JP2004507237A

JP2004507237A - マトリクスタンパク質の産生を促進する組織工学足場

Info

Publication number: JP2004507237A
Application number: JP2002522231A
Authority: JP
Inventors: ウエスト，　ジェニファー　エル．; マン，　ブレンダ　ケイ．
Original assignee: William Marsh Rice University
Current assignee: William Marsh Rice University
Priority date: 2000-08-21
Filing date: 2001-08-21
Publication date: 2004-03-11
Also published as: WO2002016557A3; US20050158358A1; WO2002016557A2; US7635592B2; EP1311657A2; AU2001286613A1; US20020106793A1; US20050158357A1

Abstract

マトリクス増強分子（例えば、ＴＧＦ−β）は、組織工学、組織再生および創傷治癒適用のために細胞によってＥＣＭ産生を増大するために、足場に結合体化されるかまたは足場に固定される。マトリクス増強分子は、組織工学または細胞増殖足場に対する結合のために、テザー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）モノアクリレートに結合体化される。マトリクス増強分子は、足場への結合後に活性を保持し、そして細胞の増殖を実質的に増大することなく（足場がさらに細胞接着リガンドを含んである場合であっても）細胞外マトリクス（ＥＣＭ）産生を増大するために足場中または足場上での細胞の増殖を引き起こす。細胞によって産生されたＥＣＭの増大は、加水分解または酵素学的分解のいずれかによって細胞の完全性を維持することを助ける（特に、足場が分解性である場合）。

Description

【０００１】
（発明の背景）
これは、一般的に、組織工学、詳細には、細胞の過度の増殖を誘導することなく細胞のマトリクス産生を改善するための規定された密度のマトリクス増殖分子を組込む足場のための、改善された組成物の分野にある。
【０００２】
本願は、２０００年８月２１日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／２２６，７７１の優先権を主張する。
【０００３】
細胞増殖、維持、外因性因子の産生が重要である分野において（例えば、組織工学の分野において）において、細胞は、しばしば、細胞接着または細胞増殖に適切な基材を提供する固体基材または足場上で増殖される。これらの足場は、天然の材料または合成材料で作製され得る。
【０００４】
組織工学および創傷治癒の適用のために開発された生体材料は、十分な細胞接着を支持する必要があり、その間に、これらの細胞によって合成された新規組織によって置換される。組織の正確な機械的完全性を維持するために、細胞は、十分な細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を生成しなければならない。組織工学足場における細胞によるＥＣＭ産生の減少は、発生組織の構造的な完全性の低下を導き得る。
【０００５】
このような材料に対する接着を最適に促進するために、研究者らは、細胞接着リガンド（例えば、ＲＧＤペプチド）の生体材料表面への結合を調べている（Ｍａｓｓｉａ　＆　Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８７：２９２−３０１（１９９０）；Ｈｅｒｎ　＆　Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．３９：２６６−２７６（１９９８）；Ｄｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４０：３７１−３７７（１９９８）；Ｔｏｎｇ　＆　Ｓｈｏｉｃｈｅｔ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４２：８５−９５（１９９８）；Ｚｈａｎｇら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　２０：１２１３−１２２０（１９９９））。しかし、細胞接着における増大は、ＥＣＭ産生に対して有害に影響を与え得る（Ｍａｎｎら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　１９９９）。さらに、未改変足場であっても、ＥＣＭ産生を増大させる実質的な必要性が存在する。なぜなら、ＥＣＭ中のタンパク質は、生じる組織の機械的な特性を大きく決定し、そしてしばしば、生物分解性の足場材料の機能を置換する必要があるからである。生じる組織の機械特性は、組織工学脈管移植片および整形外科的組織工学のような適用において特に重要であり、ここで、失敗は、不十分な機械的完全性に起因して生じ得る。
【０００６】
研究者らはまた、ポリエチレングルコールのようなポリマーテザー（ｔｅｔｈｅｒ）を介して、ＴＧＦのような増殖因子を組織工学マトリクスに結合させている。ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２８５１、「Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｔｅｔｈｅｒｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを参照のこと。ＴＧＦ−βが、活性な増殖因子の制御された放出のために、合成ポリマーキャリアまたは天然ポリマーキャリアに結合され得るかまたはこれらに分散され得る、という参考文献は多数存在する。