JP2003238405A

JP2003238405A - 敗血症の処置に使用される薬剤組成物

Info

Publication number: JP2003238405A
Application number: JP2003014654A
Authority: JP
Inventors: Che-Ming Teng; テング，チェ−ミン; Shiow-Lin Pan; パン，シオウ−リン; Jih-Hwa Guh; グー，ジー−フワ; Sheng-Chu Kuo; クオ，シェン−チュ; Fang-Yuan Lee; リー，ファン−ユアン
Original assignee: Yung Shin Pharm Industries Co Ltd
Current assignee: Yung Shin Pharm Industries Co Ltd
Priority date: 2002-01-25
Filing date: 2003-01-23
Publication date: 2003-08-27
Also published as: ATE386025T1; US20050187257A1; DE60319021D1; EP1331223A1; US20030181502A1; TWI264304B; EP1331223B1; DE60319021T2; US6943186B2; KR20030095197A; TW200302091A

Abstract

(57)【要約】【課題】敗血症の処置に有用な化合物を提供する。【解決手段】有効量の下記式（Ｉ）: 【化１】で表わされる化合物を含む、敗血症の処置に使用される
薬剤組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な化合物、な
らびに当該化合物を用いた敗血症の処置方法及び血管細
胞のアポプトシスの阻害方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】敗血症は、全身性の炎症応答から器官の
機能不全までや多臓器不全までに至る疾患であり、最終
的には死に至る（例えば、非特許文献１、２、３及び４
を参照。）。敗血症を予防するために、抗酸化剤、抗炎
症剤、及びリポ多糖（ＬＰＳ）で誘導される酸化窒素
（ＮＯ）合成[lipopolysaccharide (LPS)-induced nitr
icoxide (NO) synthesis]の阻害剤などの化合物に関す
る研究が行なわれてきた（例えば、非特許文献５、６及
び７を参照。）。しかしながら、これらの研究の結果は
満足できるものではなかった（例えば、非特許文献８を
参照。）。

【０００３】大量のＮＯが敗血症における血管系の不全
(vascular failure)の病因であることを示すデータもあ
る（例えば、非特許文献９を参照。）。インビボでは、
大量のＮＯは、下記から生じる：（ｉ）敗血症などの重
篤な発作後の内皮でのＮＯの過剰な合成（例えば、非特
許文献１０、１１及び１２を参照。）；および（ｉｉ）
細胞が細菌産物（例えば、ＬＰＳ）若しくは炎症性サイ
トカイン（例えば、インターロイキン−１β及び腫瘍壊
死因子−１α）に応答する際の誘導ＮＯ合成酵素（ｉＮ
ＯＳ）のアップレギュレーション(up-regulation)（例
えば、非特許文献１３及び１４を参照。）。ＮＯは、ス
ーパーオキシドと反応してパーオキシニトライト(perox
ynitrite)を産生し、これにより酸化損傷が起こる（例
えば、非特許文献１５を参照。）。パーオキシニトライ
トはまた、血管細胞のアポプトシスにかかわりがあると
報告されている（例えば、非特許文献１６を参照。）。

【０００４】

【非特許文献１】Stone (1994) Science 264: 365-367

【非特許文献２】Stone (1994) Science 264: 365-367

【非特許文献３】Karima et al. (1999) Mol Med Today
5: 123-132

【非特許文献４】Parrillo et al. (1990) Ann Int Me
d. 113: 227-242

【非特許文献５】Ortolani et al. (2000) Am J Respir
Crit Care Med. 161: 1907-1911

【非特許文献６】Kox et al. (2000) Intensive Care M
ed. 26: S124-128

【非特許文献７】Boyle et al. (2000) Circ Res. 87:
E18-24

【非特許文献８】Glauser (2000) Crit Care Med. 28:
S4-8

【非特許文献９】Rees (1995) Biochem Soc Trans. 23:
1025-1029

【非特許文献１０】Ochoa et al. (1991) Ann Surg. 21
4: 621-626

【非特許文献１１】Nakatsu & Diamond (1989) Can J P
hysiol Pharmacol. 67: 251-262

【非特許文献１２】Guh et al. (1998) Mol Pharmacol.
53: 467-474

【非特許文献１３】Curran et al. (1989) J Exp Med.
170: 1769-1774

【非特許文献１４】Nakayama et al. (1992) Am J Resp
ir Cell Mol Biol. 7: 471-476

【非特許文献１５】Szabo (1996) Shock. 6: 79-88

【非特許文献１６】Cuzzocrea et al. (1998) Br J Pha
rmacol. 123: 525-537

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】血管細胞のアポプトシ
スを阻害し、これにより、血管及び多臓器不全を防止す
る化合物は、敗血症または敗血症に関連のある症状の処
置または予防の薬剤候補であり、このような化合物の開
発が望まれている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記式（Ｉ）
の化合物が、血管細胞のアポプトシスを阻害し、血管及
び多臓器不全を防止でき、敗血症や敗血症に関連のある
症状の処置または予防に有用であり、このような化合物
を含む薬剤組成物が血管細胞のアポプトシスの阻害、さ
らに敗血症や敗血症に関連のある症状の処置または予防
に使用できるという知見に基づくものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の第一は、敗血症の処置方
法に関するものであり、有効量の下記式（Ｉ）:

【０００８】

【化１０】

【０００９】で表わされる融合ピラゾリル化合物を含
む、敗血症の処置に使用される薬剤組成物に関するもの
である。式（Ｉ）の化合物は、血管細胞のアポプトシス
を阻害し、敗血症の処置に有効であるため、このような
薬剤組成物は、敗血症の処置が必要な患者（例えば、哺
乳動物、ヒト、または動物）に投与されることによっ
て、敗血症を処置できる。ゆえに、上記式（Ｉ）の融合
ピラゾリル化合物は、敗血症の処置を目的とする薬剤の
製造に使用でき、このような使用は、本発明に包含され
る。

【００１０】本発明において、患者は、所望の処置が必
要であるものであれば特に制限されないが、例えば、ヒ
ト以外にも、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル、
モルモット、ラット、マウス、ウサギ等の哺乳動物、ニ
ワトリ、シチメンチョウ等の動物などが挙げられる。

【００１１】上記式（Ｉ）において、Ａは、水素、炭素
原子数１〜６のアルキル、または下記式：

【００１２】

【化１１】

【００１３】で表わされる基（本明細書中では、「（Ｃ
Ｈ₂）_nＡｒ₃（Ｒ₅）（Ｒ₆）」とも称する）を表わす。
この際、ｎは、０、１、２、または３である。また、Ａ
ｒ₁、Ａｒ₂、及びＡｒ₃は、フェニル、ピリジニル、チ
エニル、フリル、またはピロリルを表わす。この際、Ａ
ｒ₁、Ａｒ₂、及びＡｒ₃は、同一であってもあるいは異
なるものであってもよい。

【００１４】また、上記式（Ｉ）において、Ｒ₁、Ｒ₂、
Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、及びＲ₆は、ＸＹＺを表わす。または、
Ｒ₁及びＲ₂が一緒に、Ｒ₃及びＲ₄が一緒に、若しくはＲ
₅及びＲ₆が一緒に、Ｏ（ＣＨ₂）_mＯ（この際、ｍは、１
〜６の整数である）を形成するものであってもよい。こ
の際、上記Ｏ（ＣＨ₂）_mＯ基中の（ＣＨ₂）_mは、直鎖で
あってもあるいは分岐鎖であってもよい。また、Ｒ₁、
Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、及びＲ₆は、同一であってもある
いは異なるものであってもよい。

