JP2006145342A - ポリヌクレオチドの分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】煩雑な操作や高価な測定装置を必要とせず、簡便に実施可能であり、しかも、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの構造（例えば、一本鎖又は二本鎖）や塩基配列に影響を受けることなく、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを分析することのできる方法を提供する。
【解決手段】前記分析方法では、（ａ）前記被検試料不在下における、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合する電気化学活性物質の電気応答と、（ｂ）前記被検試料存在下における前記電気化学活性物質の電気応答とを比較する。
【選択図】図１
【解決手段】前記分析方法では、（ａ）前記被検試料不在下における、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合する電気化学活性物質の電気応答と、（ｂ）前記被検試料存在下における前記電気化学活性物質の電気応答とを比較する。
【選択図】図１
Description
本発明は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの分析方法に関する。本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」（例えば、標的遺伝子の検出）との両方が含まれる。
ポリヌクレオチドの定量方法としては、塩基に由来する２６０ｎｍの極大波長を利用する分光光学的定量法が一般的である。２６０ｎｍにおけるＯＤ（optical density）値が１の場合、そのポリヌクレオチド濃度は約５０μｇ／ｍＬである。
一方、二本鎖ＤＮＡの分析方法として、二本鎖認識体、例えば、二本鎖ＤＮＡ中の隣接する塩基対の間に挿入［すなわち、インターカレーション（intercalation）］することにより二本鎖ＤＮＡと特異的に結合する挿入剤（intercalating agent）を用いる方法が公知である。
例えば、特許文献１には、検出対象遺伝子を一本鎖に変性させた状態で含む試料溶液中に、担体を浸積させることにより、担体表面上に試料核酸を吸着させた後、続いて、核酸プローブが貯留された反応槽に、前記担体を浸積させ、プローブ溶液の温度を適当に制御することによりハイブリダイゼーションを行ない、更に、二本鎖認識体含有溶液が貯留された検出槽に、前記担体を浸積させ、担体の表面に形成された二重鎖核酸を認識して結合した二本鎖認識体に由来する電気化学的信号を検出する、遺伝子検出方法が開示されている。なお、前記公報には、検出対象遺伝子の含有量が微量である場合には、遺伝子を増幅した後、前記検出を行なうことができることも開示されている。
また、特許文献２には、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合可能な、電気化学的に活性な遺伝子結合性物質を用いて、前記遺伝子結合性物質及び被検試料を含む、遺伝子合成反応実施前の混合液における電気化学的応答と、その遺伝子合成反応後の生成液における電気化学的応答とを比較する、遺伝子検出方法が開示されている。
例えば、特許文献１には、検出対象遺伝子を一本鎖に変性させた状態で含む試料溶液中に、担体を浸積させることにより、担体表面上に試料核酸を吸着させた後、続いて、核酸プローブが貯留された反応槽に、前記担体を浸積させ、プローブ溶液の温度を適当に制御することによりハイブリダイゼーションを行ない、更に、二本鎖認識体含有溶液が貯留された検出槽に、前記担体を浸積させ、担体の表面に形成された二重鎖核酸を認識して結合した二本鎖認識体に由来する電気化学的信号を検出する、遺伝子検出方法が開示されている。なお、前記公報には、検出対象遺伝子の含有量が微量である場合には、遺伝子を増幅した後、前記検出を行なうことができることも開示されている。
また、特許文献２には、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合可能な、電気化学的に活性な遺伝子結合性物質を用いて、前記遺伝子結合性物質及び被検試料を含む、遺伝子合成反応実施前の混合液における電気化学的応答と、その遺伝子合成反応後の生成液における電気化学的応答とを比較する、遺伝子検出方法が開示されている。
２６０ｎｍにおける極大波長を利用する分光光学的定量法では、各塩基が有する吸収波長を指標としているため、遺伝子増幅反応後の試料を定量する場合、ｄＮＴＰなどの未反応物を取り除くための精製作業が必要である。更に、検出感度が測定セルの高路長に比例するため、比較的多くの試料を必要とする場合が多い。また、測定セルに石英が使われていることが多く、高価であるだけでなく、測定には大型の光学装置を必要とするなどの欠点がある。
