JP2007178331A - チップ上におけるリン酸化の新規な検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】簡便で特異性に優れ、ハイスループット解析も可能である、種々のプロテインキナーゼにおける活性を網羅的にプロファイリングできる方法を提供する。
【解決手段】基板上におけるペプチドもしくは蛋白質のリン酸化を検出する方法であって、リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質をβ脱離させた後、例えばチオール基で修飾された蛍光物質を作用させることによるマイケル付加を行うことを特徴とするリン酸化検出方法。
【選択図】図1

Description

本発明は、新規なＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化を検出する方法に関する。より詳細には、ガラスのような基板上にプロテインキナーゼの基質となるペプチドもしくは蛋白質を固定化させてアレイ上において、リン酸化されたセリン残基もしくはスレオニン残基をβ脱離させた後に、マイケル付加反応の可能な蛍光性物質を用いることにより、リン酸化されたペプチドもしく蛋白質を検出する方法に関する。

近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるためのバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。例えば、シグナル伝達経路に関わる様々な種類のプロテインキナーゼの基質を基板上に固定化し、プロテインキナーゼの活性を蛍光物質もしくは放射性物質で検出する技術がある。この技術によりプロテインキナーゼとその候補となる基質を１対１（一種類ずつ混ぜて）反応させていた従来の方法では難しい網羅的な解析を可能とし、より効率的にプロテインキナーゼの活性をプロファイリングすることができる。しかし、その一方で基板上への生体分子の固定化は、様々な作製段階で操作的な困難さがあり、また検出感度にもまだまだ改良する余地が残っているのが現状である。

既に報告されている関連技術として、例えばＳＰＯＴ技術によりセルロースメンブラン上で直接ペプチドを合成し、その後チップ上に固定化する技術が知られている。この技術を利用して、ｐ６０チロシンキナーゼの基質をチップ上に固定化し、蛍光物質もしくは放射性物質を用いてキナーゼ活性を評価したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、同様の技術で作製されたペプチドアレイを用いて、プロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡと示すこともある。）やＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄキナーゼ６（ＮＥＫ６）などの活性を、放射性物質を用いてアッセイしたことについての報告（例えば、非特許文献２及び３参照）もある。その他、アビジンでコートした基板上にビオチン結合したペプチドを固定化し、ＰＫＡ活性を検討した例（例えば、非特許文献４参照）もある。しかしながら、上記いずれの方法においても、検出の際のバックグラウンドがスポットを観察する上で悪影響し、その低減が大きな課題となっている。更には、放射性物質を用いる方法が主流であることから、その安全性の問題はもとより専用施設を設置する必要性もあり、限られた研究機関でしか実施できないという問題がある。あるいは抗体を用いる方法の場合には、そのコストや要求特性が十分でないなどの課題があり、必ずしも満足なものであるとは言い難いのが実情である。
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３，３１５，２００２ Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ． ４３，２６７１，２００４ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １，２７，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７７，２７８３９，２００２

本発明の目的は、簡便で特異性にも優れ、アレイを用いることによりハイスループット化も可能であるような、種々のプロテインキナーゼにおける活性を網羅的にプロファイリングできる方法を確立しようとするものである。