【００１５】Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、及びＲ₆を表わ
す式：ＸＹＺにおいて、Ｘは、結合子または炭素原子数
１〜６のアルキレンである。Ｙは、結合子、Ｏ、Ｓ、Ｏ
Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ₂）_mＣ（Ｏ）Ｏ（この際、
ｍは、１〜６の整数である）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）
Ｓ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＣ₁〜Ｃ₆アルキル、Ｎ
Ｈ、またはＮＣ₁〜Ｃ₆アルキルである。この際、上記Ｏ
（ＣＨ₂）_mＯ基中の（ＣＨ ₂）_mは、直鎖であってもある
いは分岐鎖であってもよい。また、上記Ｙを表わす置換
基において、Ｃ（Ｏ）ＮＣ₁〜Ｃ₆アルキル及びＮＣ₁〜
Ｃ₆アルキルは、それぞれ、Ｃ（Ｏ）Ｎ及びＮ側に炭素
原子数１〜６のアルキルが結合した基を意味する。ま
た、Ｚは、水素、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ₂、または炭素
原子数１〜６のアルキルである。

【００１６】なお、上記式（Ｉ）において、Ｒ₃及びＲ₄
の少なくとも一方は水素ではない。

【００１７】上記置換基において、左側に示される原子
が、融合ピラゾリル環に最も近い原子である。

【００１８】好ましい一実施態様としては、（１）Ａが
Ｈである；（２）Ａｒ₁がフェニルである；（３）Ａｒ₂
がフェニルまたはフリルである；および（４）Ｒ₁及び
Ｒ₂がＨである、の少なくとも一の条件を満足する、よ
り好ましくは、上記順序で条件を順次満足していく、上
記式（Ｉ）の融合ピラゾリル化合物がある。

【００１９】また、他の好ましい実施態様としては、
（ｉ）Ａが（ＣＨ₂）_nＡｒ₃（Ｒ₅）（Ｒ₆）である；
（ｉｉ）Ａｒ₁がフェニルまたはチエニルである；（ｉ
ｉｉ）Ａｒ ₂がフェニルまたはフリルである；（ｉｖ）
Ａｒ₃がフェニルである；（ｖ）ｎが０または１であ
る、の少なくとも一の条件を満足する、より好ましく
は、上記順序で条件を順次満足していく、上記式（Ｉ）
の融合ピラゾリル化合物がある。この実施態様によって
は、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、及びＲ₆の一がＣＯＯ
Ｈ、ＣＯＯ−Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル、ＣＨ₂ＯＨ、ＣＮ、Ｎ
Ｏ₂、またはハロゲンであることが好ましい場合があ
る。

【００２０】本明細書において、「Ａｒ」は、アリール
及びヘテロアリール基双方を包含するものである。この
際、アリールは、少なくとも一の芳香環を有する炭化水
素環系であり、このようなアリールとしては、特に制限
されず、公知のアリールが使用できるが、例えば、フェ
ニルがある。また、ヘテロアリールは、Ｏ、Ｎ、または
Ｓ等の少なくとも一のヘテロ原子を含む少なくとも一の
芳香環を有する炭化水素環系であり、このようなヘテロ
アリール部分としては、特に制限されず、公知のヘテロ
アリールが使用できるが、例えば、ピリジニル、チエニ
ル、フリル、及びピロリルなどが挙げられる。したがっ
て、本発明において、Ａｒとしては、フェニル、ピリジ
ニル、チエニル、フリル、及びピロリルが挙げられ、こ
の際、各Ａｒは一以上の（例えば、１個、２個、３個ま
たはそれ以上の）置換基を有していてもよい。Ａｒが置
換基を有する場合の置換基としては、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、
Ｒ₄、Ｒ₅、及びＲ₆で記載した基に加えて、アミノ、ヒ
ドロキシル、メルカプト、炭素原子数２〜６のアルケニ
ル、炭素原子数２〜６のアルキニル、炭素原子数１〜６
のアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、サイクリル
(cyclyl)、及びヘテロサイクリル(heterocyclyl)などが
挙げられる。この際、アルキル、アルケニル、アルキニ
ル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、サイクリ
ル(cyclyl)、及びヘテロサイクリル(heterocyclyl)は、
炭素原子数１〜６のアルキル、ハロゲン、アミノ、ヒド
ロキシル、メルカプト、シアノ、及びニトロ等の置換基
で置換されていてもよい。

【００２１】本明細書において、「アルキル」は、直鎖
及び分岐鎖のアルキル双方を包含するものである。アル
キルは、一以上の置換基を有するものであってもよく、
このような場合における置換基としては、上記Ａｒで列
挙したものと同様の置換基が使用できる。ゆえに、本発
明において、炭素原子数１〜６のアルキルとしては、メ
チル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチ
ル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、
ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキ
シルなどが挙げられる。同様にして、「アルキレン」
は、直鎖及び分岐鎖のアルキレン双方を包含するもので
ある。アルキレンは、一以上の置換基を有するものであ
ってもよく、このような場合における置換基としては、
上記Ａｒで列挙したものと同様の置換基が使用できる。
ゆえに、本発明において、炭素原子数１〜６のアルキレ
ンとしては、メチレン（ＣＨ₂）、エチレン（ＣＨ₂ＣＨ
₂）、トリメチレン（ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂）、プロピレン
（ＣＨ₃ＣＨＣＨ₂）、テトラメチレン（ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ
₂ＣＨ₂）などが挙げられる。

【００２２】また、本明細書において、「アリール」
は、少なくとも一の芳香環を有する炭化水素環系（例え
ば、単環、２環式）であり、このようなアリール部分と
しては、特に制限されず、公知のアリールが使用できる
が、例えば、フェニル、ナフチル、及びピレニルなどが
挙げられる。「ヘテロアリール」は、環系の一部として
Ｏ、Ｎ、またはＳ等の少なくとも一のヘテロ原子を含む
少なくとも一の芳香環を有する炭化水素環系（例えば、
単環、２環式）であり、このようなヘテロアリール部分
としては、特に制限されず、公知のヘテロアリールが使
用できるが、例えば、フリル、ピロリル、チエニル、オ
キサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジニル、
ピリミジニル、キナゾリニル、及びインドリルなどが挙
げられる。「サイクリル(cyclyl)」及び「ヘテロサイク
リル(heterocyclyl)」は、４〜１４個の環原子(ring at
om)を有する、部分的にまたは全部が飽和した単環また
は２環式化合物を意味する。ヘテロサイクリル(heteroc
yclyl)環は、環系の一部としてＯ、Ｎ、またはＳ等の少
なくとも一のヘテロ原子を含む。サイクリル(cyclyl)及
びヘテロサイクリル(heterocyclyl)の例としては、特に
制限されず、公知のものが使用できるが、例えば、シク
ロヘキサン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チ
オモルホリン、及び１，４−オキサゼパン(1,4-oxazepa
ne)などが挙げられる。

【００２３】したがって、本発明において特に好ましい
上記式（Ｉ）の化合物としては、下記化合物が挙げられ
る。

【００２４】

【化１２】

【００２５】

【化１３】

【００２６】

【化１４】

【００２７】

【化１５】

【００２８】

【化１６】

【００２９】

【化１７】

【００３０】上記化合物のうち、化合物１、化合物３、
化合物７及び化合物１２が特に好ましい。

【００３１】本発明の第二は、下記式（Ｉ）：

【００３２】

【化１８】

【００３３】で表わされる新規な化合物に関するもので
ある。なお、上記式（Ｉ）の説明は、特記しない限り、
上記本発明の第一における定義と同様であるため、その
説明を省略する。

【００３４】上記式（Ｉ）において、Ａは、水素、炭素
原子数１〜６のアルキル、または（ＣＨ₂）_nＡｒ
₃（Ｒ₅）（Ｒ₆）を表わす。この際、ｎは、０、１、
２、または３である。また、Ａｒ₁、Ａｒ₂、及びＡｒ₃
は、フェニル、ピリジニル、チエニル、フリル、または
ピロリルを表わす。この際、Ａｒ₁、Ａｒ₂、及びＡｒ₃
は、同一であってもあるいは異なるものであってもよ
い。

