JP2014132012A - Ｔｒｐ含有ペプチド - Google Patents

Abstract

【課題】 大豆蛋白質のプロテアーゼで処理による処理液（分解液）中の、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を除去した、溶液におけるエタノール溶解分の成分を明らかにし、さらにはその有益性を明らかにすることを目的とする。
【解決手段】 大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、不溶の疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を除去した水溶液から調製されたペプチドが、特定のアミノ酸配列を有するＴｒｐ含有ポリペプチドであって、アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性とヒト赤血球変形能低下抑制作用を有するもので、薬効性組成物とし、健康食品や医薬の原料として利用され、大豆の用途を大とするものである。
【選択図】 図１

Description

この発明は、大豆蛋白質から調製された特定の機能を有するトリプトファン（Ｔｒｐ）含有ペプチドに関するものであって、新規なペプチドおよび蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）によるペプチド調製技術に属するものである。

大豆は、植物性蛋白質の供給源として広く知られ、かつ広汎に利用されている。
この大豆蛋白質をより有効に利用するために、蛋白質を分離し、さらには、酵素により分解して、有用なアミノ酸やペプチドを得ることが幅広く行われてきている。

例えば、特開２００５−１３９１５８号公報（特許文献１）においては、大豆醗酵物を蛋白質分解酵素で処理し、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する、生体内での血圧降下作用を有し、毒性が極めて低い、新規なヘキサペプチドが得られたことが報告されている。

また、特開２００６−２２３１３８号公報（特許文献２）においては、全脂大豆の水溶液を、蛋白質分解酵素を用いて加水分解した後、セルロース系ろ過助剤を添加して不水溶性物質を分離除去することによって、苦みや大豆臭がなく、低分子のペプチドが多い組成物で、消化吸収能力の衰えた老人や、病人の栄養補給用飲料や、激しい運動後に適用される、スポーツドリンクに効果的に使用される組成物が得られることが報告されている。

さらに、特開２００６−２６５１３９号公報（特許文献３）においては、大豆中の微量蛋白質である大豆ホエー蛋白質を基質にして、蛋白質分解酵素を用いて分解することによって得られた特定のトリペプチドが、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下剤としての医薬や、血圧を降下させ、高血圧の予防や改善に適した特定保健用食品に用いられる、との報告がなされている。

このような大豆蛋白質の開発状況下において、本願の発明者等も、先に、大豆蛋白質の構造に示唆されて試験を行い、大豆蛋白質からグルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドを得ることに成功し、それらの取得方法について、国際公開番号ＷＯ２００５／００１１０６号公報（特許文献４）で報告した。

特開２００５−１３９１５８号公報 特開２００６−２２３１３８号公報 特開２００６−２６５１３９号公報 国際公開番号ＷＯ２００５／００１１０６号公報

前記特許文献４において開示された、グルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドの取得方法は、大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を沈殿として除去し、残りの溶液（分解液）にエタノールを添加して、沈殿画分を得たのち、前記沈殿画分を乾燥するというものである。

発明者等は、前記エタノール不溶解分が、グルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドから形成されていることを見出し、前記報告をなした。
その際、検討の対象から外された、エタノール溶解分に、低分子のペプチドなどで有益な成分が存在するのでないかと推定し、エタノール溶解分の成分を明らかにし、さらにはその有益性を明らかにすることを目的として研究を行った。

その結果、本願の発明者等は、前記エタノール溶解分が特定の生理活性を有すること、さらには、前記生理活性は、疎水性アミノ酸の豊富な、未分解の高分子画分を除去した大豆蛋白質のプロテアーゼ処理液、特にその分画物により奏されることを見出し、その分画物について検討を行い、この発明を完成させたものである。

すなわち、この発明の請求項１に記載のＴｒｐ含有ペプチドは、
Ｉｌｅ−Ｔｒｐ又はＶａｌ−Ｔｒｐのアミノ酸配列を有すること
を特徴とするものである。

この発明の請求項２に記載の発明は、
請求項１に記載のＴｒｐ含有ペプチドは、
アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有すること
を特徴とするものである。

この発明の請求項３に記載発明は、
請求項１又は２に記載のＴｒｐ含有ペプチドは、
ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有すること
を特徴とするものである。

この発明の請求項４に記載発明は、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記Ｔｒｐ含有ペプチドは、
大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、不溶の疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を除去した水溶液から調製されたこと
を特徴とするものである。