また、特許文献１又は２に記載の遺伝子検出方法は、いずれも、二本鎖ＤＮＡと特異的に結合可能な電気化学活性物質を用いており、その検出対象物質は二本鎖ＤＮＡに限定される。すなわち、一本鎖ポリヌクレオチドを含む被検試料、例えば、一本鎖ＤＮＡのみからなる被検試料、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡの混合物を含む被検試料、ＲＮＡを含む被検試料については、特許文献１又は２に記載の遺伝子検出方法を適用することはできない。
従って、本発明の課題は、煩雑な操作や高価な測定装置を必要とせず、簡便に実施可能であり、しかも、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの構造（例えば、一本鎖又は二本鎖）や塩基配列に影響を受けることなく、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを分析することのできる方法を提供することにある。
また、特許文献１又は２に記載の遺伝子検出方法は、いずれも、二本鎖ＤＮＡと特異的に結合可能な電気化学活性物質を用いており、その検出対象物質は二本鎖ＤＮＡに限定される。すなわち、一本鎖ポリヌクレオチドを含む被検試料、例えば、一本鎖ＤＮＡのみからなる被検試料、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡの混合物を含む被検試料、ＲＮＡを含む被検試料については、特許文献１又は２に記載の遺伝子検出方法を適用することはできない。
従って、本発明の課題は、煩雑な操作や高価な測定装置を必要とせず、簡便に実施可能であり、しかも、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの構造（例えば、一本鎖又は二本鎖）や塩基配列に影響を受けることなく、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを分析することのできる方法を提供することにある。
前記課題は、本発明による、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む可能性のある被検試料における前記ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの分析方法であって、（ａ）前記被検試料不在下における、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合する電気化学活性物質の電気応答と、（ｂ）前記被検試料存在下における前記電気化学活性物質の電気応答とを比較することを特徴とする、前記分析方法により解決することができる。
本発明の分析方法の好ましい態様によれば、前記被検試料が、少なくとも一本鎖ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む。
本発明の分析方法の好ましい態様によれば、前記被検試料が、少なくとも一本鎖ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む。
本発明によれば、ポリヌクレオチドの構造（例えば、一本鎖又は二本鎖）や塩基配列に影響を受けることなく、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを分析（例えば、定量又は検出、好ましくは定量）することができる。また、様々な遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＬＡＭＰ（loop mediated isothermal amplification）法、又はＲＣＡ（Rolling cycle amplification）法などを併用することで、標的とする遺伝子の簡易な検出も可能である。更に、煩雑な操作（例えば、未反応物質の除去操作）や高価な測定装置を必要とせず、簡便に実施可能である。
本発明の分析方法を適用することのできる分析対象ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はそれらのキメラのいずれであることもでき、また、一本鎖又は二本鎖のいずれであることもできる。また、それらの１種類のみであることもできるし、それらの混合物であることもできる。また、天然に存在するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子）であることも、化学合成したポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドであることも、更には、それらを酵素的に増幅して得られるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド（例えば、標的遺伝子）であることもできる。