例えば、「Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ａｎｄ　ｈｅｐａｒｉｎ　ｍａｔｒｉｃｅｓ　ｆｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ−Ｔｅｆｆｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　４９（２−３），２９１−２９８（１９９７）；「Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ−１　ｌｏａｄｅｄ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ　ｏｆ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ　ｐｏｌｙｍｅｒ　ａｎｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｃｅｌｌｓ．」Ｎｉｃｏｌｌら，Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　５（３）２３１−２４４（１９９５）、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに対するＥＰ　００４２８５４１「Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｗｏｕｎｄ　ｈｅａｌｉｎｇ　Ｍａｔｒｉｃｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅｉｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」；Ａｔｈａｎａｓｉｏｕらに対する米国特許第６，０１３，８５３号「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｉｍｐｌａｎｔ　ｃａｒｒｉｅｒ」を参照のこと。さらなる参考文献は、細胞または組織（特に、骨）の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を増強するための組織工学足場におけるＴＧＦ−βの使用に関する。Ｂｒｉｓｔｏｌ　Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ　ＣｏｍｐａｎｙによるＥＰ　６１６８１４「Ｃｅｒａｍｉｃ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｂａｓｅｄ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　Ａｃｔｉｖｅ　ＴＧＦ−Ｂｅｔａ　ｔｏ　Ｂｏｎｅ　Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ　Ｉｍｐｌａｎｔｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｔｈｅ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」を参照のこと。
【０００７】
しかし、これらの開示はいずれも、細胞増殖を増大させることなく、細胞外マトリクスの増強された産生を達成し得る方法を開示しない。
【０００８】
従って、本発明の目的は、すなわち細胞増殖をほとんどまたは全く増大させることなく、組織工学足場上または組織工学足場内に、良好な機械特性を有する組織の形成を増強するために、ＥＣＭの形成を促進する組織工学足場を提供することである。
【０００９】
（発明の要旨）
マトリクス増強分子（例えば、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β））が、足場に結合体化されるかまたは足場に固定されて、細胞によるＥＣＭ産生を増大させ得ることが、見出されている。このマトリクス増強分子は、組織工学足場または細胞増殖足場（これらは、組織工学適用のみでなく、組織再生適用および創傷治癒適用にも有用である）に結合させるために、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）モノアクリレート）に結合体化される。マトリクス増強分子は、足場への結合後に活性を保持し、そしてたとえ、足場がさらに細胞接着リガンドを含む場合であってもＥＣＭ産生を増大するために足場中または足場上での細胞の増殖を引き起こす。ＥＣＭ産生におけるこの増大は、細胞増殖ではなく、遺伝子発現における増大に起因するものと考えられている。細胞によって産生されたＥＣＭの増大は、加水分解または酵素学的分解のいずれかによって足場の完全性を維持することを助ける（特に、足場が分解性である場合）。
【００１０】
実施例は、ＰＥＧヒドロゲルから形成されたポリマー性足場（共有結合した接着リガンドを含む）中で増殖された脈管平滑筋細胞（ＳＭＣ）によって産生されたマトリクスが、ＴＧＦ−βが存在しない場合に対して、足場につながれた４×１０^−５ｎｍｏｌ　ＴＧＦ−β／ｍｌの存在下で増大したことを実証する。同じ時、細胞増殖は増大せず、これは、有利である。なぜなら、ＳＭＣの増大した増殖は血管の管腔を狭めるように導き得るからである。ＴＧＦ−βをポリマー性足場につなげることによって、同じ量の可溶性ＴＧＦ−βに対して、細胞外マトリクス産生において有意な増大を引き起こした（実施例１、図３を参照のこと）。これはおそらく、細胞による可溶性ＴＧＦ−βのインターナリゼーションまたはヒドロゲルからの可溶性ＴＧＦ−βの分散に起因し、これによって、ＴＧＦ−βは、細胞に対して利用可能ではなくなる。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
組織工学は、細胞の接着を可能にする足場物質を使用して行なわれる。足場物質は、マトリクス増強分子を含む。本明細書中に記載されるように、マトリクス増強分子は、細胞外マトリクスタンパク質の産生を促進すべきであるが、細胞増殖は促進すべきではない。
【００１２】
（足場物質）
好ましい実施形態において、足場は、合成ポリマーまたは天然ポリマーから形成されるが、ヒドロキシアパタイト、シリコーン、および他の無機物質のような他の物質が使用され得る。この足場は、生分解性であってもよいし非分解性であってもよい。