この発明の請求項５に記載の発明は、
請求項４に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記プロテアーゼ処理は、
アルカリ域を保持しながら、基質特性の低いプロテアーゼで行う加水分解処理であること
を特徴とするものである。

この発明の請求項６に記載の発明は、
請求項４又は５に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記未分解の高分子画分の沈殿除去は、
酸性ｐＨ調節及び／又はエタノールの添加により行われること
を特徴とするものである。

この発明の請求項７に記載の発明は、
請求項４〜６のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記Ｔｒｐ含有ペプチドは、
前記調製において、１％酢酸水溶液に不溶な物質が除去されていること
を特徴とするものである。

この発明の請求項８に記載の発明は、
請求項４〜７のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記Ｔｒｐ含有ペプチドは、
前記調製において、ゲル濾過および高速液体クロマトグラフィーによる精製が行なわれていること
を特徴とするものである。

なお、この発明には、別の形態として、下記の発明が含まれる。
（１）下記アミノ酸配列の、いずれかのアミノ酸配列を有すること
を特徴とするＴｒｐ含有ペプチド。
記
１） Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
２） Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
３） Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
４） Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
５） Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
６） Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
７） Ａｌａ−Ｔｒｐ
８） Ｖａｌ−Ｔｒｐ
９） Ｉｌｅ−Ｔｒｐ
１０） Ｌｅｕ−Ｔｒｐ
１１） Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
１２） Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
１３） Ｇｌｕ−Ｔｒｐ
１４） Ｔｒｐ−Ｍｅｔ
１５） Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
１６） Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ

（２）アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有し、
下記アミノ酸配列の、いずれかのアミノ酸配列を有すること
を特徴とするＴｒｐ含有ペプチド。
記
１） Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
２） Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
３） Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
４） Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ
５） Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
６） Ａｌａ−Ｔｒｐ
７） Ｖａｌ−Ｔｒｐ
８） Ｉｌｅ−Ｔｒｐ
９） Ｌｅｕ−Ｔｒｐ
１０） Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
１１） Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
１２） Ｇｌｕ−Ｔｒｐ
１３） Ｔｒｐ−Ｍｅｔ
１４） Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ

（３）ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有し、
下記アミノ酸配列の、いずれかのアミノ酸配列を有すること
を特徴とするＴｒｐ含有ペプチド。
記
１） Ａｌａ−Ｔｒｐ
２） Ｖａｌ−Ｔｒｐ
３） Ｉｌｅ−Ｔｒｐ
４） Ｌｅｕ−Ｔｒｐ
５） Ｓｅｒ−Ｔｒｐ
６） Ｇｌｙ−Ｔｒｐ

（４）上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記Ｔｒｐ含有ペプチドは、
大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、不溶の疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を除去した水溶液から調製されたこと
を特徴とするもの。

（５）上記（４）に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記プロテアーゼ処理は、
アルカリ域を保持しながら、基質特性の低いプロテアーゼで行う加水分解処理であること
を特徴とするもの。

（６）上記（４）又は（５）に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記未分解の高分子画分の沈殿除去は、
酸性ｐＨ調節及び／又はエタノールの添加により行われること
を特徴とするもの。

（７）上記（４）〜（６）のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記Ｔｒｐ含有ペプチドは、
前記調製において、１％酢酸水溶液に不溶な物質が除去されていること
を特徴とするもの。

（８）上記（４）〜（７）のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチドにおいて、
前記Ｔｒｐ含有ペプチドは、
前記調製において、ゲル濾過および高速液体クロマトグラフィーによる精製が行なわれていること
を特徴とするもの。

この発明にかかるＴｒｐ含有ペプチドは、酸化ストレスによる赤血球変形能の低下の防止、高血圧の予防や改善に適したものであって、血圧降下剤としての医薬や、血圧を降下させ、高血圧の予防や改善に適した特定保健用食品や健康食品の素材として有効なものである。
さらに、医薬の原料として、有効に利用されることができるものである。

さらにまた、この発明のＴｒｐ含有ペプチドは、粉末状態でも、水又はエタノール溶液としても使用することができる。
したがって、前記のような効果を発現させるために、健康食品や医薬として利用する際に、効率的に、また効果的に活用することを可能とするものである。

