JPH02500A - Ｉ型糖尿病素因の診断用プローブ - Google Patents
Ｉ型糖尿病素因の診断用プローブInfo
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- JPH02500A JPH02500A JP63272857A JP27285788A JPH02500A JP H02500 A JPH02500 A JP H02500A JP 63272857 A JP63272857 A JP 63272857A JP 27285788 A JP27285788 A JP 27285788A JP H02500 A JPH02500 A JP H02500A
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は遺伝子工学、特に疾患、特にＩ型糖尿病の素因
の診断に有用なりＮＡ及びＲＮＡプローブに係わる。
の診断に有用なりＮＡ及びＲＮＡプローブに係わる。
［発明の背景〕
特定の遺伝子プローブを使用する遺伝性疾患に対する遺
伝子スクリーニングは遺伝子診断テストの幅と精度を高
める有望な技術である。単一遺伝子の突然変異に起因す
る遺伝性のＩＩＯ宵は３，０００種類に及び、特定の遺
伝子プローブを利用してこれらをＩＣ接的に診断できる
。ほかに、１ｉｔ−遺伝子の突然変異ではなく、遺伝的
要因と恐らくは環境的要因との複合的な効果から起こる
後作関節リウマチ（ＲＡ）や１型糖尿病くまたは以下に
“糖尿＊’４”と呼称するインスリン依存型糖尿病Ｉ
ＤＤＭ＞のような障害も少なくない、このような場合、
遺伝形質が臨床的疾患の大部分と関連のある素因、即ち
催病の危険性を決定する。従って糖尿病に関する遺伝子
テストは特定の退転的疾患の原因となる単一遺伝子の欠
陥という従来の概念とは異なる遺伝的素因の識別と考え
るべきである。
伝子スクリーニングは遺伝子診断テストの幅と精度を高
める有望な技術である。単一遺伝子の突然変異に起因す
る遺伝性のＩＩＯ宵は３，０００種類に及び、特定の遺
伝子プローブを利用してこれらをＩＣ接的に診断できる
。ほかに、１ｉｔ−遺伝子の突然変異ではなく、遺伝的
要因と恐らくは環境的要因との複合的な効果から起こる
後作関節リウマチ（ＲＡ）や１型糖尿病くまたは以下に
“糖尿＊’４”と呼称するインスリン依存型糖尿病Ｉ
ＤＤＭ＞のような障害も少なくない、このような場合、
遺伝形質が臨床的疾患の大部分と関連のある素因、即ち
催病の危険性を決定する。従って糖尿病に関する遺伝子
テストは特定の退転的疾患の原因となる単一遺伝子の欠
陥という従来の概念とは異なる遺伝的素因の識別と考え
るべきである。
糖尿病素因に関連する特定遺伝子の識別は２っの異なる
観点から考察することができる。先ず、検出すべき遺伝
子が染色体において実際に疾患素因となる他の遺伝子と
結合している可能性があり、その場合には、検出ずべき
遺伝子がａ識遺伝子として作用する。他方、別の遺伝的
要因または適当な環境的作因が存在する場合に限り、検
出すべき遺伝子自体が直接疾患の引き金となり得る。こ
の２つの概念はいずれも糖尿病に罹り易い遺伝的素因を
理解する上で重要である。
観点から考察することができる。先ず、検出すべき遺伝
子が染色体において実際に疾患素因となる他の遺伝子と
結合している可能性があり、その場合には、検出ずべき
遺伝子がａ識遺伝子として作用する。他方、別の遺伝的
要因または適当な環境的作因が存在する場合に限り、検
出すべき遺伝子自体が直接疾患の引き金となり得る。こ
の２つの概念はいずれも糖尿病に罹り易い遺伝的素因を
理解する上で重要である。
糖尿病及び慢性関節リウマチの双方に対する重要な遺伝
的素因は主要組織適合″ｉ３仏子複合体と呼ばれる染色
体６の部分に符号化されている。この遺伝子複合体内で
１４個の３！！！鎖状道伝子がＨＬＡ第■類道伝遺伝ラ
スターを梢成する。この第２類遺伝子の生成物は免疫に
至る活性化段階を開始させる正常な免疫反応に不可欠で
ある。免疫系が不適正に活性化されて正常な組織を侵し
、その結果自己免疫が起こる場合にも第■類分子が疾患
の原因となる免疫活性化に重要な役割を果す、このこと
から、■型糖尿病のような０己免疫疾患におけるＨＬ
Ａ第■類遺伝子の役割は特定ターゲットに対する攻撃を
許す°″緑”信号のような許可分子信号として作用する
と考えられるに至った。Ｉ型糖尿膚の場合、ターゲット
は膵臓のインスリン分泌細胞と関係のある細胞成分であ
ると考えられる。従って、多くの点で遺伝的な糖尿病素
因の問題は自己免疫反応を活性化する変則信号の原因が
どのトｆＬ Ａ第■類遺伝子であるかを識別する問題で
もある。
的素因は主要組織適合″ｉ３仏子複合体と呼ばれる染色
体６の部分に符号化されている。この遺伝子複合体内で
１４個の３！！！鎖状道伝子がＨＬＡ第■類道伝遺伝ラ
スターを梢成する。この第２類遺伝子の生成物は免疫に
至る活性化段階を開始させる正常な免疫反応に不可欠で
ある。免疫系が不適正に活性化されて正常な組織を侵し
、その結果自己免疫が起こる場合にも第■類分子が疾患
の原因となる免疫活性化に重要な役割を果す、このこと
から、■型糖尿病のような０己免疫疾患におけるＨＬ
Ａ第■類遺伝子の役割は特定ターゲットに対する攻撃を
許す°″緑”信号のような許可分子信号として作用する
と考えられるに至った。Ｉ型糖尿膚の場合、ターゲット
は膵臓のインスリン分泌細胞と関係のある細胞成分であ
ると考えられる。従って、多くの点で遺伝的な糖尿病素
因の問題は自己免疫反応を活性化する変則信号の原因が
どのトｆＬ Ａ第■類遺伝子であるかを識別する問題で
もある。
糖尿病及び慢性関節リウマチとＨＬＡ第１ＩＪ逍伝子と
の関連か最近注目されている。ＨＬＡ道伝遺伝生成物は
ＨＬ、 Ａを型別する特異要因を帯び、この特異要因は
血清反応性を利用して測定されるのが普通である。この
ＨＬ Ａ型別特異要因はＨＬＡ遺伝子複合体内の遺伝子
ボリモルフイズムをある程度反映する。このような血清
ボリモルフイズムの１つかＨＬＡ ＤＲ４であり、丁
型糖尿病または慢性関節リウマチ患者の約７０−７５％
に存在する。しかし、正常人の約３５％もＨＬＡ Ｄ
Ｒ４として型別されるため、疾患素因分析にこの血清マ
ーカーを利用するには問題がある。
の関連か最近注目されている。ＨＬＡ道伝遺伝生成物は
ＨＬ、 Ａを型別する特異要因を帯び、この特異要因は
血清反応性を利用して測定されるのが普通である。この
ＨＬ Ａ型別特異要因はＨＬＡ遺伝子複合体内の遺伝子
ボリモルフイズムをある程度反映する。このような血清
ボリモルフイズムの１つかＨＬＡ ＤＲ４であり、丁
型糖尿病または慢性関節リウマチ患者の約７０−７５％
に存在する。しかし、正常人の約３５％もＨＬＡ Ｄ
Ｒ４として型別されるため、疾患素因分析にこの血清マ
ーカーを利用するには問題がある。
［発明の要約］
後述するような研究の結果、同じＤＲ４陽性ハブロタイ
ブ中の異なる第■類遺伝子を弁別するだけでなく、これ
らの３！！鎖部位の幾つかについて戊つかの多望性対立
遺伝子をも弁別する特殊な遺伝子プローブが開発された
。これらのプローブを利用して次のような所見が得られ
た。同じ＜ＨＬＡＤＲ４として型別されても個々の人に
応じて連鎖遺伝子のパターンが異なり、いずれもＨＬＡ
ＤＲ４であると“型別”されても、連鎖遺伝子のパター
ンが異なればＩ型糖尿病に罹り易いか慢性関節リウマチ
に罹り易いかに差が生ずる。特に、連鎖遺伝子の１つの
特殊な多望性変異体が存在する場合、このＤＲ４が■型
糖尿病に結び付く可能性は９５％以上である。従って、
個々の遺伝子連鎖に基づく特定の遺伝子プローブを利用
すれば、遺伝的な糖尿病素因と関連のある多望性変異体
を持つ人をオリゴヌクレオチド型別によって識別するこ
とができる。
ブ中の異なる第■類遺伝子を弁別するだけでなく、これ
らの３！！鎖部位の幾つかについて戊つかの多望性対立
遺伝子をも弁別する特殊な遺伝子プローブが開発された
。これらのプローブを利用して次のような所見が得られ
た。同じ＜ＨＬＡＤＲ４として型別されても個々の人に
応じて連鎖遺伝子のパターンが異なり、いずれもＨＬＡ
ＤＲ４であると“型別”されても、連鎖遺伝子のパター
ンが異なればＩ型糖尿病に罹り易いか慢性関節リウマチ
に罹り易いかに差が生ずる。特に、連鎖遺伝子の１つの
特殊な多望性変異体が存在する場合、このＤＲ４が■型
糖尿病に結び付く可能性は９５％以上である。従って、
