JP2004131502A

JP2004131502A - 高濃度のトリテルペノイドを含有する微小化リポソーム及びその製造方法

Info

Publication number: JP2004131502A
Application number: JP2003345618A
Authority: JP
Inventors: Hyung Seok Kang; 姜　亨　錫; Gae-Won Nam; 南　凱　元; Sun Sang Kwon; 韓　相　勳; Ih Seop Chang; 張　利　燮
Original assignee: Pacific Corp
Current assignee: Pacific Corp
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2003-10-03
Publication date: 2004-04-30
Anticipated expiration: 2023-10-03
Also published as: DE60333066D1; EP1410790B1; KR20040032349A; JP4203394B2; EP1410790A1; US20040180082A1; KR100489701B1

Abstract

【課題】　人体に有害でない溶媒を使用し、また、激しい物理的処理を行うことなく、效率的に高濃度のトリテルペノイドを含有する微小なリポソームを製造する方法、及びその製造方法により得られる微小なリポソーム、並びにこのような生理活性トリテルペノイドリポソームを含有する化粧料組成物を提供する。
【解決手段】　ポリオールを６０〜７０℃に加温しながら、前記ポリオールにトリテルペノイドを分散させて、分散液を製造する段階と、前記分散液に塩基を加え、低粘度の分散液を得る段階と、リン脂質を常温のエタノールに溶解させて、エタノール溶液を製造する段階と、前記エタノール溶液を前記分散液に加えた後、得られた混合液を蒸留水に投入して乳化させることにより、乳化溶液を製造する段階と、前記乳化溶液に酸を加え、微小なリポソームを製造する段階とを含む生理活性トリテルペノイドリポソームの製造方法、及びこの方法により得られる微小なリポソーム、並びにこのような生理活性トリテルペノイドリポソームを含有する化粧料組成物である。
【選択図】　　　　なし

Description

　本発明は、トリテルペノイドを含有するリポソーム及びその製造方法に関する。より詳しくは、難溶成分として、水や溶媒に対する溶解度が極めて低いトリテルペノイドをリポソーム二重層内に高濃度で含入させて製造した微小なリポソーム及びその製造方法に関する。

　リン脂質の自己組立(self-assembling process)により生成されるリポソームは、リン脂質分子の疎水性二重層で遮断された内部の水相を有する水分散型コロイド粒子である。リポソームは、１９６５年に人工生体膜研究のために試みられ（J. Mol. Biol. 13: 238-252）、以後、医薬伝達体(drug delivery carriers)として１９７０年代から今まで研究されてきている。リポソームのコロイド、表面、医薬伝達体及び化学的性質を基盤として多様な製品が開発され、このうち医薬分野では、抗菌剤、抗ガン剤、ワクチン開発等があり、化粧品分野では、スキンケア製品とヘアコンディショニング製品等に応用された。

　医薬伝達体として開発された初期のリポソームは、コロイド及び生物学的不安定性及び不安定な含有率に起因して、満足しない結果をもたらしたが、以後、高分子安定化剤及びリポソームの二重層を安定化させる生物学的分子を導入して安定性が向上しつつ、抗菌剤及び抗ガン剤等のリポソーム基盤製品が開発された。

　リポソームは、カプセル的性質を用いて疎水性脂質二重層間に疎水性化合物を捕獲したり、水相内部に親水性化合物を捕獲することによって、各種物質をカプセル化する伝達体として使われる。リポソームは、それ自体として、難溶性を示すか治療的投与量で許容されない毒性を持つ化合物を自体内に捕獲することで、毒性を低減し、長期的に生理活性物質を伝達するにも有用である。