本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、プロテインキナーゼの基質となるペプチドもしくは蛋白質をβ脱離させた後のマイケル反応を応用することが種々のプロテインキナーゼ活性を網羅的に解析する上で極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
（１）基板上におけるペプチドもしくは蛋白質のセリンもしくはスレオニン残基の側鎖水酸基のリン酸化を検出する方法であって、リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質のセリンもしくはスレオニン残基の側鎖水酸基をβ脱離させた後、マイケル付加を行うことを特徴とするリン酸化検出方法。
（２）マイケル付加反応において、チオール基を有する化合物を作用させることを特徴とする（１）に記載のリン酸化検出方法。
（３）チオール基を有する化合物として、蛍光修飾されたチオール基含有化合物を用いることを特徴とする（１）又は（２）に記載のリン酸化検出方法。
（４）チオール基を有する化合物として、蛍光修飾されたチオール基含有アビジンもしくは蛍光修飾されたチオール基含有ストレプトアビジンを用いることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
（５）マイケル付加反応において、ビオチン修飾されたチオール基含有化合物を使用し、マイケル付加生成物と蛍光修飾されたアビジンもしくはストレプトアビジンをさらに反応させることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
（６）ビオチン修飾されたチオール基含有化合物が、一方の末端にチオール基、他方の末端にビオチン基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする（５）に記載のリン酸化検出方法。
（７）ビオチン修飾されたチオール基含有化合物が、式（Ｉ）に示す構造式（式中、ｎは１〜３０の整数を示す）を有する化合物であることを特徴とする（５）又は（６）に記載のリン酸化検出方法。

（８）マイケル付加反応において、ビオチン化されたチオール基含有化合物と蛍光修飾されたアビジンもしくはストレプトアビジンとの複合体を用いることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
（９）基板がガラスであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
（１０）基板表面が金であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
（１１）末端にシステイン残基の付加されているペプチドが固定化されてなることを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
（１２）アミノ酸残基数が３０以下であるペプチドが固定化されてなることを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
（１３）キナーゼによりリン酸化され得るセリンもしくはスレオニン残基を有するペプチドもしくは蛋白質からなる基質を固定化したアレイ、塩基およびマイケル付加試薬を有するキナーゼによるリン酸化検出用のキット。

本発明は、安全でかつ簡便な操作により、特異性や感度の点でも非常に優れたＯｎ−ｃｈｉｐでのリン酸化の検出方法を提供することができるものである。アレイでの解析を行うことにより、ハイスループット化への対応も可能である点でも有用である。特に製薬業界に対して、キナーゼ阻害剤などの新規な創薬スクリーニングのための評価系として非常に有用なものとして期待される。

図１に、本発明におけるリン酸化検出に関する反応系の原理を示した。本発明は、まずセリン残基もしくはスレオニン残基のリン酸化されているペプチドもしくは蛋白質をβ脱離させた後、マイケル付加を行うことを特徴としている。リン酸化されているセリン残基もしくはスレオニン残基は塩基性条件下で容易にリン酸基が脱離して不飽和カルボニルが生成する。したがって、このβ脱離は通常アルカリ溶液により処理することにより進行される。塩基としては、アルカリ金属水酸化物(水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム等)、アルカリ金属炭酸塩(炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等)、有機塩基(ジアザビシクロウンデセン(DBU))、水酸化バリウムなどが挙げられ、アルカリ金属水酸化物が特に好ましい。具体的には０．０１〜１．０規定、好ましくは０．１〜０．５規定濃度の水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムなどの溶液が好適に用いられる。該アルカリ溶液は水溶液であってもよいが、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような水溶性の有機溶媒が混在していてもよい。反応温度は室温付近が好ましく、具体的には２５〜４０℃程度である。反応時間は３０〜１２０分程度が好ましく、６０〜９０分程度がより好ましい。

上述のように生成されたα、β−不飽和カルボニルはマイケル付加反応の受容体となりうる。マイケル付加の可能な化合物としては、例えばチオール基を有する化合物が挙げられる。したがって、蛍光発色団にチオール基を修飾させたもの（図1中の「Ｓ−蛍光団」） を作用させることにより、セリン残基もしくはスレオニン残基のリン酸化されているペプチドもしくは蛋白質において特異的に蛍光発色を確認することができ、リン酸化を検出することができる。本発明は、この原理を、ハイスループット解析に対応しやすいアレイでの解析系に応用したものである。この反応原理を利用することにより、様々な検出系を構築することができる。