【００３５】また、上記式（Ｉ）において、Ｒ₁、Ｒ₂、
Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、及びＲ₆は、ＸＹＺを表わす。Ｘは、結
合子または炭素原子数１〜６のアルキレンである。Ｙ
は、結合子、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）（Ｃ
Ｈ₂）_mＣ（Ｏ）Ｏ（この際、ｍは、１〜６の整数であ
る）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ
（Ｏ）ＮＣ ₁〜Ｃ₆アルキル、ＮＨ、またはＮＣ₁〜Ｃ₆ア
ルキルである。Ｚは、水素、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ₂、
または炭素原子数１〜６のアルキルである。またはＲ₁
及びＲ ₂が一緒に、若しくはＲ₅及びＲ₆が一緒に、Ｏ
（ＣＨ₂）_mＯ（この際、ｍは、１〜６の整数である）を
形成してもよい。さらに、Ｘは、炭素原子数１〜６のア
ルキレンでなければならない場合には、Ｙは、ＯＣ
（Ｏ）（ＣＨ₂）_mＣ（Ｏ）Ｏ（この際、ｍは、１〜６の
整数である）でなければならず、かつＺは、Ｒ₃及びＲ₄
の一方では水素または炭素原子数１〜６のアルキルでな
ければならない。この際、上記Ｏ（ＣＨ₂）_mＯ基中の
（ＣＨ₂）_mは、直鎖であってもあるいは分岐鎖であって
もよい。また、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、及びＲ₆は、
同一であってもあるいは異なるものであってもよい。

【００３６】本発明の融合ピラゾリル化合物の好ましい
実施態様としては、（１）Ａは（ＣＨ₂）_nＡｒ₃（Ｒ₅）
（Ｒ₆）である；（２）Ａｒ₁はフェニルである；（３）
Ａｒ ₂はフリルである；（４）Ａｒ₃はフェニルである；
（５）Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₅、及びＲ₆のそれぞれはＨである；
（６）Ｒ₃及びＲ₄の一方はＨである；（７）ｎは０また
は１である；ならびに（８）ＸはＣＨ₂であり、ＹはＯ
Ｃ（Ｏ）ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）Ｏであり、およびＺはＲ₃
及びＲ₄の他方では水素である、の少なくとも一の条件
を満足する、より好ましくは、上記順序で条件を順次満
足していく、上記式（Ｉ）の融合ピラゾリル化合物があ
る。本発明の化合物の一具体例としては、上記化合物９
がある。

【００３７】本発明の融合ピラゾリル化合物は、上記式
（Ｉ）の化合物自体に加えて、この塩及びプロドラッグ
を包含する。このような塩は、例えば、融合ピラゾリル
化合物上の負電荷を有する置換基（例えば、カルボキシ
レート）およびカチオン間で形成されうる。適当なカチ
オンとしては、特に制限されないが、ナトリウムイオ
ン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウム
イオン、及びテトラメチルアンモニウムイオン等のアン
モニウムカチオンなどが挙げられる。同様にして、正電
荷を有する置換基（例えば、アミノ）が、負電荷を有す
る対イオンと塩を形成してもよい。適当な対イオンとし
ては、特に制限されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化
物、サルフェート、ニトレート、ホスフェート、及びア
セテートなどが挙げられる。プロドラッグの例として
は、エステル及び他の製薬上許容できる誘導体があり、
これらは、患者に投与されると、本発明による融合ピラ
ゾリル化合物を形成できる（Goodman and Gilman's, Th
e Pharmacological basis of Therapeutics, 8^th ed.,
McGraw-Hill, Int. Ed. 1992, "Biotransformation of
Drugs"を参照。）。

【００３８】加えて、本発明による融合ピラゾリル化合
物によっては、一以上の二重結合、または一以上の不斉
中心を有するものがある。このような化合物は、ラセミ
体、ラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステ
レオマー、ジアステレオマー混合物、およびシス−また
はトランス−またはＥ−またはＺ−二重異性形態(doubl
e isomeric form)として存在してもよい。

【００３９】さらに、前記融合ピラゾリル化合物はま
た、そのＮ−オキシドを含むものであってもよい。この
際、「Ｎ−オキシド」とは、一以上の窒素原子が、融合
ピラゾリル化合物中に存在する際に、Ｎ−オキシド形
態、即ち、Ｎ→Ｏの形態を有することを意味する。

【００４０】本発明による置換体(substituent)及び変
異体(variable)の組み合わせは、安定した融合ピラゾリ
ル化合物を形成するもののみである。本明細書におい
て、「安定した」とは、製造するのに十分な安定性を有
し、本明細書に記載される目的（例えば、敗血症の処
置）に有用であるのに十分な時間、化合物の完全性(int
egrity)を維持する化合物を意味する。

【００４１】本発明の第三は、血管細胞のアポプトシス
の阻害方法に関するものであり、有効量の上記式（Ｉ）
で表わされる融合ピラゾリル化合物を含む、血管細胞の
アポプトシスの阻害に使用される薬剤組成物に関するも
のである。このような薬剤組成物は、血管細胞のアポプ
トシスの阻害が必要な患者（例えば、哺乳動物、ヒト、
または動物）に投与されることによって、血管細胞のア
ポプトシスを有効に阻害できる。ゆえに、上記式（Ｉ）
の融合ピラゾリル化合物は、血管細胞のアポプトシスの
阻害を目的とする薬剤の製造に使用でき、このような使
用は、本発明に包含される。なお、式（Ｉ）の融合ピラ
ゾリル化合物などは、特記しない限り、上記定義と同様
であるため、その説明を省略する。

【００４２】本発明による融合ピラゾリル化合物の製造
方法は、特に制限されず、公知の方法を単独であるいは
組み合わせて使用できる。例えば、米国特許第５，５７
４，１６８号に記載の方法によって、融合ピラゾリル化
合物を調製できる。本発明による融合ピラゾリル化合物
の製造方法の一実施態様では、例えば、下記合成経路を
含む。すなわち、アリールアリールケトンを、まず、ア
リールカルボニルクロリド(arylcarbonyl chloride)を
他のアリール化合物とカップリングすることによって、
調製する。この際、アリール化合物は、必要であれば、
１置換または複数置換されたものであってもよい。次
に、ケトンを、アリールアルキルヒドラジン（またはア
ルキルヒドラジン、ヒドラジン）と反応させて、３（ま
たは２）個のアリール基を含むヒドラゾンを形成する。
この際、アリールアルキルヒドラジン中のアリール基
は、必要であれば、１置換または複数置換されたもので
あってもよい。ヒドラゾン基をアルキレンリンカーを介
して融合ピラゾリルコアに変換し、他のアリール基をピ
ラゾリルコアの４−Ｃ及び５−Ｃで融合し、さらに第三
のアリール基をピラゾリルコアの３−Ｃに直接連結す
る。いずれかのアリール基での置換基を修飾することに
よって、この融合ピラゾリル化合物の誘導体を得てもよ
い。

【００４３】上記合成経路で使用される化学物質として
は、例えば、溶剤、試薬、触媒、ならびに保護基及び脱
保護基試薬があるが、これらは公知の物質が使用でき、
特に制限されない。上記方法は、本明細書に記載される
段階の前または後に、融合ピラゾリル化合物の合成を最
終的に行なうために適当な保護基を付加あるいは除去す
る段階をさらに有してもよい。加えて、様々な合成段階
を、所望の化合物を得るために、別の配列または順序で
行なってもよい。適当な融合ピラゾリル化合物を合成す
るのに使用できる合成化学変換及び保護基の方法（保護
及び脱保護）は、当該分野において既知であり、例とし
ては、例えば、R. Larock, Comprehensive Organic Tra
nsformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene a
nd P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synth
esis, 3^rd Ed., John Wiley andSons (1999); L. Fiese
r and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for
Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); 及
び L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for
Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)、な
らびにこれらの次の版に記載されるものがある。

【００４４】このようにして合成された融合ピラゾリル
化合物は、さらに精製されてもよく、この際使用できる
精製方法は、特に制限されず、公知の精製方法が使用で
きるが、例えば、フラッシュカラムクロマトグラフィ
ー、高速液体クロマトグラフィー、及び結晶化などが挙
げられる。