　一方、微小化したリポソームを製造する方法は、大きく２種類に分けられる。
第一は、脂質分子の自己組合(self-assembly)現象を用いて自発的にリポソームを形成する方法であって、例えば、水素イオン濃度の調節及び界面活性剤の添加による自発的小胞製造法、混合ミセル系から界面活性剤除去による小胞形成法が挙げられる。先ず、水素イオン濃度の調節による自発的小胞製造法は、水素イオン濃度によって溶解度が異なる特定のリン脂質類に限定される方法であって、リポソーム内部の水素イオン濃度と外部の水素イオン濃度の差をおいてリポソーム内部及び外部の曲率を異ならせて自発的に微小なリポソームを製造することが特徴であるが、一般的に、リポソームを製造するのに最も多く使われているホスファチジルコリン系のリン脂質類には使用できないという短所がある。また、界面活性剤の添加により微小なリポソームを製造する方法は、ホスファチジルコリン系の曲率を球形に補正するために、単一鎖の界面活性剤を使用する方法である。界面活性剤が使われない時のリポソームに比べて、使用した場合の方がより小さいリポソームが形成されるが、リポソームの大きさが前述の方法に比べて大きく形成されることが短所である。更に、混合ミセル系からリポソームを製造する方法は、イオン性界面活性剤とリン脂質とで構成された混合ミセル系から次第にイオン性界面活性剤を除去することで、微小なリポソームを製造することである。小さく、かつ均一なリポソームを製造できる長所があるが、大量調製が困難で、界面活性剤を除去できる別の設備が必要であり、製造時間が長いという短所がある。

　第二に、押出、フレンチプレス(French press)、高圧乳化、超音波処理等の方法で、機械的な力やエネルギーを通じて水和及び膨潤された巨大なリポソームを微小化させる製造法である。この製造方法は、巨大なリポソームを作る第１工程と、これを微小化させる第２工程とを含む。先ず、第１工程では、脂質を揮発性有機溶媒に溶かした後、溶媒を減圧乾燥し、容器内壁に脂質等よりなる薄膜を形成させ、水性分散溶媒を加え、脂質膜を水和及び膨潤させることにより、リポソームを製造する。水和膨潤後のリポソームは、多層小包体であり、粒子のサイズが数〜数百ミクロンと比較的大きいことから、これを微小化するために、機械的な力やエネルギーを加える第２工程を進行するようになる。第２工程は、エネルギーを加える方式と形態が異なるだけで、粒径を微小化させるために高いエネルギーを加える点において両者は同一である。

　一方、エタノールに脂質を溶かした後、徐々に水性分散溶媒に添加し、微小なリポソームを製造する方法も開発されている。この方法は、エタノール溶液の水性分散溶媒に対する添加速度、エタノールでの脂質の濃度に依存することから、高濃度のリポソーム分散液を作ることができないという短所があるだけでなく、多量に使われたエタノールを更に除去しなければならないという短所を持っている(D.D. Lasic, LIPOSOMES:Fromphysics to applications, 1993, Elsevier science B.V.）。
　従って、別の化合物や機械的な力を必要とせずに、微小化したリポソームを製造するのが好ましい。

　トリテルペノイドは、天然由来の生理活性成分で、ウルソル酸(ursolic acid)、ベトゥリニック酸(betulinic acid)、ボスウェリック酸(boswellic acid)、オレアノール酸(oleanolic acid)等のペンタサイクリック化合物の総称で、抗癌、肝臓保護、抗炎、抗潰瘍、抗菌、抗壊血病、抗ウイルス、皮膚のコラーゲン合成、皮膚脂質合成促進等の効能を持つと報告されている。

　しかしながら、トリテルペノイドの抗老化、抗炎、保湿、抗菌等の効能を皮膚で発現させるためには制限があり、最も大きい問題点は、難溶性で、水や溶媒に対する溶解度が極めて低く、化粧品に０.０２重量%以上使用できないということである(Rios, J.L., Recio, M.C., Manez, S., Giner, R.M., 2000. Natural triterpenoids as anti-inflammatory agents. In: Atta-Ur-Rahman Ed., Studies in Natural Products Chemistry: Bioactive Natural Products, vol. 22. Elsevier science, Amsterdam, pp. 93-143, part C.)。リポソームに水溶性、脂溶性化合物が混入される場合、皮膚吸収を増進させることができ、化合物の効果を更に増進させることができることが報告されている。

