、毛成長の為には栄養分や酸素の補給のために毛細
血管腔形成が必要である。

【０００５】更に、ガン細胞などにより分泌されるVEGF
（Vascular Endothelial Growth Factor；血管内皮細胞
増殖因子）とbFGF（basic Fibroblast Groｗth Facto
ｒ；塩基性線維芽細胞増殖因子)の増殖因子は、血管内
皮細胞の膜に直接作用し、新たな毛細血管の管腔形成を
可能にするため血管壁を弱くし、細胞を分裂させ、毛細
血管のできるスペースを確保するため隣接する組織をわ
きに動かし、新たな細胞を動かし、それらの細胞を血管
の形へとするのである。これまでに、管腔形成促進因子
として、病的レベルの高濃度グルコース、インスリン様
増殖因子（IGF-1）、インスリン、ロイコトリエンＣ
４，プロスタグランジンＥ２などが知られている。

【０００６】一方、ローヤルゼリー中の分子量５７キロ
ダルトンのタンパク質が、毛乳頭培養細胞中の血管内皮
細胞増殖因子(VEGF)及び線維芽細胞増殖因子（FGF）の
産生を促進し、内皮細胞分裂促進活性を促し、それによ
り血管新生につながる管腔形成を促進することは知られ
ておらず、更に、分子量５７キロダルトンのタンパク質
を含有するローヤルゼリーが、前述のメカニズムによる
育毛を促進することも、その結果、それを含有する皮膚
外用剤が著しく育毛促進効果に優れ、安全性の高い育毛
用の皮膚外用組成物であることも知られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、この様な状
況下為されたものであり、安全性が高く、使用性に優
れ、育毛効果が著しい育毛促進剤及び育毛用の皮膚外用
剤を提供することを課題とする。

【０００８】

【課題の解決手段】この様な状況に鑑みて、本発明者ら
は鋭意研究努力を重ねた結果、ローヤルゼリー中の分子
量５７キロダルトンの糖タンパク質が血管内皮培養細胞
中の血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を産生促進し、内皮細
胞分裂促進活性を促し、それにより血管新生につながる
管腔形成を促進し育毛を促進し、これを、医薬品及び化
粧品に配合することにより優れた育毛用の皮膚外用剤を
提供できることを見い出し、発明を完成させるに至っ
た。即ち、本発明は、次に示す技術に関するものであ
る。 （１） ローヤルゼリーからなる、育毛促進剤。 （２） ローヤルゼリーが、下記に示す、タンパク質を
９重量％以上含有するものであることを特徴とする、
（１）に記載の育毛促進剤。 １＞ローヤルゼリー中のタンパク質の非変性ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動において単一バンドを形成する。 ２＞還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により測定される分子量が約５７キロダルトンで
ある。 ３＞配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含
む。 （３） 育毛促進が、５７キロダルトンタンパク質によ
る血管内皮増殖因子(VEGF)産生促進活性によるものであ
ることを特徴とする、（１）乃至は（２）に記載の育毛
促進剤。 （４）血管内皮増殖因子(VEGF)が、VEGF-A, VEGF１６
５, VEGF-B, VEGF-C,VEGF-D, VEGF-Eから選ばれる一種
乃至は二種以上からなることを特徴とする、（１）〜
（３）の何れか一に記載の育毛促進剤。 （５） 育毛促進が、５７キロダルトンタンパク質によ
る線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）産生促進活性によるも
のであることを特徴とする、（１）〜（４）の何れか一
に記載の育毛促進剤。 （６） 線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が、FGF-1（酸
性FGF：aFGF）, FGF-3, FGF-2（塩基性FGF：bFGF）, FG
F-3(int-2),FGF-4(hst-1/kaposi- FGF), FGF-5, FGF-6
(hst-2), FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10から選ばれる一
種乃至は二種以上からなることを特徴とする、（１）〜
（５）の何れか一に記載の育毛促進剤。 （７） 育毛促進が、５７キロダルトンタンパク質によ
る内皮細胞分裂促進活性によるものであることを特徴と
する、（１）〜（６）の何れか一に記載の育毛促進剤。 （８） 育毛促進が、５７キロダルトンタンパク質によ
る管腔形成促進活性によるものであることを特徴とす
る、（１）〜（７）の何れか一に記載の育毛促進剤。 （９） （１）〜（８）の何れか一に記載の育毛促進剤
を含有する、育毛用の皮膚外用剤。 （１０） 医薬品又は、化粧品であることを特徴とす
る、（９）に記載の育毛用の皮膚外用剤。 以下、本発明について、実施の形態を中心に説明を加え
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】（１）電気泳動によるローヤルゼ
リー中の５７キロダルトンのタンパク質の定性方法 本発明のローヤルゼリー中の５７キロダルトンのタンパ
ク質は、電気泳動によりタンパク質の構成を分析し、有
効成分であるタンパク質の分子量を特定することを特徴
とする。電気泳動の方法としては、該有効タンパク質が
特定できれば特段の限定は受けないが、好ましい方法
は、水溶性ローヤルゼリータンパク質（３％ローヤルゼ
リー水溶液（Ｗ／Ｖ））をポリアクリルアミドゲル（１
０％均一）にて、電流２０ｍＡで電気泳動し、クマシー
ブリリアントブルーにより染色して、タンパク質を特定
する方法である。この様な電気泳動に於ける、本発明の
タンパク質の分子量はその精製タンパク質のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、５７キロダルト
ンと決定された。

