JPH07505773A - 標的化されたウイルスベクターを用いた遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、遺伝子治療方法に関する。

遺伝子治療は、治療用の遺伝子を直接的に人体に誘導することにより広い範囲で 病気を治療するためのアプローチである。遺伝子治療により使用できるであろう 疾病には、（１）癌、心臓病、アルツハイマー病、高血圧、アテローム性動脈硬 化症及び関節炎などの老齢者に関する疾病、（２）後天性免疫不全症候群（ＡＩ ＤＳ）及びヘルペスなどのウィルス感染症、並びに、（３）糖尿病、血友病、包 嚢繊維症、および筋ジストロフィーなどの遺伝病、が含まれている。

新たな遺伝情報をｉｓ　ｐｉｔｒｔで細胞内に誘導する最近の方法としては、細 胞融合法、染色体媒介挿入法（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−ｓｅｄｌａｔｅｄ　１ｎ ｓｅｒｔｉｏｎ　）　、マイクロセル媒介遺伝子トランスフｙ　−（ｓｉｃｒｏ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）　、リポソームＤ ＮＡキャリアーズ（ｌｌｐｏｓｏｍｅ　ＤＮＡ　ｃａｒｒｉｅｒｓ）、スフ二〇 ブラスト融合法、ＤＮＡ媒介遺伝子転移、マイクロインジェクション、組み換え ＲＮＡウィルスによるインフエクンヨン及び組み換えＤＮＡウィルスによるイン ジェクション（Ｍａｒｔ［ｎ、Ｊ、Ｃ、、ｌ９８４．１１０／、（”ｅ／／　ｌ ／ｆｏｒ／１ｗ、５９：３−１０　）がある。しかしながら、これらの技術は一 般的に用いられるものではない。それは、動物や人間に使用しても効果は少な（ 、導入された遺伝子は不安定であり、余計なあるいは望まない遺伝情報を移入し てしまったり、更には標的特異性を欠くようなことがあったりするからである。

１つの例において、人間の遺伝子治療の好ましいアプローチとしては、遺伝学的 に変化させた細胞を患者に移植手術すること（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　ｅｔ　ａ ｌ、、１９８ｇ、、、伶ｌＩ／７／〕細’ｒｉｊｅ　３２３　：　５７０−５７ ８）がある。このアプローチは、標的でない細胞から標的細胞を単離するために 、それぞれの患者から細胞を外科的に取り出す必要がある。遺伝子は、ウィルス 性のベクターか或いは他の手段を経て細胞内に導入され、その後、この遺伝学的 に変化させた細胞が患者に再移植される。このアプローチは、（例えば、病的細 胞が最早分泌することのできないホルモンを分泌する細胞の患者への移植に対す る）酵素置換治療のような目的にはよいが、包嚢繊維症や癌などの病変細胞それ 自身が矯正されなければならないような病気を取り扱うには移植戦略は不向きで あろう。このアプローチが一般的に出くわす他の問題は、幹細胞への形質導入が 非効率的で、転移遺伝子の発現が低く、しかも、元来癌化し易い細胞を選別する 組織培地において細胞を成育させる必要があるという技術上の問題である。最後 に、移植された遺伝子が非標的細胞内で不適切に発現するのは実際には患者にと って有害であろう。

遺伝子治療に対する他のアプローチは、１ｌｓｊｌｔｔで標的組織に遺伝子を直 接的に導入することを含んでいる。ｊｔｙ　５ｉｒｕで遺伝子を導入するための ２つの方法（生物学的転移法（Ｂｌｏｌｉｓｔｌｃ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）とダブ ルバルーンカテーテル法）が開発されている。遺伝子の生物学的転移法は、ＤＮ Ａでコートされた白金若しくは金の小弾丸を、標的組織に直接打ち込むことを含 む。生物学的転移法では、耳、皮膚及び外科手術的に露出された生きたマウスの 肝臓において遺伝子を一時的に発現させることに成功している（Ｊｏｈｎｓｔｏ ｎ、　Ｓ、Ａ、、１９９０．Ｊｋ／ｙｒｇ３７６：７７Ｂ−７７７；Ｗｉｔｆｌ ａｗｓ、Ｒ，Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、＋　１９９１．加ｃ　Ｎｉｌ／　Ｉｔ、ｔｔ ｆ　Ｓｄ　１１３１８１＋＋２７２６−２７３０　）　Aダブル バルーンカテーテル法は、境界の明確な動脈壁切片の細胞において遺伝子を形質 導入する。このアプローチにおいては、カテーテルの末端が目標エリアに達する まで、動脈内にダブルバルーンカテーテルを挿入する。このカテーテルの末端に 存在する２個のバルーンを膨張させると閉鎖空間が生成し、ここにレトロウィル スもしくはＤＮＡを負荷したリポソームを注入する。この方法は、ブタの回腸大 腿動脈の明確な切片においてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を一時的に発現するこ とに成功している（Ｎａｂｅｌ　Ｅ、Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、、１９９０．ｓｃ／ ｅｔｙｃｔｙ　２４９：１２ｇ５−１２８８）　、しかしながら、生物学的転移 法もダブルバルーンカテーテル法も位置特異的ではあるが、目標エリアにおいて 形質導入を行う個々の細胞においては非特異的に違いなく、転移遺伝子が目標と しない細胞内で発現した場合には、不当な遺伝子調節を引き起こすという問題を 生じる。更には、これら両方法はいずれも、肺、筋肉、腫瘍、又は全身循環系の 細胞のような大きな体積を占める組織の処理に有効性ではないように見える。こ れは、大多数の細胞を／／７５ｉｔｔｔの遺伝子転移に供することはできないか らである。

遺伝子治療に対する第３のアプローチは、／／７　ｙｊｙｏで細胞に遺伝子を誘 導することである。このアプローチは、インジェクション法、スプレィ法若しく は他の手段によりウィルスベクターを直接的に患者に導入することを含む。種々 のウィルスを工作して、当該ウィルスが通常感染する細胞に遺伝子を導入する。

例えば、アデノウィルス（通常肺細胞に感染する）は、肺細胞を標的とする遺伝 子のベクターとして開発されている（Ｒｏｓｅｎｆｌｅｌｄ、ｅｔ　ａｌ、、１ ９９２．ｒｇ／／８８１４３−１５５）　。しかしながら、大抵のウィルスベク ターは特定の細胞にしか遺伝子を誘導できないため、単一の目的達成用のベクタ ーとなる。ウィルスベクターの標的細胞特異性は当該ウィルスの通常の親和性に 制限されているため、一般的に、ウィルスベクターは細胞のタイプの広い範囲に 亘って感染するか、又は特定のタイプの細胞には全く感染しないかのいずれかに 限られる。

リポソームは、／／７　ｙ／πにおいて遺伝子あるいは薬物を特定の標的細胞に 誘導するように設計される。リポソームに抗体あるいはリガンドを化学的に共役 することにより、リポソームは特定細胞に対して標的化される。この方法におい て、アンチ−ＣＤ３−共役化リポソームを用いることにより、アンチセンス〜ｅ １７Ｖ−ＲＮＡが、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）に感染したリンパ球に誘 導されている（Ｒｅｎｎｅｆｓｅｎ、に、、　ｅｔ　ａｌ、、ｌ９９０．）１７ ／ｃ／　ｌ’ｋｚ　２６５：１８３３７−１６３４２）、クロラムフェニコール トランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子が、アンチ−Ｈ２Ｋｋ−共役化リポソー ムを用いることにより、Ｈ２に’−ネガティブなヌードマウスのＨ２Ｋｋ−陽性 リンパ種に誘導されているＣＷａｎｇ、Ｃ，ｅｔ　ａｔ　、　、　１９８７　、 ／）／−ｏｒ　＃／／　ｌｅａ／Ｓｃｊ　１ｌｓ１８４ニア８５１−７１１５５ ）。そして、キサンチン　グアニン　フォスフォリボシルトランスフェラーゼ（ ＸＧＰＲＴ）遺伝子は、スタフィロコッカスタンパクＡ−共役化リポソームを用 いて、イムノグロブリンでコートされた細胞に誘導されている（Ｍａｃｈｙ　Ｐ 、　、　ｅｔ　ａｌ　、、　１９１１８．Ｐｒｏｃ　、ｈｌ／　１ｅｓｔ／　Ｓ ｒ／　ｌ／３１８５：８０２７−８０R１）　、この 技術の主な欠点は、リガンドと共役したリポソームを多量に生産するための経費 である。

Ｗｕらは、特定の細胞へ裸のＤＮＡを標的指向する方法を報告している。アシア ログリコプロティンＤＮＡ１！合体は、アシアログリコプロティン受容体を発現 する肝細胞に対して標的化される（Ｗｕ　Ｇ、Ｙ、、ｅｔ　ａｌ、、１９９１　 ｉ！ｔ’ｏｆ７ｅｒ、ｇｐｙ３：８７−９５）。

イムノトキシンについても同様の問題に突き当たるが、大抵の場合、この戦略に よっては、ＤＮＡの内部化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ　）ができる受容 体を発現する細胞にしかＤＮＡを誘導できない。

アンチセンスＤＮＡ技術は、相捕的なりＮＡにより特定の遺伝子の発現を抑制す る方法であるＣＭＯｆｆａＬ、ｌ９９１．Ｓｃｌ′ｅｎｃｅ　２５３：５１Ｇ− ５１１）　６しかしながら、アンチセンスＤＮＡは、それが作用する遺伝子の中 では特異的であるが、それが導入される細胞の類型の中では非特異的なものであ る。これは／７７ｔ４１０において問題を生ずる。なぜならば、正常な細胞内の 内在性遺伝子はアンチセンスＤＮＡ　（例えば、プロトオンコジーン）により影 響を受けない状態であるのが望ましいからである。更には、アンチセンスＤＮＡ の製造及び投与コストは高いであろう。それは、原形質膜を通すためにアンチセ ンスＤＮＡのリン酸エステルの半分は化学的に改変しなければならず、そのため には費用のかかる有機化学を避けることができないからである。効果を得るため にミリモルオーダーにまでアンチセンスＤＮＡを濃縮した場合には、／ｌｙ　ｒ ｔ″Ｖθにおいて毒性の問題に悩まされることもあり得る。

ヒトの遺伝子治療は、遺伝子の誘導に必要な技術によって制限されている。移植 戦略（それには外科手術が必要である）では、少数の病気のための高価なサービ ス産業でしか遺伝子治療は行えない。／／７　ｓ／ｌｕで位置的な形質導入を行 うことにより遺伝子を標的化するのは、概して十分に正確なものではない。ウィ ルスベクターは、ｌγＰ／ｙｏにおける遺伝子の誘導を、当該ウィルスが通常感 染する細胞に制限する。リポソーム技術は、生産が高価であるため実行不可能で ある。単純なリガンドＤＮＡ複合体では、リガンドが指向されている受容体が細 胞内に内部化されない限り、遺伝子を細胞に誘導することができない。このよう に、近年の有用な遺伝子誘導システムは、遺伝子治療が取り扱える疾病の範囲を 著しく狭いものに制限してしまっているのである。