以下、分析対象がポリヌクレオチドである場合を例にとって本発明を説明するが、以下の説明は、分析対象がオリゴヌクレオチドである場合にも、当業者の技術常識に従って、そのまま適用することができる。
以下、分析対象がポリヌクレオチドである場合を例にとって本発明を説明するが、以下の説明は、分析対象がオリゴヌクレオチドである場合にも、当業者の技術常識に従って、そのまま適用することができる。
また、本発明の分析方法を適用することのできる被検試料は、前記分析対象ポリヌクレオチドを含む可能性がある限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料［例えば、動物の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体］、あるいは、環境由来の試料（例えば、河川水、湖沼水、若しくは海水、又は土壌）を挙げることができる。あるいは、ポリヌクレオチドの増幅反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＬＡＭＰ（loop mediated isothermal amplification）法、又はＲＣＡ（Rolling cycle amplification）法を行った後の反応液を被検試料として用いることもできる。
本発明の分析方法では、少なくとも一本鎖ポリヌクレオチドを含む被検試料、例えば、ポリヌクレオチドとして一本鎖ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）のみを含む被検試料、あるいは、ポリヌクレオチドとして一本鎖ポリヌクレオチドと二本鎖ポリヌクレオチドとを含む被検試料が好ましい。例えば、前記ＬＡＭＰ法では、増幅産物の一部が一本鎖ＤＮＡであり、前記ＲＣＡ法では、増幅産物が一本鎖ＤＮＡであるので、ＬＡＭＰ法又はＲＣＡ法を行った後の反応液を、このような被検試料として用いることができる。
本発明の分析方法では、ポリヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合する電気化学活性物質（以下、リン酸基結合性電気化学活性物質と称する）を使用する。
本明細書において、「ポリヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合する」とは、ポリヌクレオチドが一本鎖であるか、二本鎖であるかを問わず、また、ポリヌクレオチドの塩基配列にも依存することなく、ポリヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識し、ポリヌクレオチドに結合することを意味する。
また、「電気化学的に活性である」とは、電気化学測定において、酸化又は還元活性を示すこと、すなわち、特定の電圧を加えた際に、電気化学活性物質の量に比例したシグナルが得られることを意味する。
本明細書において、「ポリヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合する」とは、ポリヌクレオチドが一本鎖であるか、二本鎖であるかを問わず、また、ポリヌクレオチドの塩基配列にも依存することなく、ポリヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識し、ポリヌクレオチドに結合することを意味する。
また、「電気化学的に活性である」とは、電気化学測定において、酸化又は還元活性を示すこと、すなわち、特定の電圧を加えた際に、電気化学活性物質の量に比例したシグナルが得られることを意味する。
本発明の分析方法において用いるリン酸基結合性電気化学活性物質は、ポリヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合することができ、しかも、電気化学的に活性な物質である限り、特に限定されるものではないが、例えば、式（Ｉ）：
で表される化合物［ヘキスト３３２５８（Hoechst社）；２’−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５’−ビ−１Ｈ−ベンズイミダゾール（2’-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5’-bi-1H-benzimidazole）］、式（II）：