個々の遺伝子連鎖に基づく特定の遺伝子プローブを利用
すれば、遺伝的な糖尿病素因と関連のある多望性変異体
を持つ人をオリゴヌクレオチド型別によって識別するこ
とができる。
本発明は″３ｉｉ伝子連預
３’ −ＧＣＧＧＧＣＲＡＲＧＲＧＧＧＧＧＲＧＣＡＧ
−５’または ５’−ＣＧＣＣＣＧ＾■＾ＣＡＣＣＣＣＣ八ＣＧＴＣ−
３と特殊な２重鎖をへ成できるオリゴヌクレオチドの形
を収る、Ｉ型糖尿病素因を診断するためのオリゴヌクレ
オチドプローブを提供する。ただし、八はアデニン、Ｃ
はシトシン、Ｇはクアニン、■はチミン、Ｒはチミンま
たはウラシルを表わす。
−５’または ５’−ＣＧＣＣＣＧ＾■＾ＣＡＣＣＣＣＣ八ＣＧＴＣ−
３と特殊な２重鎖をへ成できるオリゴヌクレオチドの形
を収る、Ｉ型糖尿病素因を診断するためのオリゴヌクレ
オチドプローブを提供する。ただし、八はアデニン、Ｃ
はシトシン、Ｇはクアニン、■はチミン、Ｒはチミンま
たはウラシルを表わす。
プローブは連鎖
５ ’ −ＧＣＣＣＧＡＴ八ＣＡＣＣＣへＣＡＣＧＴ−
３才なは ３−ＣＧＧＧＣＲＡＩＩＧＲＧＧＧＧＧＲＧＣ＾−５゛
から；パ択された少なくとも１５個の連ｆｒｔ状ヌクレ
オチドを古むことが好ましい。最も好ましい実施例では
オリゴヌクレオチドプローブか少なくと６５ ’ −Ｃ
ＣＧΔ■＾ＣＡＣＣＣＣＣＡＣ−３よをは ３’−ＧＧＣＲＡＲＧＲＧＧＧＧＧＲＧ−５を斥む。
３才なは ３−ＣＧＧＧＣＲＡＩＩＧＲＧＧＧＧＧＲＧＣ＾−５゛
から；パ択された少なくとも１５個の連ｆｒｔ状ヌクレ
オチドを古むことが好ましい。最も好ましい実施例では
オリゴヌクレオチドプローブか少なくと６５ ’ −Ｃ
ＣＧΔ■＾ＣＡＣＣＣＣＣＡＣ−３よをは ３’−ＧＧＣＲＡＲＧＲＧＧＧＧＧＲＧ−５を斥む。
プローブを検出可能なマーカー、例えば酵素やビオチン
で標識することができ、ＤＮＡまたは細胞を吸収できる
基質、制限酵素、及び／または洗浄剤と組合わせた診断
用キットの形で供給されるのが普通である。
で標識することができ、ＤＮＡまたは細胞を吸収できる
基質、制限酵素、及び／または洗浄剤と組合わせた診断
用キットの形で供給されるのが普通である。
［好ましい実施例］
第１図は染色体６においてＨＬ Ａ第■類遺伝子複合体
を構成する遺伝子を示す。これらの遺伝子の幾つかは極
めて多望性である。即ち、正常ノ＼において多様な対立
因子の形で存在する。例えば、ＤＲβ１部位に少なくと
も５０個の対立因子、ＤＱα及びＤＱβ部位に士数個の
対立因子が存在することが判明している。図中、星印（
零）はＤＲβ１部位の対立因子を表わすＤｗ４（ＤＲ４
）及び９ｗ１４（ＤＲ４）遺伝子を含むＤＲ及びＤ ｗ
ｔｉ立因子連鎖である。ＤＱβ３．１ （ＤＱｗ３
）ＤＱβ３６２ （ＤＱｗ３）はＤＱβ１部位の対立
因子を及わず、星印遺伝子の蛋白生成物は免疫反応を開
始させる活性化現象に関与するリンパ系細胞の表で識別
されている。従って、この遺伝子は健康及び疾、像状態
における免疫系活性化にとって重要なシグナル現象に利
用されるｆＭ造蛋白を符号化する。ＨＬＡＤＲ４特異性
を帯びるのは星印遺伝子の蛋白生成物である。少なくと
も５個の異なるＤＲβ１′ｋ・１立因子がいずれもＨＬ
Ａ血清特異性を帯びているのに対して、その他の対立因
子はＤＲｌ、ＤＲ２などと呼称されるＨＬＡ特異性を帯
びている。
を構成する遺伝子を示す。これらの遺伝子の幾つかは極
めて多望性である。即ち、正常ノ＼において多様な対立
因子の形で存在する。例えば、ＤＲβ１部位に少なくと
も５０個の対立因子、ＤＱα及びＤＱβ部位に士数個の
対立因子が存在することが判明している。図中、星印（
零）はＤＲβ１部位の対立因子を表わすＤｗ４（ＤＲ４
）及び９ｗ１４（ＤＲ４）遺伝子を含むＤＲ及びＤ ｗ
ｔｉ立因子連鎖である。ＤＱβ３．１ （ＤＱｗ３
）ＤＱβ３６２ （ＤＱｗ３）はＤＱβ１部位の対立
因子を及わず、星印遺伝子の蛋白生成物は免疫反応を開
始させる活性化現象に関与するリンパ系細胞の表で識別
されている。従って、この遺伝子は健康及び疾、像状態
における免疫系活性化にとって重要なシグナル現象に利
用されるｆＭ造蛋白を符号化する。ＨＬＡＤＲ４特異性
を帯びるのは星印遺伝子の蛋白生成物である。少なくと
も５個の異なるＤＲβ１′ｋ・１立因子がいずれもＨＬ
Ａ血清特異性を帯びているのに対して、その他の対立因
子はＤＲｌ、ＤＲ２などと呼称されるＨＬＡ特異性を帯
びている。
第２図に示すように、ＤＲ４陽性ハブロタイブにおける
ＤＲβ１遺伝子の５個の対立因子にはそれぞれ異なる名
称、即ち、Ｄｗ４、Ｄｗ１４、Ｄｗｌｏ、Ｄｗ１３、Ｄ
ｗ１５を与えである。これらのｙ４なるＤＲβ１対立因
子はそれぞれ多型性ＤＱβ対立囚了と結合する。ＤＱβ
対立因子には図示のようにＤＱ３．１ 、ＤＱ３．２
＝ ＤＱｘの名称を与えである。公知の方法でＨＬＡ
ＤＲ４として型別される人は第２図に示すハブロタイ
ブのいずれかを帯びる可能性がある。換言ずれは、５個
または５個以下の異なるＤＲβ対立因子及び３個の異な
るＤＱβ対立因子は図示のリンケージパターンで表わす
ことができる。ｒ型糖尿病と関連するＨＡＬＤＲ４を示
唆する特定遺伝子を分析するため、これらすべての異な
るＤＲ及びＤＱ対立因子を弁別する技術を考案しなけれ
ばならなかった。
ＤＲβ１遺伝子の５個の対立因子にはそれぞれ異なる名
称、即ち、Ｄｗ４、Ｄｗ１４、Ｄｗｌｏ、Ｄｗ１３、Ｄ
ｗ１５を与えである。これらのｙ４なるＤＲβ１対立因
子はそれぞれ多型性ＤＱβ対立囚了と結合する。ＤＱβ
対立因子には図示のようにＤＱ３．１ 、ＤＱ３．２
＝ ＤＱｘの名称を与えである。公知の方法でＨＬＡ
ＤＲ４として型別される人は第２図に示すハブロタイ
ブのいずれかを帯びる可能性がある。換言ずれは、５個
または５個以下の異なるＤＲβ対立因子及び３個の異な
るＤＱβ対立因子は図示のリンケージパターンで表わす
ことができる。ｒ型糖尿病と関連するＨＡＬＤＲ４を示
唆する特定遺伝子を分析するため、これらすべての異な
るＤＲ及びＤＱ対立因子を弁別する技術を考案しなけれ
ばならなかった。
互いに異なるＤＲ４陽性ＤＲβ１対立囚子はいずれら密
接に関連し合っている。これらの対立因子は互いにアミ
ノ［Ｍ１個から５個だけ異なり、この限られた相違に対
応すべく、これらの異なる対立因子間に制限酵素認識部
位が維持される。換言すると、互いに異なるＤＲ４陽性
ＤＲβ１対立因子を制限フラグメント結合特異性（ＲＦ
ＬＰ）で弁別することはできない。
接に関連し合っている。これらの対立因子は互いにアミ
ノ［Ｍ１個から５個だけ異なり、この限られた相違に対
応すべく、これらの異なる対立因子間に制限酵素認識部
位が維持される。換言すると、互いに異なるＤＲ４陽性
ＤＲβ１対立因子を制限フラグメント結合特異性（ＲＦ
ＬＰ）で弁別することはできない。
第２図ではＤＲ４陽性ハブロタイブに３個の異なるＤＱ
β遺伝子対立因子が存在する。この３個の対立因子は互
いにかなり相違しているから、制限酵素特異性（ＲＦＬ
Ｐ）によって、あるいは特定オリゴヌクレオチド・プロ
ーブによって弁別できる。第３図はＤＱ３．１及びＤＱ
３．２対立因子を弁別する制限酵素の相違の幾つかを示
す。Ｉ型糖尿病患者と正常な対照被験者の分析結果によ
れば、ＤＲ４Ｒ性患者の９５％以上がＤＱβ遺伝子にＤ
Ｑ３．２対立因子を帯びる。これはこの疾患と密接に関
連するＨＬＡ逍伝遺伝あり、明らかに上述したＤ Ｒ＝
１型別特異性の関連を示唆する。第２図に示すように、
ＤＱ３．２道伝子は数個の異なるＤＲβｉＷ伝子と結合
している。換言すれば、ＤＲ４陽性砧尿糖尿病接に関連
するＨＬＡ第■類逍伝遺伝ＤＲβ１遺伝子ではなくＤＱ
β逍伝遺伝あり、具体的にはＤＱ３．２対立因子である
。
β遺伝子対立因子が存在する。この３個の対立因子は互
いにかなり相違しているから、制限酵素特異性（ＲＦＬ
Ｐ）によって、あるいは特定オリゴヌクレオチド・プロ
ーブによって弁別できる。第３図はＤＱ３．１及びＤＱ
３．２対立因子を弁別する制限酵素の相違の幾つかを示
す。Ｉ型糖尿病患者と正常な対照被験者の分析結果によ
れば、ＤＲ４Ｒ性患者の９５％以上がＤＱβ遺伝子にＤ
Ｑ３．２対立因子を帯びる。これはこの疾患と密接に関
連するＨＬＡ逍伝遺伝あり、明らかに上述したＤ Ｒ＝
１型別特異性の関連を示唆する。第２図に示すように、
ＤＱ３．２道伝子は数個の異なるＤＲβｉＷ伝子と結合
している。換言すれば、ＤＲ４陽性砧尿糖尿病接に関連
するＨＬＡ第■類逍伝遺伝ＤＲβ１遺伝子ではなくＤＱ