　このような理由から、トリテルペノイドを高濃度でリポソーム内に混入した研究も報告されているが、それにも関わらず、水溶液でのトリテルペノイドの含量が低く、有害溶媒を使用した方法であるから、好ましくない(Both, D.M., Goodtzova, K., Yarosh, D.B., Brown, D.A., 2002. Liposome-encapsulated ursolic acid increases ceramides and collagen in human skin cells. Arch. Dermatol. Res. 293, 569-575; Ostro, M.J., Liposomes: From Biophysics to Therapeutics, Marcel Decker, New York, 1987.)。

　従って、化粧品分野に使用するためには、人体に有害でない溶媒を使用しなければならず、また高い効能を発現させるためには、高濃度のトリテルペノイドをリポソームに混入させることが重要である。
J. Mol. Biol. 13: 238-252(1965） D.D. Lasic, LIPOSOMES: Fromphysics to applications, 1993, Elsevier science B.V. Rios, J.L., Recio, M.C., Manez, S., Giner, R.M., 2000. Natural triterpenoids as anti-inflammatory agents. In: Atta-Ur-Rahman Ed., Studies in Natural Products Chemistry: Bioactive Natural Products, vol. 22. Elsevier science, Amsterdam, pp. 93-143, part C. D.M., Goodtzova, K., Yarosh, D.B., Brown, D.A., 2002. Liposome-encapsulated ursolic acid increases ceramides and collagen in human skin cells. Arch. Dermatol. Res. 293, 569-575; Ostro, M.J., Liposomes: From Biophysics to Therapeutics, Marcel Decker, New York, 1987.

　前記問題点を解決するために、本発明者らは、リポソーム製造工程とトリテルペノイドの化学的性質を適宜組合して、トリテルペノイドがリポソーム構造内に均一に混入された微小なリポソームを製造し、トリテルペノイドの効能を確認し、本発明を完成した。

　本発明の目的は、人体に有害でない溶媒を使用し、また、激しい物理的処理を行うことなく、效率的に高濃度のトリテルペノイドを含有する微小なリポソームを製造する方法、及びその製造方法により得られる微小なリポソームを提供することにある。
　また、本発明の他の目的は、前記生理活性トリテルペノイドリポソームを含有する化粧料組成物を提供することにある。

　本発明は、高濃度のトリテルペノイドがリポソーム内に均一に混入された微小な生理活性トリテルペノイドを製造することを特徴とする。より具体的には、本発明では、トリテルペノイドを高濃度でリポソーム内に混入させるために、トリテルペノイドの中で酸基を有するトリテルペノイドを使用し、トリテルペノイドに塩基を加え、界面活性力を持つ塩形態のトリテルペノイドに変換する。塩形態に変換されたトリテルペノイドは、高いＨＬＢ値を有する界面活性剤で、ＨＬＢの低い脂質と混合される場合、混合ミセル系を形成する。製造された混合ミセル系は、トリテルペノイドの種類及び含量によって数〜数十nmの微小な直径を有するようになり、水素イオン指数（pH）は１０〜１１を維持する。酸を添加して水素イオン指数（pH）を６〜８に減少させることにより、塩形態のトリテルペノイドを、酸基を有する元来の形態に変換させ、界面活性力を失ったトリテルペノイドにより混合ミセル系はリポソームに転移され、リポソームへの転移過程でトリテルペノイドはリポソーム内に高濃度で混入される。

　製造方法は、先ず、ポリオールに６０〜７０℃に加温しながらトリテルペノイドを分散させた後、前記分散液に塩基を加え、低粘度の分散液を得る。次いで、リン脂質を常温のエタノールに溶解し、リン脂質が溶けたエタノール溶液を上記分散液に加えた後、得られた混合液を蒸留水に投入し、透明な混合ミセル水溶液を製造する。製造された混合ミセル水溶液に酸を加え、塩の形態で存在するトリテルペノイドを酸の形態に還元することで、混合ミセル系をリポソームに変換させることによって、最終的にトリテルペノイドが混入されたリポソームを製造できる。
　上述の方法により、製造されたリポソームには、高濃度のトリテルペノイドを均一に混入せしめることができる。

