JP2003286189A

JP2003286189A - 中空ナノ粒子を形成するタンパク質に疾患治療用の細胞導入物質を融合させた薬剤

Info

Publication number: JP2003286189A
Application number: JP2002097280A
Authority: JP
Inventors: Shunichi Kuroda; 俊一黒田; Katsuyuki Tanizawa; 克行谷澤; Akihiko Kondo; 昭彦近藤; Masakazu Ueda; 政和上田; Shoji Senoo; 昌治妹尾; Hiroko Tada; 宏子多田
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2002-03-29
Publication date: 2003-10-07
Also published as: WO2003082345A1; KR100686356B1; KR20040097249A; US20090011036A1; US20050181064A1; EP1491216A1

Abstract

(57)【要約】【課題】タンパク質中空ナノ粒子を用いた目的の細胞
や組織に特異的に作用する疾患治療用薬剤であって、粒
子内部にタンパク質薬剤を効率よく包含させることがで
きる薬剤、およびこの薬剤を用いた治療方法を提供す
る。【解決手段】肝細胞などの特定の細胞に対する認識能
を有し、粒子形成能を有するタンパク質（たとえば、Ｂ
型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質）からなる中空ナノ
粒子において、当該タンパク質に疾患治療用の細胞導入
物質（たとえばインターフェロンまたは肝細胞成長因子
など）が融合されてなる薬剤である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、中空ナノ粒子を形
成するタンパク質に疾患治療用の細胞導入物質が融合さ
れてなる薬剤に関し、より詳細には、粒子内部に疾患治
療用の細胞導入物質を包含し、この細胞導入物質を特定
細胞または組織内に特異的に導入可能な薬剤に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】近年、医学の分野において、患部に直接
作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛
んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム
（ＤＤＳ）と呼ばれる方法は、目的細胞、あるいは、目
的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目
的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として
注目されている。

【０００３】目的細胞、あるいは、目的組織に対して特
異的に薬剤となるタンパク質を送り込む方法としては、
従来、当該タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれ
た発現ベクターをエレクトロポレーション法等により目
的細胞に導入して、この遺伝子を細胞内で発現させるこ
とによりタンパク質薬剤を細胞内に送り込むいわゆる遺
伝子導入方法が開発されてきた。しかし、このような従
来の遺伝子導入方法は、いずれも、目的細胞、あるい
は、目的組織に対して特異的にタンパク質薬剤を送り込
む方法としては不十分なものであった。他方、薬剤とな
るタンパク質を直接的に目的細胞、あるいは、目的組織
に送り込む方法については、未だ有効な方法が開発され
ていないのが現状である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】以上のような状況に鑑
み、本発明者らは、国際公開番号ＷＯ０１／６４９３０
の国際出願（以下、「国際出願ＷＯ０１／６４９３０」
という）において、粒子形成能を有するタンパク質に生
体認識分子が導入された中空ナノ粒子を用いて、目的と
する細胞や組織に、物質（遺伝子、タンパク質、化合物
等）を特異的かつ安全に運搬、導入するための方法を提
案しているが、この方法を応用しつつ目的細胞または組
織に対して特異的に送り込むことができるタンパク質薬
剤の開発等が以下のような問題を克服する上からも更な
る課題となっていた。

【０００５】従来、タンパク質薬剤を、目的とする細胞
や組織に特異的かつ安全に運搬、導入することが困難で
あったため、タンパク質薬剤を用いた治療は患者に大き
な負担を与えていた。

【０００６】例えば、ウィルス性肝炎(特にＣ型肝炎)の
治療には、静脈注射により、タンパク質薬剤であるイン
ターフェロンを長期間全身投与する方法をとっている。
この方法は、高い治療効果が認められるものの、患部以
外にもインターフェロンが作用するため、投与のたびに
高熱、脱毛、虚脱感、免疫反応などの副作用がおきると
いう問題を有している。

【０００７】また、肝細胞成長因子は肝硬変治療に有効
であることが分かっているが、静脈注射で全身投与する
と、予測できない副作用が起こる可能性があるので、カ
テーテルにより肝臓に直接投与する方法を採用してい
る。しかし、カテーテルによる投与のためには、手術が
必要であり、長期間の治療では患者に負担がかかってい
た。

【０００８】本発明は、上記の課題に鑑みなされたもの
であり、その目的は、タンパク質中空ナノ粒子を用いた
目的の細胞や組織に特異的に作用する疾患治療用薬剤で
あって、粒子内部にタンパク質薬剤を効率よく包含させ
ることができる薬剤、およびこの薬剤を用いた治療方法
を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意検討
を重ねた結果、粒子を形成するタンパク質と、疾患治療
用のタンパク質薬剤（細胞導入物質）とが融合されたタ
ンパク質を発現するベクターを作製し、このベクターを
用いて薬剤となる粒子を製造することにより、粒子内部
にタンパク質薬剤を効率よく包含させることができるこ
とを見出し、本発明を完成させるに至った。

【００１０】即ち、本発明に係る薬剤は、特定の細胞
（たとえば肝細胞など）に対する認識能を有し、粒子形
成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子におい
て、当該タンパク質に疾患治療用の細胞導入物質が融合
されてなる薬剤である。

【００１１】上記「粒子形成能を有するタンパク質」と
しては、たとえばＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質
を挙げることができる。このタンパク質は、真核細胞で
発現させると、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、
蓄積され、粒子として放出される。本発明の薬剤は、こ
のような粒子形成能を有するタンパク質をコードする遺
伝子と、その下流側に上記細胞導入物質（換言すれば、
タンパク質薬剤）をコードする遺伝子とを含むベクター
によって真核細胞（たとえば哺乳類等の動物細胞、酵母
または昆虫細胞）を形質転換させ、当該真核細胞に遺伝
子発現させることにより、当該タンパク質に細胞導入物
質を融合させたかたちで粒子として製造することができ
る。

【００１２】このように、粒子を形成するタンパク質に
疾患治療用の細胞導入物質が融合したかたちで粒子が形
成されるので、粒子形成の際、あわせて粒子内部に細胞
導入物質を包含させることができ、粒子形成後に後工程
で粒子内部に細胞導入物質を導入するといった工程が不
要になり、薬剤の製造が容易になる。さらに、粒子形成
後に粒子内部に導入することが困難な巨大分子等でも、
粒子内部に効率よく包含させることが可能になる。

【００１３】上記Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質
を用いて形成された粒子は、肝細胞を認識し、肝細胞に
対して特異的に粒子内の物質を運搬することができるの
で、肝臓疾患治療用の物質（タンパク質薬剤）を包含さ
せることにより、肝細胞に対して特異的かつ効果的に作
用する有効な治療薬となる。この場合、粒子内部に包含
させる物資としては、たとえばインターフェロン（ＩＦ
Ｎ）または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）等のタンパク質薬
剤を挙げることができる。ＩＦＮは、ウィルス性肝炎の
治療薬として用いられており、ＨＧＦは肝硬変に冒され
た肝臓を再生させる効果がある。これらを粒子内部に包
含させることで、肝細胞特異的に導入することができ、
有効で副作用の少ない肝炎治療または肝硬変治療を行う
ことができる。

【００１４】また、たとえば上記Ｂ型肝炎ウィルス表面
抗原タンパク質を、本来の肝細胞に対する感染能を欠失
するように改変し、さらに増殖因子や抗体を提示するよ
うに改変し、このように改変されたＢ型肝炎ウィルス表
面抗原タンパク質を用いて粒子を形成することで、肝細
胞以外の特定の細胞に対して特異的に粒子内の物質を運
搬することができる。たとえば、ある癌細胞を特異的に
認識する抗体を提示させることで、その癌細胞を認識
し、その癌細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬す
ることができる。

【００１５】本発明の薬剤は、静脈注射という簡便な方
法で特定の細胞または組織における疾患を効果的に治療
することができ、従来の治療方法と大きく異なり、多量
の薬剤の投与あるいは遺伝子治療等における外科手術を
必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床
応用可能なものである。

【００１６】本発明の治療方法は、本発明の薬剤を投与
することによる疾患の治療方法である。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明の薬剤を構成する中空ナノ
粒子は、粒子形成能を有するタンパク質に細胞導入物質
が融合されてなるものであるが、その粒子形成能を有す
るタンパク質に生体認識分子（換言すれば、特定の細胞
を認識する分子）を導入することによって、目的細胞あ
るいは目的組織に特異的に物質を運搬することができ
る。このような粒子形成能を有するタンパク質として
は、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を適
用することができる。具体的には、Ｂ型肝炎ウィルス
（Hepatitis B Virus:ＨＢＶ）表面抗原タンパク質等が
例示される。

【００１８】また、このような粒子形成能を有するタン
パク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞でタ
ンパク質を発現させることにより得られるものが挙げら
れる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク
質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タ
ンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される
のである。このとき、真核細胞としては、哺乳類等の動
物細胞、酵母、昆虫細胞等が適用できる。

【００１９】本発明者らは、後述の実施例に示すとお
り、遺伝子組換え酵母で上記ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク
質を発現させることにより、発現されたＨＢＶ表面抗原
Ｌタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タン
パク質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎ
ｍの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告し
ている（J. Biol. Chem., Vol.267, No.3, 1953-1961,
1992）。このような粒子は、ＨＢＶゲノムを全く含まな
いので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が
極めて高い。また、ＨＢＶの肝細胞への極めて高い感染
力を担う肝細胞特異的レセプターを粒子表面に提示して
いるため、肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬
体としての効果も高いのである。

【００２０】このように遺伝子組換え酵母を用いてタン
パク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク
質から高効率で粒子が生産される点で好適である。