以上のように、この発明のＴｒｐ含有ペプチドによれば、大豆をさらに有効に活用することができるという優れた効果を奏するのである。

実施例１で得られたペプチド組成物の、ゲルろ過パターン図である。 実施例１で得られたペプチド組成物の、ゲルろ過により分画した画分１及び２のゲルろ過パターン図である。 前記画分１を分画して得られた画分１−４，画分１−５の、ＨＰＬＣのチャートと紫外吸収スペクトル図である。 前記画分１を分画して得られた画分１−６，画分１−７の、ＨＰＬＣのチャートと紫外吸収スペクトル図である。 前記画分２を分画して得られた画分２−４，画分２−５の、ＨＰＬＣのチャートと紫外吸収スペクトル図である。 精製されたＴｒｐ含有ペプチドの、赤血球変形能低下抑制作用の測定結果を 示す図である。

この発明の特定構造のＴｒｐ含有ペプチドは、大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、不溶の疎水性アミノ酸の豊富な、未分解の高分子画分を除去した水溶液から調製されるものである。
前記プロテアーゼ処理は、アルカリ域を保持しながら、基質特性の低いプロテアーゼで加水分解することが好ましい。
また、未分解高分子画分の除去は、水溶液のアルカリ状態を維持しながら行うことが好ましい。

水溶液としては、特許文献４で報告したように、グルタミンとグルタミン酸の豊富な水溶性の高分子量ポリペプチドを取得するために、エタノールを添加して、それらを不溶解物として取得した後の水溶液とすることもできる。
それにより、グルタミンとグルタミン酸の豊富な高分子量ポリペプチドと、Ｔｒｐ含有ペプチドが分離取得できるため好ましい方法である。

この発明に用いる大豆蛋白原料としては、分離大豆蛋白質や脱脂豆乳が好ましいが、脱脂大豆でも用いることができる。
しかしながら、脱脂大豆の場合は、蛋白質以外の成分を多量に含むため、プロテアーゼによる分解度が悪い。
また、プロテアーゼによる酵素処理は、大豆蛋白原料に水を加えて攪拌し、ｐＨをアルカリ領域に調節した後、プロテアーゼを加えることにより行う。
その際、蛋白質は、完全に溶解させる必要はなく（分解中に溶解する）、加える水の量は、蛋白原料の５〜２０倍、好ましくは９〜１０倍がよい。

この発明に用いるプロテアーゼとしては、アルカリ側に最適ｐＨを持ち、高温で安定であって、ほとんどのペプチド結合を分解できる、基質特異性の低いプロテアーゼが好ましい。
具体的には、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）由来の、アルカリプロテアーゼであるビオブラーゼなどを用いることができる。

大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理する際には、プロテアーゼ処理を、アルカリ域を保持しながら、基質特異性の低いプロテアーゼで加水分解することが好ましい。
通常、大豆蛋白をアルカリ域で酵素分解すると、加水分解が進むにつれてｐＨが低下し微酸性域に移行してしまう。
しかしながら、この発明においては、アルカリ域を保ちながら酵素分解することによって、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分の除去が容易に行なわれ、目的のＴｒｐ含有ペプチドを得ることが出来る。
なお、微酸性域に移行したままで酵素分解を続けると、アミノ酸にまで加水分解され、この発明の目的を達成することが困難となる。

かかるアルカリ域としては、ｐＨ７．５〜１０、好ましくはｐＨ８〜９．５、より好ましくはｐＨ８．５〜９．０が適当である。
このｐＨ調節には、苛性ソーダ溶液などのアルカリ金属水酸化物を用いることもできるが、アンモニア溶液（例えば５％水溶液）などの有機アルカリを用いることができる。
例えば、アンモニア溶液を用いると、高濃度を使用できるので緩衝能が大きく、ｐＨ調節の頻度が少なくて済むことに加え、分解後の減圧濃縮によって分解液から容易に除去でき、中和による塩の生成を避けることができる。

プロテアーゼ分解の温度は、分解過程における雑菌による汚染を避けるため、高い方が望ましい。
例えば、ビオブラーゼの場合、ｐＨ９で安定である温度４５〜５５℃を用いることが好適である。
分解時間としては、分解によるｐＨの低下が無くなるまで行うことが好ましい。
大豆蛋白原料に対して１／１００重量の酵素を用いた場合、１５〜２０時間とすることができる。

この酵素分解によって、大部分の蛋白質が、小さいペプチドにまで分解される。
しかしながら、大豆蛋白質中に存在する疎水性アミノ酸に富む固い高次構造部分は、分解され難く、分子量の大きいポリペプチドとして残存する。
したがって、目的とする分子量の小さいペプチドと、分別することができる。
すなわち、疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を沈殿として除去することができる。
この未分解高分子画分の沈殿除去は、前記したように、酸性ｐＨ調節、さらにはエタノールの添加によって、より確実に行うことができる。
また、グルタミンとグルタミン酸の豊富な高分子量ポリペプチドと、Ｔｒｐ含有ペプチドが分離取得できるため、好ましい方法である。