β逍伝遺伝あり、具体的にはＤＱ３．２対立因子である
。
ＤＱ３．２対立因子は糖尿病と密接に関連するが、自己
免疫疾患と関連する他のＨＬ Ａ遺伝子の場合と同慄に
、この遺伝子は保存者の遺伝疾患の素因ではあっても、
これだりが遺伝疾患の原因ではないことを強調しなけれ
ばならない。この点を強調しためが第４図であり、同図
から明らかなように、ＤＱ３．２逍伝子はＤＲ４陽性Ｉ
ＤＤＭハブロタイブの大部分と因果関係にあるが、こ
の遺伝子は多くの健常者にも存在する。これらのデータ
は一卵性双生児に関する従来の所見を再確認させる。即
ち、糖尿病のような疾患は単一遺伝子の障害ではなく、
恐らくはＦ′９．数の遺伝子を含み、かつ恐らくはなん
らかの環境的相互作用を含む多重要因が協働して症候群
の完全発現に至ると考えられる。これに関連して、特定
の素因遺伝子は引き金のような役割を果すものの、それ
自体だけは発病の原因となれない。とは云え、ＤＱ３．
２対立因子を有する被験者を識別することはＩ型糖尿病
素因を分析する上で有意義な診断方法である。
免疫疾患と関連する他のＨＬ Ａ遺伝子の場合と同慄に
、この遺伝子は保存者の遺伝疾患の素因ではあっても、
これだりが遺伝疾患の原因ではないことを強調しなけれ
ばならない。この点を強調しためが第４図であり、同図
から明らかなように、ＤＱ３．２逍伝子はＤＲ４陽性Ｉ
ＤＤＭハブロタイブの大部分と因果関係にあるが、こ
の遺伝子は多くの健常者にも存在する。これらのデータ
は一卵性双生児に関する従来の所見を再確認させる。即
ち、糖尿病のような疾患は単一遺伝子の障害ではなく、
恐らくはＦ′９．数の遺伝子を含み、かつ恐らくはなん
らかの環境的相互作用を含む多重要因が協働して症候群
の完全発現に至ると考えられる。これに関連して、特定
の素因遺伝子は引き金のような役割を果すものの、それ
自体だけは発病の原因となれない。とは云え、ＤＱ３．
２対立因子を有する被験者を識別することはＩ型糖尿病
素因を分析する上で有意義な診断方法である。
このような所見に基づき、本発明は下記３−ＧＣＧＧＧ
ＣＴ＾ＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＧ−５° （１）ま
たは ５ ’−ＣＧＣＣＣＧ八ＴＡＣＡＣＣへＣＣＡＣＧＴＣ
−３’ ！２１の特徴的なりＱ３．２遺伝子
連踊と特殊な！ぶ様で２型録形成することのできるオリ
ゴヌクレオチドの形で、Ｉ型糖尿病素因の診断に有用な
遺伝子プローブを提供する。ＤＱ３．２対立因子は例え
ば牟核細胞やＢ細胞に発現するから、下記のＲＮ Ａ
３！ 鎖と特殊な態様で２型開を形成するＲＮＡプロー
ブら得られる。
ＣＴ＾ＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＧ−５° （１）ま
たは ５ ’−ＣＧＣＣＣＧ八ＴＡＣＡＣＣへＣＣＡＣＧＴＣ
−３’ ！２１の特徴的なりＱ３．２遺伝子
連踊と特殊な！ぶ様で２型録形成することのできるオリ
ゴヌクレオチドの形で、Ｉ型糖尿病素因の診断に有用な
遺伝子プローブを提供する。ＤＱ３．２対立因子は例え
ば牟核細胞やＢ細胞に発現するから、下記のＲＮ Ａ
３！ 鎖と特殊な態様で２型開を形成するＲＮＡプロー
ブら得られる。
３’−ＧＣＧＧＧＣＵＡＵＧＵＧＧＧＧＧＵＧＣＡＧ−
５’ ｆ３１ここに“特殊な態様で２重鎖を形成
する”と云う表現は本発明のプローブが１つでも塩基の
ミスマツチがあれば２型開形成が不可能な厳しい条件で
、ＤＱ３．２対立因子のセンスまたはアンチセンススト
ランドと、またはその転写ＲＮＡとの間で２重鎮を形成
できることを意味する。当業者には明らかなように、種
々の２重鎖形成分析形式の条件は温度、イオン濃度及び
ｐＨ要因に応じて異なる。一般に、最適のＤＮＡ ：
ＤＮＡまたはＲＮＡ ：ＲＮＡ２重鎖形成が行われる条
件として、温度が塩：洪度に反比例し、ＩＩＨは例えば
１５ヌクレオチド連銀（“１５−ｍｅｒｓ ” ）なら
約６．８乃至約７．４の範囲でなければならない。ＲＮ
Ａ ： ＤＮＡ２重鎖形成の場合にも同様の分析条件が
適用されるが、−般的にはＤＮＡ ： ＤＮＡ２重鎖形
成の場合よりも（塩濃度が高くなるのにｆ′Ｐなって）
低い温度が採用される。
５’ ｆ３１ここに“特殊な態様で２重鎖を形成
する”と云う表現は本発明のプローブが１つでも塩基の
ミスマツチがあれば２型開形成が不可能な厳しい条件で
、ＤＱ３．２対立因子のセンスまたはアンチセンススト
ランドと、またはその転写ＲＮＡとの間で２重鎮を形成
できることを意味する。当業者には明らかなように、種
々の２重鎖形成分析形式の条件は温度、イオン濃度及び
ｐＨ要因に応じて異なる。一般に、最適のＤＮＡ ：
ＤＮＡまたはＲＮＡ ：ＲＮＡ２重鎖形成が行われる条
件として、温度が塩：洪度に反比例し、ＩＩＨは例えば
１５ヌクレオチド連銀（“１５−ｍｅｒｓ ” ）なら
約６．８乃至約７．４の範囲でなければならない。ＲＮ
Ａ ： ＤＮＡ２重鎖形成の場合にも同様の分析条件が
適用されるが、−般的にはＤＮＡ ： ＤＮＡ２重鎖形
成の場合よりも（塩濃度が高くなるのにｆ′Ｐなって）
低い温度が採用される。
換言すれば、本発明のプローブはオリゴヌクレオチド連
鉦（１）、（２）または（３）の全部または一部を正確
に補足しなければならない。２重鎖形成効率を高めるた
めには、プローブ構成中に＋１１、（２）及び（３）の
末端連鎖と補完関係にある塩基が含まれていないことが
好ましい。従って、本発明のプローブは下記連票から選
択された連鎖状ヌクレオチドを含むのが背通である。
鉦（１）、（２）または（３）の全部または一部を正確
に補足しなければならない。２重鎖形成効率を高めるた
めには、プローブ構成中に＋１１、（２）及び（３）の
末端連鎖と補完関係にある塩基が含まれていないことが
好ましい。従って、本発明のプローブは下記連票から選
択された連鎖状ヌクレオチドを含むのが背通である。
５’−ＧＣＣＣＧ＾■八ＣＡＣＣＣへＣＡＣＧＴ−３’
（４１または ３’−ＣＧＧＧＣＴ八ＴＧＴＧへＧＧＧＴＧＣ八−５’
へ ＋５１または ３°−ＣＧＧＧＣＵＡＵＧＵＧＧＧＧＧＩＩＧＣＡ−５
° （６）ヒト・ゲノムに関して必要な特
異性は（４）、（５）または（６）から選択した１５−
ヌクレオチド連鎖で構成することによって達成できる。
（４１または ３’−ＣＧＧＧＣＴ八ＴＧＴＧへＧＧＧＴＧＣ八−５’
へ ＋５１または ３°−ＣＧＧＧＣＵＡＵＧＵＧＧＧＧＧＩＩＧＣＡ−５
° （６）ヒト・ゲノムに関して必要な特
異性は（４）、（５）または（６）から選択した１５−
ヌクレオチド連鎖で構成することによって達成できる。
プローブは室温における商業的な診断に最適と考えられ
る１６−１ｅｒであることが好ましい、比較的高い２重
頷形成温度を得るための補助装置を利用できる臨床実験
用としては、（１）、（２）または（３）を補完する２
１−塩基連鎖を含む比較的長いオリゴヌクレオチド連鎖
を選択すればよく、これによってより高度のシグナル特
異性が得られる。
る１６−１ｅｒであることが好ましい、比較的高い２重
頷形成温度を得るための補助装置を利用できる臨床実験
用としては、（１）、（２）または（３）を補完する２
１−塩基連鎖を含む比較的長いオリゴヌクレオチド連鎖
を選択すればよく、これによってより高度のシグナル特
異性が得られる。
最大効率を達成するには、プローブが（４）、（５）ま
たは（６）の中央領域から選択されたヌクレオチド連鎖
を含めばよい。従って最も好ましい実施例では、本発明
のプローブが下記の連鎖を含むことになる。
たは（６）の中央領域から選択されたヌクレオチド連鎖
を含めばよい。従って最も好ましい実施例では、本発明
のプローブが下記の連鎖を含むことになる。
５°−ＣＣＧ八■へＣへＣＣＣＣＣＡＣ−３’
−＋７）または ３’−ＧＧＣＴＡＴＧＴＧＧＧＧＧＴＯ−５°
（８）または ３’−ＧＧＣＵＡＵＧＩＩＧＧＧＧＧＵＧ−５°
（９）このようなオリゴヌクレオチドは公知の技
術、入手可能な試薬及び装置で容易に合成できる。本発
明のプローブは種々の公知方法により、種々の分析条件
下で検出できるか、または検出可能にすることができる
。例えば、オリゴヌクレオチド合成の過程で放射性同位
元素をプローブに組み込めばよい、あるいは、分析に先
立ってアルカリ性ホスファターゼをプローブに接合する
か、または分析にビオチニル化プローブを使用し、次い
でハイブリッドを例えばストレプトアビジンアルカリ性