【００１０】（２）ローヤルゼリー中の５７キロダルト
ンタンパク質の調製方法 凍結乾燥したローヤルゼリーを０．７重量％で１０ｍＭ
のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ＵＦ１０
万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ１００；限外濾過）で６倍濃
縮、７回脱塩を行い、その濾液をさらにＵＦ３万（Ｍｉ
ｎｉｐｌａｔｅ３０；限外濾過）で８倍濃縮、１回脱塩
を行い、分子量１０万〜３万の分画を得た。上記の分子
量１０万〜３万のサンプルは、陰イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画す
ることで、分子量５７キロダルトンタンパク質を分離で
きる。陰イオン交換クロマトグラフィーとしては、通常
に知られている方法に従って行えば良く、例えば東ソー
株式会社製ＤＥＡＥーＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍをカ
ラムとして用いて、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を展開液Ａ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）と１ＭＮａＣｌを展開液Ｂとしてグラジェント
により、流速を５ｍｌ／ｍｉｎ、２８０ｎｍの吸光度で
検出し、２．５ｍｌ／チューブで分画したフラクション
Ｎｏ．１１９〜１２７に分子量５７キロダルトンのタン
パク質画分を検出することができる。さらにこの画分を
ゲル濾過クロマトグラフィーにより、これは通常に知ら
れている方法に従って行えば良く、この様な好ましい例
としては、例えば、ファルマシア株式会社製ＨｉＬｏａ
ｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００をカラムとして用
いて、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸カ
リウムバッファーｐＨ７．０を展開液とし、流速を１．
０ｍｌ／ｍｉｎに設定し、２８０ｎｍの吸光度で検出
し、２．０ｍｌ／チューブで分画したフラクションＮ
ｏ．３５〜４３に分子量５７キロダルトンのタンパク質
を検出することが出来る。（電気泳動にて同一タンパク
質を確認）また、既知分子量のゲル濾過分析の結果よ
り、上記タンパク質は、分子量５７キロダルトンモノマ
ータンパク質であると確定された。又、この蛋白質は、
Ｎ−グルコシダーゼＦによって消化され、消化後の分子
量が４８キロダルトンになるため糖タンパク質であるこ
とを本発明者は見出している。

【００１１】（３）分子量５７キロダルトンの糖蛋白質
によるVEGF産生促進の検討：ヒト頭髪毛乳頭細胞産生か
らのVEGF産生促進 分子量５７キロダルトンの糖蛋白質は、平滑筋系細胞
（大動脈平滑筋細胞、気管支／気管平滑筋細胞、冠状動
脈平滑筋細胞、肺動脈平滑筋細胞、臍帯動脈平滑筋細
胞、子宮平滑筋細胞等）、上皮系細胞（乳腺上皮細胞、
腎臓皮質上皮細胞、気管支／気管上皮細胞、前立腺上皮
細胞、腎臓近位尿細管上皮細胞、肺胞上皮細胞、小気道
上皮細胞 等）、マクロファージ、肝細胞、毛乳頭細胞
等からのＶＥＧＦ（VEGF-A, VEGF１６５, VEGF-B, VEGF
-C, VEGF-D, VEGF-E）産生を著しく促進する。ここで
は、ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＴＨＰＣ−００１）トータル
キット（ＨＤＰＣトータルキット：ＴＨＰＣＫ−００
１、製造元：セルアプリケイションズインク USA、輸
入販売元：東洋紡績株式会社）を用いて、常法によりヒ
ト毛乳頭細胞を培養し、分子量５７キロダルトンの糖蛋
白質によるVEGF産生促進活性を調べた。解凍した細胞を
懸濁するためのＰＣＧＭ培地を１０ｍＬ、１５ｍＬ遠心
チューブに分注し、氷令しておく。即ち、凍結したヒト
頭髪毛乳頭細胞（ＴＨＰＣ−００１）の入ったバイアル
瓶を３７℃の恒温槽で急速に融解する。このバイアル瓶
ににＰＣＧＭ培地を１ｍＬ程度徐々に滴下しＤＭＳＯを
希釈後、全量をＰＣＧＭ培地が入った遠心チューブに移
し懸濁させる。浮遊細胞を冷却低遠心機で４℃、１００
０ｒｐｍ、５分間遠心する。沈殿した細胞を吸わないよ
うに注意しながら上清を吸引し、１ｍＬＰＣＧＭ培地に
再懸濁させる。この全量を、コラーゲン液でコートした
Ｔ−７５フラスコに植え込み、５％ＣＯ２、加湿下で３
７℃に保たれたインキュベーターに入れ静置培養を行
う。１日後、培地の交換を行う。以後、１日おきに培地
の交換を行い継代培養をする。尚、ＰＣＧＭ培地成分
は、１％ＦＢＳを含有するＰＣＧＭ基礎培地２５０ｍＬ
に牛下垂体抽出液（ＢＰＥ）１００倍希釈液を２．５ｍ
Ｌ、、牛胎児血清（ＦＣＳ）１００倍希釈液を２．５ｍ
Ｌ、インシュリン・トランスフェリン・トリヨードサイ
ロニン溶液（ＩＴＴ）２００倍希釈液を１．２５ｍＬ、
サイロプロテイン溶液（Ｃｙｐ）２００倍希釈液を１．
２５ｍＬを添加したものを用いた。尚、分子量５７キロ
ダルトンの糖蛋白質の添加系及び無添加系によりＶＥＧ
Ｆ産生促進の検討を行った。