　以下、本発明をより具体的に説明する。
　本発明では、リン脂質として、好ましくはレシチンを使用する。本発明で用いられるレシチンは、大豆又はタマゴから抽出した後、精製し製造されたもので、炭素数が１２〜２４個である脂肪酸鎖を有するリン脂質類、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸及びこれらの加水分解により製造されたその他の脂肪酸等の混合物である。抽出されたレシチンの疎水性基を構成する脂肪酸鎖は、二重結合が０〜３個程度平均的に分布する不飽和レシチンで、精製の度合によってホスファチジルコリンの含量が７０〜９５%に該当する混合物が用いられる。脂肪酸鎖の二重結合は、水や活性酸素により容易に酸化が起きるので、レシチンの化学的安定度を増加させるために、部分的に水添して二重結合の数を減少させたレシチンを使用することもする。
より具体的に、本発明に用いられるレシチンは、大豆から抽出されたリン脂質で、ホスファチジルコリンの含量が９０〜９５%に該当する不飽和レシチンである。全体含量の０.００１〜１５重量%を使用することができ、好ましくは、１〜１０重量%を使用する。

　本発明で提供するリポソーム粒子中に混入して使用することができる生理活性有効性分は、1つ以上の酸基を有するトリテルペノイドであることを特徴とし、より具体的には、使用可能なトリテルペノイドとしては、ウルソル酸(ursolic acid)、オレアノール酸(oleanolic acid)、センテラ・アジアティカ抽出物(centella asiatica extract)、ベトゥリニック酸(betulinic acid)、ボスウェリック酸(b-boswellic acid)等が挙げられる。

　本発明で提供する生理活性トリテルペノイドリポソームにおいてトリテルペノイドの含量は、リポソーム分散液の重量に対して０.００１〜５重量%を使用することができ、好ましくは０.５〜２.５重量%を使用する。トリテルペノイドをリポソーム内に混入するために、ポリオールにトリテルペノイドを加温分散した後、更に常温に冷却し、塩基を加え、低粘度の懸濁分散液を製造する。上記分散液にレシチンのエタノール溶液を加え、常温で完全溶解し、上記溶液を水に投入した後、乳化し、半透明分散系を形成する。この際に用いられる塩基は、トリエタノールアミン(triethanolamine)、トリイソプロパノールアミン(triisopropanolamine)、水酸化カリウム(potassium hydroxide)、アミノブタノール(2-aminobutanol)、水酸化ナトリウム(sodium hydroxide)、水酸化アンモニウム(ammonium hydroxide)、水酸化カルシウム(calcium hydroxide)等を例示することができ、好ましくは、トリテルペノイドと同様なノーマル濃度で使用され、リポソーム分散液の重量に対して０.００１〜０.5重量%の程度で加え、水素イオン濃度指数が１０〜１１になるようにする。

　最終的なリポソーム分散液の水素イオン濃度指数は、５〜８間に分布するのが好ましいが、水素イオン濃度指数の補正のために、アジピン酸(adipic acid)、ホウ酸(boric acid)、クエン酸(citric acid)、酢酸(acetic acid)、蟻酸(formic acid)、フマル酸(fumaric acid)、乳酸(lactic acid)、グリコール酸(glycolic acid)、コハク酸(succinic acid)、プロピオン酸(propionic acid)、ピルビン酸(pyruvic acid)、リン酸(phosphoric acid)等のような酸を、上述の塩基と同様なノーマル濃度で加えるようにする。酸の添加により、半透明分散系をリポソームに変換させて、最終的にトリテルペノイドが混入されたリポソームを製造する。