ホスファターゼのようなアビジン化酵素で検出すればよ
い、プローブ調製に際してオリゴヌクレオチドをマーク
するのにルシフェリンも好適であり、検出可能なマーカ
ーとしては蛍光ＵｆＪまたはその他発光団、酵素抑制剤
、補酵素、常磁性金属及びその他のスピンラベルが挙げ
られる。
−＋７）または ３’−ＧＧＣＴＡＴＧＴＧＧＧＧＧＴＯ−５°
（８）または ３’−ＧＧＣＵＡＵＧＩＩＧＧＧＧＧＵＧ−５°
（９）このようなオリゴヌクレオチドは公知の技
術、入手可能な試薬及び装置で容易に合成できる。本発
明のプローブは種々の公知方法により、種々の分析条件
下で検出できるか、または検出可能にすることができる
。例えば、オリゴヌクレオチド合成の過程で放射性同位
元素をプローブに組み込めばよい、あるいは、分析に先
立ってアルカリ性ホスファターゼをプローブに接合する
か、または分析にビオチニル化プローブを使用し、次い
でハイブリッドを例えばストレプトアビジンアルカリ性
ホスファターゼのようなアビジン化酵素で検出すればよ
い、プローブ調製に際してオリゴヌクレオチドをマーク
するのにルシフェリンも好適であり、検出可能なマーカ
ーとしては蛍光ＵｆＪまたはその他発光団、酵素抑制剤
、補酵素、常磁性金属及びその他のスピンラベルが挙げ
られる。
本発明のＤＮＡ及びＲＮＡプローブは広範囲に亘る公知
の診断用２！を連鎖分析に利用でき、この分析は患者に
固有の核酸、即ち、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはこの双方
に、疾患と関連するポリヌクレオチド連鎖と特殊態様で
２重頭を形成できるオリゴヌクレオチド・プローブを接
触させ、次いでプローブと患者固有のポリヌクレオチド
の間に形成されるＤＮＡ ： ＤＮＡ、ＲＮＡ ： Ｒ
ＮＡ、ＤＮＡ ： ＲＮＡ、またはＲＮＡ ： ＤＮＡ
ハイブリッドを検出することによって患者固有のサンプ
ル中に疾患と関連するＤＮＡまたはＲＮＡが存在するが
否かを判定する。この分析では、患者細胞の核及び／ま
たは血漿膜を、プローブとの培養に先立ってオクトキシ
ノル（具体的にはＴ「目ｏｎ Ｘ−１００）のような洗
浄剤で浸透可能にする公知のプロトコルを利用して、分
離核酸または本来の部位、例えば、患者固有の白血球内
で２型録形成を起こさせることができる。
の診断用２！を連鎖分析に利用でき、この分析は患者に
固有の核酸、即ち、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはこの双方
に、疾患と関連するポリヌクレオチド連鎖と特殊態様で
２重頭を形成できるオリゴヌクレオチド・プローブを接
触させ、次いでプローブと患者固有のポリヌクレオチド
の間に形成されるＤＮＡ ： ＤＮＡ、ＲＮＡ ： Ｒ
ＮＡ、ＤＮＡ ： ＲＮＡ、またはＲＮＡ ： ＤＮＡ
ハイブリッドを検出することによって患者固有のサンプ
ル中に疾患と関連するＤＮＡまたはＲＮＡが存在するが
否かを判定する。この分析では、患者細胞の核及び／ま
たは血漿膜を、プローブとの培養に先立ってオクトキシ
ノル（具体的にはＴ「目ｏｎ Ｘ−１００）のような洗
浄剤で浸透可能にする公知のプロトコルを利用して、分
離核酸または本来の部位、例えば、患者固有の白血球内
で２型録形成を起こさせることができる。
本発明のプローブは下記試薬の１つまたは２つ以上と組
合わせた診断テスト用キットの形で販売されることが多
い。ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを吸収するかまたはこれ
と結合できる基質がプローブと共に販売されることが多
く、このような基質としては、陽性帯電置換基群を有す
ることを特徴トスるニトロセルロース、ナイロンまたは
誘導ナイロンの膜が挙げられる。また仔ウシ胸腺やサゲ
精子ＤＮＡなどのようなヒト以外のポリヌクレオチドと
共にＴａｑｌのような１つまたは２つ以上の制限酵素を
キットに含めることら可能である０本来の部位で２重鎖
が形成される場合には、分析の浸透可能化、プローブ培
養、２！ｆＬ須形成及び検出の段階を通して細胞と結合
する基質、例えば透明な２１１８５にスライドと共にＴ
「目ｏｎ Ｘ−１００のような洗浄剤を販売することも
考えられる。
合わせた診断テスト用キットの形で販売されることが多
い。ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを吸収するかまたはこれ
と結合できる基質がプローブと共に販売されることが多
く、このような基質としては、陽性帯電置換基群を有す
ることを特徴トスるニトロセルロース、ナイロンまたは
誘導ナイロンの膜が挙げられる。また仔ウシ胸腺やサゲ
精子ＤＮＡなどのようなヒト以外のポリヌクレオチドと
共にＴａｑｌのような１つまたは２つ以上の制限酵素を
キットに含めることら可能である０本来の部位で２重鎖
が形成される場合には、分析の浸透可能化、プローブ培
養、２！ｆＬ須形成及び検出の段階を通して細胞と結合
する基質、例えば透明な２１１８５にスライドと共にＴ
「目ｏｎ Ｘ−１００のような洗浄剤を販売することも
考えられる。
以下、具体例によって本発明をさらに詳細に説明する。
Ｃ実施例］
串 の゛ −′
若年でインスリン依存糖尿病が発病しているという基準
を満たすＩ型糖尿＠（ＩＤＤＭ）患者を選択した。この
調査には３１名の白色人１ＤＲ４÷患者が参加した。Ｄ
ＲｉハブロタイブのすべてがＨＬＡ−ＤＱｗ３に対して
陽性であった。５つ家族のうち、身内に１名のＩＤＤＭ
患者がいることを報告した家族があった。これら５家族
のすべての構成員からのＤＮＡも得た。対照Ｄ Ｎ Ａ
は３４名の臨床的に健常なりＲ４＋志願者から得な。
を満たすＩ型糖尿＠（ＩＤＤＭ）患者を選択した。この
調査には３１名の白色人１ＤＲ４÷患者が参加した。Ｄ
ＲｉハブロタイブのすべてがＨＬＡ−ＤＱｗ３に対して
陽性であった。５つ家族のうち、身内に１名のＩＤＤＭ
患者がいることを報告した家族があった。これら５家族
のすべての構成員からのＤＮＡも得た。対照Ｄ Ｎ Ａ
は３４名の臨床的に健常なりＲ４＋志願者から得な。
ムＤＮＡの：！
末梢血管の白血球を２×トリス綬街食塩水で洗浄し、１
０８ ＠胞／ ｍ ｅ ノｍ合テ’ｒＥ ［１０ｎＭ
トリス、１ １Ｍエチレンジアミンテトラアセテート（
Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ）、ｐＨ７，６］中に再悲濁させ、２
００μａ／ｍｅグロテイナーゼＫを含有する細胞溶解Ｍ
ｗＩ液［ｔ（１ｍＭ）リス、ｐＨ８，０，２ｎＭ Ｅ
ＤＴＡ、１０℃ＭＭ ＮａＣｅ、及び１％硫酸ナトリ
ウムドデシル（ＳＤＳ）］ＩＱ８で３７℃において１８
時間に亘り溶解した。フェノール：クロロホルム：イソ
アミルアルコール（２５： ２４： １ ）で抽出した
のち、濃度が２．ＯＭになるまで酢酸アンモニウムを添
加し、さらに無水エタノールを添加することによってＤ
ＮＡを沈澱させた。詳細な手順はＪ。
０８ ＠胞／ ｍ ｅ ノｍ合テ’ｒＥ ［１０ｎＭ
トリス、１ １Ｍエチレンジアミンテトラアセテート（
Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ）、ｐＨ７，６］中に再悲濁させ、２
００μａ／ｍｅグロテイナーゼＫを含有する細胞溶解Ｍ
ｗＩ液［ｔ（１ｍＭ）リス、ｐＨ８，０，２ｎＭ Ｅ
ＤＴＡ、１０℃ＭＭ ＮａＣｅ、及び１％硫酸ナトリ
ウムドデシル（ＳＤＳ）］ＩＱ８で３７℃において１８
時間に亘り溶解した。フェノール：クロロホルム：イソ
アミルアルコール（２５： ２４： １ ）で抽出した
のち、濃度が２．ＯＭになるまで酢酸アンモニウムを添
加し、さらに無水エタノールを添加することによってＤ
ＮＡを沈澱させた。詳細な手順はＪ。
Ｉ Ｉｎｕｎｏｌ、 １３５（１）： ６３７−６４１
．１９８５に掲載されたＳ、 Ｌ、 Ｈｏ１ｂｅｃｋ等
の論文に記載されている。
．１９８５に掲載されたＳ、 Ｌ、 Ｈｏ１ｂｅｃｋ等
の論文に記載されている。
ゲル電気泳動に先立ち、２ｕ／μ９ ＤＮＡにおいて６
０℃で４時間に亘り制限エンドヌクレアーゼＴａｑＩ
（Ｂｅｔｈａｓｄａ、Ｒｅｓ、 Ｌａｂｓ、）で消化し
た。
０℃で４時間に亘り制限エンドヌクレアーゼＴａｑＩ
（Ｂｅｔｈａｓｄａ、Ｒｅｓ、 Ｌａｂｓ、）で消化し
た。
消化されたＤＮＡを１％アガローゼゲル上で電気泳動に