発明の開示 本発明は、発現させたい核酸を異種の宿主細胞で発現をさせる方法であることを 特徴とする。この方法は、１）発現させたい核酸、及び２）ハイブリッドエンベ ロープ遺伝子、を染色体に有するウィルスを提供することを含む。前記ハイブリ ッド遺伝子は、ターゲンチイングリガントと結合されたエンベロープ断片をコー ドする。これにより、前記エンベロープ断片は、その正常な宿主細胞の認識ある いは結合を容易にせす、ウィルス成熟粒子へのウィルスの効果的な組み入れを容 ｇにする。また、これにより、前記ターゲツティングリガンドは、前記異種の宿 主細胞の表面に対する成熟ウィルス粒子の標的化と結合を容易にする。その方法 は、ウィルスが細胞に感染できるように当該ウィルスを投与することを含む。

ここで、「効果的な組み入れ」とは、前記ハイブリッドエンベロープタンパクが 成熟ウィルス粒子に、対応する野生型エンベロープタンパクが成熟ウィルス粒子 に取り込まれる程度の少なくとも２５％の頻度で取り込まれていることを意味す る。

他の側面において、本発明はウィルス、そのハイブリッドエンベロープタンパク をコードするゲノムを特徴とする。ここで、前記ハイブリッドタンパクは、フレ ームでターゲッテングリガンドに結合したエンベロープフラグメントを含む。

これにより、このエンベロープフラグメントは、その正常な宿主細胞の認識もし くは結合を容易にするものではなく、前記ハイブリッドエンベロープタンパクが 成熟ウィルス粒子に効果的な組み入れをするのを容易にする。また、これにより 、非ウィルス性タンパクは、成熟ウィルス粒子がそのウィルスによっては通常感 染しない細胞の表面に標的化及び結合するのを容品にする。

第３の面において、本発明は、発現させたい核酸を異種の宿主細胞に誘導するた めの方法であることを特徴とする。この方法は、１）発現させたい核酸及び２） ハイブリットエンベロープ遺伝子（このハイブリッド遺伝子は、ターゲッテング リガンドに結合されたエンベロープフラグメントをコードする）を含むウィルス を提供することを含む。これにより、前記エンベロープフラグメントはその正常 な宿主細胞への認識あるいは結合を容易にはせず、成熟ウィルス粒子へのウィル スの効果的な組み入れを容易にする。また、これにより、前記ターゲソテングリ ガンドは、前記異種の宿生細胞の表面への成熟ウィルス粒子の標的化と結合を容 易にする。この方法は、細胞をウィルス感染させるためにそのウィルスを投与す ることを含む。

種々の好適な実施例において、前記ウィルスは、エンベロープを有するウィルス てあり、好ましくは、ヘルペトウイルス科、バアラミクソウイルス科、若しくは レトロウィルス科、最も好ましくは、モロニーネズミ白血病ウィルスであり、又 は、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、ポックスウィルス科、若しくはイリドウィ ルス科もウィルスとして好ましいであろう。同様に、ウィルスとして、トガウィ ルス科、ラブドウィルス科、コロナウィルス科、ラブドウィルス科、Ｆｉｌ。

ｖｉｒｉｄａｅ、オルソミクソウィルス科、ブンヤウイルス科、若しくはその他 の未だに分類されていないエンベロープを有するウィルスでもよい。

他の種々の好適な実施例においては、前記発現させたい核酸は、限定されること なく、アンチセンス癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐ５３をコードする遺 伝子、若しくは網膜芽腫タンパクＲｂをコードする遺伝子）、トキシン遺伝子（ 例えば、ジフテリアトキシン遺伝子）、又は、サイトカインをコードする遺伝子 （例えば腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）もしく はインターフェロン）を含む。発現させたい核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい 。例えば、アンチセンスＤＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ、又はアンチセンス ＲＮＡをコードする核酸でもよい。発現させたい核酸は、細胞内性免疫を付与す る遺伝子若しくは遺伝病の治療のための核酸（例えば、インシュリン遺伝子若し くは嚢包性繊維症トランスメンブレンレギュレータ遺伝子（ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉ ｂｒｏｓｔｓ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｇｅｎｅ） ）でもよい。「細胞内性免疫を付与する遺伝子」とは、優性なネガティブ抵抗性 の表現型をその細胞中に与える遺伝子であり、それにより当該細胞は薬剤の浸液 から防御される。

前記異種の宿主細胞は、疾病の状態になる既得の突然変異を有する細胞であり、 好ましくは癌細胞（例えば結腸癌細胞）でもよい。この異種の宿主細胞は、第２ のウィルス（例えばヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ））により感染されたもので もよく、生体により感染されたものでも、バクテリア若しくは寄生体のような感 染原体でもよい。この感染原体は単細胞でも多細胞でもよい。異種の宿主細胞は また、遺伝病にかかった細胞（例えば、膵臓ベータ細胞もしくは肺細胞）であつ バク質、好ましくはホルモン若しくはイムノグロブリン、更に好ましくは、抗体 が特異的に結合した抗腫瘍イムノグロブリン、最も好ましくは抗癌胚抗原抗体特 異的イムノグロブリン若しくは抗ＨＩＶｇｐ１２０抗体特異的イムノグロブリン を含めることができる。前記ターゲッテングリガンドは、炭水化物若しくは脂質 であってもよい。前記ハイブリッドエンベロープフラグメントは、リセプター結 合領域、オリゴマー化領域、膜貫通領域、ウィルス発芽領域、分類シグナル、シ グナル配列及び好ましくは融合領域で構成されてもよい。多くのケースにおいて 、前記エンベロープフラグメントの融合活性は、第２のタンパク質によってもよ い。

それゆえに、第２のタンパク質は標的細胞の外皮とウィルスを融合させるであろ う。

投与の方法は、１）精製ウィルスの直接的注射、あるいは２）ウィルスを含有す る容器の患者への移植、を含んでも良いが、これらに限られるものではない。

ウィルスが容器に入れて投与されるときは、ウィルスはパッケージング細胞の内 部にあることが好ましい。「パッケージング細胞」とは、ウィルスベクターの生 産に必要なウィルスタンパクを供給する細胞のことをいう。「容器」とは、ウィ ルス透過性のウィルス封入物、または、その中にウィルスが存在するパッケージ ング細胞を含むウィルス透過性の封入物、を意味する。

本明細書で使用されている「正常な宿主細胞」とは、自然に発生したウィルスに より普通に感染される細胞型をいう。これに対して、「異種の宿主細胞」若しく は「標的化された細胞」とは、本明細書においては、ハイブリッドエンベロープ タンパクのターゲッテングリガンド部分の機能として認識されているが、ハイブ リッドエンベロープタンパクのエンベロープ部分の機能として認識されていない 細胞のことをいう。「ターゲッテングリガンド」とは、標的化された所望の細胞 の表面の分子に親和力をもって結合する分子をいう。「ハイブリッドエンベロー プタンパク」とは、この明細書においては、ターゲッテングリガンドと共有結合 するウィルスエンベロープタンパク（若しくは生物学的に活性なそのアナログ） の部分を含むタンパク質をいう。例えば、ハイブリッドイムノグロブリン−ｅ〃 ｒタンパクとは、エンベロープタンパクの部分と共有結合するイムノグロブリン の部分を意味する。「ハイブリッドエンベロープ遺伝子」とは、ハイブリッドエ ンベロープタンパクに遺伝的な指令を与える核酸をいう。「ハイブリッド抗癌胚 抗原の抗体特異的イムノグロブリン」とは、ハイブリッドイムノグロブリン−ｅ 〃Ｖタンパクであって、癌胚抗原の抗体に特異的に結合するものをいう。

「フラグメント」という言葉は、エンベロープフラグメントと用いられているよ うに、幾つかのエンベロープタンパクを含むがその全てを含むものではない。

フラグメントは、通常は、少なくとも約２０個のアミノ酸、典型的には少なくと も約３０個のアミノ酸、普通には少なくとも約４０個の隣接アミノ酸、好ましく は少なくとも約５０個のアミノ酸、そして最も好ましくは、少なくとも約６０〜 約８０若しくはそれ以上の隣接するアミノ酸からなる。エンベロープタンパクの フラグメントは、当業者により常法（例えば、これらは本明細書に記載されてい る）に従って作ることができる。

生物学的に活性なウィルスエンベロープタンパクのフラグメントは、次に示され る活性のいずれか１つを有している。

ａ）適切なターゲッテングリガンドが与えられると細胞外被に結合できる。

ｂ）細胞膜との融合を可能にし得る。又は、Ｃ）成熟ウィルス粒子へのタンパク 質の組み入れを可能にし得る。

これらの３個の生物学的な活性は、幾つかのエンベロープタンパクフラグメント か或いは２つに分離されたエンベロープタンパクフラグメントにより達成するこ とができる。上述したように、本発明に係るエンベロープフラグメントは、ウィ ルスによる正常な宿主細胞の認識あるいは結合を容易にするものではない。これ は、突然変異により正常なりセブター結合領域の活性を破壊するかあるいはそれ を物理的に除去することによって達成される。新たに組み換えられたりセブター 結合部位は、その場所に付加される。ウィルスエンベロープタンパクの生物学的 活性を出す候補フラグメントの能力は、当業者によく知られた方法により評価す ることができる。

エンベロープフラグメントは、自然発生するウィルスエンベロープのアミノ酸配 列を含んでもよく、また、生物学的に活性なそれらのアナログであってもよい。

エンベロープアナログの生物学的活性は、本明細書に記載されているようなエン ベロープフラグメントの活性を試験する方法により評価される。

本出願人は、特定の動物、植物もしくはヒト細胞型に対して、又は感染原体の細 胞に対して治療用の遺伝子若しくはアンチセンスな核酸を特異的に誘導する効果 的かつ信頼性のある手段を提供している。これらの方法は、突然変異性の後天的 な、感染性な、若しくは遺伝的な疾病の取扱を容品にする。例えば、それは次の いずれかによるものである。１）細胞性遺伝子に存在している効果を中和する、 ２）細胞性遺伝子に存在している欠陥を補足する、３）新たな遺伝物質を導入す ることにより標的細胞を破壊する、あるいは４）新たな遺伝物質を導入すること により標的細胞の表現型を変化させる。特定の標的細胞と特定の相互作用をさせ るハイブリッドエンベロープタンパク（例えば、エンベロープ抗体若しくはエン ベロープリガンドハイブリッド）が、特定の標的細胞に誘導するために、使用さ れる。ウィルスはそれ自体、その効果的な内部化機構を通じて治療用遺伝子の効 果的な内部化を容品に行う。そのようなウィルス性のベクターは遺伝子、ＲＮＡ 若しくは薬物を正常に内部化しない細胞表面タンパクに運ぶように適合する。

本発明の他の利点は、他の遺伝子治療が遭遇する遺伝子調節の問題を克服したこ とである。遺伝学的に選択された細胞は、正しい場所に、正しい時間に、及び正 しい量で遺伝子産物が合成されなければならないだけでなく、生来の組織と同じ 方法により調節されなければならない。従って、形質導入された細胞は、細胞外 のシグナルに応答するための固有のシグナル形質導入機構を全て有していなけれ ばならない。これは糖尿病の遺伝子治療において問題となるであろう。例えば、 インシュリン遺伝子を含む繊維芽細胞を移植する場所によっては効果はないか或 いは有害でさえある可能性がある。繊維芽細胞は、膵臓のベータ細胞と同じリセ ブターのシグナル形質導入機構を有していないので、インシュリン遺伝子が発現 するのは難しいであろう。正しい細胞に対する標的遺伝子は、当該遺伝子が正当 に調節されることを保証する。