【００１２】（４）分子量５７キロダルトンの糖蛋白質
によるＦＧＦ産生促進の検討：ヒト頭髪毛乳頭細胞産生
からのＦＧＦ産生促進 分子量５７キロダルトンの糖蛋白質は、内皮系細胞（大
動脈内皮細胞、冠状動脈内皮細胞、腸骨動脈内皮細胞、
皮膚微小血管内皮細胞、肺微小血管内皮細胞、肺動脈内
皮細胞、臍帯動脈内皮細胞、臍帯静脈内皮細胞、子宮筋
層微小血管内皮細胞等）、上皮系細胞（乳腺上皮細胞、
腎臓皮質上皮細胞、気管支／気管上皮細胞、前立腺上皮
細胞、腎臓近位尿細管上皮細胞、肺胞上皮細胞、小気道
上皮細胞等）、繊維芽細胞（皮膚繊維芽細胞、肺繊維芽
細胞等）、平滑筋系細胞（大動脈平滑筋細胞、気管支／
気管平滑筋細胞、冠状動脈平滑筋細胞、肺動脈平滑筋細
胞、臍帯動脈平滑筋細胞、子宮平滑筋細胞等）、骨格筋
細胞、マクロファージ、アストロサイト、表皮角化細
胞、表皮メラニン細胞、メサンギウム細胞、肝細胞、毛
乳頭細胞（間葉系細胞）、各種腫瘍細胞（ガン細胞）等
からのＦＧＦ（FGF-1（酸性FGF：aFGF）, FGF-3, FGF-2
（塩基性FGF：bFGF）, FGF-3(int-2),FGF-4(hst-1/kapo
si- FGF), FGF-5, FGF-6(hst-2), FGF-7, FGF-8, FGF-
9, FGF-10）産生を著しく促進する。ここでは、ヒト頭
髪毛乳頭細胞（ＴＨＰＣ−００１）トータルキット（Ｈ
ＤＰＣトータルキット：ＴＨＰＣＫ−００１、製造元：
セルアプリケイションズインク USA、輸入販売元：東
洋紡績株式会社）を用いて、常法によりヒト毛乳頭細胞
を培養し、分子量５７キロダルトンの糖蛋白質添加系及
び無添加系によりFGF産生促進活性の検討を行った。

【００１３】（５）血管内皮増殖因子(VEGF)の測定方法 ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＴＨＰＣ−００１）培養上清中の
血管内皮増殖因子(VEGF)をジェンザイムのヒトVEGF免疫
分析キット(Genzyme TECHNE, AN'ALYZATM, Immunoassay
System, human VEGF)を用いて測定した。

【００１４】（６）線維芽細胞増殖因子（FGF）の測定
方法 ヒト頭髪毛乳頭細胞（ＴＨＰＣ−００１）培養上清中の
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）をフナコシのヒトFGF 免
疫分析キットヒト（FGF basic, Human, ELISA Kit, Qua
ntikine (96 well)；R & D SYSTEMS, INC.；フナコシ）
を用いて測定した。