よってＶＩ選し、変性させ、中和し、ＷｈａｔＩｌａｎ
３ＭＭ紙上で乾燥させた。詳しい手順はＴ＋ｔｎｕｎｏ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４ ： ２５１−２５８．１９８
６に掲載されたＳ。
よってＶＩ選し、変性させ、中和し、ＷｈａｔＩｌａｎ
３ＭＭ紙上で乾燥させた。詳しい手順はＴ＋ｔｎｕｎｏ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４ ： ２５１−２５８．１９８
６に掲載されたＳ。
Ｌ、 Ｈｏ１ｂｅｃｋ及びＧ、 Ｔ、 Ｎ０１ｌＯ［Ｉ
の論文及び’ｒｈｅＬａｎｃｅｔ ｉｉ （８５１４）
： １００２−１００５．１９８６に掲載されたＧ、
Ｔ、Ｎｅｐｏｌ等の論文に記載されている。
の論文及び’ｒｈｅＬａｎｃｅｔ ｉｉ （８５１４）
： １００２−１００５．１９８６に掲載されたＧ、
Ｔ、Ｎｅｐｏｌ等の論文に記載されている。
（後述する）スロットプロット２重頚形成によって分析
されたサンプルを、消化または電気泳動を行うことなく
、ニトロセルロース紙に吸収させたのち直接テストした
。
されたサンプルを、消化または電気泳動を行うことなく
、ニトロセルロース紙に吸収させたのち直接テストした
。
対立因子に固有のプローブを利用するゲノムＤＮＡ分析
の詳細な手順は上記Ｎ ｅｐｏｎ等の論文に記載されて
いる。要約すると、ゲノムＤＮＡの消化物を含有するゲ
ルまたはニトロセルロース・スロット・ブｏ ットを６
Ｘ ＮＥＴ （Ｎａ Ｃ１！ ＥＤＴＡ）リス）、
１０％硫酸デキストラン、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ原
液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．０５％
Ｎ Ｐ−４０（Ｎｏｎ１ｏｄｅｔ ｐ−４０） 、２５
０ μ９ 、／ｍｌ！ ｔＲＮＡ、及び１１０９ＣＰ
／、ｌの比放射能を与えるためγ３２ｐ −ｄＡ Ｔ
Ｐ及びＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼで末ｔ４Ａ標識
した１１０７ＣＰ／ｍ２オリゴヌクレオチド・プローブ
中で３時間に亘り５５℃において２重楚形成させた。サ
ンプルを５ｘ ｓｓｃ＜クエン酸ナトリウム原液）で
洗浄し、室温で１０分間に亘って０．５％ＳＤＳで２度
、さらに５５°Ｃで３０分間２度、次いで０，５％ＳＤ
Ｓを含有する３、２モル塩化テトラメチルアンモニウム
（ＴＭＡＣＱ）で６）℃において洗浄したのち、Ｃｒｏ
ｎｅｘ Ｌ ｉｇｈｔｅｎｉｎｇ Ｐ Ｉｕｓ場感スク
リーンを利用して一７０℃で１−７日間に亘りＸＡＲ−
５フイルムに露光した。
の詳細な手順は上記Ｎ ｅｐｏｎ等の論文に記載されて
いる。要約すると、ゲノムＤＮＡの消化物を含有するゲ
ルまたはニトロセルロース・スロット・ブｏ ットを６
Ｘ ＮＥＴ （Ｎａ Ｃ１！ ＥＤＴＡ）リス）、
１０％硫酸デキストラン、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ原
液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．０５％
Ｎ Ｐ−４０（Ｎｏｎ１ｏｄｅｔ ｐ−４０） 、２５
０ μ９ 、／ｍｌ！ ｔＲＮＡ、及び１１０９ＣＰ
／、ｌの比放射能を与えるためγ３２ｐ −ｄＡ Ｔ
Ｐ及びＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼで末ｔ４Ａ標識
した１１０７ＣＰ／ｍ２オリゴヌクレオチド・プローブ
中で３時間に亘り５５℃において２重楚形成させた。サ
ンプルを５ｘ ｓｓｃ＜クエン酸ナトリウム原液）で
洗浄し、室温で１０分間に亘って０．５％ＳＤＳで２度
、さらに５５°Ｃで３０分間２度、次いで０，５％ＳＤ
Ｓを含有する３、２モル塩化テトラメチルアンモニウム
（ＴＭＡＣＱ）で６）℃において洗浄したのち、Ｃｒｏ
ｎｅｘ Ｌ ｉｇｈｔｅｎｉｎｇ Ｐ Ｉｕｓ場感スク
リーンを利用して一７０℃で１−７日間に亘りＸＡＲ−
５フイルムに露光した。
Ａ ｐｐｌｉｅｄ Ｂ １ｏｓｙｓｔａ１１ｓ自動Ｄ
ＮＡ合成装置を使用し、ホスフォラミシト類似化学作用
によりプローブＤＱβ３．Ｉ Ａ２５及びＤＱβ３．２
Ａ４３を合成した。この化学作用についてはＳ、 Ｍ
、 Ｗｅｉｓｎａｎｎ編、Ｐｒａｅｇｅｒ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ 、 Ｎ、 Ｙ、、１９８３刊行のＭ、
Ｈ，Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ著″Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
Ｄ ＮＡ ａｎｄＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｅｉｎｇ”
、ｐｐｌ−２２にａｄ載されている。上記プローブの連
預はそれぞれ５’−ＴＣＴＧＧＴＣＡＣ＾ＴＡＡＣＧＣ
ＡＣＧＣＧ−３° （ＤＱβ３．Ｉ Ａ２５）及び５°
−Ｃ（ｉＣＣＣＧ八ＴＡＣへＣＣＣＣＣＡＣＧＴＣ−３
’ （Ｄ Ｑ β ３．２ Ａ４３）であった。
ＮＡ合成装置を使用し、ホスフォラミシト類似化学作用
によりプローブＤＱβ３．Ｉ Ａ２５及びＤＱβ３．２
Ａ４３を合成した。この化学作用についてはＳ、 Ｍ
、 Ｗｅｉｓｎａｎｎ編、Ｐｒａｅｇｅｒ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒｓ 、 Ｎ、 Ｙ、、１９８３刊行のＭ、
Ｈ，Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ著″Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
Ｄ ＮＡ ａｎｄＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｅｉｎｇ”
、ｐｐｌ−２２にａｄ載されている。上記プローブの連
預はそれぞれ５’−ＴＣＴＧＧＴＣＡＣ＾ＴＡＡＣＧＣ
ＡＣＧＣＧ−３° （ＤＱβ３．Ｉ Ａ２５）及び５°
−Ｃ（ｉＣＣＣＧ八ＴＡＣへＣＣＣＣＣＡＣＧＴＣ−３
’ （Ｄ Ｑ β ３．２ Ａ４３）であった。
すべてのＤＱβ遺伝遺伝に存在する一定のヌクレオチド
連鎖と２重鎖を形成するＤＱβ道伝遺伝０−ブが上記Ｈ
ｏ１ｂｅｃｋ及びＮ ｅｐｏｌ（７）論文（１９ｇ６）
に記載されている。このプローブはハブロタイブごとに
１つの遺伝子、即ち、ＤＱβ遺伝子を識別し、従って、
第３図に示ずような制限酵素消化によって分析されるゲ
ノムＤＮＡを“ＨＬＡ ＤＱ型別する”のに利用でき
る。この型別の結果を第２図のパネルＡに示す。即ち、
種々の同型接合細胞からのゲノムＤＮＡが制限酵素Ｔａ
ｑｌで消化され、電気泳動処理され、ＤＱβ部位に固有
のプローブと２重鎖を形成している。ＤＱｗｌ、ＤＱｗ
２、ＤＱ３．１及びＤＱ３．２遺伝子を表わす異なる対
立因子はこれらの異なる遺伝子に存在するＴａｑ■認識
３！鎖中の変異体に対応するそれぞれサイズの異なる断
片によって弁別された。対立因子に固有のオリゴヌクレ
オチド・プローブの使用を第２図のパネルＢに示す。即
ち、パネルＡと同じＤＮＡプロットをＤＱ３．２に固有
のプローブと再び２重鎖を形成した。ただし、ＤＱ３．
２道伝子だけが識別された。非ＤＱ３．２ハブロタイブ
からのゲノムＤＮＡ中に２重鎖形成シグナルが存在しな
いと云うことはＤＱβ３．２ Ａ４３プローブがＤＱ３
．２β選伝子だけに存在するＤ Ｎ Ａ ３！Ｉ！Ｈに
固有であることを立証した。
連鎖と２重鎖を形成するＤＱβ道伝遺伝０−ブが上記Ｈ
ｏ１ｂｅｃｋ及びＮ ｅｐｏｌ（７）論文（１９ｇ６）
に記載されている。このプローブはハブロタイブごとに
１つの遺伝子、即ち、ＤＱβ遺伝子を識別し、従って、
第３図に示ずような制限酵素消化によって分析されるゲ
ノムＤＮＡを“ＨＬＡ ＤＱ型別する”のに利用でき
る。この型別の結果を第２図のパネルＡに示す。即ち、
種々の同型接合細胞からのゲノムＤＮＡが制限酵素Ｔａ
ｑｌで消化され、電気泳動処理され、ＤＱβ部位に固有
のプローブと２重鎖を形成している。ＤＱｗｌ、ＤＱｗ
２、ＤＱ３．１及びＤＱ３．２遺伝子を表わす異なる対
立因子はこれらの異なる遺伝子に存在するＴａｑ■認識