で表される化合物［ヘキスト３３３４２（Hoechst社）；２’−（４−エトキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５’−ビ−１Ｈ−ベンズイミダゾール（2’-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5’-bi-1H-benzimidazole）］、式（III）：
で表される化合物［ヌクレアイエロー（nuclear yellow；SIGMA社）；４−［５−（４−メチル−１−ピペラジニル）［２，５’−ビ−１Ｈ−ベンズイミダゾール］−２’−イル］−ベンゼンスルホンアミド（4-[5-(4-methyl-1-piperazinyl)[2,5’-bi-1H-benzimidazol]-2’-yl]-benzenesulfonamide）］、又は式（IV）：
で表される化合物［ミトキサントロン（mitoxantrone；SIGMA社）；１，４−ジヒドロキシ−５，８−ビス｛２−［（２−ヒドロキシエチル）−アミノ］エチル｝アミノアントラセン−９，１０−ジオン（1,4-dihydroxy-5,8-bis{2-[(2-hydroxyethyl)-amino]ethyl}aminoanthracene-9,10-dione）］を挙げることができる。
或る電気化学活性物質がリン酸基結合性電気化学活性物質であるか否か、すなわち、ポリヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合するか否かは、例えば、一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＰＮＡ（ペプチド核酸）に関する各電気化学活性を指標として判定することができる。ここで、ＰＮＡとは、天然ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の糖（例えば、デオキシリボース又はリボース）部分がペプチドに置換され、リン酸結合の代わりにペプチド結合によりポリヌクレオチド主鎖が形成されている人工化合物である。
具体的には、一本鎖ＤＮＡを用いた場合に電気化学的な活性を示し、しかも、一本鎖ＰＮＡを用いた場合に電気化学的な活性を示さない場合、その電気化学活性物質はリン酸基結合性電気化学活性物質であると判定することができる。前記判定は、例えば、実施例２に記載の手順に従って、実施することができる。
なお、従来公知の二本鎖ＤＮＡの電気化学的分析方法で使用される二本鎖ＤＮＡ認識体、例えば、インターカレーター（intercalator）又はマイナーグルーブバインダー（minor groove binder）は、二本鎖ＤＮＡの特徴的構造を認識して結合するため、前記判定法において、一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＰＮＡのいずれの場合にも電気化学的な活性を示さない。
具体的には、一本鎖ＤＮＡを用いた場合に電気化学的な活性を示し、しかも、一本鎖ＰＮＡを用いた場合に電気化学的な活性を示さない場合、その電気化学活性物質はリン酸基結合性電気化学活性物質であると判定することができる。前記判定は、例えば、実施例２に記載の手順に従って、実施することができる。
なお、従来公知の二本鎖ＤＮＡの電気化学的分析方法で使用される二本鎖ＤＮＡ認識体、例えば、インターカレーター（intercalator）又はマイナーグルーブバインダー（minor groove binder）は、二本鎖ＤＮＡの特徴的構造を認識して結合するため、前記判定法において、一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＰＮＡのいずれの場合にも電気化学的な活性を示さない。
本発明の分析方法では、被検試料を含まない液と、被検試料を含む液との各々について、各液中に同量のリン酸基結合性電気化学活性物質が存在する状態で、各液の電気化学的応答を測定し、比較する。
すなわち、本発明の分析方法は、例えば、
（１）被検試料を含まず、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合する電気化学活性物質（リン酸基結合性電気化学活性物質）を含む液の電気応答を測定する工程、
（２）被検試料とリン酸基結合性電気化学活性物質を含む液の電気応答を測定する工程、及び
（３）前記工程（１）で得られた測定値と前記工程（２）で得られた測定値とを比較する工程
を含む。
すなわち、本発明の分析方法は、例えば、
（１）被検試料を含まず、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合する電気化学活性物質（リン酸基結合性電気化学活性物質）を含む液の電気応答を測定する工程、