【００１５】（７）分子量５７キロダルトンの糖蛋白質
による内皮細胞増殖促進の検討 分子量５７キロダルトンの糖蛋白質は、ウシ頸動脈由来
内皮細胞、ヒト大動脈由来内皮細胞、ウシ大動脈由来内
皮細胞、ヒト冠動脈由来内皮細胞、ラット冠動脈由来内
皮細胞、ヒト臍帯動脈由来内皮細胞、ヒト臍帯静脈由来
内皮細胞、ヒト腸骨動脈由来内皮細胞、ヒト肺動脈由来
内皮細胞、ヒト肺静脈由来内皮細胞などの大血管由来内
皮細胞、ヒト皮膚微小血管由来内皮細胞、ヒト肺微小血
管由来内皮細胞、ヒト子宮筋層微小血管由来内皮細胞、
ヒト角膜内皮細胞、ウシ角膜内皮細胞、肝類洞内皮細胞
等の内皮細胞の増殖活性を示す。更に、ヒト大動脈由来
内皮細胞（HAEC,Code: C2535,Bio Whittaker Co. Lt
d.）、ヒト冠動脈由来内皮細胞（HCAEC,Code: C2585,Bi
o Whittaker Co. Ltd.）、ヒト腸骨動脈由来内皮細胞
（HIAEC,Code: C2545,Bio Whittaker Co. Ltd.）、ヒト
皮膚微小血管由来内皮細胞（HMVEC-d,Code:,Bio Whitta
ker Co. Ltd.）、ヒト肺微小血管由来内皮細胞（HMVEC-
L,Code: C2527,Bio Whittaker Co. Ltd.）、ヒト肺動脈
由来内皮細胞（HPAEC,Code: C2530,Bio Whittaker Co.
Ltd.）、ヒト臍帯動脈由来内皮細胞（HUAEC,Code: C252
0,Bio Whittaker Co. Ltd.）、ヒト臍帯静脈由来内皮細
胞（HUVEC,Code:,Bio Whittaker Co. Ltd.）、ヒト子宮
筋層微小血管由来内皮細胞（UtMVEC,Code: C2564,Bio W
hittaker Co. Ltd.）、正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞
トータルキット（製造元：セルアプリケイションズイン
ク USA、輸入販売元：東洋紡績株式会社）を用いるの
が市販されていて便利である。ここでは、正常ヒト皮膚
微小血管内皮細胞トータルキット（製造元：セルアプリ
ケイションズインクUSA、輸入販売元：東洋紡績株式会
社）を用いて、常法により正常ヒト皮膚微小血管内皮細
胞を培養し、分子量５７キロダルトンの糖蛋白質の増殖
活性を調べた。凍結正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞入り
のアンプルを、３７℃の恒温槽に一分間浸し細胞を素早
く解凍する。アンプルの細胞浮遊液５００μＬをイクス
トラセルラーマトリックスプロテインコートフラスコ
（７．５ｍＬのＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉ
ｕｍを入れてあったもの）に入れ、細胞が均一分散する
ように揺らす。このフラスコをインキュベーター（３７
℃，５％ＣＯ２、加湿条件下）中で、ガス交換ができる
ようにフラスコのキャップを緩め静置培養する。８時間
又は一晩培養後に、培地中のＤＭＳＯの影響をなくす為
に培地交換をする。尚、分子量５７キロダルトンの糖蛋
白質添加系及び無添加系により内皮細胞増殖促進の検討
を行った。

【００１６】（８）正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞に対
する増殖促進作用の測定方法 分子量５７キロダルトンのタンパク質を最大９５％濃度
まで、正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞の培養培地である
ＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍに添加し、
発明の実施の形態の（５）に示した通りに正常ヒト皮膚
微小血管内皮細胞を培養し、４８時間後の正常ヒト皮膚
微小血管内皮細胞に対する増殖促進作用をＭＴＴ法によ
り分析した。

【００１７】（９）ＭＴＴ法による細胞増殖の測定方法 細胞密度が５００又は５０００／ウェルとなるように正
常ヒト皮膚微小血管内皮細胞をＣＡＤＭＥＣ Ｇｒｏｗ
ｔｈ Ｍｅｄｉｕｍの入った９６ウェルプレートに播種
し、翌日の培地交換時に分子量５７キロダルトンの糖タ
ンパク質を添加し３日間培養し、無添加系を１００とし
た場合の正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞の増殖活性をＭ
ＴＴ法により測定した。具体的に、ＭＴＴ法による細胞
増殖の測定法の手順として、適当な濃度の細胞懸濁液
（１００μＬ）を９６ウェルマイクロプレートに播種
し、最大で９５％の毛乳頭細胞培養上清をＣＡＤＭＥＣ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍへ添加し（コントロー
ル：無添加系として、同量の新鮮なＰＣＧＭ培地を加え
る）、３日間培養する。その後、１００μＬのＣＡＤＭ
ＥＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍに培地交換し、１０
μＬのＭＴＴ溶液（ＭＴＴ：[3-(4,5-dimethyltiazol-2
-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] を50mgとPBS
10mLを加えた溶液）を加え、反応後にマイクロプレート
リーダー（ＢｉｏＲａｄ社）で測定し、細胞増殖活性を
求めた。（対象波長６３０ｎｍとして、５７０ｎｍ波長
の吸光度を測定した）

【００１８】（１０）本発明の管腔形成促進剤である分
子量５７キロダルトンの糖蛋白質 ここで言う管腔形成促進剤とは、哺乳動物の内皮細胞を
培養する過程に於いて管状構造を分化誘導することをい
い、血管新生促進剤及びリンパ管新生促進剤と同等の効
果を有することを意味する。特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏの
系で、ウシ頸動脈由来内皮細胞やウシ大動脈由来内皮細
胞、ラット冠動脈内皮細胞などの大血管由来内皮細
胞、、ヒト臍帯静脈由来内皮細胞を培養時に管腔形成の
促進作用がある。

