JP2006342134A - 紅麹を用いた薬剤及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 紅麹菌及び紅麹由来のペプチドを有効成分とし、特に血圧上昇抑制作用、赤血球変形能低下抑制作用を有し、安全性が高く、経口投与（摂取）で有効であり、医薬品、特定保健用食品、健康食品等に使用できる薬剤及びその製造方法、その加工食品を提供すること。
【解決手段】 ジペプチドＩｌｅ−Ｔｙｒ及びＶａｌ−Ｔｒｐ、トリペプチドＶａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ、それらの塩を有効成分として含有するアンジオテンシン２変換酵素阻害剤、および、紅麹菌を製麹し、それを原料に得られた抽出物をカラムクロマトグラフィーで処理することを特徴とするその製造方法、および、前記のペプチドを産生し、赤血球変形能低下抑制作用を有する紅麹菌を原料として得られた抽出物又はその加工食品。
【選択図】 図１

Description

本発明は、紅麹菌、すなわち、天然由来のペプチドを有効成分とする医薬剤に関し、特に血圧上昇抑制作用を有する血圧上昇抑制剤及びその製造方法、及びその効果を有する医薬品、特定保健用食品、健康食品などに関する。

高血圧症の発症と高い相関性を有するアンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥという）は、主に肺や血管内皮細胞に依存し、レニンにより分解されたアンジオテンシン１に作用して、血管壁平滑筋収縮作用を有する活性ペプチドであるアンジオテンシン２を産生することにより、強い血圧上昇作用を示すことが知られている。

さらに、ＡＣＥは、降圧作用を有するブラジキニンを分解し、不活性化する作用を有する。

このように、ＡＣＥは、血圧を上昇させる作用を有するので、この酵素活性を阻害することにより血圧上昇を抑制することができると考えられている。

このようなＡＣＥ阻害活性を作用する物質は、既に数々の天然物や合成物において見出され、それらの物質のいくつかは降圧剤として実用化されている。

例えば、化学合成物質では、カプトリルが有名である。

しかし、このような化学合成物は、常に安全性の問題を考慮しなければならないという問題点がある。

一方天然成分には、乳由来のたんぱく質、植物由来のたんぱく質あるいは、魚肉たんぱく質に、様々なＡＣＥ阻害ペプチドが含まれていることが報告されている。

これら天然由来のＡＣＥ阻害物質は、低毒性で安全性の高い降圧剤として実用化が検討されている。

近年、乳酸発酵乳からのＡＣＥ阻害剤が報告されている（Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．７８：７７７−７８３，７８：１２５３−１２５７）。

また、特開平６−４０９４４号、特開平８−０９９９４号などが開示されている。

しかしながら、乳酸発酵の進行と共に、乳酸菌が産生するたんぱく質分解酵素により生じるために、発酵条件によりＡＣＥ阻害活性作用のあるトリペプチド量は変動しやすく、一定の含有量で得ることが困難である。

従って、血圧降下作用の原因物質が明らかで、工業的に安定した生産が可能であり、且つ微量の投与量において有効な安全性の高い天然物質由来の血圧降下ペプチドが望まれている。

食品由来のＡＣＥ阻害物質は、経口摂取すると、消化管内でさらに分解されるなどの作用を受けて活性が低下する場合がある。
Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．７８：７７７−７８３，７８：１２５３−１２５７ 特開平６−４０９４４号公報 特開平８−９９９９４号公報

本発明の目的は、安全性が高く、経口投与（摂取）で有効な天然物由来の医薬品、特定保健用食品、健康食品等に使用できる血圧降下剤及びその製造方法を提供することにある。

本発明は、上記の目的を達成するために、種々の研究を重ねた結果、紅麹菌の中にアンジオテンシン変換酵素阻害物質の存在が推測され、その紅麹菌中のアンジオテンシン変換酵素阻害物質を逆相分配樹脂に吸着させ、含水有機溶媒により溶出することで、高収量に得られ、簡単に濃縮することができ、そして、得られた阻害物質中の各成分について、カラムクロマトグラフィーを用いて、阻害活性の強い成分を単離し、その成分のＩＣ５０および構造解析を行ったところ、この成分がアミノ酸配列において、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ配列及びＶａｌ−Ｔｒｐ配列及びＶａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ配列のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドであることが判明し、消化耐性試験結果より、生体内での消化・吸収後においても、ＡＣＥ阻害効果が保持されることを確認したことにより、発明を完成したものである。

