JP2004177399A - ハイブリダイゼーションの検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】一本鎖オリゴＤＮＡ等の核酸プローブを電極上に固定し、検体DNA等の核酸サンプルを添加した際に２本鎖DNA等の２本鎖を形成するか否かを電気化学的に測定する方法であって、色素の使用が不要で、繰り返し測定が可能で、より高い確度で２本鎖DNAの２本鎖の形成を検出することができるハイブリダイゼーションの検出法を提供すること。
【解決手段】電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブと、一本鎖に変性された核酸サンプルとを共存させた後、前記核酸プローブと前記核酸サンプルに含まれる目的核酸とのハイブリダイズの検出を、核酸プローブを固定化した電極の交流インピーダンスを測定することにより行う、前記目的核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出する方法。
【選択図】
【解決手段】電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブと、一本鎖に変性された核酸サンプルとを共存させた後、前記核酸プローブと前記核酸サンプルに含まれる目的核酸とのハイブリダイズの検出を、核酸プローブを固定化した電極の交流インピーダンスを測定することにより行う、前記目的核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出する方法。
【選択図】
Description
本発明は、遺伝子サンプルに含まれる目的遺伝子等の目的核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出し、サンプル中に存在する特定の遺伝子等を特異的に検出するための方法に関する。
遺伝子（ＤＮＡ）に刻み込まれた遺伝情報は、メッセンジャーＲＮＡを介して蛋白質あるいは酵素として表現される。この蛋白質や酵素の働きにより、生命の維持に必要な様々な化合物の生合成および代謝が行なわれる。このように、遺伝子に支配された多様な物質の動的平衡系として、生物が存在している。
ヒトゲノムプロジェクトの成果として、ヒトの遺伝子の総数は約３万であることが解明された。これら遺伝子の中に、例えば欠損や重複のような何等かの異常や変化が生じると、生成される蛋白質の特性、種類および量などが変化し、結果として生体系のバランスが崩れて疾病を引き起こす。従って、逆に病因となる既知の遺伝子を検出することによって、疾患の同定や予防が可能である。このような診断を遺伝子診断と呼ぶ。
遺伝子発現の機構を考えると、殆どの生化学レベルでの変化に先行して、遺伝子上での変化が生じていることが推定される。従って、遺伝子変化の検出による遺伝子診断では、病気という表現型での変化に先だって、即ち、発症前や病気の潜伏期あるいは極めて初期の段階で、診断や予測ができる。さらに、生体内の細胞では遺伝子は全て同一であるので、遺伝性の疾患に関する遺伝子診断法は、分析する臓器や組織に依存しない。このことは、特に胎児での診断では重要であり、妊婦から羊水を採取し、羊水中に浮遊している胎児の細胞を調べるだけで診断を行なうことが可能となる。
遺伝子診断法において使用可能な遺伝子検出法が幾つか提案されている。その中で、安全性および簡便性に優れると共に、短時間で目的とする遺伝子の有無を高感度に検出することを目的として、特許文献１及び２に記載の方法がある。
この遺伝子検出法は、試料から抽出し、一本鎖に変性された遺伝子サンプルを、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブと反応させた後、遺伝子とハイブリダイズされた前記核酸プローブを検出することによって前記目的遺伝子の存在を確認する遺伝子検出法である。この方法では、前記核酸プローブを電極表面、または光ファイバ先端に固定化して用いることと、二本鎖核酸に特異的に結合し、且つ電気化学的または光化学的に活性な二本鎖認識体を、前記核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加することと、さらに、前記電極または前記光ファイバを介した電気化学的または光化学的な測定により、前記核酸プローブと目的遺伝子との二本鎖核酸に結合した二本鎖認識体を検出することにより、目的遺伝子とハイブリダイズされた前記核酸プローブの存在を検出する。
この遺伝子検出法は、試料から抽出し、一本鎖に変性された遺伝子サンプルを、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブと反応させた後、遺伝子とハイブリダイズされた前記核酸プローブを検出することによって前記目的遺伝子の存在を確認する遺伝子検出法である。この方法では、前記核酸プローブを電極表面、または光ファイバ先端に固定化して用いることと、二本鎖核酸に特異的に結合し、且つ電気化学的または光化学的に活性な二本鎖認識体を、前記核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加することと、さらに、前記電極または前記光ファイバを介した電気化学的または光化学的な測定により、前記核酸プローブと目的遺伝子との二本鎖核酸に結合した二本鎖認識体を検出することにより、目的遺伝子とハイブリダイズされた前記核酸プローブの存在を検出する。