（２）被検試料とリン酸基結合性電気化学活性物質を含む液の電気応答を測定する工程、及び
（３）前記工程（１）で得られた測定値と前記工程（２）で得られた測定値とを比較する工程
を含む。
本発明の分析方法においては、例えば、被検液（すなわち、被検試料を含まない液、あるいは、被検試料を含む液）に電位を印加した時に発生する電流値を測定することによって、電気化学的応答の測定を実施することができる。具体的には、種々の電気化学測定方法、例えば、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）、クロノアンペリメトリー（ＣＡ）、クロノクーロメトリー（ＣＣ）、又はサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）などを挙げることができる。
本発明の分析方法では、以下の原理に基づいて、被検試料中における分析対象ポリヌクレオチドを分析する。
すなわち、本発明の分析方法で用いるリン酸基結合性電気化学活性物質は、ポリヌクレオチドが一本鎖であるか、二本鎖であるかを問わず、ポリヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合することができ、しかも、電気化学的に活性である。従って、被検試料中にポリヌクレオチドが含まれている場合、被検試料を含まない液における電気化学的応答と、被検試料を含む液における電気化学的応答とを比較すると、リン酸基結合性電気化学活性物質がポリヌクレオチドと結合するため、前者の電気化学的応答に比べて、後者の電気化学的応答が低下し（すなわち、電流値が低下し）、電気化学的に検出可能な差異が生じる。この電気化学的応答（すなわち、電流値）の低下率は、ポリヌクレオチドと結合するリン酸基結合性電気化学活性物質の量に依存するため、電気化学的応答の低下率から、被検液に含まれるポリヌクレオチドの総量（総質量）、あるいは、前記ポリヌクレオチド中の総塩基数又は総リン酸基数、更には被検試料に含まれるポリヌクレオチドの総量（総質量）、あるいは、前記ポリヌクレオチド中の総塩基数又は総リン酸基数を決定することができる。
なお、本発明の分析方法（特には、定量方法）では、被検試料の分析と同時に、あるいは、前記分析に先だって、予め公知濃度のポリヌクレオチドを含有する標準試料を用いた分析を実施し、ポリヌクレオチドの総量（総質量）、又はポリヌクレオチド中の総塩基数若しくは総リン酸基数と電気化学応答との関係を示す検量線又は関係式等を決定することが好ましい。
すなわち、本発明の分析方法で用いるリン酸基結合性電気化学活性物質は、ポリヌクレオチドが一本鎖であるか、二本鎖であるかを問わず、ポリヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合することができ、しかも、電気化学的に活性である。従って、被検試料中にポリヌクレオチドが含まれている場合、被検試料を含まない液における電気化学的応答と、被検試料を含む液における電気化学的応答とを比較すると、リン酸基結合性電気化学活性物質がポリヌクレオチドと結合するため、前者の電気化学的応答に比べて、後者の電気化学的応答が低下し（すなわち、電流値が低下し）、電気化学的に検出可能な差異が生じる。この電気化学的応答（すなわち、電流値）の低下率は、ポリヌクレオチドと結合するリン酸基結合性電気化学活性物質の量に依存するため、電気化学的応答の低下率から、被検液に含まれるポリヌクレオチドの総量（総質量）、あるいは、前記ポリヌクレオチド中の総塩基数又は総リン酸基数、更には被検試料に含まれるポリヌクレオチドの総量（総質量）、あるいは、前記ポリヌクレオチド中の総塩基数又は総リン酸基数を決定することができる。
なお、本発明の分析方法（特には、定量方法）では、被検試料の分析と同時に、あるいは、前記分析に先だって、予め公知濃度のポリヌクレオチドを含有する標準試料を用いた分析を実施し、ポリヌクレオチドの総量（総質量）、又はポリヌクレオチド中の総塩基数若しくは総リン酸基数と電気化学応答との関係を示す検量線又は関係式等を決定することが好ましい。
本発明の分析方法では、ポリヌクレオチドの構造（例えば、一本鎖又は二本鎖）や塩基配列に影響を受けることなく、ポリヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合するリン酸基結合性電気化学活性物質を使用するため、被検試料に含まれるポリヌクレオチドの総量（総質量）、あるいは、前記ポリヌクレオチド中の総塩基数又は総リン酸基数を分析することができる。また、被検試料中の一本鎖ポリヌクレオチド及び／又は二本鎖ポリヌクレオチドの総量を、一本鎖ポリヌクレオチドに換算した量として決定することができる。