本発明の更なる側面において、ノ＼イブリッドエンベロープタンパクを含むウィ ルスを作り出すための選別計画がたてられた。この戦略は、イムノグロブリン若 しくは細胞上の特異的な受容体を認識するあらゆるリガンドとｅｎｙタンパクを 融合するために実行することができるであろう。

本発明の他の特徴及び利点は、次に示す好適な実施例及び請求の範囲から明らか になるであろう。

詳細な記述 まず最初に図面の簡単な説明する。

図面 図１は、レトロウィルスベクターｐＬＮＣＸ”の構築計画を示したものである。

図２は、プラスミドＬＮＣｅｎｖｐＡの構築計画を示したものである。

図３は、プラスミドＬＮＣｅｔｙｖの構築計画を示したものである。

図４は、プラスミドｐＵＣＳｔａｒ−３ｉｇの構築計画を示したものである。

図５は、プラスミドＬＮＧ−３ｉｇの構築計画を示したものである。

図６は、プラスミドＬＮＧ−７／７／；ＣＥＡの構築計画を示したものである。

図７は、標的にされたウィルスの構築に用いられたプラスミドを示したものであ る。

図８は、ｊｔｙ　ｙｊ′ｔｒｏにおいてハイブリッドイムノグロブリン−１”／ ７Ｖ遺伝子の構築を含む、目的とされたレトロウィルスの作製計画を示したもの である。

図９は、プールされたウィルスを構築の生成を含む標的とされたレトロウィルス の生成戦略を示すものである。

図１０は、標的とされたウィルスの選択及び特定を含む標的にされたレトロウィ ルスの生成戦略を示すものである。

図１１は、標的にされたレトロウィルスベクターを含むプラスミドを示すもので ある。

図１２は、プラスミドｐＵＣ５ｔａｒ−ａｎｔｉｃＥＡの構築計画を示すもので ある。

図１３は、プラスミドＬＮＣ−ａｎｔ　ｔｃＥＡの他の構築計画を示したもので ある。

以下に示すのは、標的にされたウィルスベクターを用いた標的細胞に対する遺伝 子の誘導方法である。ウィルスを作製し標的とするために、ウィルスエンベロー プタンパクの受容体認識領域は、特異的な細胞の表面受容体に対するリガンドに 置換される。ハイブリッドエンベロープタンパクは発芽過程の間ウイルスエンベ ローブに組み込まれ、ｌ’ｎ　ＶＩ’Ｖθにおいてハイブリッドウィルスを生成 する。宿主の感染に際し、ハブリッドウィルスは特異的に標的細胞を認識する。

そして、その細胞との融合物はウィルス遺伝子の（標的細胞内への）内部化を容 易にするが、この遺伝子にはウィルスゲノムの中に導入工作された治療用遺伝子 が含まれる。このような内部化は極めて重要であろう。例えば、免疫毒素は、標 的細胞への毒素分子の誘導に効果的であるにもかかわらず、標的にされている細 胞の表面分子が内部化せず、この内部化が毒素分子が細胞内に入る必要があるた め、免疫毒素はしばしば臨床的に非効果的である（Ｗａｌｄｓａｎｎ、Ｔ、＾、 、１９９１，５ｃｉｅｎｃｅ　２５２・１６５７−１６２２）。標的化されたウ ィルスは、ウィルスそれ自体が必要な細胞融合機構を有しているため、受容体の 内部化の必要性を回避できる（Ｇｌｌｂｅｒｔ、Ｊ、Ｍ、、ｅＬａｌ、、１９９ ０．Ｊ　Ｖｌｒｏｌ　６４：５１０６−５１１３；Ｒｏｌｚｍａｎ　Ｂ、ｅｔ　 ａｌ、、１９９００．Ｉｎ　ＢＮ　Ｆｉｅｌр刀Aｅｔ　ａｌ。

一般的に標的ウィルスはウィルスエンベロープ蛋白質のレセプタ認識領域を特定 の細胞表面レセプタに向けられたリガンドに置き換えることによって構成される 。リガンドは、それに限定されないが、免疫グロブリン（例えば、ＦＡｂ、ｄＡ ｂＳＦｄ、またはＦＣ）、ホルモン、あるいは標的ウィルスの結合を細胞表面の 分子に向けることのできるその他の合成または天然の蛋白とすることができる。

リガンドはウィルスのアセンブリと発芽に関与する正常なウィルスエンベロープ 蛋白の部分との遺伝子融合によってウィルスエンベロープ内に生物学的に組み込 まれている。ハイブリッド蛋白のエンベロープ部分はエンベロープ１１イブ１ル ンド蛋白のウィルスエンベロープ内への効率的な組み込みを導くのに充分なエン ベロープ断片（あるいはそれに類似のもの）から成る。エンベロージハイブリン ト蛋白部分はウィルスとその正常な宿主細胞の間の相互作用を導かないことが望 ましい。

すでに証明されているように、ウィルスのエンベロープのレセプタ特異性を変え るとウィルスの親和性が変わる。例えば、ウィルスエンベロープがレトロウィル スのそれに換えられた小嚢性口内炎ウィルス（Ｖ　Ｓ　Ｖ）ブスドタイブはレト ロウィルスの感染可能細胞を感染させる能力を獲得する（Ｓｃｈｎｌｔｚｅｒ■ Ｔ、Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、１９７７、　Ｊ　Ｇｅｎ　ｌ／Ｉｒｏｌ　２３：４ ４９−４５４；　Ｚａｖａｄａ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｔ、、　１９７２．　Ｊ　 Ｇｅ氏@Ｖｌｒｏｌ　１５ ：１８３−１９１）ので、ウィルスのコア蛋白とエンベロープ蛋白の間の種固有 の蛋白量相互作用は少なくともこれらの事例についてはウィルスの融合と浸入に とって決定的ではないことが示される。さらに、以前の実験でもウィルスエンベ ロープは例えば接合したリガンドによってエンベロープ蛋白内に誘導された長さ や立体配座の変化を許容することが示されている。例えばＧｌｔ■ａｎ　ｅｔ　 ａｌ、は抗赤血球抗体に化学的に架橋した、ウィルスエンベロープグリコ蛋白で 再構成したセンダイウィルスエンベロープは正常なウィルスレセプタをはぎ取ら れた赤血球に結合する能力を獲得することが証明された。同様に、インシュリン 分子と化学的に架橋したエンベロープ蛋白で再構成したセンダイウィルスエンベ ロープはインシュリンレセプタを表現するレセプタ除去赤血球に結合することが できた。いずれの場合にも、レセプタ除去赤血球とのエンベロープ結合が発生し たが、融合は起きなかった。しかしながら、結合したエンベロープと赤血球の間 の融合が発生したのは、結合したエンベロープが正常な赤血球凝集素／ノイラミ ニダーゼと融合蛋白でコア形成されているときであった（Ｇｉｔｓａｎ、＾、Ｇ 、、　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　２４：２７６２−２７８８ 　）。

好適には、標的ウィルスは次のものを含んでいる、１）宿主の細胞膜に由来する ウィルスエンベロープ：２）ウィルスの結合と浸入を特定の標的細胞に向ける経 膜ハイブリッドエンベローブ蛋白、３）ウィルス浸入のために標的細胞の細胞膜 との標的ウィルスの融合を導く経膜エンベロープ蛋白（例えば、標的蛋白質自身 または他のエンベロープ蛋白）；４）ウィルスコア蛋白；５）対象外来遺伝子− 及び６）ウィルスゲノム中に含まれる遺伝子の浸入と表現のために必要な全ての ウィルス及び遺伝子構成要素。経膜１１イブリッドエンベロープ蛋白は次のもの から成る、１）ハイブリッド蛋白が処理され、ウィルスエンベロープ内に移入す ることを可能にする決定子；２）ウィルスエンベロープと標的細胞膜との融合を 可能にする決定子、これらは標的ウィルスの浸入に必須である；３）標的ウィル スが標的細胞上の特定のレセプタを認識し、結合するのを可能にするリガンド決 定子。ウィルスゲノムはバクテリア選択マーカー（例えばアンピシリン耐性）及 び／または哺乳類細胞選択マーカー（例えば、ネモマイシン耐性）。

経膜ハイブリッド蛋白はリガンド遺伝子の細胞表面レセプタ結合領域をウィルス エンベロープ蛋白遺伝子の部分に接合することによって遺伝子学的に構成される 。経膜ハイブリッド蛋白は効果的な翻訳後処理（ｐｏｓｔ−１ｒａｎｓｌａｔｉ ｏｎａｌ　ｐｒＯＣｅＳＳｉｎｇ）　、分類及び蛋白質のウィルスエンベロープ 内への移入を指揮するエンベロープ蛋白の部分を保持しなければならない。

ハイブリッドリガンドエンベロープ構成においては次の領域を考慮に入れなけれ ばならない・ １、レセプタ結合領域 レセプタ結合領域は細胞表面レセプタ（受容体）を認識し、結合するエンベロー プ蛋白の蛋白である。ハイブリッドエンベロープ蛋白において、エンベロープ蛋 白のこの蛋白はりガント配列によって置換される。レトロウィルスエンベロープ 蛋白のレセプタ結合領域はＳＵサブユニットに限定された（Ｃｏｉｎ、　Ｊ、Ｍ 、、　１９９０、　Ｉｎ　ＢＮ　Ｆｉｅｌｄｓ、　ａｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、Ｖ ［ｒｏｌｏｇｙ、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｔｄ、、　Ｎｅｗ　xｏｒｋ 　）。

レトロウィルスのＳＵ蛋白は経膜蛋白に対して５′に暗号指定されているので、 エンベロープ蛋白のアミノ末端配列のリガンド配列による置換は機能的なハイブ リッドリガントエンベロープ蛋白を作り出すのに何の問題もない。

２、蛋白分解切断部位 レトロウィルスのエンベロープ蛋白はＳＵおよびＴＭへテロダイマーを形成する ために後に蛋白切断される蛋白として合成される。ｌ）イブリ・ソドリガンドエ ンベローブ蛋白の構成のために、蛋白切断部位は除去しなければならない。蛋白 切断部位は欠失または部位に向けられた突然変異誘発によって除去しなければな らない。Ｐｅｒｅｚと１ｌｕｎｔｅｒは蛋白切断部位の除去によってラウス氏肉 腫つィルスエンベロープ蛋白の移動または表面発現を阻止しないことを証明した （Ｐｅｒｅｚ、　Ｌ、Ｇ、。

多くの動物のウィルスのエンベロープ蛋白は結合して３量体を形成する（Ｆｉｅ ｆｄｓ、　Ｂ、Ｎ、、　ｅｔ　ａｔ、、　１９９１．　Ｖｌｒｏｌｏｇｙ、　２ ｎｄ　ｅｄ、、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｔｄ、、　Ｎ■浴@Ｙｏｒｋ） 。

エンベロープ蛋白の３量体化はエンベロープ蛋白のウィルスエンベロープ内への 適切な移動と移入に不可欠と考えられた（Ｓｌｎｇｈ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、 　１９９０．　Ｅｃｂｏ　Ｊ　２：６３１−６３９：　Ｋｒｅｊｓ　Ｔ、Ｅ、、 　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．Ｃｅｌ　４６：９２９−９３７）　、したがって 、この領域がハイブリッドリガンドエンベロープ蛋白内に保持されることが重要 である。３量体化領域はレトロウィルスの経膜ＴＭ蛋白内にあるらしい（Ｅｌｎ ｆｅｌｄ、　Ｄ、、　ｅｔａｌ、、　１９１１ｇ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃ ａｄ　Ｓｃｌ　ＵＳＡ　８５：８６ｇｇ−８６９２）　；故に、ＳＵサブユニツ トが欠けた機能的ハイブリッドリガンドエンベロープレトロウィルス蛋白を作り 出すこと力呵能である。一部のウィルスエンベロープ蛋白は低重合体化して３量 体以外の化学量論的組合せを形成するだろう。