本発明によれば、ジペプチドＩｌｅ−Ｔｙｒと、ジペプチドＶａｌ−Ｔｒｐと、トリペプチドＶａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ及びそれらの塩を有効成分として含有するアンジオテンシン２変換酵素阻害剤が提供される。

また、本発明によれば、紅麹菌を製麹し、それを原料に得られた抽出物をカラムクロマトグラフィーで処理することにより成る上記のジペプチド及びトリペプチドの製造方法が提供される。

また、本発明によれば、上記のジペプチド及びトリペプチドを含む紅麹菌を原料として得た抽出物またはその加工食品が提供される。

また、本発明によれば、紅麹菌を用いた赤血球変形能低下抑制剤が提供される。

また、本発明によれば、上記の赤血球変形能低下抑制作用を有する紅麹菌を原料として得た抽出物またはその加工食品が提供される。

本発明のジペプチド及びトリペプチドは、前記のアミノ酸配列で示されるものであり、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｒｐ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒである。

また、その塩としては、薬理学上、許容される塩類、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩及びクエン酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、乳酸塩等の有機酸塩などが使用できる。

本発明のジペプチドの調整には、紅麹菌を原料として得られる抽出物を、例えば逆相液体カラムクロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）などの公知の方法で精製することにより得ることができる。

本発明の血圧降下剤は、ＡＣＥ阻害活性を示し血圧降下作用を有する前記のジペプチド、トリペプチド及びそれらの塩を有効成分として含有するので、人間をはじめとして、哺乳動物全般の高血圧の治療、予防に有効である。

本発明の血圧降下剤の投与（摂取）方法は、主に経口投与、静脈注射等で行うことができる。

薬剤の形態としては、乾燥粉末とした後に錠剤、顆粒製剤、カプセル製剤等として、更には液体製剤として用いることもできる。

前記ジペプチド、トリペプチド及びその塩は、それ自体を前記種々の剤形と成るように調製して使用することができるが、前記ジペプチド、トリペプチド及びその塩は、微量でも血圧降下作用を発揮するので、前記カラムクロマトグラフィー処理により得られる精製物を、そのまま、または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品内に含有させて血圧降下作用、高血圧予防の機能をもたせた機能性食品、特定保健用食品及び健康食品等として用いることができる。

本発明の赤血球変形能低下抑制剤は、血液の粘性に影響し、血栓を起きにくくする赤血球変形能低下抑制作用を有する紅麹菌を有効成分として含有するので、人間をはじめとして、哺乳動物全般の高脂血症の治療、予防に有効である。

本発明の赤血球変形能低下抑制剤の投与（摂取）方法は、主に経口投与、静脈注射等で行うことができる。

薬剤の形態としては、乾燥粉末とした後に錠剤、顆粒製剤、カプセル製剤等として、更には液体製剤として用いることもできる。

前記赤血球変形能低下抑制作用を有する紅麹菌は、それ自体を前記種々の剤形と成るように調製して使用することができるが、微量でも赤血球変形能低下抑制作用を発揮するので、そのまま、または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品内に含有させて赤血球変形能低下抑制作用、高脂血症予防の機能をもたせた機能性食品、特定保健用食品及び健康食品等として用いることができる。

本発明のＩｌｅ−Ｔｙｒ配列のジペプチド、Ｖａｌ−Ｔｒｐ配列のジペプチド、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ配列のトリペプチド及びそれらの塩は、ＡＣＥ阻害作用を有する血圧降下剤等として利用可能な安全性が高く、副作用のない新規なペプチドであり、種々の医薬品、特定保健用食品、機能性食品等への利用が期待できる。

また、消化酵素による影響がほとんどなく、生体内で消化吸収された後においてもＡＣＥ阻害効果が持続的に保持される。

また本発明による血圧上昇抑制剤は、前記ジペプチド、前記トリペプチド及びそれらの塩を有効成分として含有するので、ヒト並びに哺乳動物の血圧を有効に降下させることができる。

また有効成分であるジペプチド及びトリペプチドは、紅麹菌を原料としており、培養により容易にしかも安価に製造することができる。

また、本発明の紅麹菌を用いた赤血球変形能低下抑制剤は、高脂肪食を摂取しても赤血球変形能低下を抑制し、血中脂質の取り込みを抑制し、ヒト並びに哺乳動物の血栓を起こしにくくし、高脂血症の予防に有効である。