【００１９】（１１）分子量５７キロダルトンの糖蛋白
質のウシ頸動脈由来内皮細胞に対する管腔形成促進作用
の測定方法： コラーゲンゲル間サンドイッチ培養法
（Atherosclerosis, 92, 141,1992又は、Virchows Arc
h. B Cell Pathol., 60, 245, 1991) 分子量５７キロダルトンの糖蛋白質を以下の管腔形成実
験系の細胞に無菌的に投与し管腔形成を観察した。ウシ
頸動脈由来内皮細胞は、１０％ＦＢＳ添加のイーグルズ
最小培地（ＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，ＮＹ）、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でインキュ
ベーターで培養された。この実験で用いた細胞は、継代
６〜１０回培養されたものを用いた。管腔形成実験は、
直径２２ｍｍの１２ウェルプレートを用い、１０％ＦＢ
Ｓ含有ＭＥＭ中にウシ頸動脈由来内皮細胞密度が１×１
０５細胞／１．５ｍＬが、Ｖｉｔｒｏｇｅｎ１００（Ｃ
ｏｌｌａｇｅｎ ＣＯ．,ＣＡ）が８、０．１Ｎ Ｎａ
ＯＨが１，×１０ＭＥＭ（ｐＨ ７．４）が１の体積比
の混合物からなる０．７５ｍＬのコラーゲンゲルの入っ
たウェルプレートに播種され、２４時間インキュベート
された。この培地は、吸引され、ウシ頸動脈由来内皮細
胞上を０．５ｍＬのコラーゲンゲルにより積層し、そこ
に２％ＦＢＳを添加及び、分子量５７キロダルトンの糖
蛋白質を加えたＭＥＭ１．５ｍを加えインキュベートさ
れ、３日に一度培地を交換し培養された。これにより、
分子量５７キロダルトンの糖蛋白質の管腔形成の影響を
観た。尚、ネガティブコントロールとして、分子量５７
キロダルトンの糖蛋白質を加えない系を、ポジティブコ
ントロールとしてインスリン１００μＵ／ｍＬを加え
た。形態学的変化は、位相差光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕ
ｓ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ＩＭＴ２）により
観察し、顕微鏡写真を３３倍で撮った。各培養容器から
無差別に５箇所選択し、管状構造は１０個の写真からト
レースして、管の長さが組織分析システム（ＴＡＳ ｐ
ｌｕｓ、Ｅｒｎｓｔ Ｌｅｉｔｚ Ｗｅｔｚｌａｒ Ｇ
ｍｂＨ、Ｆ．Ｒ．Ｇ．）により決定された。管の長さ
は、次式に示させる。 特異的長さ（ｍｍ―１）＝合計管の長さ（ｍｍ）／合計
面積（ｍｍ２）

【００２０】（１２）マウス養毛試験による評価方法：
分子量５７キロダルトンの糖蛋白質の影響 （Ｃ３Ｈマウスを用いた養毛評価法）７週齢の雄性Ｃ３
Ｈマウス（チャールズ・リバー）を購入し、２週間馴化
飼育した後、実験に供した。マウス背部ほぼ全面を電気
バリカンで刈毛し、更に、尾部方向半面をシェーバー
（ナショナル・ハイスピンＥＳ４６７）で剃毛した。１
群７匹として、剃毛部位にサンプル４０μｌを毎日、１
週に５日間塗布した。被毛の成長は肉眼観察と色彩色差
計（ミノルタＣＲ−２００）による明度値（Ｌ）の測定
による客観的測定で評価した。成績は７匹の動物間のバ
ラツキを考慮して、最小並びに最大の効果を示した動物
を除いた５匹の結果から判定した。

【００２１】（１３）本発明の育毛用の皮膚外用剤 本発明の育毛用の皮膚外用剤は、分子量５７キロダルト
ンの糖蛋白質を含有し、血管内皮増殖因子(VEGF)産生促
進活性、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）産生促進活性、
内皮細胞分裂促進活性、管腔形成促進活性を有し、安全
性が高くその著しい育毛促進効果により、禿や薄毛の予
防・改善に有用である。ここで、本発明で言う育毛用の
皮膚外用剤とは、皮膚に外用で適用される組成物の総称
であって、貼付剤を含む皮膚外用医薬や洗浄料を含む化
粧料が好ましく例示でき、これらの内では、トニック剤
形、ローション剤形、クリーム剤形であることが特に好
ましい。本発明の育毛用の皮膚外用剤は、安全性が高
く、使用性に優れ、育毛効果が著しい。本発明の育毛用
の皮膚外用剤に於ける、分子量５７キロダルトンの糖蛋
白質からなる管腔形成促進剤の好ましい含有量は、皮膚
外用剤全量に対して、０．００１〜３０重量％であり、
更に好ましくは０．１〜１０重量％である。これは、少
なすぎると養毛促進作用が発揮されない場合があり、多
すぎても効果が頭打ちになり他の処方成分の自由度を損
なうことがあるからである。また、処理された毛乳頭細
胞培養上清からなる管腔形成促進剤の形態によって異な
る。