４、融合領域 融合領域はウィルスエンベロープと細胞膜の融合に関与したアミノ酸の疎水性伸 長部である（Ｖｌｌｅｙ、　Ｄ、Ｃ，、ｅｔ　ａｔ、、　１９９０．　Ｉｎ　Ｆ ｉｅｌｄｓ、　Ｂ、Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、　Ｖ■ ｒｏｌｏｇｙ、　２ｎｄ　ｅｄ、、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　ｔ、ｔｄ、、　 ＮｅＶ　Ｙｏｒｋ）　ｏウィルス融合はウィルスコア蛋白とゲノムが細胞内に入 るのを可能にする。インフルエンザウィルスにおいて、エンベロープＨＡ２蛋白 のアミノ末端に位置する融合領域は、低ｐＨ誘導立体配座変化によって融合領域 の細胞膜への呈示力呵能になるまで血球凝集素３量体内に封鎖される。エンベロ ープ蛋白の３量体化は内部の疎水性嚢内に封鎖することによって融合活性の構成 的発現を阻止することができる。潜在融合領域はラウス氏肉腫ウィルスのｇｐ３ ７１Ｍ蛋白の細胞外部分内に−付けられた（Ｈｕｎｔｅｒ　Ｅ、　ｅｔ、　ａｔ 、、　１９８３．　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　４６：９２０−９３６　）　、同様な疎水 性融合配列はＭｏｌ。

ｎｅｙ氏マウマウス白血病ウィルスｏ−ＭｕＬＶ　）のｐ１５Ｅ蛋白中にも報告 されている（Ｃｈａｓｂｅｒｓ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｊ　 Ｇｅｎ　Ｖｌｒｏｌ　７１：３０７５−３０１１０）。

ハイブリッドリガンドエンベロープ蛋白を構成するとき、標的ウィルスの感染活 性を損なうかも知れない状態である、構成融合活性を除去する必要があるかも知 れない。したがって、２つの蛋白を標的定めウィルスのウィルスエンベロープ内 に移入しても良い。第１の蛋白はウィルスの標的定めを向ける／１イブリ・ンド リガンドエンベローブ蛋白であるが、融合活性は欠落している。第２の蛋白は融 合活性を備えているがレセプタ結合領域が欠落したエンベロープ蛋白である。こ の様な状態は１つのエンベロープ蛋白が標的定めに専念し、他方が融合を実行す るパラミクソウィルスにおいて認められる（Ｋｌｎｇｓｂｕｒｒｙ、　Ｄ韮、　 １９９０．　Ｂ、Ｎ、　Ｐｉｌｅｄ融合活性を阻止する必要がないときは両方の 活性を１つの蛋白内に含めることが経膜領域はエンベロープ蛋白をウィルスエン ベロープに定着させるおよそ２０個以上のアミノ酸の伸長部である。それはＭｏ ｌｏｎｅｙ氏マウス白血病ウィルスのｐ１５Ｅ蛋白内に位置する（Ｃｈａ■ｂｅ ｒｓ、　ｅｔ　ａｔ、、前掲）。経膜領域の保持は必須と考えられるが、それは 経膜領域の欠失の結果合成エンベロープ蛋白が分泌されるエンベロープ蛋白内の アミノ酸配列にはウィルスエンベロープ内へのウィルスエンベロープ蛋白の排他 的移入及びウィルス発芽が関連しているかも知れない。

ウィルス発芽領域はハイブリッドエンベロープ蛋白をウィルスエンベロープ内に 向ける。これらの配列はウィルスの内側に向いたエンベロープ蛋白の蛋白中に位 置し、エンベロープ蛋白とウィルスコアまたは基質蛋白の特殊な蛋白量相互作用 を伴うかも知れない。Ｐｅｒｅｚ　ｅｔ　ａｌ、はラウス氏肉腫つィルスｅｎｖ 蛋白のカルボキシ末端配列の欠失の結果突然変異ウィルスが正常に発芽すること を実証したが（Ｐｅｒｅｚ、　Ｌ、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ　Ｖ ｌｒｏｌ　６１：２９１１１−２９１１８）　、証拠が存在するように、他のウ ィルスについては、エンベロープ蛋白とウィルスコアの間の相互作用はウィルス アセンブリとエンベロープを導く可能性がある（ＢＮ　Ｆｉｅｌｄｓ、　ｅｔ　 ａｌ、、　ｅｄｓ分類信号は翻訳後処理（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａ ｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）の間、修正細胞間位置にエンベロープ蛋白を指向さ せる決定子である。これらの配列はエンベロープ蛋白が細胞質網状構造、ゴルジ 体、その他の細胞小器官を通って最終的にはウィルスエンベロープに達すること を保証する。ハイブリッドリガンドエンベロープ蛋白に置いて保持すべき他の信 号としてはグリコジル化配列とエンベロープ蛋白の効率的な立体配座に関与する 配列（例えば、二値化物結合）がある。

８、信号配列（シグナル配列） 信号配列はエンベロープ蛋白を細胞質網膜構造内に導くアミノ酸のアミノ末端疎 水性伸長部である。後に蛋白質分解によって切断される信号配列はハイブリッド リガンドエンベロープ蛋白が膜内に位置づけられるために必須である。

標的ウィルスの構成において考慮すべき信号と領域は多様であるので、リガンド とエンベロープ遺伝子の精密かつ正確な接合が起きることが必要である。本発明 はりガント遺伝子がエンベロープ遺伝子断片に接合される標的ウィルスを構成す るための選択方式を記載する；このハイブリッド遺伝子は結果として生じるハイ ブリッドエンベロープリガンド蛋白を成熟したウィルス粒子内に効率的に移入す る半う指揮するのに要求されるエンベロープ蛋白の蛋白を暗号指定する。選択方 式に従えば、リガンド遺伝子の細胞表面レセプタ結合領域はウィルスエンベロー プ遺伝子の段階的欠失に無作為に連結される。リガンドとエンベロープ配列の正 確な組合せは生物学的に活性の標的ウィルスの生成のための選択方式によって決 定される。選択方式は標的ウィルスを発生するだけでなく、将来の標的ウィルス の構成を簡略にする。

標的レトロウィルスの特定の実例 細胞に所望の治療遺伝子を提供する目的のために、特定の宿主細胞を標的として 感染させる組み換えレトロウィルスの実例を以下に挙げる。この例は本発明の説 明のために挙げられるものであり、それを限定するものではない。

Ｍｏｌｏｎｅｙ氏マウス白血病ウィルス（Ｎｏ−ＭｕＬＶ　）はマウスの生態型 レトロウィルスである。結腸癌細胞を標的とする組み換えＮｏ−ＭｕＬＶ系のレ トロウィルスベクターが構成される。標的レトロウィルスベクターはネオマイシ ン耐性遺伝子を結腸癌細胞に提供する。ヒトの結腸ガン細胞への標的合わせはウ ィルスエンベロープ内に癌胚抗原に対して向けられたハイブリッド免疫グロブリ ン−ｅｎｖｌ白を移入することによって実現される。癌胚抗原（ＣＥＡ）はヒト の結腸癌細胞表面に発現するが、正常な成人細胞表面には発現しない腫瘍に伴う 抗原である。多数の膜架橋アルファ螺旋を有するＣＥＡグリコ蛋白はリガンドに 応じて内面化しない（Ｂｅｎｃｈｌｍｏｌ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８９ ．　Ｃｅ１ｌ　５７：３２７−３３４　）　、癌胚抗原と相同の蛋白はマウスの 肝炎ウィルスのレセプタであることが最近証明された（Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、　Ｇ 。

Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１．　Ｊ　Ｖｌｒｏｌ　６５：６８８１−６８ ９１）。

この説明を目的として、抗ＣＥＡのＨ鎖の単一の可変領域がｅｎｖ遺伝子の一部 に融合された。単一の可変Ｈ鎖断片（ｄＡｂ）は抗原結合においてＨ鎖とＬ鎖の 両方の断片を含む、断片化抗体（ＦＡｂ）と同じくらい効果的であることが証明 されている（Ｗａｒｄ、　Ｅ、Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３４１ ：５４４−５４６）　ｏ　しかしながら免疫グロブリン−ｅｎｖ蛋白の機能はｄ Ａｂの使用に限られるものではなく　ＦＡｂ。

ＦｖやｍＡｂと共に適用できる。

レトロウィルスベクターＬＮＣＸの修正ＬＮＣＸはプラスミドｐＬＮＣＸ内に含 まれるレトロウィルスベクターに基づ（Ｍｏｌｏｎｅｙ氏マウス白血病ウィルス である（Ｍｉｌｌｅｒ、＾、Ｄ、、　ｅｔ　ａｔ、、　１９ｇ９．　Ｂｏｌｅｃ ｈｎｌｑｕｅｓ　１・９８０−９９０）。ｐＬＮＣＸが含んでいるのは挿入され た遺伝子の発現のための独自のｌｌ［ｎｄｌｌｌ及びＣｌａｌ部位、巨細胞ウィ ルス（ＣＭＶ）プロモータ、ポリアデニル化部位（ｐＡ）、レトロウィルスＲＮ Ａ転写と逆転写のためのレトロウィルス長末端反復（ＬＴＲ）　、ネオマイシン と０４１８の両方に対する耐性を伝達するバクテリアネオマイシン耐性遺伝子（ Ｎｅｏ）、複製のバクテリア原点（Ｏｒ）、バクテリアアンピシリン耐性遺伝子 （Ａｍｐ）及びレトロウィルスＲＮＡ充填配列（甲＋）である。ＬＮＣＸは図１ に示したごとく独自の５ａｌｌ部位を含むように修正されている。ｐＬＣＮＸは Ｘｂａｌと線形化され、ファージミドＢｌｕｅｓｃｒｌｐｔｌｌ　ＳＫ＋のＸｂ ａ１部位内に亜クローン化されている（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　ＬａＪｏｌｌ ａ、　ＣＡ）　、−末鎖ＤＮＡは生成されＬＮＣＸの独自のＢｓｔ１１部位はオ リゴヌクレオチド５’　−ＧＣＡＧＡＡＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＡＣＧ−３°　（ 配列番号＝１）と共に部位に支配された突然変異生成によって５ａｌｌ部位内に 転換される。ＢｓｔＦ、１１部位はＮｏ−ＭｕＬＶ　ＲＮ　Ａの延長した充填信 号（Ｗ＋）内に位置づけられる（Ｂｅｎｄｅｒ、　Ｍ、＾、、　ｅｔ　ａｔ、、 　１９８７．　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　８１：１６３９−＋６４９；　Ａｄａｍ、　Ｍ 、＾、、　■煤@ａｌ、。

１９８ｇ、　Ｊ　Ｖｌｒｏｌ　Ｂ２：３１１０２−３８０６：　Ａｒ１ｅｎｔａ ｎｏ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｔ、、　１９８７．　Ｊ　Ｖｌｒｏ戟@６１：１６４７ − １６５０）。ＢｓＬＥＩＩ部位の５ａｌｌへの転換は充填に影響しないが、それ はこの領域が効果的な充填に重要でないことが決定されたからである（Ｓｃｈｖ ａｒｔｚｂｅｒｇ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａされるが、それは５ａｌｌ部位ではなく 、ＢｓＬＥＩ　１部位がＨ鎖遺伝子内で頬繁に発生す０６６−１０７０）。プラ スミドを含有する５ａｌｌはＸｂａｌとＤＮＡリガーゼと共に再循環してプラス ミドｐＬＮＣＸ＊を形成する。