【００４５】本発明の一態様としては、敗血症の処置方
法があるが、当該方法は、有効量の本発明による一以上
の融合ピラゾリル化合物および製薬上許容できる担体
を、敗血症の処置が必要である患者への投与を有するも
のである。ゆえに、本発明の薬剤組成物は、本発明によ
る融合ピラゾリル化合物のほかに、製薬上許容できる担
体をさらに含んでもよい。本明細書において、「処置」
は、敗血症、敗血症の症状、または敗血症への素因を治
療する(cure)、治癒する(heal)、軽減する(alleviat
e)、緩和する(relieve)、変化させる(alter)、救済する
(remedy)、向上する(ameliorate)、改善する(improv
e)、または影響を与える(affect)ことを目的として患者
に融合ピラゾリル化合物を使用することを意味する。
「有効量」は、処置の必要な患者に投与すると、患者に
治療効果を与えるのに必要である融合ピラゾリル化合物
の量として規定される。融合ピラゾリル化合物の有効量
は、特に制限されないが、例えば、約０．１ｍｇ／Ｋｇ
〜約１００ｍｇ／Ｋｇの範囲である。なお、当業者であ
れば認識するであろうが、有効投与量は、投与経路、賦
形剤の使用、及び敗血症の他の治療剤との併用の可能性
などによって異なるであろう。

【００４６】本発明による処置方法を実施するにあたっ
て、融合ピラゾリル化合物は、経口で、非経口で、吸入
スプレーによって、または埋込リザーバーを介して投与
されうる。本明細書において、「経口」は、皮下、皮
内、静脈内、筋肉内、腹腔内、関節内、動脈内、滑液包
内、胸骨内、鞘内、病巣内及び頭蓋内注射(injection)
または注入(infusion)技術によるなどの公知の経口経路
を包含する。

【００４７】経口投与用の組成物は、経口で摂取できる
投与形態であればいずれの形態であってもよく、特に制
限されないが、例えば、錠剤、カプセル、エマルジョ
ン、ならびに水性懸濁液、分散液及び溶液などが挙げら
れる。錠剤に使用される担体は、特に制限されず、公知
の担体が使用できるが、錠剤に一般的に使用される担体
としては、ラクトース及びトウモロコシデンプンなどが
ある。また、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤を、
錠剤に添加してもよい。カプセル形態での経口投与で
は、希釈剤が使用できるが、この際使用できる希釈剤と
しては、特に制限されず、公知の希釈剤が使用できる
が、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥トウモ
ロコシデンプンなどがある。水性懸濁液またはエマルジ
ョンを経口で投与する場合には、活性成分を、乳化剤ま
たは懸濁化剤と混合した油相中に懸濁あるいは溶解す
る。必要であれば、甘味剤、着香剤、または着色剤など
の公知の添加剤を添加してもよい。

【００４８】滅菌注射用組成物（例えば、水性または油
性の懸濁液）を、適当な分散剤または湿潤化剤（例え
ば、Tween 80など）及び懸濁化剤を用いて、当該分野に
おいて既知の技術に従って、配合してもよい。滅菌注射
用製剤はまた、無毒な、非経口投与可能な希釈剤または
溶剤における滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよ
く、このような例としては、例えば、１，３−ブランジ
オールの溶液がある。使用できる許容できるベヒクル及
び溶剤としては、特に制限されず、公知のものが使用で
きるが、マンニトール、水、リンガー液及び等張食塩液
などがある。さらに、滅菌された不揮発性油を、溶剤ま
たは懸濁媒体として使用してもよく、このような不揮発
性油としては、特に制限されず、公知のものが使用でき
るが、例えば、合成モノ−またはジ−グリセリドなどが
ある。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体等の、脂肪
酸を、注射剤の調製に使用してもよく、また、オリーブ
油またはヒマシ油等の、製薬上許容できる天然の油、特
にポリオキシエチレン化されたものを使用してもよい。
これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖のアルコール
希釈剤若しくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロ
ース若しくは同様の分散剤を含んでもよい。

【００４９】吸入用組成物は、製薬配合の分野において
既知の技術に従って調製でき、ベンジルアルコールまた
は他の適当な保存剤、生物学的利用能を促進するための
吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当該分
野において既知の他の可溶化剤若しくは分散剤などを用
いて、生理食塩水における溶液として調製されうる。

【００５０】薬剤組成物における担体は、配合物の活性
成分と適合でき(compatible with)、処置される患者に
有害ではないという点で「許容できる」ものでなければ
ならない。例えば、シクロデキストリン（これは、融合
ピラゾリル化合物と特定の、より可溶性のある複合体を
形成する）等の、可溶化剤を、融合ピラゾリル化合物の
デリバリー用の賦形剤として使用してもよい。他の担体
の例としては、特に制限されず、公知の担体が使用でき
るが、例えば、コロイド状２酸化ケイ素、ステアリン酸
マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、
及びＤ＆ＣＹｅｌｌｏｗ＃１０などが挙げられ
る。

【００５１】融合ピラゾリル化合物の血管細胞のアポプ
トシスを阻害する効率を予備的に評価するために、適当
なインビトロアッセイが使用できる。この際、インビト
ロアッセイは、公知の方法が使用でき、特に制限されな
い。また、インビボスクリーニングを当該分野において
既知の下記方法によって行なってもよい。下記実施例を
参照のこと。

【００５２】さらに労力をはらうことなく、上記説明に
より本発明を適切に実施できるものと考えられる。した
がって、下記特定の実施態様は、単に詳細に説明するも
のであり、他の開示部分を制限するものではないと解さ
れる。特許を含め、本明細書で列挙される、すべての文
献や公報は、参考のために完全に引用される。

【００５３】＜方法＞１．細胞培養ラットの大動脈の平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）を、スプラ
グ−ダウレイラット(Sprague-Dawley rat)から調製し、
前記(Yang et al. (2001) Br J Pharmacol. 132: 1531-
1541)と同様にして、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍ
ｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイ
シン(Gibco, Grand Island, NY)を捕捉したダルベッコ
の改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。６代ま
での細胞を本研究では使用した。平滑筋のα−アクチン
に特異的なモノクローナル抗体で免疫染色する(immunos
taining)ことによって平滑筋細胞であることを同定し
た。

【００５４】２．細胞傷害性アッセイＭＴＴアッセイ法を用いて細胞傷害性アッセイを行なっ
た。ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−
イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド[3
-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliu
m bromide, Sigma Chemical, St. Louis, MO]を、５ｍ
ｇ／ｍｌの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に
溶解し、瀘過した(Millipore, Bedford, MA)。このスト
ック溶液から、１０μｌ／１００μｌの培地をプレート
の各ウェルに添加し、プレートをゆるやかに振盪し、３
７℃で２時間インキュベートした。生きた細胞をＭＴＴ
で処理すると、暗青色のホルマザン産物が生成するが、
死細胞では染色は観察されなかった。ＭＴＴをのせた
後、培地を１００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）で置換した。細胞内のＭＴＴのホルマザンへの還元
の程度を、酵素様免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）リーダーで
ＯＤ₅₅₀を測定することによって、定量した。

【００５５】３．アポプトシス細胞のin situ標識前記(Guh et al. (1998) Mol Pharmacol. 53: 467-474)
と同様にして、アポプトシス検出キット(apoptotic det
ection kit)(Promega, Madison, WI, USA)による末端デ
オキシヌクレオチジル転移酵素(terminal deoxynucleot
idyl transferase)（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニック−エンド
標識(nick-end labeling)（ＴＵＮＥＬ）法を用いるこ
とによって、アポプトシス細胞のin situでの検出を行
なった。ＴＵＮＥＬ法は、ＴｄＴを用いてビオチン−ｄ
ＵＴＰを切断されたＤＮＡの遊離３’−ＯＨに移すこと
によって、in situでアポプトシス細胞を同定するもの
である。次に、ビオチンで標識された切断部位を、フル
オレセイン結合アビジン（アビジン−フルオレセインイ
ソチオシアネート）との反応によって可視化した。螢光
顕微鏡(Nikon)により、顕微鏡写真をとった。