しかるに、上記特許文献１及び２に記載の方法にも以下の問題がある。
上記の方法では、一本鎖オリゴＤＮＡを電極上に固定し、検体DNAを滴下した時に２本鎖DNAとなるか否かを、２本鎖DNAに特異的にインターカレーションする色素を電気化学的な酸化還元反応から検出するものである。使用されるインターカレーションする色素の酸化、還元電位とピーク電流値の測定は、電位のスイープ速度に影響され、その上、ほぼ一回の測定で色素が酸化されてしまうため繰り返し測定ができない。その結果、測定確度の低下を招く。また、色素が一本鎖オリゴＤＮＡや電極に固定化されることがあり、色素の電気化学的な測定で２本鎖DNAとなったか否かを検出することが困難な場合がある。また、残存する色素が電気化学的な測定に影響を与える場合もある。
上記の方法では、一本鎖オリゴＤＮＡを電極上に固定し、検体DNAを滴下した時に２本鎖DNAとなるか否かを、２本鎖DNAに特異的にインターカレーションする色素を電気化学的な酸化還元反応から検出するものである。使用されるインターカレーションする色素の酸化、還元電位とピーク電流値の測定は、電位のスイープ速度に影響され、その上、ほぼ一回の測定で色素が酸化されてしまうため繰り返し測定ができない。その結果、測定確度の低下を招く。また、色素が一本鎖オリゴＤＮＡや電極に固定化されることがあり、色素の電気化学的な測定で２本鎖DNAとなったか否かを検出することが困難な場合がある。また、残存する色素が電気化学的な測定に影響を与える場合もある。
そこで本発明は、上記方法における問題を解決するものであり、一本鎖オリゴＤＮＡ等の核酸プローブを電極上に固定し、検体DNA等の核酸サンプルを添加した際に２本鎖DNA等の２本鎖を形成するか否かを電気化学的に測定する方法であって、色素の使用が不要で、繰り返し測定が可能で、より高い確度で２本鎖DNAの２本鎖の形成を検出することができるハイブリダイゼーションの検出法を提供することを目的とする。
上記課題を解決する本発明は以下の通りである。
（１）電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブと、一本鎖に変性された核酸サンプルとを共存させた後、前記核酸プローブと前記核酸サンプルに含まれる目的核酸とのハイブリダイズの検出を、核酸プローブを固定化した電極の交流インピーダンスを測定することにより行う、前記目的核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出する方法。
（２）核酸プローブがＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡである（１）に記載の基板。
（３）前記核酸サンプルが、遺伝子サンプルであり、目的核酸が目的遺伝子である（1）または（２）に記載の方法。
（４）前記目的核酸が核酸プローブと相補的な塩基配列を有する（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記目的核酸が核酸プローブに対して少なくとも１つのミスマッチを有する（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（６）前記目的核酸が核酸プローブに対して１つのミスマッチを有する（５）に記載の方法。
（７）前記核酸プローブと核酸サンプルとをハイブリダイズのために共存させ、次いで、温度を８０〜８８℃の範囲にし、次いで室温に戻した後に、前記交流インピーダンスの測定を行う（５）または（６）に記載の方法。
（８）前記交流インピーダンスの測定を、櫛形の対向電極を用いて行う（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（１）電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブと、一本鎖に変性された核酸サンプルとを共存させた後、前記核酸プローブと前記核酸サンプルに含まれる目的核酸とのハイブリダイズの検出を、核酸プローブを固定化した電極の交流インピーダンスを測定することにより行う、前記目的核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出する方法。
（２）核酸プローブがＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡである（１）に記載の基板。
（３）前記核酸サンプルが、遺伝子サンプルであり、目的核酸が目的遺伝子である（1）または（２）に記載の方法。
（４）前記目的核酸が核酸プローブと相補的な塩基配列を有する（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記目的核酸が核酸プローブに対して少なくとも１つのミスマッチを有する（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（６）前記目的核酸が核酸プローブに対して１つのミスマッチを有する（５）に記載の方法。