　本発明で提供するトリテルペノイドリポソームは、０.００１〜１０μmのサイズ分布を有するのが好ましいが、より好ましくは約０.１〜１μm範囲のものがよく、更により好ましくは０.１〜０.２μm範囲のものがより一層よい。また、前記トリテルペノイドの粒子サイズ分布には特に制限はないが、均一な粒子サイズ分布を有する粒子を多量含むのがより好ましい。この場合、前記均一な粒子サイズ分布を有する粒子の粒子サイズは、好ましくは約０.１〜１μm範囲のものがよい。

　リポソーム分散液の安定度のために高分子増粘剤を使用することができ、増粘のために使用することができる高分子増粘剤としては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコールが親水性基をなすポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシドとポリプロフィレンオキシドとがブロック結合されたジフロック及びトリブロック共重合体、キサンタン・ガム、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリグルタミン酸、キトサン等を０.１〜０.５重量%程度使用することができる。

　本発明で提供する生理活性トリテルペノイドリポソームは、第一に、人体に無害な溶媒を使用して、高濃度でトリテルペノイドをリポソーム内に混入することができ、第二に、難溶性のトリテルペノイドがリポソーム内に高濃度で混入され、自由結晶(free crystal state)で存在するトリテルペノイドに比べて著しく高い生理活性を示すことができ、第三に、不飽和レシチン（リン脂質）による皮膚吸収増進効果によってトリテルペノイドの経皮吸収を促進でき、第四に、懸濁分散系からリポソームへの変換は、自己組立現象(self-assembling process)であるから、機械的な力が不要のまま、均一な微小化リポソームを製造できる特徴を持っている。

　本発明で提供する生理活性トリテルペノイドリポソームを含有する化粧料の剤形には特別な制限はないが、皮膚吸収の促進及び生理活性の増加によって明確な効果を持つことができる分野として、基礎化粧料、メーキャップ化粧料、洗浄剤、ヘアスタイリング剤、ヘア・トニック、毛染め剤等の化粧品と、ローショーン、クリーム、ジェル、パッチ又は噴霧剤のような医薬品及び医薬部外品等に幅広く適用できる。

　以上説明したように、トリテルペノイドを高濃度で含有する微小なリポソームは、人体に無害な溶媒を使用しているので安全であり、また、別の機械的な力を必要とせずに微小なリポソームを形成するので、優れた化学的安定性を持っている。また、粒子サイズが微小なので、コロイド安定性に優れているばかりでなく、トリテルペノイドが高い生理活性を示すので、トリテルペノイドリポソームを含有する化粧料又は医薬用外用剤の製造に非常に有用に利用できる。

　以下、実施例、比較例及び試験例並びに剤形例に基づいて、本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。

［実施例１］
　ブチレングリコール１５gに２gのウルソル酸(ursolic acid)を加温分散した。上記分散液に水酸化カリウム１.４gを加え、完全に溶解した。そして、大豆から抽出した９０〜９５重量%のホスファチジルコリン含量を有する不飽和レシチン１０gを４gのエタノールに溶かした溶液を製造した。この２つの溶液を合わせて、透明溶液を製造した。上記溶液を６４gの蒸留水に投入し、３００rpmの速度で３０分間常温で攪拌した後、クエン酸を１.８g投入し、最終的にウルソル酸が２重量%含有されたポソームを製造した。
　前記製造したリポソームの透過型電子顕微鏡写真を図１に示す。

［実施例２］
　ブチレングリコール１５gに２gのベトゥリニック酸(betulinic acid)を加温分散する。上記分散液に水酸化カリウム１.７gを加えて完全に溶解した。そして、大豆から抽出した９０〜９５重量%のホスファチジルコリン含量を有する不飽和レシチン１０gを４gのエタノールに溶かした溶液を製造した。この２つの溶液を合わせて、透明溶液を製造した。上記の溶液を６４gの蒸留水に投入し、３００rpmの速度で３０分間常温で攪拌した後、クエン酸を１.９g投入し、最終的にベトゥリニック酸が２重量%含有されたリポソームを製造した。