【００１３】
分解性および非分解性の多数の生体適合性ポリマーが存在する。代表的な合成の非生分解性ポリマーとしては、エチレンビニルアセテートおよびポリ（メタ）アクリレートが挙げられる。代表的な生分解性ポリマーとしては、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のようなポリヒドロキシ酸、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ならびにそれらのコポリマーが挙げられる。天然のポリマーとしては、コラーゲン、ヒアルロン酸、およびアルブミンが挙げられる。
【００１４】
好ましい物質は、ヒドロゲルである。特に好ましいヒドロゲル形成物質は、ポリエチレングリコール−ジアクリル酸ポリマーであり、これは、光重合している。他のヒドロゲル物質としては、アルギン酸カルシウム、および展性がありそして細胞をカプセル化するために使用され得るイオン性ヒドロゲルを形成し得る特定の他のポリマーが挙げられる。
【００１５】
（足場の形成）
足場は、インサイチュまたはインビトロで形成され得る。滑膜の形成のための好ましい実施形態において、足場物質は、希釈溶液で関節に噴霧され、次いで重合し、その結果、ポリマーは、関節組織の表面に結合したヒドロゲルコーティングを形成する。細胞は、ポリマー中に分散されてもよく、またはポリマーマトリクス上に播種されてもよい。足場はまた、細胞の接着および増殖を支持するために使用され得るメッシュに編まれたかまたは編まれていないポリマーの線維から形成され得る。これらの足場は、キャスティングすること、編むこと、塩浸出すること、紡績すること、または成形することによって形成され得る。なお別の実施形態において、足場は、微細加工および写真平版技術によって形成される鋳型を使用して形成され得、ここで、細胞は、鋳型の中にあるときに、または足場を取り出した後に、足場に播種され得る。好ましい実施形態において、細胞−ポリマー水溶液は、鋳型中に配置されそして光重合され、液体は、細胞がヒドロゲル内に播種されたヒドロゲルに変換される。
【００１６】
足場はまた、組織が所望される部位に、移植の際または移植の前に播種され得る。メッシュは、好ましくは、栄養分および気体が足場全体に自由に拡散するのを可能にするように十分に開放性であるべきである。
【００１７】
（マトリクス増強分子）
ＥＣＭの増加した産生を促進するマトリクス増強分子は、細胞増殖を実質的に増加させることなく、マトリクスタンパク質（例えば、糖タンパク質、エラスチン、およびコラーゲン）の産生を誘導する足場物質に結合され得る。これらのマトリクス増強物質としては、ＴＧＦ−β、アンギオテンシンＩＩ、インスリン様増殖因子およびアスコルビン酸が挙げられる。
【００１８】
ＴＧＦ−βは、培養中に増殖する血管ＳＭＣによって、細胞外マトリクスタンパク質の産生を増加させることが公知である（Ａｍｅｎｔｏら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１１：１２２３−１２３０（１９９１）；Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９６０３−９６０９（１９９４）；Ｐｌｅｎｚら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　１４４：２５−３２（１９９９））。ＴＧＦ−β（血管損傷の間の天然のＳＭＣによるかまたは遺伝子移入による産生を介する）はまた、インビボでＳＭＣによるＥＣＭ産生を増加させ得る（Ｍａｊｅｓｋｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８：９０４−９１０（１９９１）；Ｎａｂｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１０７５９−１０７６３（１９９３））。培養された線維芽細胞はまた、ＴＧＦ−βの存在下で、コラーゲン合成（Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．１０８：１２５１−１２６１（１９９５）；Ｅｉｃｋｅｌｂｅｒｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７６：Ｌ８１４−Ｌ８２４（１９９９））およびプロテオグリカン合成（Ｈｅｉｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｌ．２７：２１９１−２１９８（１９９５））を増加させることが示されている。さらに、ＴＧＦ−βの局所的送達（Ｐｕｏｌａｋｋａｉｎｅｎら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５８：３２１−３２９（１９９５））およびコラーゲン足場を介するＴＧＦ−βへの送達（Ｐａｎｄｉｔら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．１２：８９−１００（１９９９））は、創傷治癒を強化することが示されている。
【００１９】
上に参照された研究の全ては、可溶性ＴＧＦ−βの存在下での効果を調べた。以下の実施例によって示されるように、テザーＴＧＦ−βを用いてまた、細胞（平滑筋細胞および軟骨細胞のような細胞を含む）によるＥＣＭの形成を誘導し得ることが、現在示されている。
【００２０】
（テザー）
マトリクス増強分子がＥＣＭの形成を誘導するために、分子がテザーによって足場につながれることが必要である。これらのテザーは、好ましくは、約２００と約１０，０００との間、最も好ましくは、約２０００と約６，０００との間の分子量を有する。テザーは、好ましくは、直鎖状ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）である。マトリクス増強分子は、当業者に公知の任意の方法によって、テザー、すなわちさらに言えば、足場物質に結合され得、好ましくは、ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、カルボジイミド、ジイソシアネート、カルボニルジアミダゾール、またはトシルクロリドのような試薬を使用して共有結合され得る。