【００２１】一方、昆虫細胞は、酵母よりも高等動物に
近い真核細胞であるといえ、酵母では再現しきれない糖
鎖等の高次構造をも再現できる点で異種タンパク質の大
量生産において好ましい方法といえる。従来の昆虫細胞
の系はバキュロウイルスを用いた系で、ウィルス発現を
伴うものであったために、タンパク質発現に際して細胞
が死滅したり溶解したりした。その結果、タンパク質発
現を連続的に行ったり、死滅細胞から遊離したプロテア
ーゼによりタンパク質が分解したりするという問題があ
った。また、タンパク質を分泌発現させる場合には、培
地中に含まれる大量の牛胎仔血清が混入することで、折
角培地中に分泌されても精製が困難であった。しかし、
最近になって、バキュロウイルスを介さない昆虫細胞系
で、無血清培養可能なものがInvitrogen社により開発さ
れ、市販されている。従って、このような昆虫細胞を用
いれば、精製が容易で高次構造をも再現されたタンパク
質粒子が得られる。本発明のタンパク質中空ナノ粒子で
は、以上のような種々の方法によって得られた粒子表面
のレセプターを任意の生体認識分子に改変することによ
り、肝細胞以外にも、任意の細胞及び組織に極めて高い
特異性で物質を運搬、導入することが可能となる。

【００２２】もちろん、粒子形成能を有するタンパク質
は、上記のＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に限ら
れるものではなく、粒子を形成することができるタンパ
ク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植
物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質
や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例え
ばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗
体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性
を減少させたものを粒子形成能を有するタンパク質とし
て用いてもよい。例えば、粒子形成能を有するタンパク
質としては、国際出願ＷＯ０１／６４９３０に開示され
る抗原性を減少させたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパ
ク質であってもよいし、同国際出願に開示されるその他
の改変型タンパク質（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパ
ク質を、遺伝子操作技術を用いて改変したタンパク質）
であってもよい。また、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タン
パク質や同タンパク質を改変した改変型タンパク質に、
さらに増殖因子や抗体などの他のタンパク質を付加した
ものを、粒子形成能を有するタンパク質として用いても
よい。粒子形成能を有するタンパク質に導入される生体
認識分子（粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分
子が含まれる場合と、粒子形成能を有するタンパク質に
生体認識分子を融合（または直接間接に結合）させる場
合とを両方含む）としては、たとえば成長因子、サイト
カイン等の細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異
的抗原、レセプターなどの細胞および組織を識別するた
めの分子、ウィルスおよび微生物に由来する分子、抗
体、糖鎖、脂質などが好ましく用いられる。具体的に
は、癌細胞に特異的に現れるＥＧＦ受容体やＩＬ−２受
容体に対する抗体やＥＧＦ、またＨＢＶの提示するレセ
プターも含まれる。これらは、目的とする細胞、あるい
は組織に応じて適宜選択される。なお、ここで「生体認
識分子」とは、特定の細胞を認識する分子（換言すれ
ば、特定の細胞に対する認識能を本発明の薬剤に付与す
る分子）のことをいう。

【００２３】本発明では、以上のとおりのタンパク質中
空ナノ粒子を、粒子形成能を有するタンパク質に、目的
細胞または目的組織に導入したい物質（細胞導入物質）
を融合させたかたちで形成することによって、特定の細
胞に対して特異性を有する物質運搬体が得られる。この
物質運搬体に内包される細胞導入物質としては、前述の
ように、インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦ
Ｎωなど）または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）等のタンパ
ク質薬剤（ペプチドを含む）を挙げることができ、さら
に下記表１に示す物質を挙げることができる。

【００２４】

【表１】

【００２５】粒子形成能を有するタンパク質に細胞導入
物質を融合させる方法としては、後述の実施例に示すと
おり、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を
コードする遺伝子と、その下流側に上記タンパク質薬剤
をコードする遺伝子とが挿入されたプラスミドを作製
し、このプラスミドを用いて真核細胞に粒子を形成させ
ることによって、粒子を形成するＢ型肝炎ウィルス表面
抗原タンパク質にタンパク質薬剤が融合した本発明の薬
剤を製造することができる（図１参照）。

【００２６】以上のように作製された本発明の薬剤は、
特定の細胞に対して特異的に薬剤を送り込むものとして
有用である。例えば、本発明の薬剤として、ＩＦＮが融
合したＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなる粒
子を静脈注射などによって体内に投与すれば、当該粒子
は体内を循環し、粒子表面に提示した肝細胞特異的レセ
プターにより肝細胞に導かれ、感染する。そして、ＩＦ
Ｎが肝細胞中に送り込まれ、ＩＦＮの肝臓組織特異的な
導入が行われる。なお、薬剤の投与方法としては、静脈
注射による投与のほかに、経口投与、筋肉内投与、腹腔
内投与、皮下投与等が挙げられる。

【００２７】従来、インターフェロン、インターロイキ
ンなどのタンパク質薬剤は、副作用が強く、全身投与を
行うと患者の負担となるため、目的の細胞や組織に対し
てのみ特異的に薬剤を送り込む必要があった。本発明の
薬剤は、上述のように、特定の細胞や組織に対して選択
的に薬剤を送り込むことができるので、副作用の強い薬
剤でも患者に負担をかけずに効果的に治療を行うことが
できる。

【００２８】このように、本発明の薬剤を用いれば、in
vivoあるいはin vitroで細胞、または組織に特異的に
物質を導入することができ、特定細胞または組織に物質
を導入することを各種疾患の治療法あるいは治療法の１
ステップとして行うことも可能になるのである。

【００２９】以下、添付した図面に沿って実施例を示
し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明す
る。もちろん、この発明は以下の例に限定されるもので
はなく、細部については様々な態様が可能であることは
言うまでもない。

【００３０】

【実施例】以下の実施例において、ＨＢｓＡｇとは、Ｂ
型肝炎ウィルス表面抗原（Hepatitis B virus surface
Antigen）を示す。ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶの外被タンパ
ク質であり、図２の摸式図に示すように、ＨＢｓＡｇに
は、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質の３種
類がある。このうち、Ｓタンパク質は、３種のタンパク
質に共通した、重要な外被タンパク質であり、Ｍタンパ
ク質は、Ｓタンパク質のＮ末端側に５５アミノ酸（pre-
S2 peptide）が付加したものである。また、Ｌタンパク
質は、Ｍタンパク質のＮ末端側に、１０８もしくは１１
９アミノ酸（pre-S1 peptide）が付加したものである。

【００３１】ＨＢｓＡｇＬタンパク質のPre-S領域（pr
e-S1, pre-S2）は、ＨＢＶが肝細胞を認識して結合する
際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている。
Pre-S1は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、pre-S2
は、血中の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重
合アルブミンレセプターを有するのである。

【００３２】真核細胞でＨＢｓＡｇを発現させると、同
タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、
蓄積される。ＨＢｓＡｇのＬタンパク質は、分子間で凝
集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でル
ーメン側に粒子として放出される。

【００３３】以下の実施例では、ＨＢｓＡｇのＬタンパ
ク質を用いた。また、図３に以下の実施例に記載される
ＨＢｓＡｇ粒子の発現および精製操作の概略説明図を示
した。

【００３４】（実施例Ａ）遺伝子組換え酵母によるＨ
ＢｓＡｇ粒子の発現本発明者らによって報告されたJ.Biol.Chem., Vol.267,
No.3, 1953-1961, 1992記載の方法に基づいて、ｐＧＬ
ＤＬIIＰ３９−ＲｃＴを保持した遺伝子組換え酵母（Sa
ccharomyces Cerevisiae AH22R^-株）を、合成培地High-
Piおよび8S5N-P400中で培養し、ＨＢｓＡｇＬタンパク
質粒子を発現させた。（図３ａ〜ｃ）定常成長期（約７
２時間後）にある遺伝子組換え酵母から、Yeast Protei
n Extraction Reagent（Pierce Chemical Co.製）を用
いて、whole cell extractを準備し、ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）を用いて分離して、銀染色によって試料中のＨ
ＢｓＡｇの同定を行った。

【００３５】これより、ＨＢｓＡｇは分子量約５２ｋＤ
ａのタンパク質であることが明らかとなった。

【００３６】（実施例Ｂ）ＨＢｓＡｇ粒子の遺伝子組
換え酵母からの精製（１）合成培地８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００で培養された遺伝子
組換え酵母（湿重量２６ｇ）をbuffer A溶液（７．５Ｍ
尿素、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５
ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＰＭＳＦ、０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ８０）１００ｍｌに懸濁し、グラスビーズを用いてビ
ードビーター（BEAD-BEATER）にて酵母を破砕した。破
砕後、上清を遠心分離により回収した。（図３ｃ、ｄ）（２）次に、上清を０．７５倍容の３３％（ｗ／ｗ）Ｐ
ＥＧ６０００と混合し、３０分間氷冷した。その後、遠
心分離（７０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、ペレット
を回収した。同ペレットは、Ｔｗｅｅｎ８０を含まない
buffer A溶液中で再懸濁した。

【００３７】（３）再懸濁した液を、１０〜４０％の勾
配をかけたＣｓＣｌに重層し、２８０００ｒｐｍ、１６
時間の超遠心分離を行った。遠心分離後の試料を１２画
分に分け、ウェスタンブロット法（Western Blotting）
（１次抗体は、ａｎｔｉ−ＨＢｓＡｇモノクローナル抗
体）によりＨＢｓＡｇを含む画分を同定した。さらに、
ＨＢｓＡｇを含む画分をＴｗｅｅｎ８０を含まないbuff
er A溶液で透析した。

【００３８】（４）（３）で得られた透析液（１２ｍ
ｌ）を５〜５０％の勾配をかけたショ糖に重層し、２８
０００ｒｐｍ、１６時間の超遠心分離を行った。遠心分
離後、（３）と同様に、ＨＢｓＡｇを含む画分を同定
し、ＨＢｓＡｇを含む画分を尿素とＴｗｅｅｎ８０は含
まず、代わりに０．８５％のＮａＣｌを含むbuffer A溶
液で透析した。（（２）〜（４）：図３ｅ）（５）（４）と同様の操作を繰り返し、透析後の試料を
ウルトラフィルター（Ultra Filter）Ｑ２０００（ア
ドバンテック社製）を用いて濃縮し、使用する時まで４
℃にて冷蔵保存した。（図３ｆ）ＣｓＣｌ平衡遠心分離後のウェスタンブロット（３）の
結果から、ＨＢｓＡｇは、分子量５２ｋＤａでＳ抗原性
を有するタンパク質であることが分かった。最終的に、
培地２．５Ｌ由来、湿重量２６ｇの菌体から、約２４ｍ
ｇの精製ＨＢｓＡｇ粒子を得た。