［比較例１及び実施例３〜６］
　プロピレングリコール５g及びエタノール１０g中に加熱下に表１に示す量のオレアノール酸(oleanolic acid)を分散させた。上記分散液に表１に示す量の水酸化カリウムを加えて完全に溶解した。そして、大豆から抽出した９０〜９５重量%のホスファチジルコリン含量を示す不飽和レシチン１０gを４gのエタノールに溶かした溶液を製造した。この２つの溶液を合わせて、透明溶液を製造した。上記溶液を６４gの蒸留水に投入し、３００rpmの速度で３０分間常温で攪拌した後、表１に示す量のクエン酸を投入し、最終的に表１に示す量のオレアノール酸を含有するリポソームを製造した。比較例１では、オレアノール酸、水酸化カリウム、及びクエン酸を使用しなかった。

［実施例７］
　ブチレングリコール１３gとプロピレングリコール２.５gとの混合溶媒に、１gのウルソル酸、０.７gのオレアノール酸、０.５gのセンテラ・アジアティカ抽出物(centella asiatica extract)を加温分散する。上記分散液に水酸化カリウム１.２gを加えて分散した。そして、大豆から抽出した９０〜９５重量%のホスファチジルコリン含量を有する不飽和レシチン１０gを４gのエタノールに溶かした溶液を製造した。この２つの溶液を合わせて、透明溶液を製造する。上記溶液を６４gの蒸留水に投入し、３００rpmの速度で３０分間常温で攪拌した後、クエン酸１.４８gを投入し、最終的にウルソル酸１.０重量%、オレアノール酸０.７重量%、及びセンテラ・アジアティカ抽出物０.５重量%が含有されたリポソームを製造した。

［試験例１：動的光散乱による液滴サイズ］
　比較例１及び実施例１〜７で製造した生理活性トリテルペノイドリポソームの平均粒子サイズを測定した。散乱角は９０゜に固定し、温度は２５℃に維持しながら測定した。結果を表２に示す。

　本発明によって製造されたリポソームは、比較例１に比べて全てサイズが小さい０.１〜０.３μmの範囲内の均一で、かつ、微小なリポソームであって、沈殿性が低くて高いコロイド安定性を持っていることが確認された。また、比較例１と比較すれば、添加されたトリテルペノイドの種類や含量に関係なく、トリテルペノイドを含む本発明のリポソームは、全て自発的に微小なリポソームとして生成されることが判明した。

［試験例２：広角Ｘ線回折］
　リポソームの構造及び結晶の格子間距離をＣｕ−Ｋα（λ＝1.54Å）ソースの広角Ｘ線回折装置(Rigaku/USA,D/max-RB)が装着されたpowder XRDで分析した。凍結乾燥して得られたリポソーム試料を広角Ｘ線回折（θ＝2-50°）により分析し、得られた結果から炭化水素鎖の配列とＯＡ結晶の分子間距離を計算した。図２に示されているように、ＯＡ結晶による特異ピークがＯＡが捕集されたリポソーム内では観察されなかった。２０°周辺で広い領域での回折を示すものは、リン脂質がスメクチック（ラメラ）液晶相をなすことにより示されたもので、リン脂質分子間の間隔を示すものである。図３から分かるように、この領域での最高値を示す２θ値がＯＡ含量に応じて徐々に増加しながら、２５．４モル%で飽和値を示した。これは、リポソーム２重層内に挿入されたＯＡ分子によりレシチン各分子間の間隔が増加して生じた現象であって、ＯＡ２５．４モル%でリポソーム２重層内にＯＡが飽和され、これ以上ＯＡが含有できないことを意味する。