【００２１】
（マトリクス増強物質の密度）
マトリクス増強物質の密度は、細胞増殖をほとんど有さないかまたは全く有さない、ＥＣＭ産生を誘発する際に重要である。最も望ましいＥＣＭ産生の量は、組織工学足場の上またはその中で、良好な機械的特性を有する組織の形成を生じる量である。最適密度は、足場に結合される細胞の型に依存する。ＴＧＦ−βの場合において、ＥＣＭ産生を誘導するための最適な濃度は、大動脈平滑筋細胞について１ｎｇ　ＴＧＦ−β／ｍｌと５ｎｇ　ＴＧＦ−β／ｍｌとの間、そして耳介軟骨細胞について５ｎｇ　ＴＧＦ−β／ｍｌと１００ｎｇ　ＴＧＦ−β／ｍｌとの間の範囲であり、これは、４×１０^−６ｎｍｏｌ／ｍｌと４×１０^−３ｎｍｏｌ／ｍｌとの間に等しい。
【００２２】
（細胞の供給源）
細胞は、ドナー、ドナー由来の細胞の培養物、または樹立された細胞培養株から直接獲得され得る。好ましい実施形態において、同じ種の細胞（好ましくは、同じまたは同様の免疫学的プロフィールを有する）は、患者または近親者のいずれかから生検によって獲得され、次いで、標準的な条件を使用して培養物中で増殖され得る。免疫反応を誘発しそうな細胞（例えば、免疫学的に異なる個体由来のヒト筋細胞）が使用される場合、レシピエントは、例えば、ステロイドおよび他の免疫抑制薬物（例えば、シクロスポリン）のスケジュールを使用して、必要な場合、免疫抑制され得る。
【００２３】
好ましい実施形態において、細胞は、ドナーから直接獲得され、洗浄され、そしてポリマー物質と組み合わせて直接移植される。細胞は、組織培養の当業者に公知の技術を使用して培養される。生検によって獲得された細胞は、収集され、そして培養され、混入細胞を除くために必要な場合、継代される。
【００２４】
血管組織の形成のための好ましい細胞としては、平滑筋細胞、内皮細胞、および線維芽細胞が挙げられる。結合組織の形成のための好ましい細胞としては、軟骨細胞、線維芽細胞、および骨または軟骨に分化する他の型の細胞が挙げられる。
【００２５】
（足場を使用する方法）
足場は、新しい組織（例えば、血管組織、軟骨、腱、および靭帯）を生成するために使用される。足場は、代表的に、細胞で播種され；細胞は培養され；次いで、足場は、移植される。あるいは、上記のように、足場は、滑膜のような部位中またはその上に噴霧され、細胞が播種され、次いで、その部位は、外科的に閉じられる。液体ポリマー−細胞懸濁液はまた、物質が重合され得る部位中（例えば、関節内）に注入され得る。
【００２６】
適用としては、器官または組織（例えば、血管、軟骨、滑膜、腱、または靭帯）の修復および／または置換、あるいは「バルキング剤」としての使用のための組織の作製が挙げられ、「バルキング剤」は、代表的に、灌流の処置におけるように、開口部もしくは管腔をブロックするため、または隣接組織を移動するために使用される。
【００２７】
本発明は、以下の非制限的な実施例を参照して、さらに理解される。
【００２８】
（実施例１：ＰＥＧ−ジアクリル酸ヒドロゲルと組み合わせた可溶性ＴＧＦ−βの効果と、ＰＥＧ−ジアクリル酸ヒドロゲルと組み合わせた結合したＴＧＦ−βの効果との比較）
ＴＧＦ−βが、固定された細胞接着リガンドによって引き起こされるＥＣＭ合成における減少を打ち消し得るか否かを決定した。ＳＭＣを、ペプチド改変ガラス基板上およびつながれた細胞接着リガンドを含むヒドロゲル中の両方で、増殖させた。さらに、ＴＧＦ−βを、ポリマー足場に共有結合的につなぎ、ＴＧＦ−βがＥＣＭ産生を増加させるその能力を保持することを示した。
【００２９】
（材料および方法）
（細胞維持）
化学薬品は、他に述べない限り、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏラットの胸部大動脈由来のＳＭＣを単離し、そしてＳｃｏｔｔ−Ｂｕｒｄｅｎら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　１３：２９５−３０５（１９８９）によって以前に記載されるように特徴づけた。ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から獲得した。ＳＭＣおよびＨＡＳＭＣを両方とも、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、５００ユニット　ペニシリンおよび１００ｍｇ／ｌ　ストレプトマイシンを補充した最少必須イーグル培地（ＭＥＭ）で維持した。細胞を、５％　ＣＯ_２環境下で３７℃でインキュベートした。
【００３０】
（表面改変）
この研究で使用したペプチドは、ＲＧＤＳ（配列番号１）、ＶＡＰＧ（配列番号２）、およびＫＱＡＧＤＶ（配列番号３）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）であった。ＲＧＥＳ（配列番号４）を、非接着コントロールペプチドとして使用した。これらのペプチドを、Ｍａｎｎら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　２０：２２８１−２２８６（１９９９）によって以前に記載されるように、アセチル化し、そしてアミノフェーズガラススライドに結合させた。手短に言うと、アミノフェーズスライドを、３７℃で一晩、無水アセトン中で３−アミノプロピルトリエトキシシランと共にガラススライドをインキュベートすることによって、調製した。次いで、アセチル化ペプチドを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）化学を使用して、スライドに結合させた。スライドを、使用の前に、一晩ＵＶ光下で滅菌した。
【００３１】
（アクリロイル−ＰＥＧ−ＴＧＦ−βの調製）