【００３９】一連の精製過程における画分を銀染色ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで解析した。また、精製により酵母由来の
プロテアーゼが除去されていることを確認するために、
（５）で得られたＨＢｓＡｇ粒子を３７℃で１２時間イ
ンキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色
により同定を行った。

【００４０】その結果、酵母由来のプロテアーゼは、一
連の精製過程において完全に除去されていることが確認
された。

【００４１】（実施例Ｃ）ＨＢｓＡｇにＥＧＦＰが融
合した粒子の作製（１）ＥＧＦＰとＨＢｓＡｇとの融合タンパク質を発現
するプラスミドの作製（図４参照）前述のＨＢｓＡｇ発現プラスミドｐＧＬＤＬIIＰ３９−
ＲｃＴをXhoIおよびAccIにより切断することで、ニワト
リリゾチーム分泌シグナルに融合されたＨＢＶｓＡｇＬ
タンパク質をコードする遺伝子断片（以下、ＨＢｓＡｇ
遺伝子と称する）が切り出される。このとき、ＨＢｓＡ
ｇ遺伝子の上流側がXhoIに切断され、下流側がAccIに切
断される。

【００４２】一方、プラスミドpEGFP-N1（pEGFP-F（Clo
ntech社））は、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰをコード
する遺伝子断片を有している。このプラスミドpEGFP-N1
をXhoIおよびAgeIにより切断して開裂させておく。この
とき、プラスミドはＥＧＦＰ遺伝子とプロモーター（Ｃ
ＭＶＩＥ）との間で開裂し、ＥＧＦＰ遺伝子の上流側が
AgeIに切断され、プロモーターの下流側がXhoIに切断さ
れる。

【００４３】また、FLAG tag(NH2-YIDYKDDDDKI-COOH)
は、公知のタンパク質であるが、ＨＢｓＡｇとＥＧＦＰ
融合タンパク質の間に挟むことで、抗FLAG抗体によって
融合タンパク質を検出できる。FLAG tagを発現させるた
め、センス側が配列番号２のオリゴヌクレオチド、アン
チセンス側が配列番号１のオリゴヌクレオチドを用意し
た。このFLAG tagをコードする合成ＤＮＡは、上流側に
は制限酵素AccIサイトを、下流側には制限酵素ＡgeＩサ
イトを有するように設計している。

【００４４】以上のＨＢＶｓＡｇ、FLAG tag、ＥＧＦＰ
発現プラスミドは、T4DNAリガーゼにより、同一の制限
酵素で切断された部位同士が結合される。これにより、
上記ＨＢＶｓＡｇ、FLAG tagがＥＧＦＰ発現プラスミド
のプロモーターとＥＧＦＰ遺伝子との間に挿入され、Ｅ
ＧＦＰとＨＢｓＡｇとの遺伝子を含むプラスミドpBOP00
1を構築した。この構築によりプラスミドのＣＭＶプロ
モーターの下流に挿入された遺伝子は、アミノ末端側か
らニワトリリゾチーム由来分泌シグナル、ＨＢＶｓＡｇ
Ｌタンパク質、FLAG tag、ＥＧＦＰタンパク質を順に融
合したタンパク質をコードする。（２）サル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞への上記プラスミ
ドの導入とその発現上記遺伝子の塩基配列を確認した後、上記プラスミドpB
OP001をアフリカミドリサル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞に
遺伝子導入装置ジーンパルサー（バイオラッド）を用い
て導入した。導入後、１×１０⁴細胞ずつ１６穴ウェル
プレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ₂存在
下で１０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変培地D-ME
Mを用いて一晩培養した。翌日、培地を無血清培地CHO-S
FMII（Gibco-BRL）に置き換えて、さらに4日間培養し、
ＣＯＳ−７細胞を含む培地を回収した。

【００４５】まず、回収した培地中に、ＨＢｓＡｇ粒子
が発現されているかを確かめた。ＩＭｘキット（ダイナ
ボット社）により、培地中のＳ抗原性を確認し培地中に
粒子が検出された。

【００４６】また、ＩＭｘのアガロースビーズに固定さ
れた一次抗体を用いて、培地中の粒子を免疫沈降し、沈
降した蛋白質に対してドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行っ
たあと、ウェスタンブロッティングを行って、抗FLAG抗
体によりタンパク質を検出すると、分子量約８０ｋＤａ
のバンドが検出され、融合タンパク質が構築どおり発現
していることを確認した。

【００４７】さらに、蛍光分光器により励起光480nmで
ＥＧＦＰの蛍光スペクトルを検出した。これにより発現
したＥＧＦＰ融合型ＨＢｓＡｇＬタンパク質がそれぞれ
の構造を維持したまま粒子を形成していることを確認し
た。（３）酵母細胞へのプラスミドの導入とその発現さらに、上記融合タンパク質を酵母細胞で発現させるた
めにプラスミドpBOP001を、EGFP遺伝子の翻訳停止コド
ンの３’側に存在する制限酵素NotIの認識部位で切断
し、大腸菌DNAポリメラーゼラージフラグメントで粘着
末端を埋め平滑末端とした。ここに、T4DNAリガーゼに
よりXhoIリンカー5'-CCTCCGAGG-3'を挿入して平滑末端
を閉環結合してプラスミドを構築した。このプラスミド
から、制限酵素XhoIを用いて上記融合タンパク質をコー
ドする部分を切り出し、プラスミドｐＧＬＤＬIIＰ３９
−ＲｃＴの持つＨＢｓＡｇＬ蛋白質遺伝子と入れ換え
てプラスミドpBOP002を構築した。これを用いて、酵母
（Saccharomyces Cerevisiae AH22R^-株）を形質転換
し、得られた遺伝子組換え酵母を、合成培地High-Piお
よび8S5N-P400中で培養し、EGFPタンパク質融合ＨＢｓ
ＡｇＬタンパク質を発現させた。

【００４８】定常成長期（約７２時間後）にある遺伝子
組換え酵母から、Yeast Protein Extraction Reagent
（Pierce Chemical Co.製）を用いて、whole cell extr
actを準備し、ＩＭｘキットによりＨＢｓＡｇのＳ抗原
性を検出した。

【００４９】また、ＩＭｘのアガロースビーズに固定さ
れた一次抗体を用いて、培地中の粒子を免疫沈降し、沈
降した蛋白質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったあと、
ウェスタンブロッティングを行って、抗FLAG M2抗体(Si
gma)によりタンパク質を検出すると、分子量約８０ｋＤ
ａのバンドが検出された。

【００５０】さらに、蛍光分光器により励起光480nmで
ＥＧＦＰの蛍光スペクトルを検出した。これにより酵母
で発現したＥＧＦＰ融合型ＨＢｓＡｇＬタンパク質がそ
れぞれの構造を維持したまま粒子を形成していることを
確認した。（４）昆虫細胞へのプラスミドの導入とその発現次に、上記pBOP002から融合蛋白をコードする遺伝子のX
hoI断片を切り出し、大腸菌由来DNAポリメラーゼラージ
フラグメントにより末端を平滑化し、昆虫細胞安定発現
用ベクターｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Invitrogen社）の
EcoRV部位へ挿入し閉環結合させた。塩基配列を確認し
た後、このプラスミドをpBOP003と命名した。

【００５１】一方、昆虫細胞High Five株（BTI-TN-5B1-
4：Invitrogen社）は、約１ヶ月かけて次第に牛胎仔血
清入り培地から無血清培地（Ultimate Insect Serum-Fr
ee Medium：Invitrogen社）に馴化させておいた。次
に、上記プラスミドpBOP003を遺伝子導入用脂質Insecti
n-Plus（Invitrogen社）を用いて無血清培地に馴化させ
たHigh Five株を形質転換した。その後、無血清培地で2
7℃48時間培養し、抗生物質zeocin（Invitrogen社）を4
00 μg/mL含有する無血清培地でさらに細胞がconfluent
になるまで4〜7日間培養した。

【００５２】1500×g、5分間遠心により培養上清を回収
し、ＩＭｘキット（ダイナボット社）により、培地中の
ＨＢｓＡｇ粒子の発現測定したところ、ＨＢｓＡｇ粒子
が発現していることが確認された。さらに、ＩＭｘのア
ガロースビーズに固定された一次抗体を用いて、培地中
の粒子を免疫沈降し沈降した蛋白質に対してＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行ったあと、ウェスタンブロッティングを行っ
て抗FLAG M2抗体により蛋白質を検出すると、分子量約
８０ｋＤａのバンドが検出され、融合蛋白質が構築通り
発現していることを確認した。さらに、蛍光分光器を用
いて励起光480nmでEGFPの蛍光スペクトルを検出した。
これにより発現したＥＧＦＰ融合型ＨＢｓＡｇＬタンパ
ク質がそれぞれの構造を維持したまま粒子を形成してい
ることを確認した。

【００５３】上記ＥＧＦＰ融合型ＨＢｓＡｇＬタンパク
質の遺伝子配列は配列番号１３に、そのアミノ酸配列は
配列番号１４にそれぞれ示される。

【００５４】（実施例Ｄ）ＨＢｓＡｇにヒトインター
フェロンω（ＩＦＮω）が融合した粒子の作製（１）ＩＦＮωとＨＢｓＡｇとの融合タンパク質を発現
するプラスミドの作製プラスミドpGT65-hIFN-α（InvivoGen）はＩＦＮωをコ
ードする遺伝子断片を有している。この遺伝子断片を鋳
型としてＩＦＮωをコードする遺伝子断片をＰＣＲ法に
より常法どおり増幅した。

【００５５】用いた２種類のＰＣＲプライマーは、配列
番号３と配列番号４とのオリゴヌクレオチドである。上
流側にAgeIサイトを、下流側に制限酵素NotIサイトを有
するように設計した。