［試験例３：セラミド生成力測定］
　トリテルペノイドが混入されたリポソームの種類による無毛マウスの表皮で生成されるセラミド生成量を測定した。物質を無毛マウスの背中部位に塗布した後、背中部位の皮膚を８mm²のサイズで切断した後、−２０℃冷凍庫に保管した。トリプシン−エチレンジアミン４酢酸(trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid)２.５%を添加して、表皮と真皮とに分離した後、表皮だけを取って、脂質を抽出した。脂質を抽出して、薄膜液体クロマトグラフィーを展開して発色した後、ＣＡＭＡＧ社の色度計を用いて数値化した。

　実施例１、３〜６及び比較例１のセラミド生成量を分析した結果、全ての試料に対してセラミド合成が確認され、図４及び図５に示した。比較例１のセラミド生成量に比べて、実施例１では１８０%程度増加し、また、実施例３〜６では、それぞれ１４３%、１７４%、２１２%、及び２３２%程度増加した。

　トリテルペノイドを含有しているリポソームのケラチン細胞分化(keratinocyte differentiation)の程度を確認するために、無毛マウスの表皮から抽出した蛋白質を用いてウエスタンブロット(Western blotting)試験を行った。図６から分かるように、オレアノール酸（OA）を含有するリポソームだけが区別される程度の蛋白質発現を示すだけで、ウルソル酸（UA）を含有するリポソームと対照群（リポソーム単独）では非処理群と類似した結果を示した。発現された蛋白質のうち、フィラグリン(filaggrin)は、ケラチン細胞分化から由来する天然保湿因子の前駆体であり、トランスグルタミナーゼは、一種の分化マーカ(differentiation marker)である。無毛マウスの皮膚を検査した結果、ＯＡ含有リポソーム及びＵＡ含有リポソームでは、両方とも相当な程度のセラミド生成増大結果を示した。前記ウエスタンブロット試験は、“Yarosh, D.B., Both, D., Brown, D., 2000. Liposomal ursolic acid (merotaine) increases ceramides and collagen in human skin. Hormone Res. 54, 318-321”によって行われた。

　これにより、トリテルペノイドの生理活性が優秀に発現されていることを確認した。
　従って、リポソーム内にトリテルペノイドが高濃度で含有され、皮膚生体膜の主成分であるセラミドの生成を増大させることによって、皮膚改善効果を示すことができる。

　以下、本発明の剤形を説明する。本発明によるリポソーム分散液を用いて、下記表３〜６に示された含量で、通常の製造方法によってそれぞれの剤形の皮膚外用剤を製造した。

　本発明は、生理活性を持つトリテルペノイドがリポソーム内に均一に混入された微小なリポソーム及びその製造方法に関し、より具体的には、人体に有害でない溶媒を使用し、かつ、過度な物理的処理を行うことなく、效率的に高濃度のトリテルペノイドを含有する微小なリポソームを製造する方法及びその製造方法により得られる微小なリポソームを提供するものであり、人体に安全で、優れた化学的安定性を有し、トリテルペノイドが高い生理活性を示すので、トリテルペノイドリポソームを含有する化粧料又は医薬用外用剤の製造に非常に有用である。

図１は、実施例１によるリポソームの合成を示す透過型電子顕微鏡(transmission electron microscope)写真である。図２は、実施例１、３〜６で製造されたリポソーム及びオレアノール酸（ＯＡ）に対する広角(wide-angle)Ｘ線−回折の結果である。

図３は、実施例３〜６で製造されたリポソームによるレシチン分子間の間隔を示す図である。図４は、実施例１で製造されたリポソームにより生成されたセラミドの薄膜液体クロマトグラフィーである。

図５は、実施例５で製造されたリポソームにより生成されたセラミドの薄膜液体クロマトグラフィーである。図６は、実施例１及び実施例５で製造されたリポソームにより発現された蛋白質のウエスタンブロット試験結果である。