また、この紅麹菌を赤血球変形能低下抑制作用を有する種々の医薬品、特定保健用食品、機能性食品等への利用が期待できる。

次に本発明の実施形態について詳細に説明する。

紅麹菌は、Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓＩＦＯ４４８９を用い、培養して紅麹菌を得る。

この麹に対して３倍容の蒸留水を加え、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｉｘｅｒで５分間攪拌した後、室温にて１時間振とうし、これを遠心分離（７０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）し、得られた上清をろ過し、濾液を２０分間煮沸、再度ろ過して抽出液を得る。

この紅麹抽出液を逆相分配系樹脂をもちいたカラム内を流通させることにより、アンジオテンシン変換酵素阻害物質を吸着させ、含水アセトニトリル等の含水有機溶媒を用いて溶出させる。

この溶媒により溶出を行なう際も、吸着させた前述の阻害物質の前記溶媒による溶出を効果的に行わせるために、その溶媒を供給する前に、水の供給により、水に溶解する物質を溶出させる処理を行なうことが有効である。

含水有機溶媒により溶出させたアンジオテンシン変換酵素阻害物質は、その溶出液を、濃縮し、凍結乾燥することで、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを主体とする高血圧予防機能を有する機能性食品、特定健康食品および健康食品などの製品が粉末の形態で得られるようになる。

また、このアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを主体とする食品素材は、前述の抽出液を、高速液体クロマトグラフィーを用いて成分の単離を行ない、アセトニトリルでグラジエント溶出するなどにより、アンジオテンシン変換酵素阻害の活性の強い成分に単離精製された形態のものにし得る。

〔実施例１〕
アンジオテンシン変換酵素阻害活性について確認した。

供試菌株として、Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ ＩＦＯ４４８９を用い、試験管培地で７日間前培養を行い、三角フラスコにて７日間固体培養して紅麹を得た。

この麹（６０ｇ）に対して３培溶の蒸留水（１８０ｍｌ）を加え、室温にて１時間浸透し、抽出後、ろ過して抽出液とした。

この紅麹抽出液をＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＳＰ−８２５でエタノール濃度を０％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、７０％と変化させるステップワイズ法により溶出した。

図１に見られるように、１０％エタノール画分が最も活性が高く、タンパク量も多かったため、次のステップに用いた。

１０％エタノール画分をｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通したところ、図２に示されるような溶出パターンが得られた。

それぞれのピークを１〜５とし、活性測定とタンパク定量を行った結果、阻害活性の高い画分３画分４を得た（図３）。

これらの画分３及び４を逆相ＨＰＬＣにより精製を行った。

逆相ＨＰＬＣは、アセトニトリル（０．０５％ＴＦＡを含む）を１分間に１％上昇させるリニアグラジェントで行った。

各ピークを分取し、活性測定を行った結果、画分３では、ピーク８（化合物Ａ）、ピーク１２（化合物Ｂ）、ピーク１５（化合物Ｃ）で高いＡＥＣ阻害活性が見られた（図４）。

画分４では、ピーク１１（化合物Ｄ）、ピーク１４（化合物Ｅ）、ピーク１８（化合物Ｆ）で高いＡＥＣ阻害活性が見られた（図５）。

これらのピークを集め、再クロマトを行い、ＨＰＬＣによって均一な物質として確かめられたので、プロテインシーケンサを用いてアミノ酸配列を決定した。その結果を以下に示す。なお、化合物Ｄは、不純物が多いので除外した。

画分３ ピーク ８ 化合物Ａ Ｉｌｅ−Ｔｙｒ
画分３ ピーク１２ 化合物Ｂ Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
画分３ ピーク１５ 化合物Ｃ Ｖａｌ−Ｐｈｅ
画分４ ピーク１４ 化合物Ｅ Ｖａｌ−Ｔｒｐ
画分４ ピーク１８ 化合物Ｆ Ｉｌｅ（アミノ酸）

以上のように、同定された。上記の画分３の化合物ＣのＶａｌ−Ｐｈｅについては、すでに本願出願人が特開２００４−８３５２９で開示しているペプチドであり、画分４の化合物Ｆはアミノ酸である。