【００２２】本発明の育毛用の皮膚外用剤は、養毛促進
剤として知られる、ミノキシジルやスチグマスタノール
マルトシド、パントテニルエチルエーテルやアロキサジ
ン、アデノシンー３’、５’ーサイクリックモノフォス
フェート（ｃ−ＡＭＰ）、ビタミンＥアセテート、塩化
カルプロニウム、ニコチン酸ベンジル、ニコチン酸、Ｄ
Ｌ−α―トコフェロール、ＤＬ−α―トコフェロールニ
コチン酸エステル、ニコチン酸メチル、セファランチ
ン、と共に配合させれば相乗効果により養毛促進効果に
優れる。また、上記必須成分以外に、通常化粧料や皮膚
外用医薬で使用される任意の成分を含有することが出来
る。かかる任意成分としては、例えば、ローヤルゼリー
やサンザシ、イチョウ、ショウガ、センブリ、トウガラ
シ、トウキ、オタネニンジン、ジオウ、チョレイ、オウ
ゴン、カンゾウ、ダイオウ、チンピ、チョウジ、サイ
コ、センキュウ、シャクヤク、ゲンノショウコ、ウィキ
ョウ、カイコノソウ、ケンゴシ、ケイガイ、エイジツ、
クマザサ、カゴソウ、アセンヤク、シャゼンシ、アサガ
オカラクサ、シロガネカラクサ、マルバアサガオカラク
サ等の生薬抽出エキス、スクワラン、ワセリン、マイク
ロクリスタリンワックス等の炭化水素類、ホホバ油、カ
ルナウバワックス，オレイン酸オクチルドデシル等のエ
ステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油等のトリグリセラ
イド類、ステアリン酸、オレイン酸、リチノレイン酸等
の脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコー
ル、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホ
コハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナ
トリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン
塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等
のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、
脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン
付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオ
キシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤
類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブ
タンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、
酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含
有することができる。

【００２３】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明について更に
詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限
定を受けないことは、言うまでもない。

【００２４】＜実施例１〜４＞分子量５７キロダルトン
の糖蛋白質のVEGFの産生促進能をヒトVEGF ELISAキット
(Genzyme社)を用い定量した。即ち、各濃度の分子量５
７キロダルトンの糖蛋白質（１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍ
Ｌ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ）をヒト頭髪毛乳
頭細胞系へ添加しVEGF産生促進能を測定した。実験結果
を表１に示す。表１から分かるように、コントロール
（無添加系）に比べ、分子量５７キロダルトンの糖蛋白
質を１０ｎｇ／ｍＬ添加系が最もVEGF産生促進能力に優
れていた。これにより、分子量５７キロダルトンの糖蛋
白質は、優れたVEGF産生促進剤である。（尚、表１の結
果は、３回の実験結果の平均値とS.E.M.を示す）

【００２５】

【表１】

【００２６】＜実施例５〜８＞分子量５７キロダルトン
の糖蛋白質のbFGFの産生促進能をヒトFGF 免疫分析キッ
トヒト（FGF basic, Human, ELISA Kit, Quantikine (9
6 well)；R & D SYSTEMS, INC.；フナコシ）を用い定量
した。即ち、各濃度の分子量５７キロダルトンの糖蛋白
質（１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２
０ｎｇ／ｍＬ）をヒト頭髪毛乳頭細胞系へ添加しbFGF産
生促進能を測定した。実験結果を表２に示す。表２から
分かるように、コントロール（無添加系）に比べ、分子
量５７キロダルトンの糖蛋白質を１０ｎｇ／ｍＬ添加系
が最もbFGF産生促進能力に優れていた。これにより、分
子量５７キロダルトンの糖蛋白質は、優れたbFGF産生促
進剤である。（尚、表２の結果は、３回の実験結果の平
均値とS.E.M.を示す）

【００２７】

【表２】

【００２８】＜実施例９〜１２＞ 正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞に対する分子量５７キロ
ダルトンの糖蛋白質の影響 各濃度の分子量５７キロダルトンの糖蛋白質を正常ヒト
皮膚微小血管内皮細胞へ添加し（１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ
／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ）、３日間、
正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞を培養後。その増殖活性
を求めた。（コントロールとして、無添加系のもの。
尚、コントロールの増殖活性値を１００として、相対値
として正常ヒト皮膚微小血管内皮細胞の増殖活性に対す
る分子量５７キロダルトンの糖蛋白質の影響を求めた）
結果を表３に示す。実施例１１の毛乳頭細胞培養上清１
０ｎｇ／ｍＬ添加系が最も正常ヒト皮膚微小血管内皮細
胞の増殖活性を促進した。（尚、表３の結果は、３回の
実験結果の平均値とS.E.M.を示す）

【００２９】

【表３】

【００３０】＜実施例１３〜１６＞ ウシ頸動脈由来内皮細胞に対する分子量５７キロダルト
ンの糖蛋白質の管腔形成の影響 実施の形態の（４）のウシ頸動脈由来内皮細胞に対する
管腔形成促進作用の測定方法に従って、分子量５７キロ
ダルトンの糖蛋白質を各濃度１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍ
Ｌ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、添加し、ウシ頸
動脈由来内皮細胞に対する管腔形成促進作用を求めた。
（尚、ネガティブコントロールとして、分子量５７キロ
ダルトンの糖蛋白質を加えない系を、ポジティブコント
ロールとしてインスリン１００μＵ／ｍＬを加えた。）
結果を表４に示す。分子量５７キロダルトンの糖蛋白質
は、ウシ頸動脈由来内皮細胞に対して著しい管腔形成促
進作用を示した。分子量５７キロダルトンの糖蛋白質の
１０ｎｇ／ｍＬ添加系が最もウシ頸動脈由来内皮細胞に
対して管腔形成を促進した。（尚、表４の結果は、３回
の実験結果の平均値とS.E.M.を示す）