更に、本発明の分析方法では、様々な遺伝子増幅法、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、又はＲＣＡ法などを併用することで、標的遺伝子を増幅した後、そのポリヌクレオチド量を分析することにより、前記標的遺伝子の検出も可能である。本発明の分析方法は、例えば、
（１）標的遺伝子を含む可能性のある試料を用いて、前記標的遺伝子の増幅反応を実施することにより、被検試料を調製する工程、
（２）前記工程（１）で得られた前記被検試料を含まず、リン酸基結合性電気化学活性物質を含む液の電気応答を測定する工程、
（３）前記工程（１）で得られた前記被検試料とリン酸基結合性電気化学活性物質を含む液の電気応答を測定する工程、及び
（４）前記工程（２）で得られた測定値と前記工程（３）で得られた測定値とを比較する工程
を含む。
（１）標的遺伝子を含む可能性のある試料を用いて、前記標的遺伝子の増幅反応を実施することにより、被検試料を調製する工程、
（２）前記工程（１）で得られた前記被検試料を含まず、リン酸基結合性電気化学活性物質を含む液の電気応答を測定する工程、
（３）前記工程（１）で得られた前記被検試料とリン酸基結合性電気化学活性物質を含む液の電気応答を測定する工程、及び
（４）前記工程（２）で得られた測定値と前記工程（３）で得られた測定値とを比較する工程
を含む。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ断片のリニアスイープボルタンメトリー測定》
本実施例では、各種のリン酸基結合性電気化学活性物質に関して、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ断片の不在下及び存在下でのリニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）測定を行うことにより、前記ＤＮＡ断片不在下及び存在下でのそれぞれの最大電流値を求め、最大電流値の減少率を算出した。リン酸基結合性電気化学活性物質としては、ヘキスト３３２５８（Hoechst社）、ヘキスト３３３４２（Hoechst社）、ヌクレアイエロー（SIGMA社）、及びミトキサントロン（SIGMA社）を使用した。
本実施例では、各種のリン酸基結合性電気化学活性物質に関して、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡ断片の不在下及び存在下でのリニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）測定を行うことにより、前記ＤＮＡ断片不在下及び存在下でのそれぞれの最大電流値を求め、最大電流値の減少率を算出した。リン酸基結合性電気化学活性物質としては、ヘキスト３３２５８（Hoechst社）、ヘキスト３３３４２（Hoechst社）、ヌクレアイエロー（SIGMA社）、及びミトキサントロン（SIGMA社）を使用した。
具体的には、０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８４）で調製した各リン酸基結合性電気化学活性物質（６０μｍｏｌ／Ｌ又は１００μｍｏｌ／Ｌ，全量３００μＬ）を用いて、ＬＳＶ測定（掃引速度＝１００ｍＶ／ｓ）を行い、得られたピークの最大電流値（Ｉ０）を求めた。
次に、０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８４）で調製した各リン酸基結合性電気化学活性物質（６０μｍｏｌ／Ｌ又は１００μｍｏｌ／Ｌ，全量３００μＬ）に、ＨＢＶ−ＤＮＡ断片［１５５３ｂｐ（第１３２９番〜第２８８２番の塩基からなる配列）］を３０ｎｇ／μＬとなるように添加し、ＬＳＶ測定（掃引速度＝１００ｍＶ／ｓ）を行い、得られたピークの最大電流値（Ｉpa）を求めた。なお、前記ＨＢＶ−ＤＮＡ断片としては、ＨＢＶのＤＮＡ配列を挿入したプラスミドｐＢＲ３２２を鋳型とするＰＣＲ法によって増幅した試料を使用した。得られた各最大電流値から、各リン酸基結合性電気化学活性物質における電流値の減少率（Ｉpa／Ｉ０）を算出した。
次に、０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８４）で調製した各リン酸基結合性電気化学活性物質（６０μｍｏｌ／Ｌ又は１００μｍｏｌ／Ｌ，全量３００μＬ）に、ＨＢＶ−ＤＮＡ断片［１５５３ｂｐ（第１３２９番〜第２８８２番の塩基からなる配列）］を３０ｎｇ／μＬとなるように添加し、ＬＳＶ測定（掃引速度＝１００ｍＶ／ｓ）を行い、得られたピークの最大電流値（Ｉpa）を求めた。なお、前記ＨＢＶ−ＤＮＡ断片としては、ＨＢＶのＤＮＡ配列を挿入したプラスミドｐＢＲ３２２を鋳型とするＰＣＲ法によって増幅した試料を使用した。得られた各最大電流値から、各リン酸基結合性電気化学活性物質における電流値の減少率（Ｉpa／Ｉ０）を算出した。