マイケル付加反応とは、α，β−不飽和カルボニル化合物に対して求核剤が１，４−付加する反応である。エチレンのような通常のアルケンは一般的には求核剤との反応は起こらないが、アクリル酸メチルのように、電子求引性基によって（求核攻撃に対して）活性化されたアルケンは、グリニャール試薬やエノラートのような求核剤と反応することが可能である。同様に、電子求引性基であるニトロ基やシアノ基の結合したビニル化合物についても同様の反応が起こる。一般のカルボニル化合物と求核剤との反応では、求核剤がカルボニル炭素に対して求核攻撃するが、マイケル付加反応においては、求核剤の付加はカルボニルとの共鳴によりδ−となったβ位の炭素に対して起こり、求核剤上にあった負電荷は酸素へと移る。

本発明において用いられるアレイの基板としては、ガラスが最も一般的で好ましいが、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類も挙げることができる。透明な基板が好ましい。透明なガラスは容易に入手しやすく、汎用性の点でも有利である。ガラス基板を用いる場合、ガラスの種類や基板の厚さは特に限定されるものではないが、厚さとしては０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく、例えば１〜２ｍｍ程度の基板が用いられる。大きさや形状に関しても特に限定されるものではないが、一般に普及されている解析装置への対応性を考慮すると、通常市販されているスライドグラスのサイズと同じものを用いるのが好ましい。

基板表面に関しては、例えばガラス表面に公知の方法に基づいてシランカップリングのような化学修飾を行い、官能基を導入されたものを用いることができる。具体的な官能基としては、アミノ基、カルボキシル基。チオール基、エポキシ基などが挙げられる。あるいは、基板の表面が金属薄層でコーティングされていてもよい。コーティングされる金属の種類としては、金、銀、白金などが例示されるが、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定性の高い金が好ましい。金を用いる場合、上述したような官能基を末端に有してなるようなアルカンチオール化合物を用いることによる表面化学の改質に関しては、その実績や知見も数多く報告されていることからも、金表面に対して官能基を容易に導入する事ができる点で有用である。

金属、特に金をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するためには、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールするのが好ましい。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には２０〜１００ｎｍ、好ましくは３０〜８０ｎｍの範囲で選択される。また、金属薄層の剥離を抑制するために、０．５〜１０ｎｍ程度のクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。

本発明において、ペプチドもしくは蛋白質はプロテインキナーゼの活性をプロファイリングすることが可能な基質を指し、1種類のペプチドもしくは蛋白質は1種類のプロテインキナーゼによってのみリン酸化され、他のプロテインキナーゼによってはリン酸化されないのが好ましい。ここで、ペプチドもしくは蛋白質とは、複数のアミノ酸が縮合結合されて連結された通常のポリペプチド全般を指すものである。プロファイリングの対象となるプロテインキナーゼとしては、蛋白質のセリン、スレオニンなどのアミノ酸の側鎖をリン酸化する酵素が挙げられ、例えばｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）、などが例示できるが、基本的にはセリンもしくはスレオニンの側鎖水酸基をリン酸化可能なあらゆる種類のプロテインキナーゼに関して適用することが可能である。

これら該プロテインキナーゼの基質となるペプチドもしくは蛋白質は公知のものであってもよいが、アミノ酸配列は公知の配列に基づき適宜選択することも可能である。ペプチドの長さは一般的に１００アミノ酸残基以下のものが用いられるが、好ましくは５〜３０アミノ酸残基、より好ましくは８〜２５アミノ酸残基、更に好ましくは１０〜２０アミノ酸残基からなるものが用いられる。また、蛋白質を用いる場合の分子量は特に限定されるものではない。上記ペプチドもしくは蛋白質の生成手法は特に限定されるものではなく、化学的もしくは遺伝子工学的な公知の手法により生成することが可能である。