なお、この実施例ににおけるアンジオテンシン変換酵素阻害率の測定は、公知のアンジオテンシン変換酵素阻害活性測定法（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ の測定法を改良した山本等の方法）によって測定した。

また、以下の式に従い、阻害活性（％）を求めた。

ＩＣ５０値は、阻害物質がＡＣＥを５０％阻害するときの値である。

阻害率（％）＝｛（Ｃ−ＣＢ）／（Ｓ−ＳＢ）｝／（Ｃ−ＣＢ）×１００
Ｓ：サンプルの吸光値，Ｃ：コントロール（緩衝液）の吸光値
ＳＢ：サンプルブランクの吸光値、ＣＢ：コントロールブランクの吸光値

〔実施例２〕
アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを精製した。

紅麹菌３ｋｇを原料とし、その３倍溶の蒸留水９リットルを加え、２時間振とうして抽出させ、ろ過して抽出液を得た。

この抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーに供給し、吸着を行わせ、次いで３リットルの含水アセトニトリルにてアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを溶出させた。

ここで用いた逆相樹脂はコスモシール５Ｃ１８−ＡＲ３００（ナカライテスク社製）を用いた。

〔実施例３〕
実施例１で得られた紅麹由来ペプチドの生体内での消長を予測するために、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンを用いた消化耐性試験を行った。

その結果を下記に示す。
ＩＣ５０（μＭ）
消化前 消化後
化合物Ａ Ｉｌｅ−Ｔｙｒ ３．９９ ３．７４
化合物Ｂ Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ ２１．９８ １９．２５
化合物Ｃ Ｖａｌ−Ｐｈｅ ４９．６９ ５１．２４
化合物Ｅ Ｖａｌ−Ｔｒｐ ３．１２ ４．４９

この結果より、生体内で吸収された後でもＡＣＥ阻害効果が維持されることが確認された。

〔実施例４〕
紅麹菌の赤血球変形能低下抑作用について調べた。

高脂血症を誘引するコレステロール１％、バター１５％を含む高脂肪食をマウスに摂取させ、紅麹標品を毎日４週間経口ゾンデで投与した時に、マウスの赤血球の変形能について調べた。

２週間、オリエンタル酵母社の粉末飼料ＭＦで飼育した後、コレステロール１％、バター１５％、ＭＦ飼料８４％の高脂肪食飼料ＨＦＦを自由摂取させた。

マウスは１群５匹で、３群（紅麹群、超音波処理群、コントロール群）で行った。

各群の経口投与は以下のとおりで、４週間行った。

１）紅麹群
紅麹３ｇを３０ｍｌの生理食塩水に懸濁して、一匹当たり０．５ｍｌづつ経口ゾンデで投与した。
２）超音波処理群
紅麹３ｇを３０ｍｌの生理食塩水に懸濁後、超音波を１０分間かけたものを、一匹当たり０．５ｍｌづつ経口ゾンデで投与した。
３）コントロール群
生理食塩水を、一匹当たり０．５ｍｌづつ経口ゾンデで投与した。

４週間後、マウスの血液を採血し、赤血球の変形能を測定した。

赤血球の変形能は、赤血球を高粘度溶液に懸濁してニュートン流体に近似させ、オランダのＭｅｃｈａｔｒｏｎｉｃｓ社製 Ｌａｓｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｏｐｉｔｉｃａｌ Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＬＯＲＣＡ）で測定した。

その結果を図６に示す。

図は、赤血球のＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ、変形能のデータを示す。

図から、生理食塩水投与群（コントロール群）では赤血球の変形能が減少しているが、紅麹群と超音波処理群では、せん断応力（Ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ）が増すと変形能は改善して上昇している。

超音波処理により吸収力を高めることが好ましい。

〔実施例５〕
実施例１で得た抽出液５０ｃｃに、ラクトース ９０ｇと、コーンスターチ １７ｇとを混合し、この混合物を予めコーンスターチ７ｇから調整したペーストとともに顆粒化した。

得られた顆粒にステアリン酸マグネシウム １ｇを加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して、１錠あたりアンジオテンシン変換酵素阻害作用成分を５０ｍｇ含有する錠剤１０００個を製造した。

〔実施例６〕
実施例１で得た抽出液の２０％水溶液２００ｇ、酢酸トコフェロール５ｇ、硝酸チアミン１０ｇ、ニコチン酸アミド２０ｇ、無水カフェイン５０ｇ、安息香酸塩及び香料適量に脱イオン水を加えて３０Ｌとし、殺菌した後３０ｍｌずつ無菌的にビンに充填して、内用液剤を製造した。