【００３１】

【表４】

【００３２】＜実施例１７〜１９＞ （Ｃ３Ｈマウス背部を用いた育毛試験）分子量５７キロ
ダルトンの糖蛋白質を７０％エタノールに１０ｎｇ／ｍ
Ｌ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ濃度に溶解し、
これを被験試料とした。一方、コントロールとしてベヒ
クルの７０％エタノール、また比較対照例１％ミノキシ
ジルを用いた。Ｃ３Ｈマウス背部ほぼ全面を電気バリカ
ンで刈毛し、更に、尾部方向半面をシェーバー（ナショ
ナル・ハイスピンＥＳ４６７）で剃毛した。１群７匹と
して、剃毛部位にサンプル４０μｌを毎日、１週に５日
間塗布した。被毛の成長は肉眼観察と色彩色差計（ミノ
ルタＣＲ−２００）による明度値（Ｌ）の測定による客
観的測定で評価した。２０日後のマウス養毛効果の試験
結果を表５に示す。表５から分かるように、分子量５７
キロダルトンの糖蛋白質は、優れた養毛促進効果を示し
た。（尚、表５の結果は、３回の実験結果の平均値とS.
E.M.を示す）

【００３３】

【表５】

【００３４】＜実施例２０＞分子量５７キロダルトンの
糖蛋白質を用いて、下記に示すトニックを調製しヒトで
の養毛促進効果を調べた。尚、同時にコントロールとし
て分子量５７キロダルトンの糖蛋白質を除いたトニック
を、また比較対照例１％ミノキシジルを加えたトニック
を調製した。分子量５７キロダルトンの糖蛋白質を１０
％含有するトニック、コントロール乳液及び１％ミノキ
シジル含有トニック投与群の３群に分け、平均年齢が４
８．１才の男性型脱毛症の被験者を３０人集め、１０人
ずつ３グループに分けた。朝晩２回、６ヶ月連続使用し
てもらった。６ヶ月後に、養毛による改善度を調べた。
結果を、使用前に比べ有意に改善した群を＋＋、使用前
に比べ軽度に改善した群を＋、使用前に比べ改善しなか
った群を±として表した。表６の結果から、分子量５７
キロダルトンの糖蛋白質含有トニックは、ミノキシジル
含有トニックと同程度以上に男性型脱毛症に有効である
ことが分かった。

【００３５】分子量５７キロダルトンの糖蛋白質
１０ 重量部 １，３ブタンジオール
５ 重量部 グリセリン ３ 重量部 クエン酸
０．１ 重量部 クエン酸ナトリウム
０．１ 重量部 メチルパラベン
０．１ 重量部 エタノール
４５ 重量部 水
３６．７ 重量部

【００３６】

【表６】

【００３７】＜実施例２１＞下記に示す乳液基剤の成分
を常法により処理することにより分子量５７キロダルト
ンの糖蛋白質を１０％含有する乳液を調製し、薄毛に悩
むパネラー1群５名を用いて、６ヶ月間、朝晩1日2回使
用してもらいその薄毛の予防及び改善効果を評価しても
らった。評価基準は、評点2：著しい改善、評点1：明ら
かな改善、評点0.5：わずかな改善、評点0：改善なしの
基準である。平均評点は０．８６であった。本発明の育
毛促進効果のある分子量５７キロダルトンの糖蛋白質を
含有する乳液は、薄毛の改善に優れた効果のあることが
認められた。 ベヘニルアルコール ０．２ 重量部 １，３−ブチレングリコール ８ 重量部 ２−エチルヘキサン酸セチル ３ 重量部 スクワラン ８ 重量部 グリチルリチン酸ジカリウム ０ ．０２ 重量部 パラオキシ安息香酸メチル ０． ３ 重量部 親油型モノステアリン酸グリセリン ２．５ 重量部 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(50E.O.) １．６ 重 量部 サラシミツロウ １．５ 重量部 分子量５７キロダルトンの糖蛋白質 １０ 重量部 香料 ０． ３ 重量部 精製水 ５７． ７６ 重量部

【００３８】＜実施例２２＞以下に示す処方でローショ
ン型医薬品を作製した。即ち、処方成分を室温で攪拌可
溶化してローションを得た。このローション型医薬品に
ついて、薄毛に悩むパネラー1群５名を用いて、６ヶ月
間、朝晩1日2回使用してもらいその薄毛の予防及び改善
効果を評価してもらった。評価基準は、評点2：著しい
改善、評点1：明らかな改善、評点0.5：わずかな改善、
評点0：改善なしの基準である。平均評点は０．９４で
あった。本発明の育毛促進効果のある分子量５７キロダ
ルトンの糖蛋白質及びミノキシジルを配合することによ
り育毛促進に相乗効果が得られ、ローション型医薬品
は、薄毛の改善に優れた効果のあることが認められた。 分子量５７キロダルトンの糖蛋白質 10 重量部 ミノキシジル 1 重量部 １，３ブタンジオール 8 重量部 グリセリン 4 重量部 クエン酸 0 .1 重量部 クエン酸ナトリウム 0.1 重量部 メチルパラベン 0.2 重量部 エタノール 25 重量部 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(40E.O.) 1 重量 部 水 50.6 重量部