本発明においては、ペプチドもしくは蛋白質が上述したような基板上に固定化されたアレイを用いる。ペプチドもしくは蛋白質は、プロテインキナーゼの基質として機能しうるようなアミノ酸配列を含有するものを少なくとも１つ、好ましくは異なる種類のプロテインキナーゼによりリン酸化を受けるアミノ酸配列のものを複数種用いることができる。更には、予めリン酸化されたアミノ酸残基を含むもの（ポジティブコントロール）、あるいはリン酸化されるアミノ酸残基を含まないもの（ネガティブコントロール）も同じ基板上に固定化されているのが好ましい。ネガティブコントロールを用いる場合は、リン酸化部位がセリン残基、スレオニン残基の場合はアラニン残基に置換されたものが好ましい。
合成のしやすさ、取り扱いやすさ、保存安定性などの点では、比較的低分子量のペプチドを用いる方が好ましい。

本発明のペプチドアレイにおけるペプチドもしくは蛋白質の基板への固定化方法に関しては特に限定されるものではなく、ポリペプチド配列において存在するアミノ基やチオール基を介した方法、あるいはＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ等を用いる方法など様々な様式が挙げられる。この中では、特にチオール基を介してペプチドを固定化する方法が、特異性、感度の両面から特に好ましい。

固定化されるペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在することが好ましい。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端のみに付加されてなる方がよい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして１乃至数残基のアミノ酸配列をさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基及び／又はアラニン残基が１乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。あるいは、末端のシステイン残基と基質配列との間には、上述のようなアミノ酸配列の替わりに例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような親水性高分子が挿入されていてもよい。

上述のように、チオール基を介してペプチドを基板に固定化する場合、ヘテロ二官能基型リンカーを導入するのが好ましい。ヘテロ二官能基型リンカーの化学構造は特に限定されるものではないが、予めアミノ基を表面に導入した後、スクシンイミド（ＮＨＳ）基もしくは硫酸スクシンイミド基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いることが特に好ましい。このようなヘテロ二官能型架橋剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性高分子の両端がＮＨＳ基とＭＡＬ基で修飾されたものを用いることも可能であるが、ペプチドの固定化収率を向上させるためには、より低分子量のものを用いてもよい。具体的には、式（ＩＩ）に示す化合物Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくは式（ＩＩＩ）に示す化合物Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）が挙げられる。なお、式（ＩＩ）もしくは式（ＩＩＩ）に示す化合物と完全に同一構造のものだけを指すのではなく、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物をも包含される。また、本発明においてはＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。

ＰＥＧのような親水性高分子の両端がＮＨＳ基とＭＡＬ基で修飾されたものを用いる場合、特にサイズは限定されるものではない。好ましくは、例えば分子量が５００〜５０００程度であることが好ましく、より好ましくは６００〜２０００程度、更に好ましくは８００〜１２００程度のものが用いられる。

上述のように表面に官能基が導入された基板上にペプチドもしくは蛋白質溶液を作用させてアレイを作製するが、その際には自動スポッターのようなスポッティング装置を用いて行う方が好ましい。自動スポッターの形式や種類は特に制約されるものではなく、一般的に普及されているようなスポッティング装置を用いることが可能である。スポットの大きさについても特に限定されないが、１〜１０００μｍ程度が好ましく、１０〜５００μｍがより好ましい。スポットするペプチドもしくは蛋白質溶液は、ＰＢＳのような緩衝液に溶解させたものを用いるのが好ましいが、ＤＭＳＯのような有機溶媒を混合してあるいはそのまま用いてもよい。

プロファイリングの対象となるプロテインキナーゼは市販されているような試薬であってもよいが、細胞由来の抽出液中に既に含まれる、もしくは含まれると推定されるものを用いることも可能である。例えば、バッファーもしくは細胞抽出液または両者混合液中にプロテインキナーゼ試薬もしくは細胞抽出液中に既に含まれるプロテインキナーゼとヌクレオシド三リン酸を加えたものを直接アレイに作用させることにより固定化基質のリン酸化を行うことができる。リン酸化の条件はプロテインキナーゼの種類により変動するが、通常は１０〜４０℃程度、好ましくは２０〜４０℃程度の温度で５分〜８時間程度、好ましくは１０分〜５時間程度反応させることで、ペプチドもしくは蛋白質をリン酸化することができる。必要に応じてリン酸化反応液中には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋などのリン酸化を補助、促進する物質を共存させてもよい。