３！鎖中の変異体に対応するそれぞれサイズの異なる断
片によって弁別された。対立因子に固有のオリゴヌクレ
オチド・プローブの使用を第２図のパネルＢに示す。即
ち、パネルＡと同じＤＮＡプロットをＤＱ３．２に固有
のプローブと再び２重鎖を形成した。ただし、ＤＱ３．
２道伝子だけが識別された。非ＤＱ３．２ハブロタイブ
からのゲノムＤＮＡ中に２重鎖形成シグナルが存在しな
いと云うことはＤＱβ３．２ Ａ４３プローブがＤＱ３
．２β選伝子だけに存在するＤ Ｎ Ａ ３！Ｉ！Ｈに
固有であることを立証した。
このような対立因子に固有のプローブを利用することに
より、個々のＤＱβ週伝子の有無に間してＤＮＡを迅速
に分析することが可能になった。
より、個々のＤＱβ週伝子の有無に間してＤＮＡを迅速
に分析することが可能になった。
第２図のパネルＣはＤＱ３．１に固有のオリゴヌクレオ
チド・プローブと２重鎖を形成した、個々の被験者から
のＤＮＡパネルの“スロットプロット”２重鎖形成分析
を示す、この方法では、末梢血管白血球または細胞系か
ら調製されたゲノムＤＮＡを、消化及び増感処理を施す
ことなくニトロセルロース紙に直接塗布する。次いで放
射能標識を付けたＤＱ３．Ｉ Ａ２５を添加し、２重鎖
形成に照らして特定ＤＱβ３．１′ｉ１伝子の存在が示
唆された。ＤＱ３．２に固有のプローブでもスロットプ
ロット２重鎖形成が認められた。
チド・プローブと２重鎖を形成した、個々の被験者から
のＤＮＡパネルの“スロットプロット”２重鎖形成分析
を示す、この方法では、末梢血管白血球または細胞系か
ら調製されたゲノムＤＮＡを、消化及び増感処理を施す
ことなくニトロセルロース紙に直接塗布する。次いで放
射能標識を付けたＤＱ３．Ｉ Ａ２５を添加し、２重鎖
形成に照らして特定ＤＱβ３．１′ｉ１伝子の存在が示
唆された。ＤＱ３．２に固有のプローブでもスロットプ
ロット２重鎖形成が認められた。
２３通りの互いに無関係のＤＲ４＋ハブロタイブを表わ
す３１名のＨＬＡ−ＤＲ４１ＤＤＭ患者からのＤＮＡを
ＤＱオリゴヌクレオチド・プローブで分析した結果、３
１重量部がＤＱ３．２遺伝子を保有し、そのうちの３名
はＤＱ３．１遺伝子をも保有することが判明し、この３
名の患者はいずれもＤＲ４については同型接合性、ＤＱ
３．２及びＤＱ３゜１については異型接合性であった。
す３１名のＨＬＡ−ＤＲ４１ＤＤＭ患者からのＤＮＡを
ＤＱオリゴヌクレオチド・プローブで分析した結果、３
１重量部がＤＱ３．２遺伝子を保有し、そのうちの３名
はＤＱ３．１遺伝子をも保有することが判明し、この３
名の患者はいずれもＤＲ４については同型接合性、ＤＱ
３．２及びＤＱ３゜１については異型接合性であった。
第２図に示すように、ＤＱ３．２逍伝子は浅つかの異な
るＤＲ４陽性ハブロタイブに存在する。■ＤＤＭ患者が
どのハブロタイブを有するかを正確に評定するため、各
側における連ｇＤＲβ対立因子を分析した。異なるＤＲ
４＋ ＤＲ″ｉ１伝子、即ち、Ｄ ｗ ４、Ｄｗ１４及
びＤｗｌＯを弁別する対立因子に固有のオリゴヌクレオ
チド・プローブを利用して、上記Ｎ １１ｉｐｏ１１等
の論文（１９８６）に記載されているようにＥｃｏＲＩ
で消化されたゲノムＤＮＡを２型頭分析した。調査され
たＩ ＤＤＭ患者に見られる２３通りの無関係なりＲ４
＋ハブロタイブのうち、１７のハブロタイブ（７４％）
がＤｗ４遺伝子を保有しく第２図ハブロタイブＢ）、４
つのハブロタイプカ月）Ｗ１４週伝子を保有しくハブロ
タイブＣ）、２つのハブロタイブが他のＤＲβ遺伝子を
保有する（Ｄ、Ｅ）ことが判明した。換言すると、ＩＤ
ＤＭｆｉ者には幾つかの異なるＤＲ４＋ハブロタイブが
認められたが、すべてのΦ者が１）Ｑ３．２ＤＱβ対立
因子を保有した。
るＤＲ４陽性ハブロタイブに存在する。■ＤＤＭ患者が
どのハブロタイブを有するかを正確に評定するため、各
側における連ｇＤＲβ対立因子を分析した。異なるＤＲ
４＋ ＤＲ″ｉ１伝子、即ち、Ｄ ｗ ４、Ｄｗ１４及
びＤｗｌＯを弁別する対立因子に固有のオリゴヌクレオ
チド・プローブを利用して、上記Ｎ １１ｉｐｏ１１等
の論文（１９８６）に記載されているようにＥｃｏＲＩ
で消化されたゲノムＤＮＡを２型頭分析した。調査され
たＩ ＤＤＭ患者に見られる２３通りの無関係なりＲ４
＋ハブロタイブのうち、１７のハブロタイブ（７４％）
がＤｗ４遺伝子を保有しく第２図ハブロタイブＢ）、４
つのハブロタイプカ月）Ｗ１４週伝子を保有しくハブロ
タイブＣ）、２つのハブロタイブが他のＤＲβ遺伝子を
保有する（Ｄ、Ｅ）ことが判明した。換言すると、ＩＤ
ＤＭｆｉ者には幾つかの異なるＤＲ４＋ハブロタイブが
認められたが、すべてのΦ者が１）Ｑ３．２ＤＱβ対立
因子を保有した。
対立因子に固有のＤＲ及びＤＱ ＤＮＡプローブを使
用して３４名の非糖尿＠ Ｄ Ｒ４十被験者をも分析し
た。２２名（６５％）にＤＱ３．２が存在し、１２名（
３５％）にＤＱ３．１が存在した。第５図はＤＱ３．２
が対照被験者よりも患者において優勢であることを要約
して示したものであり、ＤＲ４１ＤＤ Ｍ患者における
この遺伝子マーカーは（８度は高いが特異性は低い。
用して３４名の非糖尿＠ Ｄ Ｒ４十被験者をも分析し
た。２２名（６５％）にＤＱ３．２が存在し、１２名（
３５％）にＤＱ３．１が存在した。第５図はＤＱ３．２
が対照被験者よりも患者において優勢であることを要約
して示したものであり、ＤＲ４１ＤＤ Ｍ患者における
この遺伝子マーカーは（８度は高いが特異性は低い。
ハブロタイブＡ（第２図）は平凡なりＲ４十八プロタイ
プであり、ＤＲ遺伝子はハブロタイブＢと同じであるが
ＤＱは異なる。このハブロタイブはＤＱ３．１対立因子
を保有し、患者の他のハブロタイブがＤＱ３．２遺伝子
を保有する場合にはＤＲ４−同型接合性の患者だけに認
められる。このことと、ＤＱβ３．１出現率が対照被験
者よりも患者において低いことから、ハゲロタイブＡは
ＩＤＤＭと関連性のないＤＲ４＋ハブロタイブであると
考えられる。ＩＤＤＭと関連する敏感なりＲ４÷ハブロ
タイブに関しては、ＤＱ３．２逍伝子が存在する限り、
連頒ＤＲβ対立因子が異なる可能性がある。
プであり、ＤＲ遺伝子はハブロタイブＢと同じであるが
ＤＱは異なる。このハブロタイブはＤＱ３．１対立因子
を保有し、患者の他のハブロタイブがＤＱ３．２遺伝子
を保有する場合にはＤＲ４−同型接合性の患者だけに認
められる。このことと、ＤＱβ３．１出現率が対照被験
者よりも患者において低いことから、ハゲロタイブＡは
ＩＤＤＭと関連性のないＤＲ４＋ハブロタイブであると
考えられる。ＩＤＤＭと関連する敏感なりＲ４÷ハブロ
タイブに関しては、ＤＱ３．２逍伝子が存在する限り、
連頒ＤＲβ対立因子が異なる可能性がある。
複数のＩＤＤＭ罹病親顕を含む５家族もＤＮＡプローブ
方法を使用して分析した。５家族のすべてにおいて、Ｄ
Ｒ４＋ハスロタイブをＴＤＤＭとして分離した。５家族
の合計１３名の’Ｉ病者を分析した結果、１３名すべて
がＤＱ３．２遺伝子を保有した。興味深いことに、これ
らの家族のうち２家族ではＤＱ３．２逍伝子がＤ ｗ
４３！ｉ伝子（ハブロタイブＢ）と結合し、池の３家族
ではＤＱ３．２遺伝子がＤｗ１４遺伝子（ハブロタイブ
Ｃ）と結合しな。
方法を使用して分析した。５家族のすべてにおいて、Ｄ
Ｒ４＋ハスロタイブをＴＤＤＭとして分離した。５家族
の合計１３名の’Ｉ病者を分析した結果、１３名すべて
がＤＱ３．２遺伝子を保有した。興味深いことに、これ
らの家族のうち２家族ではＤＱ３．２逍伝子がＤ ｗ
４３！ｉ伝子（ハブロタイブＢ）と結合し、池の３家族
ではＤＱ３．２遺伝子がＤｗ１４遺伝子（ハブロタイブ
Ｃ）と結合しな。
以上に本発明の好ましい実施例を説明したが、特許請求
の範囲内で種々の変更を加えることができる。即ち、本
発明は上記実施例以外の態様で実施できる。
の範囲内で種々の変更を加えることができる。即ち、本
発明は上記実施例以外の態様で実施できる。
第１図はヒト染色体６におけるＨＬＡ複合体の第■類領
域の遺伝子構造、第２図はハブロタイブによって構成し
たＨＬＡ−ＤＲ４に関連するＤＲ及びＤＱ特異性、第３
図はＤＱβ遺伝子のＤＱ３゜１及びＤＱ３．２対立因子
を弁別する制限酵素の相違、第４図は正常及び糖尿病Ｄ
ＲＱ陽性人のＤＱ３．１及びＤＱ３．２対立因子の分布
比較、第５図は対照被験者に対する■型＠尿病患者のＤ
Ｑ３．２の優勢を示す。 肩と色りシロ１こｉａｙう）−ＩＬＡ ｆｉＩ＃４Ｊム