ｐＬＮＣＸ＊内のＮｏ−ＭｕＬＶ　ｅ　ｎ　ｖ蛋白のクローン化Ｎｏ−ＭｕＬＶ 　ｅ　ｎ　ｖ遺伝子は図２に示したごと（ｐｔ、Ｎｃｘｓ内にクローン化される ｏ　Ｎｏ−ＭｕＬＶ　ｅ　ｎ　ｖ遺伝子は１　、　９　ｋ　ｂ　５ｃａｌ−Ｎｈ ｅｌ断片としてプラスミドｐ８゜２から摘出される（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｃ ，、ｅｔ　ａｌ、、　１９８０．　Ｐｒｏｃ　Ｎａ１ｌ＾ｃａｄ　Ａｃｉ　ＵＳ Ａ　７７：３９３２−３９３６）　、　１．　９ｋｂ　５ｅａｌ−Ｎｈｅｌ断片 はｐ１５Ｅ経膜蛋白のための完全な暗号化領域とｇｐ７０　ＳＵ蛋白の暗号化領 域の大半が含まれる。５′　−の突出している末端はＳｌ−ヌクレアーゼで消化 され、Ｈｌｎｄｌｌｌ　リンカ−（５−ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ−３’　；配列番 号＝２）が加えられる。ｅｎｖ遺伝子はＨ１ｎｄｌｌｌ断片としてｐＬＮＣＸ＊ のＨＩｎｄｌ１１部位内にクローン化されてプラスミドＬＮＣｅｎｖｐＡを形成 する。Ｈｌｎｄｌｌｌ　ｅｎｖ断片の方向は細胞メガロウイルス（ＣＭＶ）プロ モータから転写され、表現されるような方向である。

ＬＮＣｅｎｖに対するＬＮＣｅｎｖｐＡの修飾ＬＮＣｅｎｖｐＡは追加の部位に 支配された突然変異発生のためにファージミドｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｉ　Ｉｔ　 ＳＫ＋内にＸｂａ　ｌ断片としてクローン化される（図３）。ｅｎＶ符号化Ｈ１ ｎｄｌｌｌ断片はウィルスベクターによりて提供されるポリアデニル化信号と干 渉するかも知れないポリアデニル化信号を含んでいる。ＡＡＵＡＡＡポリアデニ ル化信号はそれ故にオリゴヌクレオチド５°　−ＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴＣ− ３’　（配列番号＝３）で部位に支配された突然変異発生によってＡＡＧＡＡＡ に変えられる。ｅｎｖ遺伝子の３°端に位置づけられるＢｉｎｄｌ１１部位はオ リゴヌクレオチド５−ＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＴＴＧＣＣ−３’　（配列番号：４ ）で部位に支配される突然変異によって除去される。ｅｎｖを含むレトロウィル スベクターはＸｂａｌ制限と結紮によって再循環されてプラスミドＬＮＣｅ　ｎ 　ｖを形成する。

抗ＣＥＡ免疫グロブリン遺伝子の分子クローニング抗ＣＥＡ　Ｈ鎖遺伝子の成熟 可変領域ドメインを暗号指定するｃＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ　ＣＲ） とＲＮＡ鋳型を用いてＸｈｏｌ−８ｐｅｌ断片としてクローン化される。ＲＮＡ は精製した癌胚抗原に対して免疫を付けたマウスの牌臓から採った。その代わり に、ＲＮＡはＣＥＡに対して単クローン抗体を分泌するハイブリドーマ細胞ライ ン、例えば１．１１６ＮＳ−３ｄ　（＾ｍｅｒｌｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃ。

１１ｅｃｔｌｏｎ　ｃｒｌｌｌ（１１９）またはＣＥＡ　６６−Ｅ　３　ＣＷａ ｇｅｎｅｒ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｊ１＋ｎｕｎｏ１１３０： ２３０８−２３１５）から採ることもできる。

下記のＰＣＲプライマーは成熟Ｈ鎖遺伝子（Ｓｔｒａｔａｃｙｔｅ、　Ｉｎｃ、 ）のアミノ末端端をｃＤＮＡ暗号指定するためにハイブリッド化する。退化プラ イマーは下線を引いたＸｈｏ１部位を導入する。

５’　ＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧロエ叡１．ＱＴＣＴＧＧ　］Ｆ　（ＳＥＱより　 Ｎｏ：　８）　□５’　ＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧロエａ環ＴＣＴＧＧ　３’　（ ＳＥＱより　Ｎｏ：　９）下記のＰＣＲプライマーはＪ領域を暗号指定する領域 内で免疫グロブリンＨ鎖ｍＲＮＡにハイブリッド化し、５ｐｅｌとＢｓｔＥ１１ 部位を導入する。

５’　ＣＴＡｌｒＴ砧ｓλπＧＡＣ弱コムｘＧＴＧＧＴＣＣＣＴｒＧＧＣＣＣＣ Ａ　３’　（ＳＥＱより　Ｎｏ：　１０） Ｓｐａｒ　ＢｓｔＥ工工 増幅された抗ＣＥＡ遺伝子ＤＮＡは免疫ＺＡＰ　Ｈベクター（Ｓｔｒａｔａｃｙ ｔｅ、　Ｉｎｃ、）内のＸｈｏｌ−３ｐｅｌ断片としてクローン化される（Ｍｕ ｌｉｌｎａｘ、　Ｒ，１，ｅｔ　ａｌ、、　１９９０、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ＾ ｃａｄ　Ａｃｔ　ＵＳＡ　Ｉｔ７：１１０９５−１ｔ０９９）　。免疫ＺＡＰ　 Ｈはｐｅ　ＩＢ信号配列の背後でＥ、ｅｏｌｌ免疫グロブリン可変Ｈ鎖断片内で 発現するように修正された。

手順は充填細胞細胞ライン内に免疫グロブリンＬ鎖断片を発現することによって 同様に実行することができるだろう。

高親和性抗ＣＥＡクローンの識別 高親和性抗ＣＥＡ抗体を発現するクローンはフィルタ結合分析によって識別され る。抗ＣＥＡファージライブラリは先に述べたごと＜ＣＥＡに接合した已２５！ ］ウシ血清アルブミンでニトロセルロースプラーク引き上げによって選別される （）ｆｕｓｅ、　Ｗ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４Ｂ：１２７５−１２８１）　ｏ高及び中間親和性抗ＣＥＡクローンが選択され 、さらに操作される。

プラスミドＬＮＧ−免疫グロブリンの構成プラスミドＬＮＣ−免疫グロブリン（ この実例では、抗ＣＥＡ免疫グロブリン遺伝子を暗号指定するＬＮＣ−抗ＣＥＡ ）を作り出すために２つの戦略が提供される。ＬＮＧ−免疫グロブリンベクター はアミノ末端信号配列に融合した免疫グロブリンペプチドを暗号指定する。成熟 免疫グロブリンペプチドのアミノ末端端にある一部のアミノ酸は免疫ＺＡＰライ ブラリを発生するのに使用されたＰＣＲによって修正された。さらに、ＬＮＣ− 抗ＣＥＡプラスミドの設計の結果余分のアミノ酸がアミノ末端端に挿入された。

これらのアミノ酸変化は抗原結合に影響しないのは、１）アミノ酸変化に保存性 がない、２）影響されたアミノ酸は通常その部位において可変である；また３） 影響されたアミノ酸は抗原結合または抗体の配座に関与しないことが証明されて いる免疫グロブリンの骨組み領域内で発生する（Ｒｅｌｃｈｍａｎ　ｅｔ　ａｔ 、、　１９８８　Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３−３２７）　、からである。こ れと同じ理由のために、成熟ペプチドからの信号配列の切断は影響を受けないだ ろう。

ＬＮＧ−免疫グロブリンを作り出すための戦略は共に、下記に構造を紹介する、 プラスミドｐ　Ｕ　ＣＳｔａｒ−３１ｇの使用に依存している。

免疫信号配列は次のようにｐ　Ｕ　ＣＳｔａｒ−８１ｇを作り出すために修正さ れたＰｕｃｌ１９ベクター内にクローン化される（図４）。ｐＵＣはポリリンカ ークローン化部位を含むファージミドである。ｐＵｃ１１９の多数のクローン化 部位は下記のポリリンカーをｐＵｃ１１９のＨｌｎｄｌｌｌとＸｂａ１部位に挿 入することによって新しい制限部位に置換される。

ＨｌｎｄＨＩ　Ｐ＋ｓｔｒ　Ｘｈｏｌ　ＢｃＬ工　Ｓｐａ工　Ｎｏｔ工　（Ｌａ Ｘ　Ｘｂａ１５’−ＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴＣＡＡＣＴ ＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＡＴＴ−３’　（ＳＥＱより　Ｎｏ：　１１） 修正されたｐＵｃ１１９はｐ　Ｕ　Ｃ５ｔａｒ−１と呼ばれる（図４）。制限部 位は、隣接する制限部位が消化の間に互いに干渉するならば小さいリンカ−によ ってさらに分離することもてきる。

抗ＮＰ免疫グロブリンＨ鎖遺伝子からの信号配列は一３３０ｂｐ　Ｐｓｔｌ断片 としてプラスミドｐ　ｃ　ＤＦ　Ｌ、１　（Ｕｃｋｅｒ、　Ｄ、Ｓ、、　ｅｔ　 ａｌ、＋　１９８５．　Ｊ　Ｉｇｉｎｏｌ　１３５：ｌ４０４−４３１４　）か ら単離される。３３０ｂｐ　Ｐｓｔｌ断片はプラスミドｐＵＣ３ｔａｒ−３１ｇ を精製するためにｐ　Ｕ　Ｃ５ｔａｒ−１内に亜クローン化される（図４）。

Ｐｓｔｌ断片は信号配列が発現されるように向けられている。

Ａ、免疫発現ベクター、プラスミドＬＮＧ−３ｒ　ｇを介したＬＮＧ免疫グロブ リンの構成 ＬＮＣＸ＊は真核免疫グロブリン発現ベクターに転換される（図４と５）。免疫 グロブリンＨ積信号配列とＸｈｏｌ−８ｐｅｌ　クローン化部位はプラスミドＬ ＮＣＸ＊のＣＭＶプロモータの背後に挿入されてＰＣＲ増幅免疫グロブリン遺伝 子の発現を可能にする。ＬＮＣＸ＊の転換は次の通りである。

免疫グロブリンＨ積信号配列はｐ　Ｕ　ＣＳｔａｒ−８ｄｇからＨｉｎｄｌ　ｌ ｌ−Ｃ１ａｌ制限断片として回収され、ＬＮＣＸ＊の１ｌｉｎｄｌｌｌ−Ｃｌａ ｌ部位内にクローン化される。結果として得られるプラスミドのＬＮＣ−８ｉｇ はＣＭＶプロモータの支配の下にある免疫グロブリンＨ鎖信号を備えたレトロウ ィルスベクターを含んでいる（図５）。