【００５６】ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で分離し
た後、目的のｃＤＮＡを含むバンドを回収し、TOPO TA
Cloning kit（Invitrogen社）を用いてpCR2.1-TOPOベク
ター（Invitrogen社）にサブクローニングした。挿入し
た塩基配列を情報（pORF-hIFNa v.11製品に添付された
資料）に従って確認後、制限酵素AgeIとNotIでこのcDNA
断片を切り出し、前記プラスミドpEGFP-N1のAgeIとNotI
部位を利用してEGFP遺伝子と入れ換えてプラスミドpBOP
004を構築した。

【００５７】上記プラスミドpBOP004にFLAG tag遺伝子
およびＨＢｓＡｇ遺伝子を挿入する。挿入方法は前記実
施例Ｃの（１）に記載した方法と同様である。これによ
り、プラスミドpBOP005を構築した。この構築によりプ
ラスミドのＣＭＶプロモーターの下流に挿入された遺伝
子は、アミノ末端側からニワトリリゾチーム由来分泌シ
グナル、ＨＢＶｓＡｇＬタンパク質、FLAG tag、ＩＦＮ
ωを順に融合したタンパク質をコードする。（２）サル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞への上記プラスミ
ドの導入とその発現上記遺伝子の塩基配列を確認した後、上記プラスミドpB
OP005をアフリカミドリサル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞に
遺伝子導入装置ジーンパルサー（バイオラッド）を用い
て導入した。導入後１０％子牛胎児血清を含むダルベッ
コ改変培地を用いて一晩培養した。翌日、培地を無血清
培地CHO-SFMII（Gibco-BRL）に置き換えて、さらに4日
間培養し、ＣＯＳ−７細胞を含む培地を回収した。

【００５８】培地中のＳ抗原性をＩＭｘキット（ダイナ
ボット社）により確認し、培地中に粒子が検出された。
また、ＩＭｘのアガロースビーズに固定された一次抗体
を用いて、培地中の粒子を免疫沈降し、沈降した蛋白質
に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったあと、ウェスタンブ
ロッティングを行って、抗FLAG M2抗体によりタンパク
質を検出すると、分子量約７０ｋＤａのバンドが検出さ
れ、融合タンパク質が構築どおり発現していることを確
認した。これにより発現したＩＦＮω融合型ＨＢｓＡｇ
Ｌタンパク質がそれぞれの構造を維持したまま粒子を形
成していることを確認した。（３）酵母細胞へのプラスミドの導入とその発現さらに、上記融合タンパク質を酵母細胞で発現させるた
めにプラスミドpBOP005を、ＩＦＮω遺伝子の翻訳停止
コドンの３’側に存在する制限酵素NotIの認識部位で切
断し、大腸菌DNAポリメラーゼラージフラグメントで粘
着末端を埋め平滑末端とした。ここに、T4DNAリガーゼ
によりXhoIリンカー5'-CCTCCGAGG-3'を挿入して平滑末
端を閉環結合してプラスミドを構築した。このプラスミ
ドから、制限酵素XhoIを用いて上記融合タンパク質をコ
ードする部分を切り出し、プラスミドｐＧＬＤＬIIＰ３
９−ＲｃＴの持つＨＢｓＡｇＬ蛋白質遺伝子と入れ換
えてプラスミドpBOP006を構築した。これを用いて、酵
母（Saccharomyces CerevisiaeAH22R^-株）を形質転換
し、得られた遺伝子組換え酵母を、合成培地High-Piお
よび8S5N-P400中で培養し、ＩＦＮωタンパク質融合型
ＨＢｓＡｇＬタンパク質を発現させた。

【００５９】定常成長期（約７２時間後）にある遺伝子
組換え酵母から、Yeast Protein Extraction Reagent
（Pierce Chemical Co.製）を用いて、whole cell extr
actを準備し、ＩＭｘキットによりＳ抗原性を検出し
た。また、ＩＭｘのアガロースビーズに固定された一次
抗体を用いて、培地中の粒子を免疫沈降し、沈降した蛋
白質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったあと、ウェスタ
ンブロッティングを行って、抗FLAG M2抗体(Sigma)によ
り試料中の融合タンパク質を検出すると、分子量約７０
ｋＤａのバンドが検出された。これにより、酵母で発現
したヒトインターフェロンω融合型ＨＢｓＡｇＬタン
パク質がそれぞれの構造を維持したまま粒子を形成して
いることを確認した。（４）昆虫細胞へのプラスミドの導入とその発現次に、上記pBOP006から融合蛋白をコードする遺伝子のX
hoI断片を切り出し、大腸菌由来DNAポリメラーゼラージ
フラグメントにより末端を平滑化し、昆虫細胞安定発現
用ベクターｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Invitrogen社）の
EcoRV部位へ挿入し閉環結合させた。塩基配列を確認し
た後、このプラスミドをpBOP007と命名した。

【００６０】一方、昆虫細胞High Five株（BTI-TN-5B1-
4：Invitrogen社）は、約１ヶ月かけて次第に牛胎仔血
清入り培地から無血清培地（Ultimate Insect Serum-Fr
ee Medium：Invitrogen社）に馴化させておいた。次
に、上記プラスミドpBOP007を遺伝子導入用脂質Insecti
n-Plus（Invitrogen社）を用いて無血清培地に馴化させ
たHigh Five株を形質転換した。その後、無血清培地で2
7℃48時間培養し、抗生物質zeocin（Invitrogen社）を4
00 μg/mL含有する無血清培地でさらに細胞がconfluent
になるまで4〜7日間培養した。

【００６１】1500×g、5分間遠心により培養上清を回収
し、ＩＭｘキット（ダイナボット社）により、培地中の
ＨＢｓＡｇ粒子の発現測定したところ、ＨＢｓＡｇ粒子
が発現していることが確認された。さらに、ＩＭｘのア
ガロースビーズに固定された一次抗体を用いて、培地中
の粒子を免疫沈降し沈降した蛋白質に対してＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行ったあと、ウェスタンブロッティングを行っ
て抗FLAG M2抗体により蛋白質を検出すると、分子量約
７０ｋＤａのバンドが検出され、融合蛋白質が構築通り
発現していることを確認した。これにより発現したヒト
インターフェロンω融合型ＨＢｓＡｇＬタンパク質がそ
れぞれの構造を維持したまま粒子を形成していることを
確認した。

【００６２】上記ヒトインターフェロンω融合型ＨＢｓ
ＡｇＬタンパク質の遺伝子配列は配列番号１５に、その
アミノ酸配列は配列番号１６にそれぞれ示される。

【００６３】（実施例Ｅ）ＨＢｓＡｇにヒトインター
フェロンβ１（ＩＦＮβ１）が融合した粒子の作製（１）ＩＦＮβ１とＨＢｓＡｇとの融合タンパク質を発
現するプラスミドの作製プラスミドpCMV （Hu beta）
はＩＦＮβ１をコードする遺伝子断片を有している。こ
の遺伝子断片を鋳型としてＩＦＮβ１をコードする遺伝
子断片をＰＣＲ法により常法どおり増幅した。

【００６４】用いた２種類のＰＣＲプライマーは、セン
ス側が配列番号５のオリゴヌクレオチド、アンチセンス
側が配列番号６のオリゴヌクレオチドである。上流側に
は制限酵素AgeIサイトを、下流側には制限酵素NotIサイ
トを有するように設計した。

【００６５】ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で分離し
た後、目的のｃＤＮＡを含むバンドを回収し、TOPO TA
Cloning kit（Invitrogen社）を用いてpCR2.1-TOPOベク
ター（Invitrogen社）にサブクローニングした。挿入し
た塩基配列を情報（GenBankacceesion no. M28622）に
従って確認後、制限酵素AgeIとNotIでこのcDNA断片を切
り出し、前記プラスミドpEGFP-N1のAgeIとNotI部位を利
用してEGFP遺伝子と入れ換えてプラスミドを構築した。

【００６６】上記プラスミドにFLAG tag遺伝子およびＨ
ＢｓＡｇ遺伝子を挿入する。挿入方法は前記実施例Ｃの
（１）に記載した方法と同様である。これにより、プラ
スミドpBOP008を構築した。この構築によりプラスミド
のＣＭＶプロモーターの下流に挿入された遺伝子は、ア
ミノ末端側からニワトリリゾチーム由来分泌シグナル、
ＨＢＶｓＡｇＬタンパク質、FLAG tag、ＩＦＮβ１を順
に融合したタンパク質をコードする。（２）サル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞への上記プラスミ
ドの導入とその発現上記遺伝子の塩基配列を確認した後、上記プラスミドpB
OP008をアフリカミドリサル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞に
遺伝子導入装置ジーンパルサー（バイオラッド）を用い
て導入した。導入後１０％子牛胎児血清を含むダルベッ
コ改変培地を用いて一晩培養した。翌日、培地を無血清
培地CHO-SFMII（Gibco-BRL）に置き換えて、さらに１週
間培養し、ＣＯＳ−７細胞を含む培地を回収した。

【００６７】培地中のＳ抗原性をＩＭｘキット（ダイナ
ボット社）により確認し、培地中に粒子が検出された。
また、ＩＭｘのアガロースビーズに固定された一次抗体
を用いて、培地中の粒子を免疫沈降し、沈降した蛋白質
に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったあと、ウェスタンブ
ロッティングを行って、抗FLAG M2抗体によりタンパク
質を検出すると、分子量約７０ｋＤａのバンドが検出さ
れ、融合タンパク質が構築どおり発現していることを確
認した。これにより発現したＩＦＮβ１融合型ＨＢｓＡ
ｇＬタンパク質がそれぞれの構造を維持したまま粒子を
形成していることを確認した。（３）酵母細胞へのプラスミドの導入とその発現さらに、上記融合タンパク質を酵母細胞で発現させるた
めにプラスミドpBOP008を、ＩＦＮβ１遺伝子の翻訳停
止コドンの３’側に存在する制限酵素NotIの認識部位で
切断し、大腸菌DNAポリメラーゼラージフラグメントで
粘着末端を埋め平滑末端とした。ここに、T4DNAリガー
ゼによりXhoIリンカー5'-CCTCCGAGG-3'を挿入して平滑
末端を閉環結合してプラスミドを構築した。このプラス
ミドから、制限酵素XhoIを用いて上記融合タンパク質を
コードする部分を切り出し、プラスミドｐＧＬＤＬIIＰ
３９−ＲｃＴの持つＨＢｓＡｇＬ蛋白質遺伝子と入れ
換えてプラスミドpBOP009を構築した。これを用いて、
酵母（Saccharomyces Cerevisiae AH22R^-株）を形質転
換し、得られた遺伝子組換え酵母を、合成培地High-Pi
および8S5N-P400中で培養し、ＩＦＮβ１タンパク質融
合型ＨＢｓＡｇＬタンパク質を発現させた。