（７）前記核酸プローブと核酸サンプルとをハイブリダイズのために共存させ、次いで、温度を８０〜８８℃の範囲にし、次いで室温に戻した後に、前記交流インピーダンスの測定を行う（５）または（６）に記載の方法。
（８）前記交流インピーダンスの測定を、櫛形の対向電極を用いて行う（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、一本鎖オリゴＤＮＡ等の核酸プローブを電極上に固定し、検体DNA等の核酸サンプルを添加した際に２本鎖DNA等の２本鎖を形成するか否かを電気化学的に測定する方法であって、色素の使用が不要で、繰り返し測定が可能で、より高い確度で２本鎖DNAの２本鎖の形成を検出することができるハイブリダイゼーションの検出法を提供することができる。
本発明の方法では、電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブを用意する。核酸プローブは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであることができる。核酸プローブは、例えば、検出すべき目的遺伝子等の目的核酸に対して相補的な塩基配列を有するものであることができる。
そのような一本鎖の核酸プローブは、検出すべき目的遺伝子等の目的核酸が定まれば、その塩基配列は自ずと決まり、そのような一本鎖の核酸プローブは、例えば、化学合成法により用意することができる。化学合成法としては、例えば、ホスホルアミダイト法、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法等を挙げることができるが、これらに限定されない。
一本鎖の核酸プローブの塩基数には、特に制限はないが、例えば、２０〜１０００の範囲であることができ、検出すべき目的遺伝子の塩基数等を考慮して、適宜決定できる。
そのような一本鎖の核酸プローブは、検出すべき目的遺伝子等の目的核酸が定まれば、その塩基配列は自ずと決まり、そのような一本鎖の核酸プローブは、例えば、化学合成法により用意することができる。化学合成法としては、例えば、ホスホルアミダイト法、リン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法等を挙げることができるが、これらに限定されない。
一本鎖の核酸プローブの塩基数には、特に制限はないが、例えば、２０〜１０００の範囲であることができ、検出すべき目的遺伝子の塩基数等を考慮して、適宜決定できる。
上記一本鎖の核酸プローブへの電極表面の固定化は、例えば、（１）一本鎖の核酸プローブの末端にチオール基を導入し、金と硫黄との金−硫黄配位結合を介してＤＮＡを電極に固定化する方法（特開平９−２８８０８０号公報参照）、（２）アミノ基、カルボキシル基、スルホン基等の反応性官能基、ハプテン分子、ビオチン、アビジン等の物質で修飾して固定化する方法（特開平６−７０７９９号公報参照）を挙げることができる。あるいは、（３）一本鎖の核酸プローブを物理吸着により電極表面へ固定化する方法（特開平５−１９９８９８号公報参照）により、一本鎖の核酸プローブへの電極表面の固定化を行うこともできる。
一本鎖の核酸プローブを固定化してある領域の面積は、例えば、Φ４〜６ｍｍ、電極表面の固定化される一本鎖の核酸プローブの量は、４００ｐｍｏｌ〜６ｎｍｏｌの範囲とすることができる。但し、これらの範囲に限定されるものではない。
一本鎖の核酸プローブを固定化する電極としては、例えば、貴金属電極（例えば、金、白金、パラジウム、ロジウム等）、カーボン電極、酸化物電極（例えば、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛等）等を用いることができる。さらに、一本鎖の核酸プローブを固定化する電極は、例えば、櫛形の対向電極とすることができる。櫛形の対向電極を含む測定装置の平面図を図１に示し、櫛形の対向電極の拡大図を図２に示す。図１に示す装置には、１〜８の櫛形の対向電極が設けられ、櫛形の対向電極を構成する２つの電極は、それぞれ端子２０または２１と１１〜１８のいずれかの端子に接続している。端子２０及び２１並びに端子１１〜１８は、交流インピーダンス測定装置に接続する。
また、図１に示す装置は、図示されていないが、櫛形の対向電極の部分以外は、例えば、樹脂製のカバーが設けられ、櫛形の対向電極の部分に供給された測定用溶液が他の櫛形の対向電極と短絡するのを防止することができる。図２の櫛形の対向電極の周囲に設けられた円部が樹脂製のカバーに設けられた測定用溶液供給用の孔である。
また、図１に示す装置は、図示されていないが、櫛形の対向電極の部分以外は、例えば、樹脂製のカバーが設けられ、櫛形の対向電極の部分に供給された測定用溶液が他の櫛形の対向電極と短絡するのを防止することができる。図２の櫛形の対向電極の周囲に設けられた円部が樹脂製のカバーに設けられた測定用溶液供給用の孔である。
本発明の方法では、一本鎖に変性された核酸サンプルを用意する。核酸サンプルは、例えば、遺伝子サンプルであることができる。遺伝子サンプル以外の核酸サンプルとして、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞等中に含まれる核酸を挙げることができる。あるいは、核酸サンプルとして合成した核酸サンプルも用いることができる。