免疫ＺＡＰライブラリからの抗ＣＥＡ遺伝子は次にＬＮＧ−３ｉｇ中に亜クロー ン化されてプラスミドＬＮＣ抗−ＣＥＡを形成する。これによって信号配列を含 む抗ＣＥＡ可変Ｈ鎖遺伝子を発生する（図６）。抗ＣＥＡ遺伝子は最初に免疫Ｚ ＡＰファージＤＮＡからＢｌｕｅｓｃｒｌｐｔ　ＳＫ−ファージミドとして摘出 される（参照ＩａｌｂｄａＺＡＰ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ、　Ｉｎｃ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）　６抗ＣＥＡ遺伝子はＸｈｏｌ− ８ｐｅｌ断片として精製され、Ｘｈｏｌ−Ｓｐｓ＋制限ＬＮＧ−５ｉｇに結紮さ れる。

ＬＮＧ−３ｉｇは３個の５ｐｅｌ部位を含んでいる。したがって、プラスミドＬ ＮＣ抗ＣＥＡを発生するためには、結紮混合物はネオマイシン感受、アンピシリ ン感受Ｅ、Ｃｏ１１に転換され、ネオマイシン耐性、アンピシリン耐性転換体が 選択される。プラスミドＬＮＣ抗ＣＥＡはプローブとしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ 　ＳＫ−抗ＣＥＡからの５ｐｅｌ　−Ｘｈｏｌ抗ＣＥＡ制限断片を使用してネオ マイシン耐性、アンピシリン耐性転換体から選別される。５ｐｅｌ部位を使用す るのは免疫ＺＡＰ発現ベクター内の利用できる部位に依存しているからである。

ＬＮＣ抗ＣＥＡ構成を簡単にするために、独自のＮｏｔ１部位を免疫ＺＡＰ　Ｈ 発現ベクター内に導入して、５ｐｅｌ部位の代わりにＮｏｔ１部位を使用するこ とができる。

Ｂ、プラスミドｐ　Ｕ　ＣＳｔａｒ−８１ｇによるＬＮＣ−免疫グロブリンの構 成プラスミドｐＵｃｓｔａｒ−抗ＣＥＡを形成するために免疫ＺＡＰライブラリ からの抗ＣＥＡ遺伝子はプラスミドｐ　Ｕ　ＣＳｔａｒ−８１ｇ内に亜クローン 化される。これによって信号配列を含む抗ＣＥＡ可変Ｈ鎖遺伝子が発生する（図 １２）。抗ＣＥＡ遺伝子はＢｌｕｅｓｃｒｌｐｔ　ＳＫ−ファージミドとして免 疫ＺＡＰファージＤＮＡから摘出される（参照　１ａｓｂｄａＺＡＰ　ｐｒｏｔ ｏｃｏｌｓ、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｉｎｃ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ ）　、　Ｂ■ ｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ−抗ＣＥＡ二本鎖ＤＮＡが調整されＸｈｏｌと５ｐｅｌ で制限される。抗ＣＥＡを含むＸｈｏｌ−３ｐｅｌ断片は電気溶出によって精製 し、プラスミドｐＵｃｓｔａｒ−抗ＣＥＡを作り出すためにＸｈｏｌ−３ｐｅｌ 制限ｐ　Ｕ　ＣＳｔａｒ−３１ｇに結紮される（図１２）抗遺伝子はプラスミド ＬＮＣ抗ＣＥＡを作り出すために１ｌｉｎｄｌｌｌ−Ｃ１ａｌとしてｐＵＣ５ｔ ａｒ抗ＣＥＡからＬＮＣＸ＊に移転される（図１３）。抗ＣＥＡを含む１■ｎｄ ｌｌｌ−Ｃｌａｌ断片は電気溶出によってｐＵＣ３ｔａｒ抗ＣＥＡから精製され る。ホスホターゼ処理したＨｉｎｄｌｌｌ−Ｃｌａｌ制限ＬＮＣＸ＊はＬＮＣ抗 ＣＥＡを作り出すために精製した１１ｉｎｄｌｌｌ−Ｃ１ａｌ抗ＣＥＡ断片と結 紮される（図１３）。

標的ウィルスを発生するための戦略 標的ウィルスを発生するための出発点の材料は図７に示したＬＮＣｅ　ｎ　ｖと ＬＮＣ免疫グロブリン（この例では、ＬＮＣ抗ＣＥＡ）プラスミドである。図８ 〜１１は標的ウィルスの１次発生の一般原則を図示している。ウィルスを癌胚抗 原を発現する細胞に標的定めする／Ｘイブリッド免疫グロブリンーｅｎｖ蛋白が 発生される。エンベロープ蛋白分類（Ｓ）　、３量体化（Ｔ）、融合（Ｆ）のた めに重要な決定子の場所は確実に判っているので、免疫グロブリン遺伝子はｅｎ ｖ遺伝子の段階的欠失に結びつけられ、機能的免疫グロブリンｅｎｄ／’イブ１ ルツドが選択される。

有益なエンベロープ断片または類似物 融合蛋白のエンベロープ部分はエンベロープ融合蛋白の（生産細胞ラインからの 組み換えウィルスの発芽において）ウィルス外波内への効率的移入を指揮するの に充分なエンベロープ蛋白（またはその類似物）の任意の部分から成ることがで きる。この様な断片または類似物は、リガンド遺伝子の細胞表面レセプタ結合ド メインのウィルスエンベロープ遺伝子の段階的ｆＰＲＯＧＥｓｓｌＶＥｌ欠失へ の結紮を一般的に含む下記の一般的選択方式を使用して決定することができる。

リガンドとエンベロープの正確な組み換えは生物学的に活性の標的ウィルスの生 産のための選択方式によって決定される。選択方式は標的ウィルスを生産するだ けでなく将来の標的ウィルスの構成を簡略にする。

Ｉｎ　ＶＩＬｒＯハイブリッド免疫グロブリン−ｅｎｖ遺伝子の構成プラスミド ＬＮＣｅ　ｎ　ｖはＮｏ−ＭｕＬＶ　ｅｎｖポリプロティンのための暗号指定領 域を含んでいる（図８）。ＬＮＣｅ　ｎ　ｖは最初に旧ｎｄｌｌｌ制限によって 線形化される。ｅｎｖ遺伝子内に延長している一連の欠失は経時的にエキソヌク レアーゼ１１１処理ＤＮＡ（７）部分標本を回収し、Ｓｌ−ヌクレアーゼで５° 　−ＰＲＯＣＥＳＳ　Ｉ　ＶＥ端を除去して作り出される（Ｇｕｏ、　１．ｔＬ 、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ＋＋ｏｌ　１００ ：６０；　ａｎｄ　５ａｓｂｒｏｏｋ、Ｊ、、ｅｒ　ａｌ、、１９８９．　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂ盾秩@ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｂｏｒ　）　ｏ 　Ｎｏｔｌリンカ−（５’　ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ　３’配列番号＝１３）は鈍 感端末端に結紮され、Ｎｏｔｌで制限される。この結果としてＮｏｔ　Ｉ制限が ｅｎｖ遺伝子内の各々の欠失の５゛　−境界で突出する。分子の他の端側のＮｏ Ｌｌ突出は反応混合物の５ａｌｌ制限によって除去される。反応混合物は次にホ スホダーゼで処理して反応生成物の循環を阻止する。

反応混合物は抗ＣＥＡ可変Ｈ鎖遺伝子を含むＬＮＣ−抗ＣＥＡからの５ａｌｔ− Ｎｏｔ１制限断片に結紮される。これによって一連のｅｎｖ欠失に融合された抗 ＣＥＡペプチドを暗号指定する機能的レトロウィルスベクターの溜まりが作り出 される。

溜められたウィルス構造の発生 上記からの合計反応混合物はアンピシリン感受Ｅ、Ｃｏ１１内に転換され、アン ピシリン耐性が選択される（図９）。機能レトロウィルスベクターを含む組み換 え型が選択されるがそれは、それらだけがアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる からである。プラスミドＤＮＡは液体培地内で生長した転換体から調整され、異 なる免疫グロブリンｅｎｖ融合遺伝子を含むレトロウィルスベクターの溜まりを 作り出す。

ＤＮＡはクリップ２レトロウイルス充填細胞ライン内にトランスフェクトされと して、ＤＮＡは野生型ｅｎｖ蛋白を暗号指定しない充填細胞ライン内にトランス フェクトされる。トランスフェクトされた充填細胞ラインは異なるハイブリッド 免疫ｅｎｖ蛋白並びに野生型ｅ　ｎ　ｖ蛋白（細胞ライン内に含まれるｅｎｖ遺 伝子によって暗号指定される）のそれぞれを合成する。トランスフェクトされた 充填細胞ラインはハイブリッド免疫グロブリン−ｅｎｖ遺伝子を暗号指定する異 なるレトロウィルスゲノムを含む包み込まれたレトロウィルスの溜まりを分泌す る。

ハイブリッド免疫グロブリン−ｅｎｖ蛋白がウィルスエンベロープへの効率的な 移入のために必要な全ての決定子を保持しているとき、ハイブリッド−ｅｎｖ蛋 白はウィルスエンベロープ内に移入することができる。充填細胞ラインによって 暗号指定された野生型ｅｎｖ蛋白もウィルスエンベロープ内に移入される。これ によってウィルスエンベロープ内に野生型とハイブリッドｅｎｖ蛋白の両方を含 むウィルスが作り出される。したがって、このシステムはその遺伝子生成物をウ ィルスエンベロープ内に移入することのできる免疫グロブリン−ｅｎｖハイブリ ッドを選択する。

ウィルスの溜まりは０．４５μで濾過した媒質から収穫して、汚染するＧ４１８ −耐性充填細胞を除去する。

標的ウィルスの選択と特性化 Ｇ４１８感受標的細胞は標準的手順でウィルス溜まりに露出され、０４１８−耐 性細胞が選択される。標的細胞は癌胚抗原を発現する非マウス細胞ライン（野生 型Ｍｏ−ＭｕＬＶで感染できない）とすることができる。例としてはＡＴＣＣＣ ０ＬＯ２０５、結腸癌のある患者の腹水から単離したヒト細胞ライン（Ａ、　Ｔ 。

Ｃ，Ｃ，＃ＣＣＬ　２２２）；ＬＲ−７３ＣＥＡ、マウスの癌胚抗原遺伝子でト ランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｂｅｎｃｈｌ■ｏｆ、　 Ｓ、　ｅｔ　ａｌ。

、前掲）；及びＨＣＴ４８、ヒトの結腸腺癌細胞ライン（Ｓｈｌ、　Ｚ、Ｒ，、 ｅｔ　ａｌ、、　１１１８３、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　４３：４０４５−４０ ４９）が挙げられる。

Ｇ４１８耐性細胞は標的細胞によってネオマイシン耐性遺伝子の形質導入から生 じたばかりである。したがって、このシステムはウィルスの標的定めと融合に必 要な全ての決定子を保持したハイブリッド免疫グロブリン−ｅｎｖ蛋白を有する 組み換えウィルスを選択する。