アレイ上のリン酸化の検出に際しては、上述したように、β脱離を行った後でマイケル付加反応を行う。マイケル付加に際しては、例えばチオール基を有する化合物の作用が推奨される。その化学構造については特に限定されるものではないが、アルキル鎖やエチレングリコールの繰り返し構造を基本骨格として末端にチオール基の有するようなものが挙げられる。こうした構造の化合物に蛍光性物質が標識されていれば、１ステップのマイケル付加を行うことにより、リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質における蛍光発色をモニターすることができる。蛍光性物質は特に限定されるものではなく、あらゆる蛍光性化合物が適用される。例えば、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ．Ｃｙ３、Ｃｙ５，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，ＴＡＭＲＡ，ＡＰＣなど一般的な蛍光アッセイに際して用いられるものが例示される。

また、チオール基と反対側の末端にはビオチンが修飾されたものを用いるのも好ましい。具体的な構造式としては、例えば式（Ｉ）に示すようなものが挙げられる。式（Ｉ）において、ｎは１〜３０の整数を示すが、２〜２５が好ましく、３〜２０がより好ましい。ビオチン修飾された化合物を用いる場合、マイケル付加を行った後で、上述したような蛍光性物質が標識されてなるアビジンもしくはストレプトアビジンを更に作用させるのが好ましい。あるいは、予めビオチン修飾された化合物と蛍光標識されたアビジンもしくはストレプトアビジン（以下、ＳＡとも示す。）を複合体化させたものを用いて、１ステップのマイケル付加を行ってもよい。

上述のようなチオール基を有する化合物によるマイケル付加に際した反応温度は室温付近が好ましく、具体的には２５〜４０℃程度である。反応時間は１０〜１２０分程度が好ましく、３０〜９０分程度がより好ましい。また、反応溶液の種類は特に限定されるものではなく、水、緩衝液、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯのような有機溶媒、あるいはこれらの混合系が挙げられる。付加反応に用いられる化合物の特性に応じて適宜調整することが好ましい。

マイケル付加反応を行うことにより、上述のように蛍光性物質を作用させたアレイは、一般に普及されているアレイスキャナのような解析装置を用いることによる蛍光イメージングを行うことにより解析することができる。リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質においては、特異的に蛍光発色を観察することができる。本発明においては、特にアレイを用いることにより、多数のペプチドもしくは蛋白質に関するリン酸化のプロファイリングを行うことが可能であり、網羅的なプロテインキナーゼ活性の解析において非常に有用なものである。創薬のスクリーニング、特にプロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニングに際して大いに役立つものと考えられる。

以下、実施例を挙げることにより本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
［実施例１］
（ペプチドアレイの作製）
アミノ基が高密度に導入されたガラス基板（松浪硝子工業製ＳＤＭ００１１；サイズ：２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ×１ｍｍ、コートタイプ：高密度化アミノ基導入コート）を用い、０．４ｍｇ／ｍｌ濃度のＳＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ製）溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸バッファー；ｐＨ７．４に溶解して調製した。）を各々のガラス基板上のペプチドを固定化する領域を覆うように、３００μｌをドロップして溶液を広げて、室温で１５分間反応させた。こうして、基板上にマレイミド基表面を形成させることができた。その後ガラス基板をエタノール、水の順で洗浄し乾燥させた。