結果を表１に示す。表１において、最大電流値（Ｉpa，Ｉ０）の単位はμＡであり、電位（Ｅ，Ｅpa）の単位はｍＶであり、測定物質濃度の単位はμｍｏｌ／Ｌである。
《表１》
測定物質 Ｉ ０ （Ｅ） Ｉpa（Ｅpa） Ｉpa／Ｉ ０ 測定物質濃度
ヘキスト33258 18.90 (557) 6.79 (553) 0.36 60
ヘキスト33342 21.46 (584) 16.57 (576) 0.77 60
ヌクレアイエロー 11.24 (570) 6.09 (581) 0.54 60
ミトキサントロン 5.19 (542) 4.18 (549) 0.80 100
測定物質 Ｉ ０ （Ｅ） Ｉpa（Ｅpa） Ｉpa／Ｉ ０ 測定物質濃度
ヘキスト33258 18.90 (557) 6.79 (553) 0.36 60
ヘキスト33342 21.46 (584) 16.57 (576) 0.77 60
ヌクレアイエロー 11.24 (570) 6.09 (581) 0.54 60
ミトキサントロン 5.19 (542) 4.18 (549) 0.80 100
《実施例２：二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、及び一本鎖ＰＮＡのＬＳＶ測定》
本実施例では、各種濃度の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、又は一本鎖ＰＮＡ（ｓｓＰＮＡ）共存下における各種リン酸基結合性電気化学活性物質のＬＳＶ測定を行うことにより、得られたピークの最大電流値（Ｉpa）を求め、グラフを作成した。ｄｓＤＮＡとしては、３７８ｂｐのＰＣＲ増幅産物を使用し、ｓｓＤＮＡ及びｓｓＰＮＡとしては、
配列：5'-CCG CAC ACG TC-3'（配列番号１）
からなるオリゴヌクレオチドを使用した。
本実施例では、各種濃度の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、又は一本鎖ＰＮＡ（ｓｓＰＮＡ）共存下における各種リン酸基結合性電気化学活性物質のＬＳＶ測定を行うことにより、得られたピークの最大電流値（Ｉpa）を求め、グラフを作成した。ｄｓＤＮＡとしては、３７８ｂｐのＰＣＲ増幅産物を使用し、ｓｓＤＮＡ及びｓｓＰＮＡとしては、
配列：5'-CCG CAC ACG TC-3'（配列番号１）
からなるオリゴヌクレオチドを使用した。
具体的には、０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８４）で調製した各リン酸基結合性電気化学活性物質（６０μｍｏｌ／Ｌ，全量３００μＬ）に、各種濃度のｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、又はｓｓＰＮＡをそれぞれ添加し、ＬＳＶ測定（掃引速度＝５ｍＶ／ｓ，掃引範囲＝３００ｍＶ〜７００ｍＶ）を行い、得られたピークの最大電流値（Ｉｐａ）を求め、グラフを作成した。
図１に、リン酸基結合性電気化学活性物質としてヘキスト３３２５８を用いた場合の結果を示す。
図１において、曲線ａ（正方形）はｄｓＤＮＡの結果であり、曲線ｂ（三角形）はｓｓＤＮＡの結果であり、曲線ｃ（円）はｓｓＰＮＡの結果である。図１に示すグラフの横軸は、式（１）：
ＮＢ＝Ｍ×Ｌ×ｎ （１）
［式中、ＮＢは総塩基数（相対値）であり、ＭはＤＮＡ又はＰＮＡのモル濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、ＬはＤＮＡ又はＰＮＡの塩基長（ｂｐ）であり、ｎは鎖数（個）である］
で算出される総塩基数（相対値）である。例えば、０．０８μｍｏｌ／Ｌ濃度のｄｓＤＮＡ（３７８ｂｐ）の場合、その総塩基数（相対値）は、
ＮＢ＝０．０８（μｍｏｌ／Ｌ）×３７８（ｂｐ）×２（個）
より、６０である。
グラフは示さないが、ヘキスト３３３４２、ヌクレアイエロー、及びミトキサントロンについても、ヘキスト３３２５８と同様の結果が得られた。
図１において、曲線ａ（正方形）はｄｓＤＮＡの結果であり、曲線ｂ（三角形）はｓｓＤＮＡの結果であり、曲線ｃ（円）はｓｓＰＮＡの結果である。図１に示すグラフの横軸は、式（１）：
ＮＢ＝Ｍ×Ｌ×ｎ （１）
［式中、ＮＢは総塩基数（相対値）であり、ＭはＤＮＡ又はＰＮＡのモル濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、ＬはＤＮＡ又はＰＮＡの塩基長（ｂｐ）であり、ｎは鎖数（個）である］
で算出される総塩基数（相対値）である。例えば、０．０８μｍｏｌ／Ｌ濃度のｄｓＤＮＡ（３７８ｂｐ）の場合、その総塩基数（相対値）は、