組み込まれた免疫グロブリン−ｅｎｖ遺伝子の救出標的ウィルスによる感染の結 果として標的定め蛋白を作り出したハイブリッドエンベロープ遺伝子か組み込ま れる。組み込まれたハイブリッド免疫グロブリン−ｅｎｖ遺伝子は次のプライマ ーによるポリメラーゼ連鎖反応によって宿主ＤＮＡから救出される： ＰＣＲ５’救出プライマー： ５’−ＧＧＴＴｑ；λ込緑ＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧＣ−３’　（ＳＥＱより　Ｎｏ ：　１５）これらのプライマーによるＰＣＲ増幅はＩ（ｉｎｄｌｌｌ及びＸｂａ １部位を境界とする免疫グロブリン−ｅｎｖ遺伝子を発生する。増幅されたＤＮ ＡはＨｉｎｄｌｌｌとＸｂａｌによって制限されて粘着性の端を作り出し、ＤＮ Ａは旧ｎｄｌｌｌ−Ｘｂａｌ切断ＬＮＣＸ本内に結紮される。クリップ２充填細 胞内にトランスフェクトされたとき、これは細胞表面癌胚抗原（例えば、結腸癌 細胞）を発現する細胞に標的を合わせたレトロウィルスベクターを発生する。

上記の選択方式で発生したレトロウィルスベクターはクリップ２充填細胞内で発 生し八ときＣＥＡ発現ヒト細胞（ハイブリッドエンベロープ蛋白に支配される） と正常なマウス細胞の両方に標的が合わされる。標的細胞だけを感染させるウィ ルスを作り出すために、レトロウィルスは最初にハイブリッドエンベロープ蛋白 の移入だけてウィルス誘導を指揮するのに充分であるか試験される。これは野生 型ｅｎｖを暗号指定しない修正された充填細胞ライン内にＤＮＡをトランスフェ クトすることで実現される。

融合機能が野生型エンベロープ蛋白から供給されることが判ったときは、標的ウ ィルスは次のようにして作り出せるだろう。レセプタ結合ドメイン内にｅｎｖ遺 伝子を含む突然変異を暗号指定する充填細胞ラインを作り出す。標的ウィルスベ クターＤＮＡでトランスフェクトされたとき、ハイブリッドリガンド−ｅｎｖ蛋 白と突然変異した結合部位を備えたｅｎｖ蛋白の両方を発現する標的ウィルスが 生成される。ウィルスは標的細胞に排他的に感染するだろう。

標的ウィルスベクターは普遍的ベクターである上記手順で構成されたウィルスベ クターは普遍的標的ベクターである（図１１）。他の細胞への標的合わせはＸｈ ｏｌ−３ｐｅｌ抗ＣＥＡ断片をインフレーム免疫グロブリンを暗号指定するＸｈ ｏｌ−８ｐｅｌ断片または特定細胞表面蛋白に向けられたりガントに置換するこ とで実現される。例えば、免疫ＺＡＰライブラリからのＸｈｏｌ−３ｐｅＩ免疫 グロブリン含有断片は信号配列の背後のフレームに融合し、先に概略を述べたご と（、ｐＵＣＳｔａｒ−３ｉｇプラスミドを介してＬＮＣＸｓ内に亜クローン化 することができる。別のＬＮＧ−免疫グロブリンプラスミドからの５ａｌｌ−Ｎ ｏｔｌを普遍的ベクター内に置換することによって別の標的ウィルスベクターが 作り出さ治療遺伝子の標的定めされた供給のためのベクターとしては任意の包囲 されたウィルスを使用できる。特定の例としては、ヘルペスライリブのようなり ＮＡとＲＮＡウィルスの両方、例えばヘルペス単純型１または２、パラミクソラ イリブ、レトロライリブ、ヘバドナウィリデ、ボクスウィリデ、イリドライリブ 、トガライリブ、フラウィウィリデ、コロナライリブ、ラボドライリブ、フィロ ライリブ、オルトミクソライリブ、ブニアウィリデまたはアレナウィリデ、また はその他の、未分類の包囲されたウィルスが挙げられる。

これらのウィルスを網羅した選択は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　Ｃｏｌ　１ｅｃｔｌｏｎから入手できる。

標的定めリガンド 標的宿主細胞との特定の相互作用を指揮することのできる分子（例えば、宿主細 胞表面蛋白の特定の認識と結合によって）はエンベロープ融合蛋白の標的定めリ ガンド部分として使用できる。好適には、この様な蛋白はリガンド：レセプタ対 の一方に由来する。標的リガンドは蛋白に限らない。炭水化物と脂質の部分はグ リコリル化と脂質化の共通配列を含む蛋白断片を介してエンベロープ蛋白に付け ることができる。

上述の実例に示したごとく、免疫グロブリン遺伝子はりガントとして使用できる 。高親和性免疫グロブリンのための遺伝子は先に述べたごとく抗原に接合した［ １２５１１ウシ血清アルブミンによるフィルタ結合分析によってラムダまたはバ クテリア表現ライブラリから選別される（ｔ（ｕｓｅ、　ｅｔ　ａｌ、、前掲） 。

インテグリンなどの細胞表面分子、接着分子または回帰レセプタはセル特定リガ ンドとして使用できるが、それはそれらが他の細胞上のレセプタを介して細胞間 相互作用に関与しているからである。これらの分子を暗合指定する遺伝子は５ｅ ｅｄ　ａｎｄ　Ａｒｕｆｆｏ　のパニング法によって識別できる（Ｓｅｅｄ、　 Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９１１？。

Ｐｒｏｃ　ＮａＬｌ＾ｃａｄ　Ｓｃｌ　ＬＩＳＡ　８４：３３６５−３３６９） 。

特定のレセプタに結合するホルモンは標的定めリガンドとして、並びにＨＩＶエ ンベロープ蛋白ｇｐ１２０などのウィルス蛋白、自然発生リガンドの修飾として 使用できる。

治療遺伝子 本発明に有益な治療遺伝子には下記のものがある。１）癌細胞に対して治療効果 のある遺伝子としては　ａ）アンチセンス腫瘍遺伝子；ｂ）ｐ５３などの腫瘍抑 制遺伝子または網膜芽腫遺伝子生成物Ｒｂ５ｃ）ジフテリア毒素遺伝子などの破 壊毒素遺伝子；ｄ）腫瘍壊死因子またはインターフェロンなどのサイトカイン； またはｅ）その他−切の治療遺伝子、が挙げられる。２）ＨＩＶで感染された細 胞に標的を定めた治療遺伝子。具体的な例としては、ポリメラーゼなどのＨＩＶ に対する本質的遺伝子を補足するアンチセンスＤＮＡ、ジフテリア毒素などの破 壊毒素遺伝子：及びＨＩＶ調節蛋白を滴定し、除去するＨＩＶエンハンサ−配列 などの、細胞間免疫を利用する遺伝子（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　Ｄ、、　１９８ ８．　Ｎａｔｕｒｅ　３３５：３９５−３９６）。３）遺伝的欠失補正遺伝子。

以下に限定されるものではないが、実例としては、特に膵臓ベータ細胞に供給さ れるインスリン遺伝子、または嚢胞性繊維症患者の適切な肺臓細胞に供給される 嚢胞性繊維症経膜調節子（ＣＦＴＲ）遺伝子が挙げられる。標的遺伝子の発現は さらにトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ　）を調節する組織特定エンハンサ −の使用を介して実現される。

本書に記載の遺伝子治療について、上述のような適切な組み換えウィルスは薬学 的に許容される緩衝液（例えば、生理食塩水）中で患者に投与される。治療製剤 は治療条件に応じて投与される。例えば、ＨＩＶ感染した個人を治療するのに、 ウィルスはＨＩＶ感染した宿主細胞の適切な標的定めと溶解を提供する用量で静 注、筋注、または組織内注射なとの直接注射によって投与される。代案として、 標的ウィルスを適切な標的組織に外斜的に、またはカテーテルを介して、または ビデオを介して投与するのが必要になることもある。治療薬は例えば液体または スプレーの形で経口、経鼻腔、または局所的に投与するのが便利であろう。ここ でも、適切な用量というのは、疾患の低減をもたらすような治療ウィルスの量で ある。

治療ウィルスはウィルス充填細胞を患者の中に埋め込んで投与することもできる 。細胞は、例えばウィルスを通すが充填細胞は通さない半透過性容器内に閉じ込 めることができる。埋め込まれた容器は取出し可能とすることもできる。代案と して、ウィルスが鍼またはカテーテルを介して患者の中に入るように患者の静脈 内に鈎で留めることもできる。このようにすれば、患者はウィルス遺伝子治療の 連続的な用量を受けることができる。

その他の実施態様 その他の実施態様は下記の請求範囲によって限定される。

例えば、場合によっては複製可能なウィルスを使用することができる。複製欠失 ウィルスが必要な他の場合、標的ウィルスよりも修正充填細胞を患者に投与した 方が効果的なこともある。この方法によれば、非増殖用量の組み換えウィルスが 局所領域に供給され、次いでウィルスが特定標識細胞の場所を突き止める。例え ば、癌細胞を囲繞する腫瘍浸潤リンパ球（Ｔ　Ｉ　Ｌ）は局所的に高濃度の癌細 胞標的ウィルスを分泌するように修飾することができる。必要の都度治療を反復 することができる。標的ウィルスに対する免疫反応は免疫抑制剤によって克服で きる。

結腸癌細胞に加えて、本発明のウィルスは他の癌細胞、例えば卵巣、乳、または 肺癌細胞、または筋ジストロフィー、ハンチングトン病などの遺伝病に冒された 細胞、またはアデノシンジアミナーゼが欠失した細胞の標的定めにも使用するこ とができる。ヘルペスライリブ・ウィルスはヘルペス単純型１または２、Ｅｐｓ ｔｅｌｎ−Ｂａｒｒ　ウィルス、またはサイトメガロウィルスも含まれる。セン ダイウィルス及び予防接種ウィルスもこの方法に適合させることができる。

配列リスト （１）一般情報。

（１）出願人：　Ａｌｅｎｘａｎｄｅｒ　Ｔ、Ｙｏｕｎｇ（１、発明の名称：標 的化されたウィルスベクターを用いた遺伝子治療 （ｉ　ｉ　ｉ）配列数、１５ （ｉｖ）対応アドレス： （Ａ）名宛人二　Ｆｉｓｈ　＆　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（Ｂ）４す＝　フランク リンストリート２２５（Ｃ）市；　ボストン （Ｄ）州：　マサチューセッツ （Ｅ）国・　ＵＳＡ （Ｆ）郵便番号：　０２１１０−２８０４（Ｖ）コンピュータ読み出し形態 （Ａ）媒体形式　３．５デイスク、１．４４Ｍｂ（Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ 　ＰＳ／２　モデル５０Ｚまたは５５ＳＸ （Ｃ）作動システム：　ＭＳ−ＤＯ３（バージョン５．０）（Ｄ）ソフトウェア ：　ワードパーフェクト（バージョン５゜（ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日。

（Ｃ）分類： （ｖｉｉ）優先出願データ： （Ａ）出願番号・　０７／８６２，７９５（Ｂ）出願日：　１９９２年４月３日 （ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）代理人情報 （Ａ）氏名−ボール　ティー　クラーク（Ｂ）登録番号：　３０．１６２ （Ｃ）整理番号：　０５１４０１００２００２（ｉｘ）遠隔通信情報。

（Ａ）電話番号：　（６１７）５４２−５０７０（Ｂ）ファックス番号：　（６ １７）５４２−８９０６（Ｃ）テレックス番号：　２００１５４（２）配列番号 １の情報・ （１）配列の特性・ （Ａ）配列の長さ：１９ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー・　直鎖状 （ｘ）配列の記載：　配列番号１： ＧＣＡＧＡＡＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＡＣＧ　１９（２）配列番号２の情報・ （１）配列の特性。