一本鎖に変性された遺伝子サンプルは、例えば、以下の方法により入手することができる。
＜ＳＤＳ／フェノール法によるＤＮＡの精製＞
（１）細胞を５０ｍＬチューブにいれる。
（２）リシスバッファー１０ｍＬ、プロテナーゼＫ溶液0.1ｍＬを加え、ゆっくりと振とうしながら55℃で８時間インキュベートする。
（３）Tris／フェノールを10ｍL加え、30rpmで１時間ゆっくり混合する。
（４）3000rpm、10分間、室温で遠心後、広口のピペットで慎重に回収し、新しいチューブに移す。
（５）10ｍLのフェノール／クロロホルムを加え、１時間ゆるやかに混合し、3000rpmで10分間、室温で遠心する。
（６）広口のピペットで水層を慎重に回収し、新しいチューブに移す。フェノール／クロロホルム抽出をタンパク質層が無くなるまで繰り返す。
（７）20ｍLの100％エタノールをチューブの壁面に沿わせながら静かに重層する。
（８）ガラス棒を水層とエタノール層の界面に挿入してゆっくりとかき回し、析出したDNAを巻き取る。
（９）70％エタノール20ｍLの中にDNAを30秒浸してリンスする。ガラス棒についたDNAを風乾する。
（１０）50ｍLのチューブにTEを10ｍLとり、巻き取ったDNAを浸す。
（１１）４℃で一晩ゆるやかに振とう／攪拌してDNAを溶かす。
（１２）RNaseAを終濃度40μg/ｍLに加え、37℃で1時間インキュベートする。
（１３）分注して-20℃で保存する。
＜DNA精製キットを用いる精製＞QIAGEN社 #69504 DNeasy Tissue Kit など
（１）細胞を50ｍLチューブに入れ、180μLのATLバッファーを加える。
（２）プロティナーゼKを20μL加えて、55℃で保温しながら１〜３時間振とうし組織を完全に溶かす。
（３）15秒間ボルテックスした後、200μLのALバッファーを加えてよく混合し、70℃で10分間インキュベートする。
（４）200μLのエタノールを加えよく混合する。
（５）ピペットで全量2mLサンプリングチューブにセットしたスピンカラムに移し、1分間遠心後、濾液の入ったサンプリングチューブを捨てる。
（６）スピンカラムを新しいサンプリングチューブにセットし、500μLのAWIバッファーを入れる。
（７）1分間遠心後、濾液の入ったサンプリングチューブを捨てる。
（８）スピンカラムに再度新しいサンプリングチューブをセットし、500μLのAW2バッファーを入れる。
（９）3分間15000rpmで遠心し、カラムから水分をできるだけ除く、遠心後濾液の入ったサンプリングチューブは捨てる。
（１０）スピンカラムをエッペンチューブにセットし、200μLのAEバッファーをピペットで直接シリカ膜上に載せ、1分間放置する。
（１１）1分間遠心し、濾液（精製DNA）を得る。
＜制限酵素による断片化＞
（１）10μgのゲノムDNAが入ったエッペンチューブに、10×制限酵素バッファー（BSAまたはtriton−Ｘ）を40μl、制限酵素を100〜1000unit加え、SP水で400μLにする。
（２）制限酵素の最適温度で8時間以上反応させる。
（３）400μLのフェノール／クロロホルムを加え、ボルテックスミキサーで攪拌する。
（４）室温、15000rpm、5分間遠心する。
（５）ピペットマンで上層を新しいエッペンチューブに移す（（３）、（４）の繰り返し）。
（６）上層に40μLの３M酢酸ナトリウムと1mLの冷100%エタノールを加え、混ぜる。４℃、15000rpm、20分間遠心する。
（７）エタノールを捨て、沈殿に70%エタノールを加え、４℃、15000rpm、5分間遠心してリンスする。
（８）エタノールを捨て遠心乾燥機で乾燥させ、10μLのTEに溶かす。
ＴＥは 10mM Tris/HCl(pH8.0), 1mM EDTA
Tris (ヒドロキシメチル)アミノメタン
電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブと、一本鎖に変性された核酸サンプルとを、ハイブリダイゼーションのために共存させる。以下、核酸サンプルが遺伝子サンプルの場合を例に説明する。
上記ハイブリダイゼーションのための共存は、例えば、一本鎖に変性された遺伝子サンプルを含む溶液を、電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブ上に滴下することで行うことができる。一本鎖に変性された遺伝子サンプルを含む溶液中の遺伝子サンプルの濃度は、例えば、１０〜１００μｍｏｌ／Ｌとすることができる。
＜ＳＤＳ／フェノール法によるＤＮＡの精製＞
（１）細胞を５０ｍＬチューブにいれる。
（２）リシスバッファー１０ｍＬ、プロテナーゼＫ溶液0.1ｍＬを加え、ゆっくりと振とうしながら55℃で８時間インキュベートする。
（３）Tris／フェノールを10ｍL加え、30rpmで１時間ゆっくり混合する。
（４）3000rpm、10分間、室温で遠心後、広口のピペットで慎重に回収し、新しいチューブに移す。
（５）10ｍLのフェノール／クロロホルムを加え、１時間ゆるやかに混合し、3000rpmで10分間、室温で遠心する。