ＴＧＦ−βを、ＴＧＦ−βを、５０ｍＭ　ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中アクリロイル−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（アクリロイル−ＰＥＧ−ＮＨＳ，３４００Ｄａ；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）と、２時間反応させることによって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合体化させた。次いで、混合物を、凍結乾燥し、そして凍結して貯蔵した。ＵＶ／Ｖｉｓ（２６０ｎｍ）および蒸発光散乱検出器（ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ　ｌｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を備えたゲル透過クロマトグラフィーを使用して、得られたアクリロイル−ＰＥＧ−ＴＧＦ−βおよびＰＥＧ標準（Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）を分析した。
【００３２】
（表面でのマトリクスタンパク質産生の評価）
マトリクスタンパク質産生を、Ｍａｎｎ（１９９９）によって以前に記載にされたとおりに評価した。ＳＭＣの懸濁物を、５μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を補充したＭＥＭ中に、４０，０００細胞／ｍｌの濃度で調製した。ＴＧＦ−βを受けたサンプルについては、０．０４ｐｍｏｌ／ｍｌ（１ｎｇ／ｍｌ）の未改変ＴＧＦ−βまたは０．０４ｐｍｏｌ／ｍｌのアクリロイル−ＰＥＧ−ＴＧＦ−βを、この培地中に添加した。ＥＣＭタンパク質産生の測定のために用いられる細胞懸濁物にまた、１μＣｉ／ｍｌ　^３Ｈ−グリシン（４０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を補充した。ガラススライドを、ＱｕａｄｒｉＰｅｒｍ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｖｅｓｓｅｌｓ（Ｈｅｒａｅｕｓ，Ｏｓｔｅｒｏｄｅ　ａｍ　Ｈａｒｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中でＦｌｅｘｉＰｅｒｍストリップに取り付けて、各スライドに８つのウェル（１．１１×０．７９×０．７９ｃｍ）を作製した。各スライドの８つのウェルのうちの４つを利用してＥＣＭ産生を測定し、一方、残りの４つのウェルを細胞数決定のために利用し、そして^３Ｈ−グリシンの非存在下で培養した。細胞数を、トリプシンを使用して単細胞懸濁物を調製し、そしてＣｏｕｌｔｅｒ計数器（Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ　＃０６４６，Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用いて細胞を計数することによって、２日間の培養後に決定した。
【００３３】
ＥＣＭタンパク質の合成を評価するために、細胞増殖培地に、上記のとおりに、^３Ｈ−グリシンを補充した。^３Ｈ−グリシン添加の２日後、細胞を、２５ｍＭ水酸化アンモニウムで非酵素的に取り出し、次いで７０％エタノールでリンスし、そして乾燥させた。このプロセスは、培養の間に細胞によって製造されたＥＣＭをインタクトなままにする（Ｊｏｎｅｓら，Ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６：３５３−３５７（１９７９））。逐次の酵素消化を、Ｍａｎｎ（１９９９）によって以前に記載されたとおりに用いて、ＥＣＭタンパク質の総組成を決定した。手短に述べると、ＥＣＭを、最初にトリプシンで、続いてエラスターゼで、次いでコラゲナーゼで消化した。最後の酵素消化後、基材上に残っているあらゆる物質を、１Ｎ　ＮａＯＨとのインキュベーションによって溶解した。アリコートを、シンチレーションカウンティングのために消化の各ステップから採取した。
【００３４】
（アクリロイル−ＰＥＧ−ＲＧＤＳ（配列番号１）の調製）
ＲＧＤＳ（配列番号１）を、ＴＧＦ−βと同じ様式でアクリロイル−ＰＥＧ−ＮＨＳに結合体化させた。
【００３５】
（ＰＥＧ−ジアクリレートの調製）
ＰＥＧ−ジアクリレートを、０．１ｍｍｏｌ／ｍｌ乾燥ＰＥＧ（６，０００Ｄａ；Ｆｌｕｋａ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、０．４ｍｍｏｌ／ｍｌアクリロイルクロリドおよび０．２ｍｍｏｌ／ｍｌトリエチルアミンを無水ジクロロメタン中で合わせ、そしてアルゴン下で一晩攪拌することによって調製した。次いで、得られたＰＥＧ−ジアクリレートをエーテルで沈澱させ、濾過し、そして減圧オーブン中で乾燥させた。
【００３６】
（ヒドロゲルの調製）
ヒドロゲルを、０．４ｇ／ｍｌ　ＰＥＧ−ジアクリレート、１．４μｍｏｌ／ｍｌアクリロイル−ＰＥＧ−ＲＧＤＳ（配列番号１）および０．３ｍｍｏｌ／ｍｌトリエタノールアミンを１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４、ＨＢＳ）中で合わせることによって調製した。このポリマー水溶液を、濾過（０．８μｍプレフィルターおよび０．２μｍフィルター）によって滅菌し、そして等容量のＳＭＣ懸濁物に２×１０^６細胞／ｍｌで添加し、その結果、得られたポリマー−細胞溶液は、１×１０^６細胞／ｍｌを含んでいた。ＴＧＦ−βを含有するヒドロゲルについては、０．０４ｐｍｏｌ／ｍｌ（１ｎｇ／ｍｌ）未改変ＴＧＦ−βまたは０．０４ｐｍｏｌ／ｍｌアクリロイル−ＰＥＧ−ＴＧＦ−βを、このポリマー−細胞溶液に添加した。次いで、ｎ−ビニルピロリドン（６００ｍｇ／ｍｌ）中の２，２−ジメチル−２−フェニル−アセトフェノン４０μｌを添加し、そしてこの溶液の０．２５ｍｌを、ディスク型の鋳型に配置した（２０ｍｍ直径、２ｍｍの厚さ）。次いで、このポリマー−細胞水溶液をＵＶ光（３６５ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ^２）に２０秒間暴露して、ポリマー−細胞水溶液を、均質に播種された細胞を有するヒドロゲルへと変換した。ヒドロゲルを、１０％　ＦＢＳを含有するＭＥＭ中で７日間にわたって３７℃で、５％　ＣＯ_２を用いてインキュベートした。培地を、３日毎に交換した。