【００６８】定常成長期（約７２時間後）にある遺伝子
組換え酵母から、Yeast Protein Extraction Reagent
（Pierce Chemical Co.製）を用いて、whole cell extr
actを準備し、ＩＭｘキットによりＳ抗原性を検出し
た。また、ＩＭｘのアガロースビーズに固定された一次
抗体を用いて、培地中の粒子を免疫沈降し、沈降した蛋
白質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったあと、ウェスタ
ンブロッティングを行って、抗FLAG M2抗体(Sigma)によ
り試料中の融合タンパク質を検出すると、分子量約７０
ｋＤａのバンドが検出された。これにより、酵母で発現
したヒトインターフェロンβ１融合型ＨＢｓＡｇＬタ
ンパク質がそれぞれの構造を維持したまま粒子を形成し
ていることを確認した。（４）昆虫細胞へのプラスミドの導入とその発現次に、上記pBOP009から融合蛋白をコードする遺伝子のX
hoI断片を切り出し、大腸菌由来DNAポリメラーゼラージ
フラグメントにより末端を平滑化し、昆虫細胞安定発現
用ベクターｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Invitrogen社）の
EcoRV部位へ挿入し閉環結合させた。塩基配列を確認し
た後、このプラスミドをpBOP010と命名した。

【００６９】一方、昆虫細胞High Five株（BTI-TN-5B1-
4：Invitrogen社）は、約１ヶ月かけて次第に牛胎仔血
清入り培地から無血清培地（Ultimate Insect Serum-Fr
ee Medium：Invitrogen社）に馴化させておいた。次
に、上記プラスミドpBOP010を遺伝子導入用脂質Insecti
n-Plus（Invitrogen社）を用いて無血清培地に馴化させ
たHigh Five株を形質転換した。その後、無血清培地で2
7℃48時間培養し、抗生物質zeocin（Invitrogen社）を4
00 μg/mL含有する無血清培地でさらに細胞がconfluent
になるまで4〜7日間培養した。

【００７０】1500×g、5分間遠心により培養上清を回収
し、ＩＭｘキット（ダイナボット社）により、培地中の
ＨＢｓＡｇ粒子の発現測定したところ、ＨＢｓＡｇ粒子
が発現していることが確認された。さらに、ＩＭｘのア
ガロースビーズに固定された一次抗体を用いて、培地中
の粒子を免疫沈降し沈降した蛋白質に対してＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行ったあと、ウェスタンブロッティングを行っ
て抗FLAG M2抗体により蛋白質を検出すると、分子量約
７０ｋＤａのバンドが検出され、融合蛋白質が構築通り
発現していることを確認した。これにより発現したヒト
インターフェロンβ１融合型ＨＢｓＡｇＬタンパク質が
それぞれの構造を維持したまま粒子を形成していること
を確認した。

【００７１】上記ヒトインターフェロンβ１融合型ＨＢ
ｓＡｇＬタンパク質の遺伝子配列は配列番号１７に、そ
のアミノ酸配列は配列番号１８にそれぞれ示される。

【００７２】（実施例Ｆ）ＨＢｓＡｇにヒト肝細胞成
長因子（ＨＧＦ）が融合した粒子の作製（１）ＨＧＦとＨＢｓＡｇとの融合タンパク質を発現す
るプラスミドの作製ヒト肝臓由来RNA（ClonTech）から、Oligo-dTプライマ
ーを用いて逆転写酵素スーパースクリプトII（Gibco-BR
L）によりｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを、
ＨＧＦ遺伝子を特異的に増幅する配列番号７および配列
番号８のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて
ＰＣＲを行うことにより、約２.２ｋｂｐのＨＧＦ遺伝
子を増幅した。このとき、プライマーは、増幅されたＨ
ＧＦ遺伝子が、上流側にAgeIサイトを、下流側に制限酵
素NotIサイトを有するように設計した。

【００７３】ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で分離し
た後、目的のｃＤＮＡを含むバンド（約２．２ｋｂｐ）
を回収し、TOPO TA Cloning kit（Invitrogen社）を用
いてpCR2.1-TOPOベクター（Invitrogen社）にサブクロ
ーニングした。

【００７４】次に、プラスミドの構築を行いやすくする
ため、ＨＧＦ遺伝子中に存在する２箇所の制限酵素認識
部位を改変した。その手順を以下に示す。

【００７５】二組の相補的な合成ＤＮＡ、配列番号９の
オリゴヌクレオチドとその相補配列である配列番号１０
のオリゴヌクレオチド、および配列番号１１のオリゴヌ
クレオチドとその相補配列である配列番号１２のオリゴ
ヌクレオチドを用いて、QuickChange^TMSite-Directed
Mutagenesis Kit （Stratagene社）により上記プラスミ
ドＤＮＡのＰＣＲを行った。

【００７６】まず、最初の一組のプライマーにより、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてPfuＤＮＡ polymerase
（Stratagene）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ
は、９５℃３０秒間の変性、５５℃１分間のアニーリン
グ、６８℃３０分間の合成反応を３０回繰り返して行っ
た。その後、ＰＣＲ産物を制限酵素Dpn Iで処理して、
大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。そして、形質転換した
大腸菌ＤＨ５αを培養し、出現コロニーからベクターＤ
ＮＡを抽出し、塩基配列を確認して、変異導入されたプ
ラスミドを選抜した。次に、得られたプラスミドを鋳型
として二組目のプライマーを用いて同様の操作を行っ
た。その結果ＨＧＦｃＤＮＡにコードされるアミノ酸を
変更することなく２ケ所のXhoI認識部位が消去されたヒ
トHGFcDNAを保持するプラスミドpBOP011が得られた。

【００７７】塩基配列をGenBankの情報（GenBank accee
sion no. M29145）により確認した後、制限酵素AgeIお
よびNotIでこのcDNA断片を切り出し、前記プラスミドpE
GFP-N1のAgeIとNotI部位を利用してEGFP遺伝子と入れ換
えてプラスミドを構築した。

【００７８】上記プラスミドにFLAG tag遺伝子およびＨ
ＢｓＡｇ遺伝子を挿入する。挿入方法は前記実施例Ｃの
（１）に記載した方法と同様である。これにより、プラ
スミドpBOP012を構築した。この構築によりプラスミド
のＣＭＶプロモーターの下流に挿入された遺伝子は、ア
ミノ末端側からニワトリリゾチーム由来分泌シグナル、
ＨＢｓＡｇＬタンパク質、FLAG tag、ヒトＨＧＦを順に
融合したタンパク質をコードする。（２）サル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞への上記プラスミ
ドの導入とその発現上記遺伝子の塩基配列を確認した後、上記プラスミドpB
OP012をアフリカミドリサル腎臓由来ＣＯＳ−７細胞に
遺伝子導入装置ジーンパルサー（バイオラッド）を用い
て導入した。導入後１０％子牛胎児血清を含むダルベッ
コ改変培地を用いて一晩培養した。翌日、培地を無血清
培地CHO-SFMII（Gibco-BRL）に置き換えて、さらに４日
間培養し、ＣＯＳ−７細胞を含む培地を回収した。

【００７９】培地中のＳ抗原性をＩＭｘキット（ダイナ
ボット社）により確認し、培地中に粒子が検出された。
また、ＩＭｘのアガロースビーズに固定された一次抗体
を用いて、培地中の粒子を免疫沈降し、沈降した蛋白質
に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったあと、ウェスタンブ
ロッティングを行って、抗FLAG M2抗体によりタンパク
質を検出すると、分子量約１２５ｋＤａのバンドが検出
され、融合タンパク質が構築どおり発現していることを
確認した。これにより発現したヒトＨＧＦ融合型ＨＢｓ
ＡｇＬタンパク質がそれぞれの構造を維持したまま粒子
を形成していることを確認した。（３）酵母細胞へのプラスミドの導入とその発現さらに、上記融合タンパク質を酵母細胞で発現させるた
めにプラスミドpBOP012を、ＨＧＦ遺伝子の翻訳停止コ
ドンの３’側に存在する制限酵素NotIの認識部位で切断
し、大腸菌DNAポリメラーゼラージフラグメントで粘着
末端を埋め平滑末端とした。ここに、T4DNAリガーゼに
よりXhoIリンカー5'-CCTCCGAGG-3'を挿入して平滑末端
を閉環結合してプラスミドを構築した。このプラスミド
から、制限酵素XhoIを用いて上記融合タンパク質をコー
ドする部分を切り出し、プラスミドｐＧＬＤＬIIＰ３９
−ＲｃＴの持つＨＢｓＡｇＬ蛋白質遺伝子と入れ換え
てプラスミドpBOP013を構築した。これを用いて、酵母
（Saccharomyces Cerevisiae AH22R^-株）を形質転換
し、得られた遺伝子組換え酵母を、合成培地High-Piお
よび8S5N-P400中で培養し、ヒトＨＧＦタンパク質融合
型ＨＢｓＡｇＬタンパク質を発現させた。

【００８０】定常成長期（約７２時間後）にある遺伝子
組換え酵母から、Yeast Protein Extraction Reagent
（Pierce Chemical Co.製）を用いて、whole cell extr
actを準備し、ＩＭｘキットによりＨＢｓＡｇＬタンパ
ク質のＳ抗原性を検出した。また、ＩＭｘのアガロース
ビーズに固定された一次抗体を用いて、培地中の粒子を
免疫沈降し、沈降した蛋白質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ
を行ったあと、ウェスタンブロッティングを行って、抗
FLAG M2抗体(Sigma)により試料中の融合タンパク質を検
出すると、分子量約１２５ｋＤａのバンドが検出され
た。これにより、酵母で発現したヒトＨＧＦ融合型ＨＢ
ｓＡｇＬタンパク質がそれぞれの構造を維持したまま
粒子を形成していることを確認した。（４）昆虫細胞へのプラスミドの導入とその発現次に、上記pBOP013から融合蛋白をコードする遺伝子のX
hoI断片を切り出し、大腸菌由来DNAポリメラーゼラージ
フラグメントにより末端を平滑化し、昆虫細胞安定発現
用ベクターｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Invitrogen社）の
EcoRV部位へ挿入し閉環結合させた。塩基配列を確認し
た後、このプラスミドをpBOP014と命名した。