【００５６】４．ｃＧＭＰ含量のアッセイコンフルエンスになった、単層細胞を、１０分間、指示
剤(indicated agent)と共にインキュベートした。次
に、細胞を氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、０．５ｍＬ
ＮａＯＨ（０．１モル／Ｌ）で溶解した。さらに、０．
５ｍＬＨＣｌ（０．１モル／Ｌ）を添加して、アッセ
イ溶液を中和した。遠心（３，０００×ｇで３分間）
後、上清を、ｃＧＭＰＥＬＩＳＡキットを用いること
によるｃＧＭＰ含量の検出に使用した。

【００５７】５．カスパーゼ−３(Caspase-3)活性の測
定カスパーゼ−３(Caspase-3)活性を、カスパーゼ−３活
性比色アッセイキット(Caspase-3 colorimetric assay
kit)(R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota)を
用いて測定した。細胞を指示剤で１０時間処理した後、
細胞を氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理
し、遠心した（８００×ｇで５分間）。さらに、細胞ペ
レットを、カスパーゼ−３活性比色アッセイキットから
得られた予め冷却した溶解緩衝液中に再懸濁した。氷上
で１０分間インキュベートした後、細胞ホモジネート
を、１０，０００×ｇで１分間遠心し、上清を、カスパ
ーゼ−３活性を測定するために除去した。５０μｌのサ
イトゾル抽出物及びこのキットから得られた５μｌのＤ
ＥＶＤ−ｐＮＡを含む全容積が１００μｌの反応緩衝液
中で、タンパク分解反応を行なった。この反応混合物
を、３７℃で１〜２時間インキュベートした後、ｐ−ニ
トロアニリンの形成をＥＬＩＳＡリーダーによって４０
５ｎｍで測定した。

【００５８】６．チトクロームｃの放出反応の検出細胞をトリプシン処理し、８００×ｇで１０分間遠心し
た。次に、細胞ペレットを、２０ミリモル／ＬＨＥＰ
ＥＳ、ｐＨ７．５、１０ミリモル／ＬＫＣｌ、１．
５ミリモル／ＬＭｇＣｌ₂、１ミリモル／ＬＥＤＴ
Ａ、１ミリモル／ＬＥＧＴＡ、１ミリモル／Ｌジチ
オトレイトール、１ミリモル／ＬＰＭＳＦを含む抽出
緩衝液５０μｌ中に再懸濁し、氷上で３分間インキュベ
ートした。細胞を３０ストロークで処理し、４℃で１
５，０００×ｇで１５分間、遠心した。２０μｇのタン
パク質を含むアリコートを、１５％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜にブロットした。
膜を抗チトクロームｃモノクローナル抗体と共にインキ
ュベートした。次に、膜を抗マウスＩｇＧと共にインキ
ュベートし、チトクロームｃの発現を前記したのと同様
にして検出した。

【００５９】７．ウェスタンブロット分析細胞を指示剤に４時間（Ｂｃｌ−２では）または６時間
（チトクロームｃでは）暴露した後、細胞を氷冷したＰ
ＢＳで２回洗浄し、１００μｌの氷冷溶解緩衝液（１０
ミリモル／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５
０ミリモル／ＬＮａＣｌ、１ミリモル／ＬＥＧＴＡ、
０．５ミリモル／Ｌフェニルメチルスルホニルフルオ
リド（ＰＭＳＦ）、１０ｇ／ｍＬアプロチニン、１０
ｇ／ｍＬロイペプチン、及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００）を添加することによって、反応を終了させ
た。リン酸化Ａｋｔの検出を目的として、１ミリモル／
ＬＮａ３ＶＯ４、１ミリモル／ＬＮａＦ、５０ミリモ
ル／Ｌピロリン酸４ナトリウム、１０ナノモル／Ｌ
オカダイックアシッド(okadaic acid)、０．２５％デ
オキシコール酸ナトリウムを、溶解緩衝液に含ませた。
タンパク質含量は、バイオ−ラッドタンパク質アッセイ
(Bio-Rad protein assay)(Bio-Rad Laboratories, CA,
USA)によって測定した。ウェスタンブロット分析では、
細胞溶解産物（２５μｇ／レーン）を、１０〜１５％Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロ
セルロース膜に移した。この膜を、抗Ｂｃｌ−２若しく
は抗α−チューブリンモノクローナル抗体、または抗リ
ン酸化Ａｋｔポリクローナル抗体を用いて調べた。移し
た膜を、前記(Guh et al. (1998) Eur J Pharmacol.35
9: 281-284)と同様にして第２抗マウスまたは抗ウサギ
抗体で発色させた。シグナルの検出を、高度化学ルミネ
ッセンス検出キット(enhanced chemiluminescence dete
ction kit)（ＥＣＬ）(Amersham International, Littl
e Chalfont, U.K.)を用いて行なった。

【００６０】８．内毒素性ショックの誘導及び組織学試
験本実験では、マウス（２５〜３０ｇ、ＩＣＲ株）に、６
０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ（ＰＢＳに溶解）を腹腔内に注射
し、化合物３（カルボキシメチルセルロースに懸濁）
を、ＬＰＳを注射してから２及び６時間後に経口投与し
た。生存率を、ＬＰＳを注射してから３〜６時間ごとに
モニターした。組織学試験では、肺組織を４％パラホル
ムアルデヒド中に入れ、パラフィンに包埋した。包埋組
織を６μｍ厚に切片化し、ヘマトキシリン−エオシンで
染色し、顕微鏡検査法を用いて分析した。

【００６１】９．統計学的分析データは、それぞれの実験の示された数に関する平均値
±ＳＥＭとして表わす。データの統計学的分析を、分散
のワンウエイ分析(one-way analysis of variance)（Ａ
ＮＯＶＡ）さらにはｔ−検定(t-test)を用いて、行なっ
た。０．０５未満のＰ値が有意であると考えられる。

【００６２】＜結果＞インビトロアッセイ第一に、培養ＲＡＳＭＣにおけるニトロプルシドナトリ
ウム（ＳＮＰ）で誘導されたアポプトシスに関する化合
物３の効果を試験した。データから、ＭＴＴアッセイ法
及びＴＵＮＥＬ反応技術によって測定される際に、ＳＮ
Ｐ（１ミリモル／Ｌ）は顕著な細胞のアポプトシスを誘
導することが示された。しかしながら、化合物３（３０
マイクロモル／Ｌ）は、ＳＮＰで誘導されたアポプトシ
スを完全に消滅させた。興味深いことに、可溶性グアニ
リルシクラーゼの阻害剤である、ＯＤＱは、ＳＮＰで誘
導されたアポプトシスに何ら影響を与えないが、化合物
３が仲介する抗アポプトシス反応を有意に逆転した(rev
erse)（表１を参照）ことから、可溶性グアニリルシク
ラーゼの活性化は、ＳＮＰで誘導されたアポプトシス反
応ではなく、化合物３が仲介する抗アポプトシス反応に
かかわりがあることが明らかになった。

【００６３】細胞内ｃＧＭＰレベルもまた本研究でアッ
セイした。化合物３単独では、ｃＧＭＰ合成の顕著な増
加を誘導した（２．３±０．３ｆｍｏｌ／ウェルの基準
値に比して４．２±０．８ｆｍｏｌ／ウェル）。さら
に、ＳＮＰ及び化合物３を組み合わせることによって、
この環状ヌクレオチド形成の６０倍以上の増加が相乗的
に誘発された（２５２．８±８１．８ｆｍｏｌ／ウェ
ル）。しかしながら、ＯＤＱは、化合物３単独の効果
（およそ基準値）ならびにＳＮＰ及び化合物３の複合作
用（およそ２１ｆｍｏｌ／ウェル）を有意に阻害した。
さらに、ＭＴＴアッセイ法を用いることにより、細胞透
過性ｃＧＭＰ類似体であるジブチル−ｃＧＭＰは、ＳＮ
Ｐで誘導されたアポプトシスを有意に逆転できた（デー
タ示さず）。一緒に考慮すると、これらのデータから、
ＳＮＰはｃＧＭＰに依存しないアポプトシス反応を誘導
するが、化合物３はｃＧＭＰに依存するシグナル伝達経
路(signaling pathway)を介してＳＮＰ作用を防止する
ことが示唆された。