【００３７】
（ヒドロゲル中のＤＮＡおよびヒドロキシプロリンの決定）
７日間の培養後、ヒドロゲルを、培養培地から取り出し、計量し、そして１ｍｌ　０．１Ｎ　ＮａＯＨで３７℃で一晩消化した。次いで、消化したヒドロゲルを、１ｍｌ　０．１Ｎ　ＨＣｌで中和した。消化して中和したヒドロゲルのＤＮＡ含量を、蛍光ＤＮＡ結合染料Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて決定した。このサンプルの蛍光を、３６０ｎｍでの励起フィルターおよび４６０ｎｍでの発光フィルターを備えた蛍光計（ＶｅｒｓａＦｌｕｏｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて決定し、そして仔ウシ胸腺ＤＮＡ標準の蛍光に対して比較した。ヒドロキシプロリン濃度を、クロラミンＴ（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）を用いた酸化およびｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いた発色（Ｗｏｅｓｓｎｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．９３：４４０−４４７（１９６１））によって決定した。ヒドロキシプロリンは、コラーゲン産生についてのマーカーである。従って、マトリクス合成の指標として用いた。
【００３８】
（ヒドロゲルの機械的試験）
ヒドロゲルを、２ｍｌのポリマー−細胞水溶液を３ｍｍ厚さの長方形鋳型（４２ｍｍ×１４ｍｍ）に配置したこと以外は、上記のとおりに調製した。この実験について、ＨＡＳＭＣを、３．５×１０^５細胞／ｍｌの最終細胞密度で用いた。ヒドロゲルは、ＴＧＦ−βを含んでいないか、または０．０４ｐｍｏｌ／ｍｌアクリロイル−ＰＥＧ−ＴＧＦ−βを含んでいるかのいずれかであった。
【００３９】
光重合後、このヒドロゲルを、１０％　ＦＢＳを含有する１０ｍｌ培地を有するＱｕａｄｒｉＰｅｒｍ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｖｅｓｓｅｌ中に配置し、そして３７℃で、５％　ＣＯ_２を用いてインキュベートした。培地を、３日毎に交換した。７日間の培養後、このヒドロゲルを３つのセクション（１４ｍｍ×１４ｍｍ）に切断し、そしてＶｉｔｒｏｄｙｎｅ　Ｖ−１０００　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｔｅｓｔｅｒ（Ｃｈａｔｉｌｌｏｎ，Ｇｒｅｅｎｓｂｏｒｏ，ＮＣ）を用い、１００μｍ／ｓのひずみ速度で、１５０ｇの荷重セルを用いて機械的試験を行った。
【００４０】
（統計的解析）
データセットを、独立両側ｔ検定を用いて比較した。０．０５未満のＰ値を、有意であるとみなした。
【００４１】
（結果）
現在の研究の目的は、ＴＧＦ−βが、生体材料（特に、細胞接着リガンドで改変された材料）上または生体材料（特に、細胞接着リガンドで改変された材料）中で増殖した細胞によるＥＣＭ合成速度を増強し得るか否かを決定することであった。図１は、マトリクスタンパク質産生を、ＴＧＦ−βなしの培地または０．０４ｐｍｏｌ／ｍｌ（１ｎｇ／ｍｌ）可溶性ＴＧＦ−βを有する培地のいずれかで増殖させた細胞について、細胞あたりに基づいて示す。培地中にＴＧＦ−βがない場合、接着性ペプチド上で増殖させたよりも多くのマトリクスが、非接着剤コントロールであるＲＧＥＳ（配列番号４）上で増殖させた細胞によって産生された。ＴＧＦ−βをこの培地に添加した場合、マトリクス産生は、ＴＧＦ−βが添加されなかった場合に産生されたよりも多く、接着表面で増加した。（ＲＧＤＳ（配列番号１）表面で２２４％増加、ＶＡＰＧ（配列番号２）表面で２０％増加、ＫＱＡＧＤＶ（配列番号３）表面で１０４％増加）。ＴＧＦ−βの存在下でのＲＧＤＳ（配列番号１）改変表面およびＫＱＡＧＤＶ（配列番号３）改変表面でのマトリクス産生は、非接着性コントロールで見られた産生を超えて増加した。
【００４２】
ＲＧＤＳ（配列番号１）改変ガラス表面に播種した細胞をまた、０．０４ｐｍｏｌ／ｍｌアクリロイル−ＰＥＧ−ＴＧＦ−βの存在下で増殖させて、ＴＧＦ−βがポリマーに共有結合され得る（可溶性ポリマー鎖に共有結合しているが、三次構造に係留していない）か否かおよびＥＣＭ産生を増加させるその能力を保持するか否かを決定した。図２は、培地中にＴＧＦ−βなしで増殖させた細胞、可溶性ＴＧＦ−βを用いて増殖させた細胞またはアクリロイル−ＰＥＧ−ＴＧＦ−βを用いて増殖させた細胞によるマトリクス産生を示す。ＳＭＣは、可溶性ＴＧＦ−βまたはポリマー結合体化ＴＧＦ−βのいずれかの存在下で、ＴＧＦ−βの非存在下で産生されるよりも多くの量のマトリクスを産生した。しかし、ポリマー結合体化ＴＧＦ−βを用いた場合、非改変ＴＧＦ−βを用いた場合よりも少ないマトリクスが産生された。
【００４３】
次いで、ＳＭＣを、共有結合的に係留されたＲＧＤＳ（配列番号１）を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ヒドロゲル中に均質に播種した。このヒドロゲルは、ＴＧＦ−βを含まないか、未改変（可溶性）ＴＧＦ−βを含むか、またはＰＥＧに係留されたＴＧＦ−βを含むかのいずれかであった。これらの光重合ヒドロゲルにおいては、ＴＧＦ−βの係留したペプチドは、高度に可撓性のＰＥＧ鎖を介してこのヒドロゲル構造に共有結合されている。このことによって、係留された部分は、この部分がこのヒドロゲル材料中に保持されながらも、それらのレセプターとコンホメーション的に自由に相互作用する。７日間の培養後、このヒドロゲルを消化し、そしてＤＮＡおよびヒドロキシプロリンについてアッセイした。ヒドロキシプロリンはコラーゲンについてのマーカーであるので、これは、どれくらい多くの細胞外マトリクスが産生されたかの指標である。
【００４４】