【００８１】一方、昆虫細胞High Five株（BTI-TN-5B1-
4：Invitrogen社）は、約１ヶ月かけて次第に牛胎仔血
清入り培地から無血清培地（Ultimate Insect Serum-Fr
ee Medium：Invitrogen社）に馴化させておいた。次
に、上記プラスミドpBOP014を遺伝子導入用脂質Insecti
n-Plus（Invitrogen社）を用いて無血清培地に馴化させ
たHigh Five株を形質転換した。その後、無血清培地で2
7℃48時間培養し、抗生物質zeocin（Invitrogen社）を4
00 μg/mL含有する無血清培地でさらに細胞がconfluent
になるまで4〜7日間培養した。

【００８２】1500×g、5分間遠心により培養上清を回収
し、ＩＭｘキット（ダイナボット社）により、培地中の
ＨＢｓＡｇＬタンパク質粒子の発現測定したところ、Ｈ
ＢｓＡｇＬタンパク質粒子が発現していることが確認さ
れた。さらに、ＩＭｘのアガロースビーズに固定された
一次抗体を用いて、培地中の粒子を免疫沈降し沈降した
蛋白質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったあと、ウェス
タンブロッティングを行って抗FLAG M2抗体により蛋白
質を検出すると、分子量約１２５ｋＤａのバンドが検出
され、融合蛋白質が構築通り発現していることを確認し
た。これにより発現したヒトＨＧＦ融合型ＨＢｓＡｇＬ
タンパク質がそれぞれの構造を維持したまま粒子を形成
していることを確認した。

【００８３】上記ヒトＨＧＦ融合型ＨＢｓＡｇＬタンパ
ク質の遺伝子配列は配列番号１９に、そのアミノ酸配列
は配列番号２０にそれぞれ示される。

【００８４】（実施例Ｇ）ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２にお
けるＨＢｓＡｇＬタンパク質粒子によるＧＦＰの導入指数増殖期にあるヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２を１×１０⁵
cells／wellになるように、３．５ｃｍガラス底皿シャ
ーレに植菌し、３７℃、５％ＣＯ₂存在下で１０％ウシ
胎児血清を含むD-MEMを用いて一晩培養した。翌日、実
施例Ｃで使用したＨＢｓＡｇＬタンパク質にＥＧＦＰが
融合した粒子を１０μｇ／wellになるように添加し、３
７℃、５％ＣＯ₂存在下で６時間培養した。

【００８５】また、陰性対照として、ヒト扁平上皮癌由
来細胞Ａ４３１（JCRB9009）についても同様の操作を行
った。

【００８６】ＨｅｐＧ２とＡ４３１において、細胞内で
のＧＦＰの発現の様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて
観察した。

【００８７】これにより、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２にＧ
ＦＰに由来する蛍光を認めた(図５)。しかし、ヒト扁平
上皮癌由来細胞Ａ４３１には蛍光を認めなかった(図
６)。

【００８８】以上より、ＨＢｓＡｇＬタンパク質粒子を
用いることにより、ヒト肝細胞に対して極めて高い特異
性と効率でタンパク質が構造を維持したまま導入される
ことが示された。したがって、この発明の物質運搬体
は、極めて有効であることが確認された。

【００８９】（実施例Ｈ）ヒト肝癌を移植したヌード
マウスに対するＨＢｓＡｇＬタンパク質粒子による物質
導入胆癌マウスは、ヌードマウス（系統：BALB／c nu／nu、
微生物学的品質：ＳＰＦ、性別：オス５週齢）の両側背
部皮下に、ヒト肝癌由来細胞ＨｕＨ−７（JCRB0403）を
１×１０⁷細胞皮下に注射し、移植腫瘍が直径２ｃｍ程
度の固形癌になるまで２〜4週間生育させて得た。

【００９０】また、陰性対照として、ヒト大腸癌由来細
胞ＷｉＤｒ（ATCC CCL-218）についても、同様にヌード
マウスに移植した。

【００９１】それぞれのマウスに、実施例ＣのＨＢｓＡ
ｇＬタンパク質にＥＧＦＰが融合した粒子５０μｇを、
腹腔内に２６Ｇ注射針を使用して投与した。投与後１２
時間後ににマウスを屠殺し、腫瘍部、肝臓、脾臓、腎
臓、腸管を摘出し、ＧＦＰ用樹脂包埋キット（Technovi
t7100）を用いて組織を固定・包埋した。

【００９２】具体的には、固定は４％中和ホルムアルデ
ヒドに浸漬して行い、脱水は７０％ＥｔＯＨで室温２時
間、９６％ＥｔＯＨで室温２時間、１００％ＥｔＯＨで
室温１時間、予備浸漬は１００％ＥｔＯＨ／Technovit7
100等量混合液で室温２時間行った。その後、Technovit
7100で室温２４時間以内の浸漬を行い、取り出した後、
室温で１時間および３７℃で１時間静置して重合反応さ
せた。

【００９３】常法に従って、切片を作製し、同時にヘマ
トキシンエオリン染色（一般的な組織染色）を行って、
蛍光顕微鏡によりＨＢｓＡｇＬタンパク質粒子投与群と
非投与群のＧＦＰによる蛍光を比較した。

【００９４】これにより、ヒト肝癌由来ＨｕＨ−７細胞
による胆癌マウスの腫瘍部にＧＦＰに由来する蛍光を認
めた(図７)。しかし、同マウスより同時に摘出した肝
臓、脾臓、腎臓、腸管には蛍光を認めなかった。さら
に、ヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞による胆癌マウスの腫
瘍、肝臓、脾臓、腎臓、腸管にも蛍光を認めなかった
(腫瘍部：図８)。

【００９５】以上より、ＨＢｓＡｇＬタンパク質粒子を
用いることにより、実験動物レベルでも、ヒト肝細胞に
対して極めて高い特異性と効率でタンパク質が構造を維
持したまま導入されることが示された。したがって、こ
の発明の物質運搬体は、極めて有効であることが確認さ
れた。

【００９６】

【発明の効果】以上のように、本発明に係る薬剤は、静
脈注射などといった簡便な方法で、特定の細胞または組
織に対して選択的かつ効率的に疾患治療用の細胞導入物
質を送り込むことができるので、従来の遺伝子治療と大
きく異なり、外科手術を必要とせず、副作用の心配もき
わめて低く、そのまま臨床応用可能なものである。

【００９７】また、粒子を形成するタンパク質に細胞導
入物質が融合したかたちで粒子を形成することにより、
粒子形成の際、あわせて粒子内部に細胞導入物質を包含
させることができ、薬剤の製造を容易にできる。