〔実施例７〕
生の紅麹３５００ｇを恒温器（ＥＹＥＬＡ社製 ＷＦＯ−６０１ＳＤ）を用いて、６０℃で８時間乾燥させ、水分量を８％以下とした。

乾燥させた紅麹を粉砕器（Ｒｅｔｓｃｈ社製 ＳＫ１００／Ｃｒｏｓｔｆｒｅｉ）で０．２９３μｍメッシュを通して、紅麹パウダー２４００ｇを得た。

〔実施例８〕
うるち米を白米と同様に炊き上げ、７０℃まで冷まし、熱湯殺菌した瓶の中に、ごはん１００ｇ、黄麹９５ｇ、紅麹５ｇ、６０℃の湯１００ｇを入れ、軽くかき混ぜる。

６０℃の保温器で８時間発酵させ、甘酒のもとを得た。

この甘酒のもとに火入れして発酵を停止させ、水を加えて２倍希釈し、ミキサーでペースト状にし、鮮やかな紅色とほのかな麹の香りがする紅麹甘酒を得た。

〔実施例９〕
大豆１ｋｇを煮上げ、煮汁を３００ｃｃとり、種水とし、大豆をすり潰す。

甕の底に種味噌１２５ｇを敷く。

黄麹９００ｇ、紅麹１００ｇ、仕込み用粗塩４９０ｇを混合し、潰した大豆と種味噌１２５ｇと加え、種水で調整しながら、混ぜ合わせる。

これを甕に詰めて熟成させ、４ｋｇの紅麹味噌を得た。

〔実施例１０〕
強力粉１２５ｇ、ドライイースト４ｇ、砂糖２０ｇ、上記実施例７で得られた紅麹パウダー２５ｇとを混合し、水１６０ｃｃと混ぜ合わせる。

さらに強力粉１００ｇ、塩３．３ｇ、バター２５ｇを加えて混ぜ、グルテンの膜がはるまで良くこねる。

生地を丸めて４０℃で３０分間ねかせ、一次発酵させる。

濡れ布巾をかけ、１０分間やすませる。

再び４０℃で３０分間、二次発酵させる。

オーブンで１５分焼いた。

鮮やかな紅色とほのかな麹の香りがする紅麹パンを得た。

〔実施例１１〕
重曹小さじ１、塩５ｇ、卵１個を混ぜ合わせかん水とした。

強力粉３６０ｇと紅麹パウダー４ｇに前記のかん水を加えながら十分にこねる。

２時間室温でねかせる。

片栗粉３５ｇを打ち粉にし、めん棒でのばし、生地を折りたたみ等間隔に切った。

鮮やかな紅色とほのかな麹の香りがする紅麹沖縄そばの麺を得た。

以上のように、本発明のペプチド、その塩及び紅麹菌を用いて、各種の医薬品、特定保健用食品、健康食品を製造することができる。

紅麹抽出液の溶出エタノール濃度によるＡＣＥ活性とタンパク量の比較表を示す図である。 １０％エタノール画分の溶出パターンを示すクロマトグラフの図である。 １０％エタノール画分の溶出パターンにおけるピーク時のＡＣＥ活性とタンパク量の比較表を示す図である。 画分３の逆相ＨＰＬＣ結果のクロマトグラフを示す図である。 画分４の逆相ＨＰＬＣ結果のクロマトグラフを示す図である。 紅麹菌標品の経口投与による赤血球変形能の変化を示す図である。

Claims (7)

1. Ｉｌｅ−Ｔｙｒ配列のジペプチド及びその塩を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
2. Ｖａｌ−Ｔｒｐ配列のジペプチド及びその塩を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
3. Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ配列のトリペプチド及びその塩を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
4. 紅麹を製麹し、それを原料に得られた抽出物をカラムクロマトグラフィー処理することにより成る請求項１から請求項３までのいずれかの項に記載のペプチドの製造方法。
5. 請求項１から請求項３までのいずれかの項に記載のペプチドを生産する紅麹菌を原料として得られた抽出物または、その加工食品。
6. 紅麹菌を用いた赤血球変形能低下抑制剤。
7. 請求項６に記載の紅麹菌を原料として得られた抽出物または、その加工食品。