０．０４ｐｍｏｌ／ｍｌのＴＧＦ−βの存在下で増殖させた細胞についての結果を図３に示す。ＴＧＦ−βが存在しない場合よりも多くのヒドロキシプロリン、従ってより多くのコラーゲンが、可溶性ＴＧＦ−βまたは係留ＴＧＦ−βのいずれかの存在下で増殖させたＳＭＣによって産生された。さらに、ＴＧＦ−βをヒドロゲル上に係留した場合、可溶性ＴＧＦ−βを用いた場合よりも有意に多くのヒドロキシプロリンが産生された。
【００４５】
さらに、ＴＧＦ−βを用いて作製したヒドロゲルおよびＴＧＦ−βを用いずに作製したヒドロゲルの機械的特性を調べた。足場の剛性の尺度であるヤング率は、ＴＧＦ−βを足場に係留した場合、ＴＧＦ−βを用いなかった場合よりも有意に高かった（係留したＴＧＦ−βについては６６．６±３．７ｋＰａ、これに対して、ＴＧＦ−βを用いない場合、５８．５＋１．８ｋＰａ、ｐ＝０．０３）。
【００４６】
（実施例２：ＴＧＦ−βに対する大動脈平滑筋細胞の用量応答）
大動脈平滑筋細胞を、アミノフェース（ａｍｉｎｏｐｈａｓｅ）ガラスに共有結合した０．５ｎｍｏｌ／ｃｍ^２　ＲＧＤＳ（配列番号１）を有するこのガラス上で増殖させた。ＴＧＦ−βを、０、１または５ｎｇ／ｍｌ（０、４×１０^−５、２×１０^−４ｎｍｏｌ／ｍｌ）でこの媒体に添加した。２日間の期間でのこの細胞によるＥＣＭタンパク質産生を、細胞によって製造されたＥＣＭ中に取り込まれた^３Ｈ−グリシンの量を調べることによって決定した。
【００４７】
図４に見られるように、ＴＧＦ−βを１ｎｇ／ｍｌおよび５ｎｇ／ｍｌの両方でこの媒体に添加した場合、細胞あたりのＥＣＭタンパク質産生（コントロールの％）は増加した。さらに、細胞数は、１細胞あたりのマトリクス産生における変化にかかわらず、２日間にわたって増加しなかった。このことは、このヒドロゲルにおいて見られたように、ＴＧＦ−βの存在が、ＳＭＣの増殖を増加させなかったことを示す。
【００４８】
（実施例３：ＴＧＦ−βに対する耳介軟骨細胞の用量応答）
耳介軟骨細胞を、培地に添加した種々の量（０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌ）のＴＧＦ−βを含む組織培養ポリスチレンで増殖させた。２日間の期間の間での細胞によるＥＣＭタンパク質産生を、細胞によって製造されたＥＣＭ中に取り込まれた^３Ｈ−グリシンの量を調べることによって決定した。
【００４９】
図５に見られるように、１細胞あたりのＥＣＭタンパク質産生は、ＴＧＦ−βを１ｎｇ／ｍｌを超える濃度で培地に添加した場合増加し、最適濃度は２５ｎｇ／ｍｌ（１×１０^−３ｎｍｏｌ／ｍｌ）であった。さらに、細胞数は、１細胞あたりのマトリクス産生における変化にもかかわらず、２日間にわたって増加しなかった（図６を参照のこと）。このことは、このヒドロゲルにおいて見られたように、ＴＧＦ−βの存在が、この軟骨細胞の増殖を増加させなかったことを示す。
【００５０】
（実施例４．アスコルビン酸の存在下でのマトリクス産生における増加）
大動脈平滑筋細胞および耳介軟骨細胞を、培地に添加した５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含む組織培養ポリスチレンおよびアスコルビン酸を含まない組織培養ポリスチレン上で増殖させた。２日間の期間の間のでの細胞によるＥＣＭタンパク質産生を、細胞によって製造されたＥＣＭ中に取り込まれた^３Ｈ−グリシンの量を調べることによって決定した。
【００５１】
図７に見られるように、１細胞あたりのＥＣＭタンパク質産生は、ＳＭＣ（薄灰色）および軟骨細胞（濃灰色）の両方について、アスコルビン酸の存在下で増加した。さらに、細胞数は、１細胞あたりのマトリクス産生における変化にもかかわらず、２日間にわたって増加しなかった（図８）。このことは、アスコルビン酸の存在が、この平滑筋細胞（薄灰色）の増殖も軟骨細胞（濃灰色）の増殖も増加させなかったことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、培地中でＴＧＦ−βの有りまたは無しで、ＲＧＤＳ（配列番号１）、ＶＡＰＧ（配列番号２）、ＫＱＡＧＤＶ（配列番号３）、またはＲＧＥＳ（配列番号４）と共有結合したガラス表面上で増殖させたＳＭＣによる、細胞当たりのマトリクス産生のグラフである。「＋」は、ＴＧＦ−βが培地に添加されたことを示し、一方、「−」は、培地からＴＧＦ−βが欠如していることを示す。
【図２】図２は、ヒドロゲル中ＴＧＦ−β無し、４×１０^−５ｎｍｏｌ／ｍｌの可溶性ＴＧＦ−βまたはアクリロイルＰＥＧ−ＴＧＦ−βと共に、ＲＧＤＳ（配列番号１）改変ガラス表面上で増殖させたＳＭＣによる、細胞あたりのマトリクス産生のグラフである。コントロールは、ヒドロゲル中にＴＧＦ−βがない。
【図３】図３は、ヒドロゲル中ＴＧＦ−β無し、４×１０^−５ｎｍｏｌ／ｍｌの可溶性ＴＧＦ−βまたはアクリロイルＰＥＧ−ＴＧＦ−βと共に、ＲＧＤＳ（配列番号１）含有ヒドロゲル中で増殖させたＳＭＣによる、ＤＮＡ　１ｎｇあたりのヒドロキシプロリン産生のグラフである。コントロールは、ヒドロゲル中にＴＧＦ−βがない。
【図４】図４は、コントロールのパーセントとして、ＴＧＦ−β濃度（０、１、および５ｎｇ／ｍｌ）の関数としての、ＲＧＤＳ（配列番号１）改変ガラス表面上で増殖させたＳＭＣによる、マトリクス産生のグラフである。
【図５】図５は、培地中に種々の量のＴＧＦ−β（０、０．１、１、５、１０、２５、および１００ｎｇ／ｍｌ）が存在する組織培養ポリスチレン上で増殖させた心耳軟骨細胞による、コントロールのパーセントとしての、マトリクス産生のグラフである。コントロールは、培地中にＴＧＦ−βがない。
【図６】図６は、培地中に種々の量のＴＧＦ−β（０、０．１、１、５、１０、２５、および１００ｎｇ／ｍｌ）が存在する組織培養ポリスチレン上で増殖する心耳軟骨細胞による、コントロールのパーセントとしての、細胞数のグラフである。コントロールは、培地中にＴＧＦ−βがない。
【図７】図７は、培地中に０および５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸が存在する組織培養ポリスチレン上で増殖させた心耳軟骨細胞および大動脈平滑筋細胞による、コントロールのパーセントとしての、マトリクス産生のグラフである。コントロールは、培地中にアスコルビン酸がない。