Claims

　（イ）ポリオールを６０〜７０℃に加温しながら、前記ポリオールにトリテルペノイドを分散させて、分散液を製造する段階と、
（ロ）前記分散液に塩基を加え、低粘度の分散液を得る段階と、
（ハ）リン脂質を常温のエタノールに溶解させて、エタノール溶液を製造する段階と、
（ニ）前記エタノール溶液を前記分散液に加えた後、得られた混合液を蒸留水に投入して乳化させることにより、乳化溶液を製造する段階と、
（ホ）前記乳化溶液に酸を加え、微小なリポソームを製造する段階と
を含むことを特徴とする生理活性トリテルペノイドリポソームの製造方法。
　前記段階（イ）のポリオールは、ペンチレングリコール、ブチレングリコール及びプロピレングリコールよりなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項１に記載の生理活性トリテルペノイドリポソームの製造方法。
前記段階（ロ）の塩基は、トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、水酸化カリウム、アミノブタノール、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム及び水酸化カルシウムよりなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項１に記載の生理活性トリテルペノイドリポソームの製造方法。
前記塩基は、前記段階（イ）のトリテルペノイドと同様なノーマル濃度で、リポソーム分散液の重量に対して０.００１〜０.５重量%を添加することを特徴とする請求項３に記載の生理活性トリテルペノイドリポソームの製造方法。
前記塩基は、前記段階（ロ）の分散液のｐＨが１０乃至１１の範囲に維持されるようにする量であることを特徴とする請求項３に記載の生理活性トリテルペノイドリポソームの製造方法。
前記段階（ホ）の酸は、アジピン酸、ホウ酸、クエン酸、酢酸、蟻酸、フマル酸、乳酸、グリコール酸、コハク酸、プロピオン酸、ピルビン酸及びリン酸よりなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項１に記載のトリテルペノイドリポソームの製造方法。
前記酸は、前記段階（ロ）の塩基と同様なノーマル濃度で添加することを特徴とする請求項６に記載の生理活性トリテルペノイドリポソームの製造方法。
前記酸は、前記段階（ホ）のリポソームのｐＨが５乃至８間に維持されるようにする量であることを特徴とする請求項６に記載の生理活性トリテルペノイドリポソームの製造方法。
前記段階（ハ）のリン脂質は、二重結合が０〜３個存在するものであることを特徴とする請求項１に記載の生理活性トリテルペノイドリポソームの製造方法。
前記段階（ハ）のリン脂質は、ホスファチジルコリンの成分を７０〜９５重量%含有することを特徴とする請求項1に記載の生理活性トリテルペノイドリポソームの製造方法。
請求項1〜１０のいずれかに記載の方法で製造された、リポソーム内にトリテルペノイドが高濃度で混入されている生理活性トリテルペノイドリポソーム。
前記リポソームは、粒子サイズが０.００１〜１０μmの範囲内に存在する均一な分散液であることを特徴とする請求項１１に記載の生理活性トリテルペノイドリポソーム。
前記トリテルペノイドは、酸基を有するもので、ウルソル酸、オレアノール酸、センテラ・アジアティカ抽出物、ベトゥリニック酸、ボスウェリック酸及びこれらの混合物よりなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項１１に記載の生理活性トリテルペノイドリポソーム。
前記生理活性トリテルペノイドリポソームにおいて前記リン脂質の含量は、リポソーム分散液の重量に対して０.００１〜１５重量%であることを特徴とする請求項１１に記載の生理活性トリテルペノイドリポソーム。
前記生理活性トリテルペノイドリポソームにおいて前記トリテルペノイドの含量は、リポソーム分散液の重量に対して０．００１〜４重量%であることを特徴とする請求項１１に記載の生理活性トリテルペノイドリポソーム。
請求項１１に記載の生理活性トリテルペノイドリポソームを含有することを特徴とする皮膚外用剤組成物。
前記皮膚外用剤は、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディーエッセンス、メイカップベース、ファウンデーション、毛染め剤、シャンプー、リンス、ボディー洗浄剤、歯磨き粉、口腔清浄液、パッチ又は噴霧剤の剤形を有することを特徴とする請求項１６に記載の皮膚外用剤組成物。