ＮＢ＝０．０８（μｍｏｌ／Ｌ）×３７８（ｂｐ）×２（個）
より、６０である。
グラフは示さないが、ヘキスト３３３４２、ヌクレアイエロー、及びミトキサントロンについても、ヘキスト３３２５８と同様の結果が得られた。
《実施例３：ＬＡＭＰ法を利用したＢ型肝炎ウイルスの検出》
本実施例では、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＤＮＡを含有する検体試料（ＨＢＶ患者由来の全血）と、前記ＤＮＡを含有しない検体試料（健常者由来の全血）とを、それぞれ、ＬＡＭＰ法により増幅させ、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）測定を行うことにより、前記ＤＮＡ断片不在下及び存在下でのそれぞれの最大電流値を求め、その差を算出することで、標的遺伝子（ＨＢＶ）の検出を行った。なお、リン酸基結合性電気化学活性物質としては、ヘキスト３３２５８（Hoechst社）を使用した。
本実施例では、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＤＮＡを含有する検体試料（ＨＢＶ患者由来の全血）と、前記ＤＮＡを含有しない検体試料（健常者由来の全血）とを、それぞれ、ＬＡＭＰ法により増幅させ、リニアスイープボルタンメトリー（ＬＳＶ）測定を行うことにより、前記ＤＮＡ断片不在下及び存在下でのそれぞれの最大電流値を求め、その差を算出することで、標的遺伝子（ＨＢＶ）の検出を行った。なお、リン酸基結合性電気化学活性物質としては、ヘキスト３３２５８（Hoechst社）を使用した。
具体的には、０．２ｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．８４）で調製したヘキスト３３２５８（１００μｍｏｌ／Ｌ，全量２５０μＬ）に、前記の各検体試料を用いたＬＡＭＰ法の増幅産物をそれぞれ添加し、ＬＳＶ測定（掃引速度＝５０ｍＶ／ｓ，掃引範囲＝２００ｍＶ〜８００ｍＶ）を行い、グラフを作成した。
図２に結果を示す。図２において、曲線ａは、ＨＢＶ患者由来血液の結果であり、曲線ｂは、健常者由来血液の結果である。図２に示すグラフの横軸は、掃引範囲（ｍＶ）を表しており、縦軸は得られた電流値を表す。
図２に結果を示す。図２において、曲線ａは、ＨＢＶ患者由来血液の結果であり、曲線ｂは、健常者由来血液の結果である。図２に示すグラフの横軸は、掃引範囲（ｍＶ）を表しており、縦軸は得られた電流値を表す。
本発明の分析方法は、ポリヌクレオチド分析の用途に適用することができる。
配列表の配列番号１の配列で表される塩基配列は、人工的に合成したオリゴヌクレオチド配列である。
Claims (2)
- ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む可能性のある被検試料における前記ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの分析方法であって、（ａ）前記被検試料不在下における、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド主鎖のリン酸基を認識して結合する電気化学活性物質の電気応答と、（ｂ）前記被検試料存在下における前記電気化学活性物質の電気応答とを比較することを特徴とする、前記分析方法。
- 前記被検試料が、少なくとも一本鎖ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の分析方法。
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| WO2003089929A1 (en) * | 2002-04-22 | 2003-10-30 | Hokuto Scientific Industry, Co., Ltd. | Device, method, and kit for gene detection |
-
2004
- 2004-11-18 JP JP2004334649A patent/JP2006145342A/ja active Pending
Patent Citations (1)
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| WO2003089929A1 (en) * | 2002-04-22 | 2003-10-30 | Hokuto Scientific Industry, Co., Ltd. | Device, method, and kit for gene detection |
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