（Ａ）配列の長さ：１０ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　二本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：　配列番号２： ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ　１０ （２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ＝１３ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：　配列番号３： ＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴ　ＡＴＣ１３ （２）配列番号４の情報： （１）配列の特性＝ （Ａ）配列の長さ；１５ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：　配列番号４： ＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＴＴＧＣＣ１５ （２）配列番号５の情報： （１）配列の特性： （Ａ）配列の長さ＝２２ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数、　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘ　ｉ）配列の記載：　配列番号５：ＡＧＧＴＧＣＡにＣＴ　ＧＣＴＣＧＡＧ ＴＣＧ　ＧＧ　２２（２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：２２ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘ　ｉ）配列の記載・　配列番号６：ＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴ　ＧＣＴＣＧＡＧ ＴＣＴ　ＧＧ　２２（２）配列番号７の情報・ （ｉ）配列の特性・ （Ａ）配列の長さ　２２ （Ｂ）配列の型、　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー＝　直鎖状 （ｘ　ｉ）配列の記載・　配列番号７：ＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴ　ＧＣＴＣＧＡＧ ＴＣＴ　ＧＧ　２２（２）配列番号８の情報： （ｉ）配列の特性・ （Ａ）配列の長さ：２２ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー・　直鎖状 （ｘ　ｉ）配列の記載：　配列番号８・ＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴ　ＧＣＴＣＧＡＧ ＴＣＴ　ＧＧ　２２（２）配列番号９の情報： （１）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：２２ （Ｂ）配列の型＝　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：　配列番号９： ＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴ　ＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴ　ＧＧ　２２（２）配列番号１０ の情報： （１）配列の特性。

（Ａ）配列の長さ＝３９ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘ）配列の記載：　配列番号１０： ＣＴＡＴＴＡＡＣＴＡ　ＧＴＧＡＣＧＧＴＴＡ　ＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧ ＣＣＣＣＡ　３９ （２）配列番号１１の情報・ （１）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：４５ （Ｂ）配列の型；　核酸 （Ｃ）鎖の数二　二本鎖 （Ｄ）トポロジー・　直鎖状 （ｘ）配列の記載・　配列番号１１： ＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡ　ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧ　ＡＴＣＡＡＣＴＡＧＴＧＣＧＧ ＣＣＧＣＡＴ　ＣＧＡＴＴ　４５（２）配列番号１２の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：４５ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数；　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘ）配列の記載；　配列番号１２・ ＡＧＡＣＧＴＣＣＧＡ　ＧＣＴＣＡＣＴＡＧＴ　ＴＧＡＴＣＡＣＧＣＣＧＧＣＧ ＴＡＧＣＴＡ　ＡＧＡＴＣ４５（２）配列番号１３の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１０ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘ）配列の記載：　配列番号１３： ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ　１０ （２）配列番号１４の情報： （１）配列の特性： （Ａ）配列の長さ＝２８ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−末鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘ）配列の記載：　配列番号１４： ＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧ　ＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧ　ＣＴＴＣＴＧＣＡ　２８（２） 配列番号１５の情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：２４ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−末鎖 （Ｄ）トポロジー；　直鎖状 （ｘ）配列の記載：　配列番号１５： ＧＧＴＴＣＴＣＴＡ　ＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧ　ＡＧＧＧＣ２４ＨｉｒｗｌＩｌｌ ｌ 特表千７−５０５７７３　（１３） Ｈ１閣１１１ ＦＩＧ、　９ 標的化されたレトロウィルスの作製戦略１１、プールされたウィルス構築物の生 成アンピシリン感受性Ｅ、ｃｏｌｌを形質転換液体培地中のアンピシリン耐性の ＦＩＧ、１１ ｐＵｃ　Ｓｔａｒ−Ｓｉｇ　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ−ａｎｔｉＣＥＡＦＩ Ｇ、　１２ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　７１０１ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，Ｌ Ｋ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ。

ＳＫ、ＵＡ、ＶＮ Ｉ

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．発現させたい核酸を異種の宿主細胞内で発現させるための方法であって、（ ａ）次のものをゲノムに含むウイルスを供給する工程と、（ｉ）前記発現させた い核酸、及び、 （ｉｉ）ハイブリッドエンベロープ遺伝子（このハイブリッド遺伝子はターゲッ ティングリガンドに結合されたエンベロープフラグメントをコードする（これに よって、前記エンベロープフラグメントは、それの正常な宿主細胞の認識あるい は結合を容易にするものではなく、前記ウイルスの成熟ウイルス粒子への効果的 な組み入れを容易にし、かつ、前記ターゲッティングリガンドは、前記異種の宿 主細胞の表面に対する前記成熟ウイルス粒子の標的化及び結合を容易にする）） と、 （ｂ）前記異種の宿主細胞のウイルス感染を受け入れるように前記ウイルスを投 与する工程と、 を含む方法。
2. ２．請求の範囲第１項記載の方法において、前記ウイルスはエンベロープウイル ス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｖｌｒｕｓ）である。
3. ３．請求の範囲第２項記載の方法において、前記エンベロープウイルスはヘルペ スウイルス科である。
4. ４．請求の範囲第２項記載の方法において、前記エンベロープウイルスはレトロ スウイルス科である。
5. ５．請求の範囲第４項記載の方法において、前記レトロスウイルス科はモロニー ネズミ白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖ ｉｒｕｓ）である。
6. ６．請求の範囲第１項記載の方法において、前記発現させたい核酸はＤＮＡであ る。
7. ７．請求の範囲第１項記載の方法において、前記発現させたい核酸はＲＮＡであ る。
8. ８．請求の範囲第１項記載の方法において、前記異種の宿主細胞は感染性のもの である。
9. ９．請求の範囲第１項記載の方法において、前記ハイブリッドエンベロープフラ グメント部位は、受容体結合領域、オリゴマー化領域（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａ ｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ）、膜貫通領域、ウイルス発芽領域、分類シグナル（ｓ ｏｒｔｉｎ　ｓｉｇｎａｌｓ）、及びシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ　ｓｅｑｕｅ ｎｃｅ）からなる。
10. １０．請求の範囲第９項記載の方法において、前記エンベロープフラグメントは 、更に、融合領域からなる。
11. １１．請求の範囲第１項記載の方法において、前記エンベロープフラグメントの 融合活性は別のタンパク質による。
12. １２．請求の範囲第１項記載の方法において、前記投与は、前記ウイルスを封入 した容器を患者に移植するものである。
13. １３．請求の範囲第１２項記載の方法において、前記ウイルスはパッケージング 細胞（ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｃｅｌｌ）内である。
14. １４．ウイルス、このウイルスのゲノムはハイブリッドエンベロープタンパクを コードする、前記ハイブリッドタンパクは、フレーム内でターゲッティングリガ ンドに結合しているエンベロープフラグメントを含む、これにより、前記エンベ ロープフラグメントは、それの正常な宿主細胞の認識あるいは結合を容易にする ものではなく、前記ハイブリッドエンベロープタンパクの成熟ウイルス粒子への 効果的な組み入れを容易にし、かつ、前記非ウイルスタンパクは、前記ウイルス により正常に感染されていない細胞の表面に対する前記成熟ウイルス粒子の標的 化及び結合を容易にする。
15. １５．請求の範囲第１４項記載の方法において、前記ウイルスはエンベロープウ イルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｖｉｒｕｓ）である。
16. １６．請求の範囲第１５項記載の方法において、前記エンベロープウイルスはヘ ルペスウイルス科である。
17. １７．請求の範囲第１５項記載の方法において、前記エンベロープウイルスはレ トロスウイルス科である。
18. １８．請求の範囲第１７項記載の方法において、前記レトロスウイルス科はモロ ニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍａ　 ｖｉｒｕｓ）である。
19. １９．請求の範囲第１４項記載の方法において、前記発現させたい核酸はＤＮＡ である。
20. ２０．請求の範囲第１４項記載の方法において、前記発現させたい核酸はＲＮＡ である。
21. ２１．請求の範囲第１４項記載の方法において、前記異種の宿主細胞は感染性の ものである。
22. ２２．請求の範囲第１４項記載の方法において、前記ハイブリッドエンベロープ タンパク質は、受容体結合領域、オリゴマー化領域（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔ ｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ）、膜貫通領域、ウイルス発芽領域、分離類シグナル（ｓ ｏｒｔｉｎ　ｓｉｇｎａｌｓ）、及びシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ　ｓｅｑｕｅ ｎｃｅ）からなる。
23. ２３．請求の範囲第２２項記載の方法において、前記エンベロープフラグメント は、更に、融合領域からなる。
24. ２４．請求の範囲第１４項記載の方法において、前記エンベロープフラグメント の融合活性は別のタンパク質による。
25. ２５．請求の範囲第１４項記載の方法において、前記投与は、前記ウイルスを封 入した容器を患者に移植するものである。
26. ２６．請求の範囲第２５項記載の方法において、前記ウイルスはパッケージング 細胞（ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｃｅｌｌ）内である。
27. ２７．発現させたい核酸を異種の宿主細胞内で発現させるための方法であって、 （ａ）次のものをゲノムに含むウイルスを供給する工程と、（ｉ）前記発現させ たい核酸、及び、 （ｉｉ）ハイブリッドエンベロープ遺伝子（このハイブリッド遺伝子はターゲッ ティングリガンドに結合されたエンベロープフラグメントをコードする（これに よって、前記エンベロープフラグメントは、それの正常な宿主細胞の認識あるい は結合を容易にするものではなく、前記ウイルスの成熟ウイルス粒子への効果的 な組み入れを容易にし、かつ、前記ターゲッティングリガンドは、前記異種の宿 主細胞の表面に対する前記成熟ウイルス粒子の標的化及び結合を容易にする）） と、 （ｂ）前記細胞のウイルス感染を受け入れるように前記ウイルスを投与する工程 と、 を含む方法。
28. ２８．請求の範囲第２７項記載の方法において、前記ウイルスはエンベロープウ イルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｖｉｒｕｓ）である。
29. ２９．請求の範囲第２８項記載の方法において、前記エンベロープウイルスはヘ ルペスウイルス科である。
30. ３０．請求の範囲第２８項記載の方法において、前記エンベロープウイルスはレ トロスウイルス科である。
31. ３１．請求の範囲第３０項記載の方法において、前記レトロスウイルス科はモロ ニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ 　ｖｉｒｕｓ）である。
32. ３２．請求の範囲第２７項記載の方法において、前記発現させたい核酸はＤＮＡ である。
33. ３３．請求の範囲第２７項記載の方法において、前記発現させたい核酸はＲＮＡ である。
34. ３４．請求の範囲第２７項記載の方法において、前記異種の宿主細胞は感染性の ものである。
35. ３５．請求の範囲第２７項記載の方法において、前記ハイブリッドエンベロープ フラグメント部位は、受容体結合領域、オリゴマー化領域（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉ ｚａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ）、膜貫通領域、ウイルス発芽領域、分類シグナル（ ｓｏｒｔｉｎｇ　ｓｉｇａｌｓ）、及びシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ　ｓｅｑｕ ｅｎｃｅ）からなる。
36. ３６．請求の範囲第３５項記載の方法において、前記エンベロープフラグメント は、更に、融合領域からなる。
37. ３７．請求の範囲第２７項記載の方法において、前記エンベロープフラグメント の融合活性は別のタンパク質による。
38. ３８．請求の範囲第２７項記載の方法において、前記投与は、前記ウイルスを封 入した容器を患者に移植するものである。
39. ３９．請求の範囲第３８項記載の方法において、前記ウイルスはパッケージング 細胞（ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｃｅｌｌ）内である。