【００６４】ＰＩ３−キナーゼ及びマイトジェン活性
化タンパク質キナーゼ(mitogen-activated protein kin
ase)（ＭＡＰＫ）が化合物３が仲介する抗アポプトシス
にかかわりがあるかどうかを試験するために、これらの
選択的な阻害剤を機能測定に使用した。ＰＩ３−キナ
ーゼの阻害剤である、ウォートマニン(wortmannin)、お
よびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼの阻害剤で
ある、ＰＤ９８０５９は、化合物３の作用を有意に逆転
したことから、ＰＩ３−キナーゼの活性化は、化合物
３が誘導する抗アポプトシス効果において中心的な役割
を果たす可能性があることが示された。

【００６５】ＰＩ３−キナーゼの脂質産物がＡｋｔ／
ＰＫＢＰＨドメインに高い親和性及び特異性をもって
結合した後、細胞生存のシグナル伝達経路を開始するこ
とはよく示唆されている。本研究では、リン酸化Ａｋｔ
の発現を、ウェスタンブロット分析を用いて試験した。
これらの結果から、化合物３単独ならびにＳＮＰとのこ
の組み合わせがリン酸化Ａｋｔの発現の顕著な増加を誘
導することが示された。これらの効果は、ＯＤＱ及びウ
ォートマニンによって顕著に阻害されたことから、化合
物３によって誘導されたＰＩ３−キナーゼの活性化
は、ｃＧＭＰ合成の下流にあることが示唆される。

【００６６】Ｂｃｌ−２レベル及びチトクロームｃ放出
反応に関するＳＮＰ及び化合物３の効果を研究した。Ｓ
ＮＰ（１ミリモル／Ｌ）に暴露することによって、Ｂｃ
ｌ−２の発現の顕著なダウンレギュレーション(down-re
gulation)及びサイトゾルへのチトクロームｃの放出が
起こった。ＳＮＰの作用は、細胞を化合物３で処理する
ことによって完全に防止された。しかしながら、ＯＤＱ
及びウォートマニンは、化合物３に対する防止作用を十
分逆転した。これらのデータから、化合物３へのｃＧＭ
Ｐ依存性のＰＩ３−キナーゼにかかわりのあるシグナ
ル伝達経路(cGMP-dependent PI 3-kinase-involved sig
naling pathway to Compound 3 action)によりＳＮＰに
よって生じるＢｃｌ−２のダウンレギュレーション及び
チトクロームｃの放出が防止されることが示唆される。

【００６７】カスパーゼ−３活性を、ＳＮＰ（１ミリモ
ル／Ｌ）に細胞を暴露した後に測定した。これらの結果
から、ＳＮＰはＲＡＳＭＣにおいてカスパーゼ−３活性
を有意に増加させるが、化合物３はＳＮＰ作用に対する
この酵素活性を完全に阻害することが示された。さら
に、化合物３が仲介する阻害効果はまた、それぞれ、Ｏ
ＤＱ及びウォートマニンによって、部分的であるが有意
に逆転された。アポプトシス率（％）及びカスパーゼ−
３活性をさらに相関を目的として分析したところ、０．
９８０の相関係数（γ²値）で正の直線的な回帰が得ら
れたことから、化合物３のＳＮＰで誘導される効果にお
けるカスパーゼ−３活性の調節及び抗アポプトシス作用
の重要な役割が示唆された。

【００６８】培養ＶＳＭＣにおけるニトロプルシドナト
リウム（ＳＮＰ）で誘導されるアポプトシスに関する化
合物１〜２２の効果を試験した。１６化合物は、ＳＮＰ
（１ミリモル／Ｌ）で誘導されたアポプトシスに対して
阻害効果を示した。これらのうちには、ＳＮＰで誘導さ
れたアポプトシスを完全に消滅させるものもあった。

【００６９】インビトロアッセイ敗血症の処置における化合物３の治療の可能性を調べる
ために、マウスモデルにおけるＬＰＳで誘導される敗血
症による死を使用した。ＬＰＳを腹腔内投与（６０ｍｇ
／ｋｇ）することによって、１０〜２８時間以内に累積
動物死(cumulative animal death)が起こった。しかし
ながら、ＬＰＳを投与して２時間後に化合物３（１０ｍ
ｇ／ｋｇ）を経口処置すること（即ち、化合物３の処置
後）によって、マウスの生存率が有意に増加した（図
１）。さらに、これらの生存マウスは、ＬＰＳで処置し
てから１ヶ月以上活発でい続けた。

【００７０】また、インビボ動物研究の組織学的試験を
も考察した。コントロールマウスは、肺組織の完全な組
織学的な様子を示した。ＬＰＳを適用してから２８時間
後では、動物は、血管の損傷および肺組織における循環
からの血液細胞の多量の漏れを示した。しかしながら、
化合物３で処置した後の健常なマウス群は、血液細胞の
浸潤を示すことなく完全な血管を示した。

【００７１】血管の平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）のアポプト
シスの効果は、明らかに環境に依存する。ＶＳＭＣのア
ポプトシスは、アテローム性動脈硬化症及び損傷後の新
生内膜形成(neointimal formation post injury)で良く
研究されている(Mallat et al. (1997) Circulation 9
6: 424-428; and Newby & George (1996) Curr Opin Ca
rdiol. 11: 574-582.)。しかしながら、敗血症に関して
はあまり注意が払われていない。アポプトシスへのＮＯ
の作用は、細胞の型、細胞濃度、ラジカルの環境、さら
には細胞のレドックス状態に依存する(Yabuki et al.
(1997) Free Radical Res. 27: 325-335; and Filippov
et al. (1997) J Clin Invest. 100: 942-948)。化合
物３をＳＮＰと組み合わせることによってｃＧＭＰ合成
を相乗的に増加し、ジブチル−ｃＧＭＰは化合物３が仲
介する効果を効率よく模倣し、さらにＯＤＱは化合物３
の作用を有意に逆転するという考察に基づいて、化合物
３は、ｃＧＭＰに依存してＳＮＰで誘導されるアポプト
シス効果を防止した。しかしながら、化合物３が仲介す
る効果において約２０％のＯＤＱ無応答作用(ODQ-irres
ponsible action)が依然として残っていた。

【００７２】ＮＯで誘導される細胞障害性に関して示唆
されたメカニズムは、ミトコンドリアの呼吸鎖の不活性
化、ＤＮＡの損傷、およびＢｃｌのダウンレギュレーシ
ョン／Ｂａｘのアップレギュレーションを含む(Bolanos
et al. (1997) J Neurochem. 68: 2227-2240; and Tam
atani et al. (1998) Cell Death Differ. 5: 911-91
9)。上述したように、ＳＮＰは、Ｂａｘの発現への影響
ではなくＢｃｌ−２タンパク質の有意なダウンレギュレ
ーションを誘導した。ＳＮＰはまた、サイトゾルへのチ
トクロームｃの放出反応およびカスパーゼ−３活性の活
性化を刺激した。これらのデータから、ＲＡＳＭＣにお
けるＳＮＰが仲介するアポプトシスメカニズムでのＢｃ
ｌ−２／チトクロームｃ／カスパーゼ−３のシグナル伝
達経路の調節が示される。しかしながら、化合物３は、
ＳＮＰ作用に対するこれらのアポプトシス事象をすべて
ほとんど完全に遮断した。さらに、ＯＤＱは、化合物３
が仲介する効果を顕著に逆転することから、化合物３は
ｃＧＭＰに依存する抗アポプトシス作用をすることが示
される。