乾燥後、ガラス基板上に基質となる合成ペプチド（以下、基質ペプチドとも示す。）をスポッター（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）自動スポッター）を用いて１０ｎｌずつスポットし、湿度を保った状態で、室温で１６時間静置して基質ペプチドを固定化させた。用いた基質ペプチドは、配列表に示したアミノ酸配列のものであり、図２に各基質ペプチドの固定化された配置を示した。Ｎｏ．１はＰＫＡ基質のセリン型基質（配列番号１）、Ｎｏ，２は予めセリン残基がリン酸化されたポジティブコントロール、Ｎｏ．３はセリン残基がアラニンに置換されたネガティブコントロール（配列番号２）、Ｎｏ．４はＰＫＡ基質のスレオニン型基質（配列番号３）、Ｎｏ．５は予めスレオニン残基がリン酸化されたポジティブコントロール、Ｎｏ．６はペプチドが固定化されていないブランクである。いずれのペプチドも末端にシステイン残基が付加されてなり、このシステイン残基の有するチオール基が、基板表面のマレイミド基とカップリング反応することにより基板上に基質ペプチドが固定化されるものである。基質ペプチドの固定化パターンは図２に示す通りである。基質ペプチド溶液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（東京化成工業製）を含む１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）中に１ｍｇ／ｍｌ濃度になるように溶解したものを用いた。
（リン酸化の検出）
上記のように作製されたアレイをＰＢＳ、水の順で洗浄した後、０．１Ｎ濃度のＮａＯＨ溶液（水／ＤＭＳＯ／エタノール；容量比４：３：１）の混合溶媒）中に浸漬して、室温で１時間の反応させることによりβ脱離を行った。その後、アレイをＰＢＳ、水の順に洗浄して乾燥させた。次に、蛍光標識されたＳＡとビオチン修飾されているチオール化合物との複合体を作用させた。蛍光標識されたＳＡとしては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２もしくはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３標識ストレプトアビジン（いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製）の２種をいずれも１μｇ／ｍｌ濃度で用いた。一方、ビオチン修飾されているチオール化合物（以下、ビオチン化ＰＥＧ−ＳＨと示す。）としては、式（ＩＶ）に示すようなビオチンが付加されてなるＰＥＧアルカンチオール（ＳｅｎｓｏＰａｔｈ製Ｂｉｏｔｉｎｏｌａｔｅｄ ＰＥＧ Aｌｋａｎｅｔｈｉｏｌ）を用いた。ビオチン化ＰＥＧ−ＳＨが１０ｍＭ濃度になるようにエタノールに溶解したストック溶液を、ＰＢＳで１００倍希釈して１００μＭ濃度として用いた。上記の濃度に調整したビオチン化ＰＥＧ−ＳＨと蛍光標識ＳＡのそれぞれの溶液を等量ずつ混合して１５分間、室温で反応させた溶液をそのままマイケル付加に用いた。反応溶液３００μｌをアレイ上にドロップして溶液を広げて室温で３０分間反応させた。