【００９８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Therapentic drug contains drug components expressed and fused with proteins composing nano-particles <130> P023P01 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Sequence <400> 1 ccggtatctt atcgtcgtca tccttgtaat caatat 36 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Sequence <400> 2 atatattgat tacaaggatg acgacgataa gata 34 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 3 ataccggtgg gctgtgatct gcctcaga 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 4 atgcggccgc tcaagatgag cccaggtc 28 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 5 gaaccggtga gctacaactt gcttggatt 29 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 6 atgcggccgc tcagtttcgg aggtaacctg 30 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 7 gcaccggtac aaaggaaaag aagaaata 28 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 8 ttgcggccgc tatgactgtg gtaccttat 29 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 9 ctgtcgaaat ccacgagggg aagaa 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 10 ttcttcccct cgtggatttc gacag 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 11 tttcccttct cgtgacttga aagat 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 12 atctttcaag tcacgagaag ggaaa 25 <210> 13 <211> 2013 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (23)..(1999) <220> <223> Description of Artificial Sequence:GFP gene fused with HBsAg L pro tein gene <400> 13 ctcgaggtcg agtataaaaa ca atg aga tct ttg ttg atc ttg gtt ttg tgt 52 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys 1 5 10 ttc ttg cca ttg gct gct ttg ggt aag gtt cga caa ggc atg ggg acg 100 Phe Leu Pro Leu Ala Ala Leu Gly Lys Val Arg Gln Gly Met Gly Thr 15 20 25 aat ctt tct gtt ccc aat cct ctg gga ttc ttt ccc gat cac cag ttg 148 Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu 30 35 40 gac cct gcg ttc gga gcc aac tca aac aat cca gat tgg gac ttc aac 196 Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn 45 50 55 ccc aac aag gat caa tgg cca gag gca aat cag gta gga gcg gga gca 244 Pro Asn Lys Asp Gln Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala 60 65 70 ttc ggg cca ggg ttc acc cca cca cac ggc ggt ctt ttg ggg tgg agc 292 Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser 75 80 85 90 cct cag gct cag ggc ata ttg aca aca gtg cca gca gca cct cct cct 340 Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro 95 100 105 gcc tcc acc aat cgg cag tca gga aga cag cct act ccc atc tct cca 388 Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro 110 115 120 cct cta aga gac agt cat cct cag gcc atg cag tgg aat tcc aca aca 436 Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr 125 130 135 ttc cac caa gct ctg cta gat ccc aga gtg agg ggc cta tat ttt cct 484 Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro 140 145 150 gct ggt ggc tcc agt tcc gga aca gta aac cct gtt ccg act act gcc 532 Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala 155 160 165 170 tca ccc ata tct ggg gac cct gca ccg aac atg gag aac aca aca tca 580 Ser Pro Ile Ser Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser 175 180 185 gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg 628 Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu 190 195 200 aca aga atc ctc aca ata cca cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct 676 Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser 205 210 215 ctc aat ttt cta ggg gga gca ccc acg tgt cct ggc caa aat tcg cag 724 Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln 220 225 230 tcc cca acc tcc aat cac tca cca acc tct tgt cct cca att tgt cct 772 Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro 235 240 245 250 ggc tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc 820 Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile 255 260 265 ctg ctg cta tgc ctc atc ttc ttg ttg gtt ctt ctg gac tac caa ggt 868 Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly 270 275 280 atg ttg ccc gtt tgt cct cta ctt cca gga aca tca acc acc agc acg 916 Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr 285 290 295 ggg cca tgc aag acc tgc acg att cct gct caa gga acc tct atg ttt 964 Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe 300 305 310 ccc tct tgt tgc tgt aca aaa cct tcg gac gga aac tgc act tgt att 1012 Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile 315 320 325 330 ccc atc cca tca tcc tgg gct ttc gca aga ttc cta tgg gag tgg gcc 1060 Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala 335 340 345 tca gtc cgt ttc tcc tgg ctc agt tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg 1108 Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp 350 355 360 ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt tca gtt ata tgg atg atg 1156 Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met 365 370 375 tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac aac atc ttg agt ccc ttt tta cct 1204 Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro 380 385 390 cta tta cca att ttc ttt tgt ctt tgg gta tat att gat tac aag gat 1252 Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Tyr Lys Asp 395 400 405 410 gac gac gat aag ata ccg gtc gcc acc atg gtg agc aag ggc gag gag 1300 Asp Asp Asp Lys Ile Pro Val Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu 415 420 425 ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg gtc gag ctg gac ggc gac gta 1348 Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val 430 435 440 aac ggc cac aag ttc agc gtg tcc ggc gag ggc gag ggc gat gcc acc 1396 Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr 445 450 455 tac ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc tgc acc acc ggc aag ctg ccc 1444 Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro 460 465 470 gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg acc acc ctg acc tac ggc gtg cag tgc 1492 Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys 475 480 485 490 ttc agc cgc tac ccc gac cac atg aag cag cac gac ttc ttc aag tcc 1540 Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser 495 500 505 gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag cgc acc atc ttc ttc aag gac 1588 Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp 510 515 520 gac ggc aac tac aag acc cgc gcc gag gtg aag ttc gag ggc gac acc 1636 Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr 525 530 535 ctg gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc atc gac ttc aag gag gac ggc 1684 Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly 540 545 550 aac atc ctg ggg cac aag ctg gag tac aac tac aac agc cac aac gtc 1732 Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val 555 560 565 570 tat atc atg gcc gac aag cag aag aac ggc atc aag gtg aac ttc aag 1780 Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys 575 580 585 atc cgc cac aac atc gag gac ggc agc gtg cag ctc gcc gac cac tac 1828 Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr 590 595 600 cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc ccc gtg ctg ctg ccc gac aac 1876 Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn 605 610 615 cac tac ctg agc acc cag tcc gcc ctg agc aaa gac ccc aac gag aag 1924 His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys 620 625 630 cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc gtg acc gcc gcc ggg atc act 1972 Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr 635 640 645 650 ctc ggc atg gac gag ctg tac aag taa agcggcccct cgag 2013 Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 655 <210> 14 <211> 658 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence:GFP protein fused with HBsAg L protein <400> 14 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Gly Lys Val Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn 20 25 30 Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala 35 40 45 Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Gln Trp 50 55 60 Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr 65 70 75 80 Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile 85 90 95 Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln 100 105 110 Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His 115 120 125 Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu 130 135 140 Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Gly Asp 165 170 175 Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu 180 185 190 Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile 195 200 205 Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly 210 215 220 Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His 225 230 235 240 Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys 245 250 255 Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile 260 265 270 Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro 275 280 285 Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys 290 295 300 Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr 305 310 315 320 Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp 325 330 335 Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp 340 345 350 Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro 355 360 365 Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser 370 375 380 Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe 385 390 395 400 Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ile Pro 405 410 415 Val Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val 420 425 430 Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser 435 440 445 Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu 450 455 460 Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu 465 470 475 480 Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp 485 490 495 His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr 500 505 510 Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr 515 520 525 Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu 530 535 540 Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys 545 550 555 560 Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys 565 570 575 Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu 580 585 590 Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile 595 600 605 Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln 610 615 620 Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu 625 630 635 640 Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu 645 650 655 Tyr Lys <210> 15 <211> 1803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (23)..(1795) <220> <223> Description of Artificial Sequence:IFNω gene fused with HBsAg L p rotein gene <400> 15 ctcgaggtcg agtataaaaa ca atg aga tct ttg ttg atc ttg gtt ttg tgt 52 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys 1 5 10 ttc ttg cca ttg gct gct ttg ggt aag gtt cga caa ggc atg ggg acg 100 Phe Leu Pro Leu Ala Ala Leu Gly Lys Val Arg Gln Gly Met Gly Thr 15 20 25 aat ctt tct gtt ccc aat cct ctg gga ttc ttt ccc gat cac cag ttg 148 Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu 30 35 40 gac cct gcg ttc gga gcc aac tca aac aat cca gat tgg gac ttc aac 196 Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn 45 50 55 ccc aac aag gat caa tgg cca gag gca aat cag gta gga gcg gga gca 244 Pro Asn Lys Asp Gln Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala 60 65 70 ttc ggg cca ggg ttc acc cca cca cac ggc ggt ctt ttg ggg tgg agc 292 Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser 75 80 85 90 cct cag gct cag ggc ata ttg aca aca gtg cca gca gca cct cct cct 340 Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro 95 100 105 gcc tcc acc aat cgg cag tca gga aga cag cct act ccc atc tct cca 388 Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro 110 115 120 cct cta aga gac agt cat cct cag gcc atg cag tgg aat tcc aca aca 436 Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr 125 130 135 ttc cac caa gct ctg cta gat ccc aga gtg agg ggc cta tat ttt cct 484 Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro 140 145 150 gct ggt ggc tcc agt tcc gga aca gta aac cct gtt ccg act act gcc 532 Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala 155 160 165 170 tca ccc ata tct ggg gac cct gca ccg aac atg gag aac aca aca tca 580 Ser Pro Ile Ser Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser 175 180 185 gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg 628 Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu 190 195 200 aca aga atc ctc aca ata cca cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct 676 Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser 205 210 215 ctc aat ttt cta ggg gga gca ccc acg tgt cct ggc caa aat tcg cag 724 Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln 220 225 230 tcc cca acc tcc aat cac tca cca acc tct tgt cct cca att tgt cct 772 Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro 235 240 245 250 ggc tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc 820 Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile 255 260 265 ctg ctg cta tgc ctc atc ttc ttg ttg gtt ctt ctg gac tac caa ggt 868 Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly 270 275 280 atg ttg ccc gtt tgt cct cta ctt cca gga aca tca acc acc agc acg 916 Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr 285 290 295 ggg cca tgc aag acc tgc acg att cct gct caa gga acc tct atg ttt 964 Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe 300 305 310 ccc tct tgt tgc tgt aca aaa cct tcg gac gga aac tgc act tgt att 1012 Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile 315 320 325 330 ccc atc cca tca tcc tgg gct ttc gca aga ttc cta tgg gag tgg gcc 1060 Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala 335 340 345 tca gtc cgt ttc tcc tgg ctc agt tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg 1108 Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp 350 355 360 ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt tca gtt ata tgg atg atg 1156 Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met 365 370 375 tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac aac atc ttg agt ccc ttt tta cct 1204 Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro 380 385 390 cta tta cca att ttc ttt tgt ctt tgg gta tat att gat tac aag gat 1252 Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Tyr Lys Asp 395 400 405 410 gac gac gat aag ata ccg gtg ggc tgt gat ctg cct cag aac cat ggc 1300 Asp Asp Asp Lys Ile Pro Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln Asn His Gly 415 420 425 cta ctt agc agg aac acc ttg gtg ctt ctg cac caa atg agg aga atc 1348 Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile 430 435 440 tcc cct ttc ttg tgt ctc aag gac aga aga gac ttc agg ttc ccc cag 1396 Ser Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln 445 450 455 gag atg gta aaa ggg agc cag ttg cag aag gcc cat gtc atg tct gtc 1444 Glu Met Val Lys Gly Ser Gln Leu Gln Lys Ala His Val Met Ser Val 460 465 470 ctc cat gag atg ctg cag cag atc ttc agc ctc ttc cac aca gag cgc 1492 Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg 475 480 485 490 tcc tct gct gcc tgg aac atg acc ctc cta gac caa ctc cac act gga 1540 Ser Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Gly 495 500 505 ctt cat cag caa ctg caa cac ctg gag acc tgc ttg ctg cag gta gtg 1588 Leu His Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val 510 515 520 gga gaa gga gaa tct gct ggg gca att agc agc cct gca ctg acc ttg 1636 Gly Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu 525 530 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cca gca 1348 Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala 430 435 440 ctg aag ata aaa acc aaa aaa gtg aat act gca gac caa tgt gct aat 1396 Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn 445 450 455 aga tgt act agg aat aaa gga ctt cca ttc act tgc aag gct ttt gtt 1444 Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val 460 465 470 ttt gat aaa gca aga aaa caa tgc ctc tgg ttc ccc ttc aat agc atg 1492 Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met 475 480 485 490 tca agt gga gtg aaa aaa gaa ttt ggc cat gaa ttt gac ctc tat gaa 1540 Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu 495 500 505 aac aaa gac tac att aga aac tgc atc att ggt aaa gga cgc agc tac 1588 Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr 510 515 520 aag gga aca gta tct atc act aag agt ggc atc aaa tgt cag ccc tgg 1636 Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp 525 530 535 agt tcc atg ata cca cac gaa cac agc tat cgg ggt aaa gac cta cag 1684 Ser Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln 540 545 550 gaa aac tac tgt cga aat cca cga ggg gaa gaa ggg gga ccc tgg tgt 1732 Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys 555 560 565 570 ttc aca agc aat cca gag gta cgc tac gaa gtc tgt gac att cct cag 1780 Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln 575 580 585 tgt tca gaa gtt gaa tgc atg acc tgc aat ggg gag agt tat cga ggt 1828 Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly 590 595 600 ctc atg gat cat aca gaa tca ggc aag att tgt cag cgc tgg gat cat 1876 Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His 605 610 615 cag aca cca cac cgg cac aaa ttc ttg cct gaa aga tat ccc gac aag 1924 Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys 620 625 630 ggc ttt gat gat aat tat tgc cgc aat ccc gat ggc cag ccg agg cca 1972 Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro 635 640 645 650 tgg tgc tat act ctt gac cct cac acc cgc tgg gag tac tgt gca att 2020 Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile 655 660 665 aaa aca tgc gct gac aat act atg aat gac act gat gtt cct ttg gaa 2068 Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu 670 675 680 aca act gaa tgc atc caa ggt caa gga gaa ggc tac agg ggc act gtc 2116 Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val 685 690 695 aat acc att tgg aat gga att cca tgt cag cgt tgg gat tct cag tat 2164 Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr 700 705 710 cct cac gag cat gac atg act cct gaa aat ttc aag tgc aag gac cta 2212 Pro His Glu His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu 715 720 725 730 cga gaa aat tac tgc cga aat cca gat ggg tct gaa tca ccc tgg tgt 2260 Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys 735 740 745 ttt acc act gat cca aac atc cga gtt ggc tac tgc tcc caa att cca 2308 Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro 750 755 760 aac tgt gat atg tca cat gga caa gat tgt tat cgt ggg aat ggc aaa 2356 Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys 765 770 775 aat tat atg ggc aac tta tcc caa aca aga tct gga cta aca tgt tca 2404 Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser 780 785 790 atg tgg gac aag aac atg gaa gac tta cat cgt cat atc ttc tgg gaa 2452 Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu 795 800 805 810 cca gat gca agt aag ctg aat gag aat tac tgc cga aat cca gat gat 2500 Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp 815 820 825 gat gct cat gga ccc tgg tgc tac acg gga aat cca ctc att cct tgg 2548 Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp 830 835 840 gat tat tgc cct att tct cgt tgt gaa ggt gat acc aca cct aca ata 2596 Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile 845 850 855 gtc aat tta gac cat ccc gta ata tct tgt gcc aaa acg aaa caa ttg 2644 Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu 860 865 870 cga gtt gta aat ggg att cca aca cga aca aac ata gga tgg atg gtt 2692 Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val 875 880 885 890 agt ttg aga tac aga aat aaa cat atc tgc gga gga tca ttg ata aag 2740 Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys 895 900 905 gag agt tgg gtt ctt act gca cga cag tgt ttc cct tct cgt gac ttg 2788 Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu 910 915 920 aaa gat tat gaa gct tgg ctt gga att cat gat gtc cac gga aga gga 2836 Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly 925 930 935 gat gag aaa tgc aaa cag gtt ctc aat gtt tcc cag ctg gta tat ggc 2884 Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly 940 945 950 cct gaa gga tca gat ctg gtt tta atg aag ctt gcc agg cct gct gtc 2932 Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val 955 960 965 970 ctg gat gat ttt gtt agt acg att gat tta cct aat tat gga tgc aca 2980 Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr 975 980 985 att cct gaa aag acc agt tgc agt gtt tat ggc tgg ggc tac act gga 3028 Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly 990 995 1000 ttg atc aac tat gat ggc cta tta cga gtg gca cat ctc tat ata atg 3076 Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met 1005 1010 1015 gga aat gag aaa tgc agc cag cat cat cga ggg aag gtg act ctg aat 3124 Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn 1020 1025 1030 gag tct gaa ata tgt gct ggg gct gaa aag att gga tca gga cca tgt 3172 Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys 1035 1040 1045 1050 gag ggg gat tat ggt ggc cca ctt gtt tgt gag caa cat aaa atg aga 3220 Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg 1055 1060 1065 atg gtt ctt ggt gtc att gtt cct ggt cgt gga tgt gcc att cca aat 3268 Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn 1070 1075 1080 cgt cct ggt att ttt gtc cga gta gca tat tat gca aaa tgg ata cac 3316 Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His 1085 1090 1095 aaa att att tta aca tat aag gta cca cag tca tag cggccgc 3359 Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 1100 1105 1110 <210> 20 <211> 1109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence:HGF protein fused with HBsAg L protein <400> 20 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Gly Lys Val Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn 20 25 30 Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala 35 40 45 Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Gln Trp 50 55 60 Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr 65 70 75 80 Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile 85 90 95 Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln 100 105 110 Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His 115 120 125 Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu 130 135 140 Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Gly Asp 165 170 175 Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu 180 185 190 Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile 195 200 205 Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly 210 215 220 Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His 225 230 235 240 Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys 245 250 255 Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile 260 265 270 Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro 275 280 285 Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys 290 295 300 Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr 305 310 315 320 Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp 325 330 335 Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp 340 345 350 Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro 355 360 365 Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser 370 375 380 Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe 385 390 395 400 Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ile Pro 405 410 415 Val Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala 420 425 430 Lys Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys 435 440 445 Lys Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys 450 455 460 Gly Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys 465 470 475 480 Gln Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys 485 490 495 Glu Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg 500 505 510 Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile 515 520 525 Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His 530 535 540 Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn 545 550 555 560 Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu 565 570 575 Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys 580 585 590 Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu 595 600 605 Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His 610 615 620 Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr 625 630 635 640 Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp 645 650 655 Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn 660 665 670 Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln 675 680 685 Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly 690 695 700 Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met 705 710 715 720 Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg 725 730 735 Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn 740 745 750 Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His 755 760 765 Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu 770 775 780 Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met 785 790 795 800 Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu 805 810 815 Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp 820 825 830 Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser 835 840 845 Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro 850 855 860 Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile 865 870 875 880 Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn 885 890 895 Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr 900 905 910 Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp 915 920 925 Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln 930 935 940 Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu 945 950 955 960 Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser 965 970 975 Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser 980 985 990 Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly 995 1000 1005 Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser 1010 1015 1020 Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala 1025 1030 1035 1040 Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly 1045 1050 1055 Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile 1060 1065 1070 Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val 1075 1080 1085 Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr 1090 1095 1100 Lys Val Pro Gln Ser 1105