（６）広口のピペットで水層を慎重に回収し、新しいチューブに移す。フェノール／クロロホルム抽出をタンパク質層が無くなるまで繰り返す。
（７）20ｍLの100％エタノールをチューブの壁面に沿わせながら静かに重層する。
（８）ガラス棒を水層とエタノール層の界面に挿入してゆっくりとかき回し、析出したDNAを巻き取る。
（９）70％エタノール20ｍLの中にDNAを30秒浸してリンスする。ガラス棒についたDNAを風乾する。
（１０）50ｍLのチューブにTEを10ｍLとり、巻き取ったDNAを浸す。
（１１）４℃で一晩ゆるやかに振とう／攪拌してDNAを溶かす。
（１２）RNaseAを終濃度40μg/ｍLに加え、37℃で1時間インキュベートする。
（１３）分注して-20℃で保存する。
＜DNA精製キットを用いる精製＞QIAGEN社 #69504 DNeasy Tissue Kit など
（１）細胞を50ｍLチューブに入れ、180μLのATLバッファーを加える。
（２）プロティナーゼKを20μL加えて、55℃で保温しながら１〜３時間振とうし組織を完全に溶かす。
（３）15秒間ボルテックスした後、200μLのALバッファーを加えてよく混合し、70℃で10分間インキュベートする。
（４）200μLのエタノールを加えよく混合する。
（５）ピペットで全量2mLサンプリングチューブにセットしたスピンカラムに移し、1分間遠心後、濾液の入ったサンプリングチューブを捨てる。
（６）スピンカラムを新しいサンプリングチューブにセットし、500μLのAWIバッファーを入れる。
（７）1分間遠心後、濾液の入ったサンプリングチューブを捨てる。
（８）スピンカラムに再度新しいサンプリングチューブをセットし、500μLのAW2バッファーを入れる。
（９）3分間15000rpmで遠心し、カラムから水分をできるだけ除く、遠心後濾液の入ったサンプリングチューブは捨てる。
（１０）スピンカラムをエッペンチューブにセットし、200μLのAEバッファーをピペットで直接シリカ膜上に載せ、1分間放置する。
（１１）1分間遠心し、濾液（精製DNA）を得る。
＜制限酵素による断片化＞
（１）10μgのゲノムDNAが入ったエッペンチューブに、10×制限酵素バッファー（BSAまたはtriton−Ｘ）を40μl、制限酵素を100〜1000unit加え、SP水で400μLにする。
（２）制限酵素の最適温度で8時間以上反応させる。
（３）400μLのフェノール／クロロホルムを加え、ボルテックスミキサーで攪拌する。
（４）室温、15000rpm、5分間遠心する。
（５）ピペットマンで上層を新しいエッペンチューブに移す（（３）、（４）の繰り返し）。
（６）上層に40μLの３M酢酸ナトリウムと1mLの冷100%エタノールを加え、混ぜる。４℃、15000rpm、20分間遠心する。
（７）エタノールを捨て、沈殿に70%エタノールを加え、４℃、15000rpm、5分間遠心してリンスする。
（８）エタノールを捨て遠心乾燥機で乾燥させ、10μLのTEに溶かす。
ＴＥは 10mM Tris/HCl(pH8.0), 1mM EDTA
Tris (ヒドロキシメチル)アミノメタン
電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブと、一本鎖に変性された核酸サンプルとを、ハイブリダイゼーションのために共存させる。以下、核酸サンプルが遺伝子サンプルの場合を例に説明する。
上記ハイブリダイゼーションのための共存は、例えば、一本鎖に変性された遺伝子サンプルを含む溶液を、電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブ上に滴下することで行うことができる。一本鎖に変性された遺伝子サンプルを含む溶液中の遺伝子サンプルの濃度は、例えば、１０〜１００μｍｏｌ／Ｌとすることができる。
また、一本鎖に変性された遺伝子サンプルを含む溶液は、電解液として機能することが必要であり、そのような溶液としては、種々のバッファーを挙げることができ、特に、ＤＮＡ分解酵素阻害剤であるＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有する緩衝液であることが好ましく、例えば、ＥＤＴＡを含むトリス緩衝液（ＴＥバッファー）、ＥＤＴＡを含むトリス・酢酸塩緩衝液（ＴＡＥバッファー）、ＥＤＴＡを含むトリス・ホウ酸塩緩衝液（ＴＢＥバッファー）、標準クエン酸ナトリウム緩衝液（ＳＳＣバッファー）などを挙げることができる。
核酸プローブと核酸サンプルとのハイブリダイズの条件は、通常のハイブリダイゼーションと同様である。ハイブリダイゼーションの最適温度、塩濃度、ホルムアミドを用いる場合はその濃度等は、用いる核酸プローブの塩基配列及び長さ、核酸サンプルの種類と核酸サンプルに含まれる目的核酸の種類及び配列等に依存する。一般には、ハイブリダイゼーションの温度は融解温度（Ｔｍ）より約２５℃低い温度が用いられる。Ｔｍは、塩温度またはホルムアミド濃度により調節可能である。例えば、通常１％ホルムアミドはＴｍを約０．６℃下げる。本発明の方法におけるハイブリダイゼーションは、例えば、３７〜７２℃の範囲で行われることが適当である。