【００３９】＜実施例２３＞以下に示す処方に従ってス
カルプクリームを作製した。即ち、イ、ロ、ハをそれぞ
れ８０℃に加熱溶解して、イにロを徐々に加え、更にハ
を加え乳化した後、ホモミキサーにより乳化粒子を均一
化し、冷却してスカルプクリームを得た。このスカルプ
クリームは、脱毛に対する予防改善に優れた効果があっ
た。 イ） スクワラン ８ 重量部 セタノール ５ 重量部 ソルビタンセスキステアレート ２ 重量部 ポリオキシエチレン（２０）ベヘニルエーテル ２ 重量部 ビタミンＥアセテート ０ ．２ 重量部 ロ） １，３−ブタンジオール ７ 重量部 分子量５７キロダルトンの糖蛋白質 ５ 重量部 カルボキシビニルポリマー ０．３ 重量 部 メチルパラベン ０．２ 重量部 水 ４０ 重量部 ハ） 水 ３０ ．１ 重量部 水酸化カリウム ０．２ 重量部

【００４０】

【発明の効果】本発明によれば、、血管内皮成長因子産
生促進活性、線維芽細胞成長因子産生促進活性、内皮細
胞増殖促進活性や管腔形成促進活性のあるローヤルゼリ
ーやローヤルゼリーから得られた分子量５７キロダルト
ンの糖蛋白質を育毛用の皮膚外用剤に含有させることに
より、安全性が高く、使用性に優れ、育毛効果が著しい
養毛促進剤及びそれを含有する医薬品・化粧料などの養
毛料を提供することができる。

【００４１】

【配列表】

【００４２】 ＆＃６０；210＆＃６２； 1 ＆＃６０；211＆＃６２； 25 ＆＃６０；212＆＃６２； PRT ＆＃６０；213＆＃６２； Apis mellifera ＆＃６０；220＆＃６２； ＆＃６０；221＆＃６２； UNSURE ＆＃６０；222＆＃６２； (24) ＆＃６０；223＆＃６２； Xaa=unknown ＆＃６０；400＆＃６２； 1 Asn Ile Leu Arg Gly Glu Ser Leu Leu Lys Lys Leu Pro Ile Leu His 1 2 10 10 Glu Met Lys Phe Phe Asp Tyr Xaa Asp 20 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 14/435 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4C083 AA071 AA072 AA082 AB032 AC022 AC072 AC102 AC122 AC182 AC302 AC352 AC422 AC432 AC442 AC482 AC852 AD092 AD411 AD412 AD532 AD662 CC37 DD23 DD31 EE22 4C084 AA02 AA03 BA01 BA02 BA17 BA19 BA34 CA49 MA17 MA22 MA28 MA63 NA14 ZA922 ZC022 4C087 AA01 AA02 AA04 BB22 CA16 CA17 CA33 CA38 CA44 CA46 MA17 MA22 MA28 MA63 NA14 ZA92 ZC02 4H045 AA10 AA30 BA10 CA51 EA28 HA06

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ローヤルゼリーからなる、育毛促進剤。
2. 【請求項２】 ローヤルゼリーが、下記に示す、タンパ
   ク質を９重量％以上含有するものであることを特徴とす
   る、請求項１に記載の育毛促進剤。 １）ローヤルゼリー中のタンパク質の非変性ポリアクリ
   ルアミドゲル電気泳動において単一バンドを形成する。 ２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
   気泳動により測定される分子量が約５７キロダルトンで
   ある。 ３）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含
   む。
3. 【請求項３】 育毛促進が、５７キロダルトンタンパク
   質による血管内皮増殖因子(VEGF)産生促進活性によるも
   のであることを特徴とする、請求項１乃至は２に記載の
   育毛促進剤。
4. 【請求項４】血管内皮増殖因子(VEGF)が、VEGF-A, VEGF
   １６５, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-Eから選ばれる
   一種乃至は二種以上からなることを特徴とする、請求項
   １〜３の何れか一項に記載の育毛促進剤。
5. 【請求項５】 育毛促進が、５７キロダルトンタンパク
   質による線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）産生促進活性に
   よるものであることを特徴とする、請求項１〜４の何れ
   か一項に記載の育毛促進剤。
6. 【請求項６】 線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が、FGF-
   1（酸性FGF：aFGF）, FGF-3, FGF-2（塩基性FGF：bFG
   F）, FGF-3(int-2),FGF-4(hst-1/kaposi- FGF), FGF-5,
   FGF-6(hst-2), FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10から選ば
   れる一種乃至は二種以上からなることを特徴とする、請
   求項１〜５の何れか一項に記載の育毛促進剤。
7. 【請求項７】 育毛促進が、５７キロダルトンタンパク
   質による内皮細胞分裂促進活性によるものであることを
   特徴とする、請求項１〜６の何れか一項に記載の育毛促
   進剤。
8. 【請求項８】 育毛促進が、５７キロダルトンタンパク
   質による管腔形成促進活性によるものであることを特徴
   とする、請求項１〜７の何れか一項に記載の育毛促進
   剤。
9. 【請求項９】 請求項１〜８の何れか一項に記載の育毛
   促進剤を含有する、育毛用の皮膚外用剤。
10. 【請求項１０】 医薬品又は、化粧品であることを特徴
    とする、請求項９に記載の育毛用の皮膚外用剤。