【００７３】環状ヌクレオチド合成の増加および次のＰ
Ｉ３−キナーゼの活性化が様々なタイプの細胞におけ
るアポプトシス反応の防止に中心的な役割を果たすこと
が示唆された(Webster & Anwer (1998) Hepatology. 2
7: 1324-1331)。さらに、サイトカインで活性化された
メサンギウム細胞等の、細胞のタイプによっては、ｃＧ
ＭＰがＮＯによるｐ４２／４４ＭＡＰＫの活性化を調
節するかもしれないことが報告された(Callsen et al.
(1998) J Immunol. 161: 4852-4858)。また、ＰＤ９８
０５９ではなくウォートマニンが化合物３が仲介する効
果を逆転することが上記で示された。さらに、Ａｋｔリ
ン酸化は化合物３の存在下で顕著に誘導されたが、この
作用はＯＤＱによって減少した。これらの結果から、Ｐ
Ｉ３−キナーゼは化合物３の適用後のｓＧＣ活性化の
下流のエフェクターであり、抗アポプトシスメカニズム
にかかわりがあることが示唆される。これに対して、ｐ
４２／４４ＭＡＰＫ経路はＲＡＳＭＣにおいて化合物
３が仲介する生存に関連しない。興味深いことに、統計
学的に有意ではないものの、化合物３は単独でＲＡＳＭ
Ｃにおいて細胞数の適度な増加（１１％、表１）を誘導
した。ＯＤＱ及びＰＤ９８０５９は双方とも、ｓＧＣ及
びｐ４２／４４ＭＡＰＫ活性の関係を伴うこの化合物
３が誘導する細胞増殖を完全に阻害した。

【００７４】この研究から、ＰＫＣ活性化の抗アポプト
シスの役割が示された。しかしながら、データからは、
選択的なＰＫＣ阻害剤である、Ｒｏ−３１８２２０は化
合物３が仲介する抗アポプトシス作用にほとんど影響を
及ぼさない（１０７．１±３．１％対１００．６±５．
５％化合物３＋ＳＮＰ群の細胞生存率、Ｐ＝０．３
２、ｎ＝７）ことが示され、これから、化合物３の作用
にはＰＫＣ活性は無関係であることが示唆される。

【００７５】マウスにおけるＬＰＳで誘導される敗血症
の防止に関する化合物３の効果が示された。特に、化合
物３の処置後を行なった。データから、ＬＰＳで処置さ
れたマウスにおいて死亡率の有意な減少が示される。ま
た、肺不全が敗血症による死の最も顕著な原因の一つで
あることが示唆されるため、肺の組織を試験した。組織
学的試験に基づいた結果から、動物は、ＬＰＳ投与後、
血管の損傷および肺組織における循環からの血液細胞の
多量の漏れを示したことが示された。さらに、化合物３
処置後のマウス群は、血液細胞の浸潤なく完全な血管を
示し、さらに一般と同様に活発であった。

【００７６】他の生理学的な活性に関する化合物３の効
果をも測定した。従来では、化合物３は、シクロオキシ
ゲナーゼ活性の阻害を示さなかった(Ko et al. (1994)
Blood. 84: 4226-4233)。また、化合物３は、ＮＲ８３
８３マクロファージにおけるＬＰＳ／インターフェロン
−γで誘導される腫瘍壊死因子−αの放出（コントロー
ルの１５．５±１．３ｎｇ／ｍＬに比べて１８．５±
１．２ｎｇ／ｍＬ、Ｐ＝０．１３、ｎ＝４）およびキサ
ンチン／キサンチンオキシダーゼ系から形成されるスー
パーオキシドアニオンによるチトクロームｃの還元（コ
ントロールの４２．０±２．１％に比べて４０±０．６
％、Ｐ＝０．４、ｎ＝４）にはほとんど阻害を示さなか
った。さらに、化合物３の遊離ラジカル捕捉活性を、安
定したラジカルである１，１−ジフェニル−２−ピクリ
ルヒドラジル(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)を用い
て試験した。化合物３は、遊離ラジカル捕捉活性をほと
んど示さなかった（データ示さず）。他の実験では、Ｌ
ＰＳによるマウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７
細胞の２４時間の刺激後、ＮＯの顕著な形成が観察され
た。にもかかわらず、化合物３は、本研究ではこのＬＰ
Ｓで誘発される効果に影響を与えなかった（コントロー
ルの６８．８±１３．４ｍｏｌ／Ｌ亜硝酸塩に比べて
５３．４±１２．３ｍｏｌ／Ｌ亜硝酸塩、Ｐ＝０．４
３、ｎ＝４）。これらの結果から、化合物３は、ＮＯ形
成に関する抗炎症、抗酸化、及び抗ＬＰＳ作用の活性を
ほとんど発揮しないことが示され、化合物３が仲介する
動物の生存に関するこれらの効果の寄与が除外される。
したがって、上記考察に基づいて、化合物３は、マウス
の敗血症による死に関する抗アポプトシス効果の重要な
役割を有する。

【００７７】

【表１】

【００７８】上記表１において、データは、５〜７実験
の平均値±ＳＥＭとして表わし、ｎは、各実験の数を表
わす。また、上記表１中の略称は、下記のとおりであ
る。＊：コントロールに比してＰ＜０．００１；＋：Ｓ
ＮＰ単独に比してＰ＜０．００１；＃：ＳＮＰ＋化合物
３に比してＰ＜０．０１。

【００７９】本明細書中に開示されるすべての態様は、
組み合わせてもよい。本明細書中に開示される各態様
は、別の態様に置き換えて、同様の、等価の、または類
似の目的を機能してもよい。ゆえに、特記しない限り、
開示される各態様は、一連の等しいまたは類似の態様の
例であるのみである。

【００８０】上記説明から、当業者は、本発明の本質的
な特徴を容易に確認でき、本発明の精神及び概念から逸
脱しない限り、本発明の様々な変更や修飾を行なって、
これを様々な用途及び症状に適用できる。例えば、融合
ピラゾリル化合物に構造が類似する化合物を本発明の実
施に使用していもよい。したがって、他の実施態様もま
た特許請求の範囲に包含される。