未分解の疎水性高分子ポリペプチドを、沈殿させる酸性ｐＨ調節は、大豆蛋白の等電点近傍にすることが好ましく、例えば、ｐＨ３．５〜５．５、好ましくはｐＨ４．０〜５．０が適当である。
沈殿の程度は、用いる蛋白原料（例えば、分離大豆蛋白、濃縮大豆蛋白、豆乳、脱脂大豆など）により異なる。
大豆蛋白の割合が低くなるほど沈殿度が悪くなるため、この場合は、さらにエタノール添加して除去することが好ましい。

エタノール添加により沈殿物と溶液を分別する場合、未分解の疎水性高分子ポリペプチドを沈殿させるエタノール濃度は、ｐＨによって異なる。
中性の場合は、酸性の場合より高いエタノール濃度を必要とする。
中和した分解液にエタノールを加える場合、５０％エタノール濃度までの低い濃度で殆ど沈殿するので、エタノールの濃度は５０％以下とすることができる。
大豆蛋白の割合が高い分離大豆蛋白を用いる場合で、かつ等電点付近であれば、アルコールは殆ど必要としない。
等電点以外でも、大豆蛋白の割合の高い分離大豆蛋白を用いる場合、エタノール濃度は２０％〜５０％で、未分解の疎水性高分子ポリペプチドを沈殿させることができる。

未分解の疎水性高分子ポリペプチドを除去した溶液に、さらにエタノールを加えると、高Ｇｌｘ含有ポリペプチドを沈殿させ、グルタミンとグルタミン酸の豊富な高分子量ポリペプチドとＴｒｐ含有ペプチド組成物が分離取得できる。
その際、Ｔｒｐ含有ペプチドのみを目的とする場合には、工程の増加とエタノールの量の増加によるポリペプチドの純度が低下するため好ましい方法ではない。

このようにして得られたＴｒｐ含有ペプチド組成物は、ゲルろ過及び高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）で精製され、Ｔｒｐ含有ペプチドが取得される。
ゲルろ過剤としては、Ｂｉｏ ＧｅｌＰ−１０やＰ−２などを用いることができる。

＜ペプチドの調製１＞
分離大豆蛋白質（ＳＰＩ；不二製油（株）製「フジプローＲ」）３００ｇに、脱イオン水を加えて３ｌとし、ホモジネートしたのち、５％アンモニア溶液でpＨ９に調節した。
それに、ビオプラーゼ６ｇを加え、攪拌しながら恒温槽中、温度５０℃で２０時間、pＨを調節しながらインキュベートした。
得られたpＨ８．３６の分解液を、遠心分離（８０００ｒｐｍ×１０分）して得られた上清を、減圧濃縮後凍結乾燥して、ペプチド組成物２４１ｇを得た。

＜ペプチド組成物の分画・精製＞
上記で得られたペプチド組成物２ｇに、１％酢酸１０ｍｌを加えて溶解したのち、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ×１０分）して得られた上清を、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ−１０カラム（３×３７ｃｍ）に供し、１％酢酸水溶液で展開し、分画した。
その際の、ゲルろ過パターンを図１に示す。

このゲルろ過パターンにおいて、その溶出位置と吸光度曲線から、管数２２０〜２９７の領域に、Ｔｒｐ含有ペプチドが溶出していると推測した。
そこで、この領域を画分１（管数２２０〜２６０）と、画分２（管数２６１〜２９７）の２つに分画し、それらを、さらにＢｉｏＧｅｌ Ｐ−２カラム（１．５×７０ｃｍ）に供し、１％酢酸水溶液で展開し、分画した。
その際の、ゲルろ過パターンを図２に示す。

前記画分１及び画分２を再分画して得られた、画分１−４〜１−７及び２−４、２−５について、ＨＰＬＣによる分離を行った。
そのチャートと、分離したピーク成分の紫外吸収スペクトルを、併せて図３〜図５に示す。

＜ペプチドの同定＞
精製したペプチドのアミノ酸配列を、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロティンシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定した結果は、下記表１の通りであった。
また、１−６ｄのペプチド（Ｌｅｕ−Ｔｒｐ）のプロティンシークエンサーのデータは、表２に示される通りで、他のペプチドのデータも同様なものであった。