マイケル付加反応を行った上記アレイをＰＢＳ、水の順に洗浄して乾燥させ、蛍光イメージング解析を行った。アレイ解析に際しては、マイクロアレイスキャナＧｅｎｅＰｉｘ４２００ＡＬ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いた。いずれの蛍光を用いた場合においても、ややアラニン体基質（Ｎｏ，３）においてやや非特異的な影響は見られるものの、リン酸化セリン体基質（Ｎｏ，２）、リン酸化スレオニン体基質（Ｎｏ，５）において強い発色が認められた。
［実施例２］
実施例１と全く同様なアレイを作製して、リン酸化の検出に際しても、β脱離の工程までは、実施例１と同じ方法で処理を行った。その後のマイケル付加に際しては、まず上述の式（ＩＶ）のビオチン化ＰＥＧ−ＳＨの１００μＭ濃度溶液３００μｌをアレイ上にドロップして広げ、室温で３０分間反応させた。その後、ＰＢＳ、水の順に洗浄して乾燥させ、実施例１で用いたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２標識ストレプトアビジンを、１ｍｇ／ｍｌ濃度にて室温で２０分間反応させた。すなわち、マイケル付加と蛍光染色を２段階に分けて行った。結果を図３に示した。実施例１の場合と比べて、アラニン体基質（Ｎｏ，３）における非特異的な影響が少なくなり、リン酸化セリン体基質（Ｎｏ，２）、リン酸化スレオニン体基質（Ｎｏ，５）における発色が強くなり、特異性が向上していることが確認される。
［実施例３］
（ペプチドアレイの作製）
スライドグラス（松浪硝子工業製Ｓ１２２６；サイズ：２６ｍｍ×７６ｍｍ×１ｍｍ）に金を蒸着処理した金スライド（コート内容：１層目 クロム２０Å、２層目 金４５０Å）を、１ｍＭ濃度の８−Ａｍｉｎｏ−１−ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（同仁化学製）のエタノール溶液中に室温で１．５時間浸漬させた。こうしてアミノ基が金表面に導入された金スライドを、エタノール及び水で洗浄して乾燥を行い、ＳＳＭＣＣによる処理以降の操作を実施例１と全く同様にして、ペプチドアレイを作製した。
（リン酸化の検出）
得られたペプチドアレイを、実施例２と全く同様にして、β脱離及びマイケル付加反応を行い、更に解析も同様にして検討した。その結果を図４に示した。ガラス表面を用いた実施例１及び実施例２と比べると、アラニン体基質（Ｎｏ，３）における非特異的な影響はほとんど見られなくなった。リン酸化セリン体基質（Ｎｏ，２）における発色がやや弱くなっているが、リン酸化されている基質に対する特異性に関しては非常に優れていることが確認された。

本発明を利用することにより、多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。

本発明におけるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化検出に関する反応系の基本概念を示した図である。 実施例１において作製したアレイにおける、各基質ペプチドの固定化された配置を示す図である。 実施例２において、リン酸化ペプチドの検出を行った結果を示す図である。 実施例３において、リン酸化ペプチドの検出を行った結果を示す図である。

Claims (13)

1. 基板上におけるペプチドもしくは蛋白質のセリンもしくはスレオニン残基の側鎖水酸基のリン酸化を検出する方法であって、リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質のセリンもしくはスレオニン残基の側鎖水酸基をβ脱離させた後、マイケル付加を行うことを特徴とするリン酸化検出方法。
2. マイケル付加反応において、チオール基を有する化合物を作用させることを特徴とする請求項１に記載のリン酸化検出方法。
3. チオール基を有する化合物として、蛍光修飾されたチオール基含有化合物を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載のリン酸化検出方法。
4. チオール基を有する化合物として、蛍光修飾されたチオール基含有アビジンもしくは蛍光修飾されたチオール基含有ストレプトアビジンを用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
5. マイケル付加反応において、ビオチン修飾されたチオール基含有化合物を使用し、マイケル付加生成物と蛍光修飾されたアビジンもしくはストレプトアビジンをさらに反応させることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
6. ビオチン修飾されたチオール基含有化合物が、一方の末端にチオール基、他方の末端にビオチン基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする請求項５に記載のリン酸化検出方法。
7. ビオチン修飾されたチオール基含有化合物が、式（Ｉ）に示す構造式（式中、ｎは１〜３０の整数を示す）を有する化合物であることを特徴とする請求項５又は６に記載のリン酸化検出方法。
   

   
8. マイケル付加反応において、ビオチン化されたチオール基含有化合物と蛍光修飾されたアビジンもしくはストレプトアビジンとの複合体を用いることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
9. 基板がガラスであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
10. 基板表面が金であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
11. 末端にシステイン残基の付加されているペプチドが固定化されてなることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
12. アミノ酸残基数が３０以下であるペプチドが固定化されてなることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
13. キナーゼによりリン酸化され得るセリンもしくはスレオニン残基を有するペプチドもしくは蛋白質からなる基質を固定化したアレイ、塩基およびマイケル付加試薬を有するキナーゼによるリン酸化検出用のキット。
    
    

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