ケ第１図 特許出願人 パージニア メイソンリサーチ セン
ター 代理人弁理士 吉 村 悟 ■暑し−一−ｊ ｐ＜０．００１ 第５図 図面の浄８（内容に変更なし） Ｂ４＆？−３・ 手続補正書（方式） １、事件の表示 昭和６３年特許願第２７２８５７号
２、発明の名称 ■型糖尿病素因の診断用プローブ３
、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国、 ９８１０１ ワシントン
州。 シアトル、セネカ ストリート １０００名称 パージ
ニア メイソン リサーチ センター代表者 ジエラル
ド ティー、ネポム ４゜
域の遺伝子構造、第２図はハブロタイブによって構成し
たＨＬＡ−ＤＲ４に関連するＤＲ及びＤＱ特異性、第３
図はＤＱβ遺伝子のＤＱ３゜１及びＤＱ３．２対立因子
を弁別する制限酵素の相違、第４図は正常及び糖尿病Ｄ
ＲＱ陽性人のＤＱ３．１及びＤＱ３．２対立因子の分布
比較、第５図は対照被験者に対する■型＠尿病患者のＤ
Ｑ３．２の優勢を示す。 肩と色りシロ１こｉａｙう）−ＩＬＡ ｆｉＩ＃４Ｊム
ケ第１図 特許出願人 パージニア メイソンリサーチ セン
ター 代理人弁理士 吉 村 悟 ■暑し−一−ｊ ｐ＜０．００１ 第５図 図面の浄８（内容に変更なし） Ｂ４＆？−３・ 手続補正書（方式） １、事件の表示 昭和６３年特許願第２７２８５７号
２、発明の名称 ■型糖尿病素因の診断用プローブ３
、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 アメリカ合衆国、 ９８１０１ ワシントン
州。 シアトル、セネカ ストリート １０００名称 パージ
ニア メイソン リサーチ センター代表者 ジエラル
ド ティー、ネポム ４゜
Claims (15)
- （１）遺伝子連鎖 【遺伝子配列があります】 または 【遺伝子配列があります】 （ただし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン
、Ｔはチミン、Ｒはチミンまたはウラシル、を表わす。 ） と特殊な２重鎖を形成することのできるオリゴヌクレオ
チドから成ることを特徴とする I 型糖尿病素因の診断
に有用なプローブ。 - （２）オリゴヌクレオチドが約１６個のヌクレオチドか
ら成ることを特徴とする請求項第（１）項に記載のプロ
ーブ。 - （３）連鎖 【遺伝子配列があります】 または 【遺伝子配列があります】 （ただし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン
、Ｔはチミン、Ｒはチミンまたはウラシル、を表わす。 ） から選択された少なくとも１５個の連鎖ヌクレオチドを
含むオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とする I
型糖尿病素因の診断に有用なプローブ。 - （４）オリゴヌクレオチドが 【遺伝子配列があります】 または 【遺伝子配列があります】 から成ることを特徴とする請求項第（３）項に記載のプ
ローブ。 - （５）オリゴヌクレオチドに検出可能なマーカーで標識
したことを特徴とする請求項第（３）項に記載のプロー
ブ。 - （６）検出可能なマーカーを酵素、ビオチン、放射性核
種、蛍光団、発光団、酵素抑制因子、補酵素、ルシフェ
リン、常磁性金属及びスピンから選択したことを特徴と
する請求項第（５）項に記載のプローブ。 - （７）ＤＮＡを吸収できる基質と請求項第（１）項に記
載のプローブを組合わせたことを特徴とする I 型糖尿
病素因の診断に有用な診断用キット。 - （８）基質が陽帯電置換基であることを特徴とする請求
項第（７）項に記載の診断用キット。 - （９）制限酵素と請求項第（１）項に記載のプローブを
組合わせたことを特徴とする I 型糖尿病素因の診断に
有用な診断用キット。 - （１０）制限酵素をＳｔｕ I 、ＨｉｎｄIII、Ｓｓｔ
I ，ＰｖｕII、Ｔａｑ I 、Ｘｂａ I 及びＢａｍＨ I
から成る群から選択したことを特徴とする請求項第（９
）項に記載の診断用キット。 - （１１）制限酵素がＴａｑ I であることを特徴とする
請求項第（９）項に記載の診断用キット。 - （１２）細胞膜を浸透性化するための洗浄剤と請求項第
（１）項に記載のプローブを組合わせたことを特徴とす
る I 型糖尿病素因の診断に有用な診断用キット。 - （１３）洗浄剤がオクトキシノールであることを特徴と
する請求項第（１２）項に記載の診断用キット。 - （１４）疾患に関連するポリヌクレオチド連鎖と特殊な
２重鎖を形成することのできるオリゴヌクレオチドから
成るプローブを患者の核酸と接触させ、疾患と関連する
ポリヌクレオチド連鎖が患者の核酸中に存在するか否か
を検出する遺伝性疾患に対する遺伝子スクリーニング方
法であって、患者の核酸に請求項第（１）項に記載のプ
ローブを接触させることを特徴とする遺伝子スクリーニ
ング方法。 - （１５）疾患に関連するポリヌクレオチド連鎖と特殊な
２重鎖を形成することのできるオリゴヌクレオチドから
成るプローブを患者の核酸と接触させ、疾患と関連する
ポリヌクレオチド連鎖が患者の核酸中に存在するか否か
を検出する遺伝性疾患に対する遺伝子スクリーニング方
法であって、患者の核酸に請求項第（３）項に記載のプ
ローブを接触させることを特徴とする遺伝子スクリーニ
ング方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/114,559 US5039606A (en) | 1987-10-29 | 1987-10-29 | Diagnostic probe for diabetes type I predisposition |
| US114,559 | 1987-10-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02500A true JPH02500A (ja) | 1990-01-05 |
| JP2975023B2 JP2975023B2 (ja) | 1999-11-10 |
Family
ID=22355999
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63272857A Expired - Lifetime JP2975023B2 (ja) | 1987-10-29 | 1988-10-28 | Ｉ型糖尿病素因の診断用プローブ |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5039606A (ja) |
| EP (1) | EP0314500B1 (ja) |
| JP (1) | JP2975023B2 (ja) |
| AT (1) | ATE88507T1 (ja) |
| AU (1) | AU612418B2 (ja) |
| CA (1) | CA1299506C (ja) |
| DE (1) | DE3880434T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0667217A1 (de) * | 1994-02-09 | 1995-08-16 | Widia GmbH | Rotationsschneidwerkzeug |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1284931C (en) * | 1986-03-13 | 1991-06-18 | Henry A. Erlich | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
| US5604099A (en) * | 1986-03-13 | 1997-02-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
| US6194561B1 (en) | 1986-03-13 | 2001-02-27 | Roche Molecular Systems, Inc. | Characterization and detection of sequences associated with autoimmune diseases |