【００８１】本発明の他の態様、目的および利点は、本
明細書の記載及び図面、さらには特許請求の範囲から明
らかであろう。

【００８２】

【発明の効果】上述したように、本発明によると、上記
式（Ｉ）の化合物を含む薬剤組成物は、敗血症の処置お
よび血管細胞のアポプトシスの阻害に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】は、ＬＰＳで誘導される敗血症のマウスの生存
に関する化合物３の投与による効果を示すグラフであ
る。図中、実線は、ベヒクルを示し、長い点線は、ＬＰ
Ｓを注射してから２時間後の化合物３の投与を示し、短
い点線は、ＬＰＳを注射してから６時間後の化合物３の
投与を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｄ 231/56 Ｃ０７Ｄ 231/56 Ｂ 405/04 405/04 491/056 491/056 495/04 １０３ 495/04 １０３ (71)出願人 503032809 12Ｆ， 181，Ｓｅｃ．３，Ｍｉｎ −ＣｈｕａｎＥ．Ｒｏａｄ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ (72)発明者テング，チェ−ミン台湾，タイペイ，シグ−ウエイロードナンバー 100 (72)発明者パン，シオウ−リン台湾，タイペイ，セクション４，シン− イロード，レイン 265，ナンバー 28, ３エフ−１ (72)発明者グー，ジー−フワ台湾，タイペイ，ウ−シンロード，レイン 394，ナンバー 60，ビー１ (72)発明者クオ，シェン−チュ台湾，タイチュン，タイユアンロード, セクション３，レイン 352，ナンバー 67 (72)発明者リー，ファン−ユアン台湾，タチアタイチュン，チュンシャンロード，セクション１，ナンバー 1191 Ｆターム(参考） 4C050 AA01 AA08 BB05 CC17 EE02 FF01 GG03 HH02 4C063 AA01 BB01 CC75 DD22 EE01 4C071 AA01 BB01 CC02 CC21 DD40 EE13 FF04 GG03 JJ06 LL01 4C086 AA01 AA02 BC37 CB22 CB27 GA02 GA07 MA01 MA04 MA13 MA17 MA22 MA23 MA28 MA31 MA35 MA37 MA41 MA43 MA52 MA56 MA58 MA59 MA60 MA63 MA66 NA14 ZA36 ZB21 ZB35 ZC41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有効量の下記式（Ｉ）: 【化１】ただし、Ａは、水素、炭素原子数１〜６のアルキル、ま
たは下記式：【化２】で表わされる基を表わし、この際、ｎは、０、１、２、
または３であり；Ａｒ₁、Ａｒ₂、及びＡｒ₃は、独立し
て、フェニル、ピリジニル、チエニル、フリル、または
ピロリルを表わし；さらにＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、
及びＲ₆は、独立して、ＸＹＺを表わす；またはＲ ₁及び
Ｒ₂が一緒に、Ｒ₃及びＲ₄が一緒に、若しくはＲ₅及びＲ
₆が一緒に、Ｏ（ＣＨ₂）_mＯ（この際、ｍは、１〜６の
整数である）を形成し；この際、Ｘは、結合子または炭
素原子数１〜６のアルキレンであり、Ｙは、結合子、
Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ₂）_mＣ（Ｏ）Ｏ
（この際、ｍは、１〜６の整数である）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、
Ｃ（Ｏ）Ｓ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＣ₁〜Ｃ₆アルキ
ル、ＮＨ、またはＮＣ₁〜Ｃ₆アルキルであり、およびＺ
は、水素、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ ₂、または炭素原子数
１〜６のアルキルであり；かつ、Ｒ₃及びＲ₄の少なくと
も一方は水素ではない、で表わされる化合物を含む、敗
血症の処置に使用される薬剤組成物。
【請求項２】Ａは水素である、請求項１に記載の薬剤
組成物。
【請求項３】Ａｒ₁はフェニルである、請求項２に記
載の薬剤組成物。
【請求項４】Ａｒ₂はフェニルである、請求項３に記
載の薬剤組成物。
【請求項５】Ｒ₁及びＲ₂は水素である、請求項４に記
載の薬剤組成物。
【請求項６】Ａｒ₂はフリルである、請求項３に記載
の薬剤組成物。
【請求項７】Ｒ₁及びＲ₂は水素である、請求項６に記
載の薬剤組成物。
【請求項８】Ａは下記式：【化３】ただし、Ａｒ₃、Ｒ₅、Ｒ₆及びｎは、式（Ｉ）における
定義と同様である、で表わされる、請求項１に記載の薬
剤組成物。
【請求項９】Ａｒ₁はフェニルである、請求項８に記
載の薬剤組成物。
【請求項１０】Ａｒ₂はフェニルである、請求項９に
記載の薬剤組成物。
【請求項１１】Ａｒ₃はフェニルである、請求項１０
に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】ｎは０または１である、請求項１１に
記載の薬剤組成物。
【請求項１３】Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、及びＲ₆の
一は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル、ＣＨ₂Ｏ
Ｈ、ＣＮ、ＮＯ₂、またはハロゲンである、請求項１２
に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】Ａｒ₂はフリルである、請求項９に記
載の薬剤組成物。
【請求項１５】Ａｒ₃はフェニルである、請求項１４
に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】ｎは０または１である、請求項１５に
記載の薬剤組成物。
【請求項１７】Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、及びＲ₆の
一は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル、ＣＨ₂Ｏ
Ｈ、ＣＮ、ＮＯ₂、またはハロゲンである、請求項１６
に記載の薬剤組成物。
【請求項１８】Ａｒ₃はフェニルである、請求項９に
記載の薬剤組成物。
【請求項１９】ｎは０または１である、請求項９に記
載の薬剤組成物。
【請求項２０】Ａｒ₁はチエニルである、請求項８に
記載の薬剤組成物。
【請求項２１】Ａｒ₂はフリルである、請求項２０に
記載の薬剤組成物。
【請求項２２】Ａｒ₃はフェニルである、請求項２１
に記載の薬剤組成物。
【請求項２３】ｎは０または１である、請求項２２に
記載の薬剤組成物。
【請求項２４】Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、及びＲ₆の
一は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−Ｃ₁〜Ｃ₆アルキル、ＣＨ₂Ｏ
Ｈ、ＣＮ、ＮＯ₂、またはハロゲンである、請求項２３
に記載の薬剤組成物。
【請求項２５】該化合物は、下記式：【化４】である、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項２６】下記式（Ｉ）: 【化５】ただし、Ａは、水素、炭素原子数１〜６のアルキル、ま
たは下記式：【化６】で表わされる基を表わし、この際、ｎは、０、１、２、または３であり；Ａｒ₁、
Ａｒ₂、及びＡｒ₃は、独立して、フェニル、ピリジニ
ル、チエニル、フリル、またはピロリルを表わし；さら
にＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、及びＲ₆は、独立して、Ｘ
ＹＺを表わす；この際、Ｘは、結合子または炭素原子数
１〜６のアルキレンであり、Ｙは、結合子、Ｏ、Ｓ、Ｏ
Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ₂）_mＣ（Ｏ）Ｏ（この際、
ｍは、１〜６の整数である）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）
Ｓ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＣ₁〜Ｃ₆アルキル、Ｎ
Ｈ、またはＮＣ₁〜Ｃ₆アルキルであり、Ｚは、水素、ハ
ロゲン、ＣＮ、ＮＯ₂、または炭素原子数１〜６のアル
キルである；またはＲ₁及びＲ₂が一緒に、若しくはＲ₅
及びＲ₆が一緒に、Ｏ（ＣＨ₂）_mＯ（この際、ｍは、１
〜６の整数である）を形成し；さらに、Ｘは、炭素原子
数１〜６のアルキレンでなければならない場合には、Ｙ
は、ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ₂）_mＣ（Ｏ）Ｏ（この際、ｍは、
１〜６の整数である）でなければならず、かつＺは、Ｒ
₃及びＲ₄の一方では水素または炭素原子数１〜６のアル
キルでなければならない、で表わされる化合物。
【請求項２７】Ａは下記式：【化７】ただし、Ａｒ₃、Ｒ₅、Ｒ₆及びｎは、式（Ｉ）における
定義と同様である、で表わされる、請求項２６に記載の
化合物。
【請求項２８】Ａｒ₁はフェニルである、請求項２７
に記載の化合物。
【請求項２９】Ａｒ₂はフリルである、請求項２８に
記載の化合物。
【請求項３０】Ａｒ₃はフェニルである、請求項２９
に記載の化合物。
【請求項３１】Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₅、及びＲ₆は水素であ
る、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】Ｒ₃及びＲ₄の一方は水素である、請求
項３１に記載の化合物。
【請求項３３】ｎは０または１である、請求項３２に
記載の化合物。
【請求項３４】ＸはＣＨ₂であり、ＹはＯＣ（Ｏ）Ｃ
Ｈ₂ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）Ｏであり、およびＺはＲ₃及びＲ₄の他
方では水素である、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】有効量の下記式（Ｉ）: 【化８】ただし、Ａは、水素、炭素原子数１〜６のアルキル、ま
たは下記式：【化９】で表わされる基を表わし、この際、ｎは、０、１、２、または３であり；Ａｒ₁、
Ａｒ₂、及びＡｒ₃は、独立して、フェニル、ピリジニ
ル、チエニル、フリル、またはピロリルを表わし；さら
にＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、及びＲ₆は、独立して、Ｘ
ＹＺを表わす；またはＲ ₁及びＲ₂が一緒に、Ｒ₃及びＲ₄
が一緒に、若しくはＲ₅及びＲ₆が一緒に、Ｏ（ＣＨ₂）_m
Ｏ（この際、ｍは、１〜６の整数である）を形成し；こ
の際、Ｘは、結合子または炭素原子数１〜６のアルキレ
ンであり、Ｙは、結合子、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ
（Ｏ）（ＣＨ₂）_mＣ（Ｏ）Ｏ（この際、ｍは、１〜６の
整数である）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、Ｃ（Ｏ）Ｎ
Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＣ₁〜Ｃ₆アルキル、ＮＨ、またはＮＣ₁
〜Ｃ₆アルキルであり、およびＺは、水素、ハロゲン、
ＣＮ、ＮＯ ₂、または炭素原子数１〜６のアルキルであ
り；かつ、Ｒ₃及びＲ₄の一方は水素ではない、で表わさ
れる融合ピラゾリル化合物を含む、血管細胞のアポプト
シスの阻害に使用される薬剤組成物。