ハイブリダイズを行った後、核酸プローブを固定化した電極の交流インピーダンスを測定する。交流インピーダンスの測定は、図３に示すようにして行うことができる。図３は金電極上に固定された一本鎖ＤＮＡ（プローブＤＮＡ）が、その上に滴下された検体一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズしたか否かを交流インピーダンス（Ｚ）から測定する方法の概念図を示している。図３中、ガラス基板の表面に金電極が設けられ、その上に核酸プローブが固定されている領域が有る。そして、核酸プローブが固定されている領域に、目的遺伝子を含有する電解液を滴下して、所定のハイブリダイゼーション条件に置く。具体的には、例えば、金電極上には端末にＳＨ基が付けてあるプローブＤＮＡを４０μＬ（１０μｍｏｌ／Ｌ）滴下して固定されており、検体ＤＮＡも１０μｍｏｌ／Ｌのものを４０μＬ滴下する。金電極上のＴＥ溶液の径は４ｍｍ（１２．６ｍｍ2）である。ハイブリダイゼーション条件においた後、電解液に対極となる白金電極を接触させて、金電極と白金電極との間で、例えば、周波数０．０１Ｈｚから１ＭＨｚまでの交流インピーダンスを測定する。交流インピーダンスの測定は、室温で行うことができるが、例えば、ハイブリダイズへの温度の影響を測定する場合などは、測定温度を適宜変更することができる。
図４に電解液が接触している２つの電極間の交流インピーダンス（Ｚ）の測定における電気的等価回路を示す。
図４において、界面１がプローブＤＮＡと検体ＤＮＡとがハイブリダイズする時の状態を示しており、本測定法では電極、界面１、電解液（ＴＥ液）、界面２、対向電極のインピーダンスが測定できる。図中の式は電極界面の反応抵抗や電解液の抵抗、静電容量等を示す式であり、図中のＺｗは電極界面で電極反応する種の拡散などを表すワールブルグインピーダンスと呼ばれるものであり、電気反応する種とはセル内の電気伝導過程、ファラデー電荷移動過程、二重層充電過程等である。これら電気化学的過程に対応するインピーダンスは、抵抗やコンデンサのような簡単な受動素子と同じ振る舞いをする（Ｚｗは別）。すなわち、図中の式より界面１での反応抵抗や二重層、溶液の抵抗等を求めることが出来る。また、数１０ＫＨｚ以下の低周波側を解読することにより、固定化されたプローブＤＮＡ界面でのイオンの拡散情報を得ることが出来る。従って、界面１ではプローブＤＮＡと検体ＤＮＡがハイブリダイズするか否かの反応が起きるため、ハイブリダイズの有無を交流インピーダンス測定法から解析できる。
図４において、界面１がプローブＤＮＡと検体ＤＮＡとがハイブリダイズする時の状態を示しており、本測定法では電極、界面１、電解液（ＴＥ液）、界面２、対向電極のインピーダンスが測定できる。図中の式は電極界面の反応抵抗や電解液の抵抗、静電容量等を示す式であり、図中のＺｗは電極界面で電極反応する種の拡散などを表すワールブルグインピーダンスと呼ばれるものであり、電気反応する種とはセル内の電気伝導過程、ファラデー電荷移動過程、二重層充電過程等である。これら電気化学的過程に対応するインピーダンスは、抵抗やコンデンサのような簡単な受動素子と同じ振る舞いをする（Ｚｗは別）。すなわち、図中の式より界面１での反応抵抗や二重層、溶液の抵抗等を求めることが出来る。また、数１０ＫＨｚ以下の低周波側を解読することにより、固定化されたプローブＤＮＡ界面でのイオンの拡散情報を得ることが出来る。従って、界面１ではプローブＤＮＡと検体ＤＮＡがハイブリダイズするか否かの反応が起きるため、ハイブリダイズの有無を交流インピーダンス測定法から解析できる。
インピーダンス測定によって得られた結果は、一般に(1)ボード線図表示または(2)複素平面表示（Cole-Cole-plot）される。(1)のボード線図表示では、横軸は周波数、縦軸はインピーダンスの絶対値の対数であり、周波数とインピーダンスの絶対値の関係がわかる。高周波数(数100kHz程度以上)帯から溶液抵抗Rsol、中間の周波数帯(数100mHz〜数kHz程度)から二重層容量Cdl、低周波数帯(数100mHz程度以下)から反応抵抗r等がそれぞれ求まる。(2)の複素平面表示（Cole-Cole-plot）では、インピーダンス(Z=Z'＋jZ'')の実数成分Z'を横軸に、虚数成分Z''を縦軸に描いたものである。周波数との関係が読み取りにくいため、プロットした点に測定周波数を付記し、(1)と同様に複素平面表示により、Rsol、Cdl、rをそれぞれ求めることができる。
電解液が接触している２つの電極間の交流インピーダンスの内、数１０ＫＨｚ以下の低周波数域を解読することにより、電極に固定化された核酸プローブ界面におけるイオンの拡散情報を得ることができ、上記交流インピーダンスを測定することにより、目的遺伝子と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出することができる。
ハイブリダイゼーションの検出は、実施例で詳述するが、例えば、上記ボード線図表示で表された結果（例えば、図５に示す結果）から、抵抗値ｒを求め、ハイブリダイゼーションの有無によってｒが変動することから、ハイブリダイゼーションを検出できる。
あるいは、ボード線図表示で表された結果であって、1〜100Hzのデータを拡大した結果（例えば、図６に示す結果）において、ハイブリダイゼーションの有無によって同一周波数でのインピーダンスの絶対値が変動することから、ハイブリダイゼーションを検出できる。