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の薬剤を構成する粒子の概略模式図であ
って、粒子を形成するＨＢｓＡｇＬタンパク質にタンパ
ク質薬剤が融合された状態を示す図である。

【図２】本発明の実施例におけるＨＢｓＡｇＬタンパク
質遺伝子の各タンパク質領域を表す概略摸式図である。
１〜８は、表面抗原における各部位の働きを示してい
る。

【図３】本発明の実施例における遺伝子組換え酵母を用
いたＨＢｓＡｇＬタンパク質粒子の発現および精製操作
を例示した概略説明図である。（ａ）遺伝子組換え酵母
の作成、（ｂ）Ｈｉｇｈ−Ｐｉ培地における培養、
（ｃ）８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００培地における培養、（ｄ）破
砕、（ｅ）密度勾配遠心分離、（ｆ）ＨＢｓＡｇＬタン
パク質粒子。

【図４】本発明の実施例における、ＨＢｓＡｇＬタンパ
ク質とＥＧＦＰとの融合タンパク質を発現するプラスミ
ドの作製方法を説明する図である。

【図５】本発明の実施例における、ＨＢｓＡｇＬタンパ
ク質とＥＧＦＰとの融合タンパク質によってＥＧＦＰを
導入した、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２の共焦点レーザー蛍
光顕微鏡写真を示した図である。

【図６】本発明の実施例における、ＨＢｓＡｇＬタンパ
ク質とＥＧＦＰとの融合タンパク質によってＥＧＦＰを
導入した、ヒト扁平上皮癌由来細胞Ａ４３１の共焦点レ
ーザー蛍光顕微鏡写真を示した図である。

【図７】本発明の実施例における、ＨＢｓＡｇＬタンパ
ク質とＥＧＦＰとの融合タンパク質を静脈注射した、ヒ
ト肝癌由来ＨｕＨ−７細胞を移植された胆癌マウスの腫
瘍部の共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真を示した図であ
る。

【図８】本発明の実施例における、ＨＢｓＡｇＬタンパ
ク質とＥＧＦＰとの融合タンパク質を静脈注射した、ヒ
ト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞を移植された胆癌マウスの腫
瘍部の共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真を示した図であ
る。

【符号の説明】

１粒子形成抑制部位２直接的ヒト肝細胞特異的レセプター３糖鎖１４間接的なヒト肝細胞特異的レセプター（血清重合
アルブミンレセプター）５膜貫通領域１６膜貫通領域２７糖鎖２８膜貫通領域３

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/21 Ａ６１Ｐ 1/16 38/22 Ｃ０７Ｋ 14/02 39/29 Ａ６１Ｋ 37/02 ＺＮＡＡ６１Ｐ 1/16 37/66 Ｈ // Ｃ０７Ｋ 14/02 37/24 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者上田政和東京都新宿区納戸町６ (72)発明者妹尾昌治岡山県岡山市門田文化町２−10−13 (72)発明者多田宏子岡山県岡山市伊島町２−20−22−206 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA33 CA04 CA07 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 4C084 AA02 AA06 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA01 CA17 DA21 DB62 MA05 MA52 MA56 MA66 NA03 NA13 ZA751 4C085 AA21 BA89 CC04 CC05 CC07 DD21 DD62 EE03 GG02 GG03 GG04 GG06 GG08 4C087 AA01 AA02 BB21 BB33 BC12 MA05 NA05 NA13 ZA75 4H045 AA20 AA30 BA10 BA41 CA02 DA01 EA20 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特定の細胞に対する認識能を有し、粒子形
成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子におい
て、当該タンパク質に疾患治療用の細胞導入物質が融合
されてなる薬剤。
【請求項２】上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウィルス表面
抗原タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の
薬剤。
【請求項３】上記薬剤は、上記タンパク質をコードする
遺伝子と、その下流側に上記細胞導入物質をコードする
遺伝子とを含むベクターにて真核細胞を形質転換させ、
当該真核細胞に遺伝子発現させることにより得られるこ
とを特徴とする請求項１または２記載の薬剤。
【請求項４】上記真核細胞は、動物細胞、酵母または昆
虫細胞であることを特徴とする請求項３記載の薬剤。
【請求項５】肝臓疾患治療用に用いられることを特徴と
する請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項６】上記細胞導入物質は、インターフェロンま
たは肝細胞成長因子であることを特徴とする請求項１〜
５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項７】静脈注射により人体に投与されることを特
徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項８】請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬剤
を投与することによる疾患の治療方法。