【図８】図８は、培地中に０および５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸が存在する組織培養ポリスチレン上で増殖させた心耳軟骨細胞および大動脈平滑筋細胞による、コントロールのパーセントとしての、細胞数のグラフである。コントロールは、培地中にアスコルビン酸がない。

Claims

足場に結合した細胞による細胞外マトリクスの形成を誘導するための組織工学足場を作製するための方法であって、該方法は、
細胞増殖を増大させることなく細胞外マトリクスの形成を誘発するのに有効な密度で、精製したマトリクス増強分子を該足場に結合させる工程を包含し、
ここで、該マトリクス増強分子がＴＧＦ−βである場合、該ＴＧＦ−βは、ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定された場合に２０００と６０００との間の分子量を有するポリマーテザーによって該マトリクスに結合され、そして１ｍｌのポリマーマトリクスもしくはポリマーマトリクス−細胞混合物当たり５ｎｇと１００ｎｇとの間のＴＧＦ−β密度であるか、または１ｍｌのポリマーマトリクスもしくはポリマーマトリクス−細胞混合物当たり約４×１０^−６ｎｍｏｌと４×１０^−３ｎｍｏｌとの間の濃度である、
方法。
細胞を前記足場に結合させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
前記マトリクス増強分子がアンギオテンシンＩＩである、請求項１に記載の方法。
前記マトリクス増強分子がインスリン様増殖因子である、請求項１に記載の方法。
前記マトリクス増強分子がアスコルビン酸である、請求項１に記載の方法。
前記マトリクス増強分子が、前記足場に共有結合されるテザーに共有結合される、請求項１に記載の方法。
前記足場がヒドロゲルである、請求項１に記載の方法。
請求項７に記載の方法であって、ここで、前記ヒドロゲルが、アルギネート、コラーゲン、ヒアルロン酸、およびポリエチレングリコールポリマーからなる群より選択されるポリマーで形成される、方法。
請求項７に記載の方法であって、ここで、前記マトリクス増強分子が、約４×１０^−６ｎｍｏｌ／ｍｌと４×１０^−３ｎｍｏｌ／ｍｌとの間の濃度でヒドロゲルに結合するＴＧＦ−βである、方法。
足場に結合した細胞による細胞外マトリクスの形成を誘導するための組織工学足場であって、
該足場は、細胞増殖を増大させることなく細胞外マトリクスの産生を誘発するのに有効な密度で、足場マトリクス増強分子に結合され、
ここで、該マトリクス増強分子がＴＧＦ−βである場合、該ＴＧＦ−βは、ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定された場合に２０００と６０００との間の分子量を有するポリマーテザーによって該マトリクスに結合され、そして１ｍｌのポリマーマトリクスもしくはポリマーマトリクス−細胞混合物当たり５ｎｇと１００ｎｇとの間のＴＧＦ−β密度であるか、または１ｍｌのポリマーマトリクスもしくはポリマーマトリクス−細胞混合物当たり約４×１０^−６ｎｍｏｌと４×１０^−３ｎｍｏｌとの間の濃度である、
足場。
細胞が結合されている、請求項１０に記載の足場。
請求項１１に記載の足場であって、ここで、前記細胞は、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および軟骨細胞からなる群より選択される、足場。
請求項１０に記載の足場であって、ここで、前記マトリクス増強分子は、約４×１０^−６ｎｍｏｌ／ｍｌと４×１０^−３ｎｍｏｌ／ｍｌとの間の濃度で足場に結合されるＴＧＦ−βである、足場。
請求項１０に記載の足場であって、ここで、前記マトリクス増強分子は、該マトリクスに共有結合したテザーに結合され、ここで、該テザーは、ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定された場合に約２００と１０，０００との間の分子量を有する、足場。
請求項１４に記載の足場であって、ここで、前記テザーは、ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定された場合に約２０００と６０００との間の分子量を有する、足場。
組織の修復または置換のための方法であって、該方法は、修復が必要な部位に組織工学足場を適用または移植する工程を包含し、
該組織工学足場は、細胞増殖を増大させることなく細胞外マトリクスの産生を誘発するのに有効な密度で、該足場マトリクス増強分子に結合され、
ここで、該マトリクス増強分子がＴＧＦ−βである場合、該ＴＧＦ−βは、ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定された場合に約２０００と６０００との間の分子量を有するポリマーテザーによって該マトリクスに結合され、そして１ｍｌのポリマーマトリクスもしくはポリマーマトリクス−細胞混合物当たり５ｎｇと１００ｎｇとの間のＴＧＦ−β密度であるか、または１ｍｌのポリマーマトリクスもしくはポリマーマトリクス−細胞混合物当たり約４×１０^−６ｎｍｏｌと４×１０^−３ｎｍｏｌとの間の濃度である、
方法。
前記マトリクス増強分子がＴＧＦ−βである、請求項１６に記載の方法。
前記マトリクス増強分子がアンギオテンシンＩＩである、請求項１６に記載の方法。
前記マトリクス増強分子がインスリン様増殖因子である、請求項１６に記載の方法。
前記マトリクス増強分子がアスコルビン酸である、請求項１６に記載の方法。
前記マトリクス増強分子が、前記足場に共有結合するテザーに共有結合される、請求項１６に記載の方法。
前記足場がヒドロゲルである、請求項１６に記載の方法。
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記ヒドロゲルが、アルギネート、コラーゲン、ヒアルロン酸、およびポリエチレングリコールポリマーからなる群より選択されるポリマーで形成される、方法。