ハイブリダイゼーションの検出は、実施例で詳述するが、例えば、上記ボード線図表示で表された結果（例えば、図５に示す結果）から、抵抗値ｒを求め、ハイブリダイゼーションの有無によってｒが変動することから、ハイブリダイゼーションを検出できる。
あるいは、ボード線図表示で表された結果であって、1〜100Hzのデータを拡大した結果（例えば、図６に示す結果）において、ハイブリダイゼーションの有無によって同一周波数でのインピーダンスの絶対値が変動することから、ハイブリダイゼーションを検出できる。
目的遺伝子が核酸プローブと相補的である場合、以下のようにハイブリダイゼーションを検出することができる。
ハイブリダイゼーションの最適条件は、前述のように、用いる核酸プローブの塩基配列、長さ、核酸濃度等に依存する。一般に、ハイブリダイズの温度は融解温度より約２５℃低い温度が用いられ、通常、３７〜７２℃の範囲で行うことができる。
ハイブリダイゼーションの最適条件は、前述のように、用いる核酸プローブの塩基配列、長さ、核酸濃度等に依存する。一般に、ハイブリダイズの温度は融解温度より約２５℃低い温度が用いられ、通常、３７〜７２℃の範囲で行うことができる。
目的遺伝子が核酸プローブに対して少なくとも１つのミスマッチを有する場合、特に、目的遺伝子が核酸プローブに対して１つのミスマッチを有する場合、例えば、核酸プローブと目的遺伝子とのハイブリダイズさせるための反応を行った後、温度を８０〜８８℃の範囲にした後に、交流インピーダンスの測定を行い、以下のようにハイブリダイゼーションを検出することができる。温度を８０〜８８℃の範囲にすることで、核酸プローブに対してミスマッチを有する目的遺伝子は、核酸プローブから解離するので、上記温度処理の前後で交流インピーダンスの測定結果（抵抗）に変化が現れ、ミスマッチの存在を検出できる。上記温度を８０〜８８℃の範囲内のどの温度にするのが最適かは、目的遺伝子及び核酸プローブの長さや塩基配列に応じて適宜決定できる。
以下、本発明の方法を実施例によりさらに説明する。
（実施例）
図３に示す装置において、プローブＤＮＡ＝ａ0が固定されている金電極上に、検体ＤＮＡ＝ａ1もしくはｂ１を滴下し、４３℃の雰囲気中に１時間程度放置することによってハイブリダイズ処理をする。使用したオリゴＤＮＡの塩基配列は以下の通りである。
a0＝Trp64 (脂肪減少型) gtggccatcgcctggactccgagac（配列番号１）
b0＝Arg64 (脂肪蓄積型) gtggccatcgcccggactccgagac（配列番号２）
a1＝Trp64と相補的なDNA caccggtagcggacctgaggctctg（配列番号３）
b1＝Arg64と相補的なDNA caccggtagcgggcctgaggctctg（配列番号４）
ａ0=Trp64とｂ0=Arg64とでは中心の一塩基だけが異なっており、これらに対応した相補的ＤＮＡも中心の一塩基だけが異なる。（たった一塩基の違いで一方はやせ型となり、他方は肥満型となる。）
ここで、ａ0−ａ1の組合せはハイブリダイズする組合せであり、ａ0−ｂ1の組合せはハイブリダイズしない組合せである。
ハイブリダイズ処理をした後、周波数を０．０１Ｈｚから１ＭＨｚまで自動掃引しながらインピーダンスを測定した。交流インピーダンス測定装置にはソーラートロン社製インピーダンス／ゲイン−フェイズ・アナライザー１２６０型を用いた。
（実施例）
図３に示す装置において、プローブＤＮＡ＝ａ0が固定されている金電極上に、検体ＤＮＡ＝ａ1もしくはｂ１を滴下し、４３℃の雰囲気中に１時間程度放置することによってハイブリダイズ処理をする。使用したオリゴＤＮＡの塩基配列は以下の通りである。
a0＝Trp64 (脂肪減少型) gtggccatcgcctggactccgagac（配列番号１）
b0＝Arg64 (脂肪蓄積型) gtggccatcgcccggactccgagac（配列番号２）
a1＝Trp64と相補的なDNA caccggtagcggacctgaggctctg（配列番号３）
b1＝Arg64と相補的なDNA caccggtagcgggcctgaggctctg（配列番号４）
ａ0=Trp64とｂ0=Arg64とでは中心の一塩基だけが異なっており、これらに対応した相補的ＤＮＡも中心の一塩基だけが異なる。（たった一塩基の違いで一方はやせ型となり、他方は肥満型となる。）
ここで、ａ0−ａ1の組合せはハイブリダイズする組合せであり、ａ0−ｂ1の組合せはハイブリダイズしない組合せである。
ハイブリダイズ処理をした後、周波数を０．０１Ｈｚから１ＭＨｚまで自動掃引しながらインピーダンスを測定した。交流インピーダンス測定装置にはソーラートロン社製インピーダンス／ゲイン−フェイズ・アナライザー１２６０型を用いた。
測定結果を図５に示す。
図５中、（１）は金電極のみの結果、（２）は金電極にプローブＤＮＡとしてTrpSH（a0）を固定化した場合の結果、（３）はプローブＤＮＡとしてTrpSH（a0）を固定化した金電極に完全相補性のａ1をハイブリダイズさせた場合の結果、（４）はプローブＤＮＡとしてTrpSH（a0）を固定化した金電極に１塩基違いのｂ1をハイブリダイズさせた場合の結果である。