| US5340935A (en) * | 1990-01-05 | 1994-08-23 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | DNAS encoding proteins active in lymphocyte-medicated cytotoxicity |
| US5079343A (en) * | 1990-01-05 | 1992-01-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Intracellular antigen found in subpopulation of cd8+ t lymphocytes and monoclonal antibody reactive with same |
| DK0515660T3 (da) * | 1990-12-21 | 1997-07-28 | Hoffmann La Roche | HLA-DQbeta-DNA-typebestemmelse |
| DE4114365A1 (de) * | 1991-05-02 | 1992-11-05 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur diagnose von nicht-insulin-abhaengigem diabetes mellitus |
| DE4224738A1 (de) * | 1992-07-27 | 1994-02-03 | Engler Blum Gabriele | Verfahren zur Analyse molekularer organischer Strukturen |
| US5763591A (en) * | 1996-03-25 | 1998-06-09 | Cedars-Sinai Medical Center | Polynucleic acid sequences that are functionally associated with the development of autoimmune disease |
| FR2749308B1 (fr) * | 1996-06-03 | 1998-07-24 | Bio Merieux | Sondes nucleotidiques et procede pour determiner le typage hla dqb1 |
| GB9621129D0 (en) | 1996-10-10 | 1996-11-27 | Duff Gordon W | Detecting genetic predisposition to sight-threatening diabetic retinopathy |
| US20050032077A1 (en) * | 1998-03-10 | 2005-02-10 | Duff Gordon W. | Detecting genetic predisposition to sight-threatening diabetic retinopathy |
| US6852493B2 (en) | 1999-05-14 | 2005-02-08 | Iris Biotechnologies, Inc. | Magnetic field enhanced hybridization of target molecules to immobilized probes |
| WO2000073506A1 (en) * | 1999-05-27 | 2000-12-07 | Iris Biotechnologies, Inc. | Method for increasing the hybridization rate of nucleic acids |
| US9051601B2 (en) * | 2006-08-01 | 2015-06-09 | Gen-Probe Incorporated | Methods of nonspecific target capture of nucleic acids |
| EP2279411A4 (en) * | 2008-04-09 | 2011-09-21 | Pacific Northwest Res Inst | SCREENING METHOD FOR THE GENETIC PRESDITION OF DIABETES OF TYPE I |
| WO2011083477A1 (en) * | 2010-01-10 | 2011-07-14 | New Diabetic Solutions | Immuno-tolerance formulations |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986007464A1 (en) * | 1985-06-14 | 1986-12-18 | Genetic Systems Corporation | Methods for identifying alleles associated with increased risk of diabetes |
| CA1284931C (en) * | 1986-03-13 | 1991-06-18 | Henry A. Erlich | Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids |
| AU8155787A (en) * | 1986-10-22 | 1988-05-25 | Matrix Inc. | Apparatus and method for preparing fried potato products |
-
1987
- 1987-10-29 US US07/114,559 patent/US5039606A/en not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-10-21 AU AU24109/88A patent/AU612418B2/en not_active Ceased
- 1988-10-28 AT AT88310163T patent/ATE88507T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-10-28 EP EP88310163A patent/EP0314500B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-28 DE DE8888310163T patent/DE3880434T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-28 CA CA000581575A patent/CA1299506C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-28 JP JP63272857A patent/JP2975023B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0667217A1 (de) * | 1994-02-09 | 1995-08-16 | Widia GmbH | Rotationsschneidwerkzeug |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE88507T1 (de) | 1993-05-15 |
| JP2975023B2 (ja) | 1999-11-10 |
| AU612418B2 (en) | 1991-07-11 |
| CA1299506C (en) | 1992-04-28 |
| DE3880434D1 (de) | 1993-05-27 |
| DE3880434T2 (de) | 1993-09-02 |
| EP0314500A3 (en) | 1989-07-26 |
| EP0314500A2 (en) | 1989-05-03 |
| EP0314500B1 (en) | 1993-04-21 |
| AU2410988A (en) | 1989-05-04 |
| US5039606A (en) | 1991-08-13 |
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