＜ペプチド画分及び精製ペプチドの特性評価＞
上記精製で得られた８種のＴｒｐ含有（ジ）ペプチドについて、以下に示した方法で、赤血球変形能低下抑制作用を測定し、その結果を図６に示す。
図から明らかなように、Ｔｒｐ含有（ジ）ペプチドの赤血球変形能低下抑制作用は、ペプチドの構造によって異なり、ＩＷとＬＷが強い抑制作用を有することが分かった。

５０ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度の精製Ｔｒｐ含有ペプチドを用い、以下に示した方法で、ＡＣＥ阻害活性を調べた結果、表２に示すように、阻害度は、ペプチドによって大きく異なった。
阻害度の高い８種について、阻害活性（ＩＣ_５０）を測定した結果、ＩＷ、ＶＷ、ＬＷは特に強いＡＣＥ阻害活性を有することが分かった。

＜特性評価方法＞
−ＡＣＥ阻害活性測定方法（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ変法）−
ＡＣＥ（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３．４．１５．１）と、合成基質ヒプリル−ヒスチジル−ロイシン（ペプチド研究所製）を用い、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎの測定法を改良した山本等の方法に準じて測定した。
すなわち、生成した馬尿酸を酢酸エチルにて抽出し２２５ｎｍの吸光度で測定した。
被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＥｂとして、次式から阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
ＡＣＥ阻害剤の阻害活性ＩＣ_５０値は、ＡＣＥの酵素活性を５０％（阻害率）阻害するために必要な試料の濃度（Ｍ）で示した。

−赤血球変形能低下抑制作用測定法−
３．８％クエン酸ソーダ溶液を含む、採血管に採血した血液を２５００ｒｐｍ×１０分遠心分離して赤血球を沈殿させた後、洗浄し、ＨＥＰＥＳを加え、６．０％赤血球浮遊液を調製した。
この６．０％赤血球浮遊液にＨＥＰＥＳを加え、温度３７．０℃で予備インキュベートしたのち、ＡＡＰＨ溶液（酸化ストレス物質）、ＡＡＰＨ溶液と測定試料をそれぞれ添加し、温度３７．０℃で４５分インキュベートした。
その後、測定するまで氷冷し、測定は、温度２５．０℃で７分、再度インキュベートしてから行った。
なお、赤血球変形能は、従来の定量性と再現性に難点のある微細孔（ｎｕｃｌｅｉｐｏｒｅ）フィルターを用いた方法に代わるものとして、発明者が開発したフィルター特性が顕著に改善された、ニッケルメッシュ（ｎｉｃｋｅｌｍｅｓｈ）フィルターを用いる方法で測定した。

この発明のＴｒｐ含有ペプチドは、前記のような優れた特性を有し、粉末ないし水、酢酸またはエタノールの無毒の溶媒溶液として供給可能な抗酸化性成分であって、大豆から容易に得られることができるため、健康食品産業や医薬業界で広く利用される可能性の高いものである。

（配列表）

Claims (8)

1. Ｉｌｅ−Ｔｒｐ又はＶａｌ−Ｔｒｐのアミノ酸配列を有すること
   を特徴とするＴｒｐ含有ペプチド。
2. アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性を有すること
   を特徴とする請求項１に記載のＴｒｐ含有ペプチド。
3. ヒト赤血球変形能低下抑制作用を有すること
   を特徴とする請求項１又は２に記載のＴｒｐ含有ペプチド。
4. 前記Ｔｒｐ含有ペプチドは、
   大豆蛋白原料をプロテアーゼで処理し、不溶の疎水性アミノ酸の豊富な未分解の高分子画分を除去した水溶液から調製されたこと
   を特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチド。
5. 前記プロテアーゼ処理は、
   アルカリ域を保持しながら、基質特性の低いプロテアーゼで行う加水分解処理である
   こと
   を特徴とする請求項４に記載のＴｒｐ含有ペプチド。
6. 前記未分解の高分子画分の沈殿除去は、
   酸性ｐＨ調節及び／又はエタノールの添加により行われること
   を特徴とする請求項４又は５に記載のＴｒｐ含有ペプチド。
7. 前記Ｔｒｐ含有ペプチドは、
   前記調製において、１％酢酸水溶液に不溶な物質が除去されていること
   を特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチド。
8. 前記Ｔｒｐ含有ペプチドは、
   前記調製において、ゲル濾過および高速液体クロマトグラフィーによる精製が行なわれていること
   を特徴とする請求項４〜７のいずれか１項に記載のＴｒｐ含有ペプチド。