図５中、（１）は金電極のみの結果、（２）は金電極にプローブＤＮＡとしてTrpSH（a0）を固定化した場合の結果、（３）はプローブＤＮＡとしてTrpSH（a0）を固定化した金電極に完全相補性のａ1をハイブリダイズさせた場合の結果、（４）はプローブＤＮＡとしてTrpSH（a0）を固定化した金電極に１塩基違いのｂ1をハイブリダイズさせた場合の結果である。
図５に示す交流インピーダンス測定の結果は、ボード線図表示したものであり、横軸は周波数、縦軸はインピーダンスの絶対値の対数であり、周波数とインピーダンスの絶対値の関係がわかる。
このグラフを低周波側へ外挿することにより、抵抗ｒを求めることができる。その結果を表１に示す。表中ｒ（ＭΩ）はプローブＤＮＡが固定されている金電極界面の反応抵抗（電荷移動抵抗）を示している。なお、測定は金電極のみの場合も金電極上にＤＮＡが固定してある場合も、金電極とＴＥ溶液間で実施している。
このグラフを低周波側へ外挿することにより、抵抗ｒを求めることができる。その結果を表１に示す。表中ｒ（ＭΩ）はプローブＤＮＡが固定されている金電極界面の反応抵抗（電荷移動抵抗）を示している。なお、測定は金電極のみの場合も金電極上にＤＮＡが固定してある場合も、金電極とＴＥ溶液間で実施している。
これから明らかであるように、ハイブリダイズしない場合とハイブリダイズしたもののｒの間にははっきりと差があり、ハイブリダイズした場合は、ｒは大きくなる。一方、ハイブリダイズしたものとミスマッチ接合の場合はｒに差は見られない。しかし、ミスマッチ接合は８０〜８８℃の熱処理を施すことによって一本鎖ＤＮＡとすることができ、正規にハイブリダイズしたものはこの温度では一本鎖ＤＮＡとすることができないので、所定の温度処理をした後に測定することによってハイブリダイズの有無を判定することが出来る。
上記の点を確認するために、ハイブリダイズ後、８４〜８８℃で熱処理を１０分間行った後に、上記と同様にして周波数を０．０１Ｈｚから１ＭＨｚまで自動掃引しながらインピーダンスを測定した。得られた交流インピーダンス測定結果から求めた抵抗値ｒを以下の表２に示す。
これらの結果から、本発明の方法によれば、二本鎖ＤＮＡを識別するために用いられている標識物質を使用しなくてもハイブリダイズの有無やミスマッチの有無を判定することが出来ることが分かる。
なお、上記測定は、それぞれ５回繰り返し実施したが、ほぼ同じ測定結果が得られた。
上記表１及び２に示すように、交流インピーダンス測定結果から求めた抵抗値ｒを比べることで、ハイブリダイズの有無やミスマッチの有無を判定することが出来るが、それ以外にもハイブリダイズの有無やミスマッチの有無を判定することが出来る。例えば、図６に図５の結果を、周波数が１〜１００Ｈｚの範囲について拡大した結果を示す。図６の結果からハイブリダイズの有無を判定することが出来る。また、ハイブリダイズ後、８４〜８８℃で熱処理を１０分間行った後に室温に戻し、交流インピーダンス測定を行った結果からも、周波数が１〜１００Ｈｚの範囲の結果に注目すれば、ミスマッチの有無を判定することが出来る。
Claims (8)
- 電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブと、一本鎖に変性された核酸サンプルとを共存させた後、前記核酸プローブと前記核酸サンプルに含まれる目的核酸とのハイブリダイズの検出を、核酸プローブを固定化した電極の交流インピーダンスを測定することにより行う、前記目的核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出する方法。
- 核酸プローブがＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡである請求項１に記載の基板。
- 前記核酸サンプルが、遺伝子サンプルであり、目的核酸が目的遺伝子である請求項1または２に記載の方法。
- 前記目的核酸が核酸プローブと相補的な塩基配列を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記目的核酸が核酸プローブに対して少なくとも１つのミスマッチを有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記目的核酸が核酸プローブに対して１つのミスマッチを有する請求項５に記載の方法。
- 前記核酸プローブと核酸サンプルとをハイブリダイズのために共存させ、次いで、温度を８０〜８８℃の範囲にし、次いで室温に戻した後に、前記交流インピーダンスの測定を行う請求項５または６に記載の方法。
- 前記交流インピーダンスの測定を、櫛形の対向電極を用いて行う請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015503095A (ja) * | 2011-11-22 | 2015-01-29 | アイティーアイ・スコットランド・リミテッド | アナライトの検出 |
-
2003
- 2003-09-19 JP JP2003327743A patent/JP2004177399A/ja active Pending
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