JP2009019002A

JP2009019002A - マイケル反応によるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化の検出方法

Info

Publication number: JP2009019002A
Application number: JP2007182117A
Authority: JP
Inventors: Kazunori Inamori; 和紀稲森; Motoki Kyo; 基樹京; Naoki Umezawa; 直樹梅澤; Shoji Akita; 昌二秋田; Tsunehiko Higuchi; 恒彦樋口
Original assignee: Toyobo Co Ltd; Nagoya City University
Current assignee: Toyobo Co Ltd; Nagoya City University
Priority date: 2007-07-11
Filing date: 2007-07-11
Publication date: 2009-01-29

Abstract

【課題】簡便で特異性に優れ、ハイスループット解析も可能である、種々のプロテインキナーゼにおける活性を網羅的にプロファイリングできる方法を提供する。
【解決手段】基板上におけるペプチドもしくは蛋白質のリン酸化を検出する方法であって、リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質を塩基処理し、リン酸基をβ脱離させた後、チオール基で修飾されたローダミン誘導体化合物を作用させることによるマイケル付加反応を行うことを特徴とするリン酸化検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規なＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化を検出する方法に関する。より詳細には、ガラスのような基板上にプロテインキナーゼの基質となるペプチドもしくは蛋白質を固定化させてアレイ上において、リン酸化されたセリン残基もしくはスレオニン残基のリン酸基をβ脱離させた後に、マイケル付加反応の可能な蛍光性物質を用いることにより、リン酸化されたペプチドもしく蛋白質を検出する方法に関する。

近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるためのバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。例えば、シグナル伝達経路に関わる様々な種類のプロテインキナーゼの基質を基板上に固定化し、プロテインキナーゼの活性を蛍光物質もしくは放射性物質で検出する技術がある。この技術によりプロテインキナーゼとその候補となる基質を１対１（一種類ずつ混ぜて）反応させていた従来の方法では難しい網羅的な解析を可能とし、より効率的にプロテインキナーゼの活性をプロファイリングすることができる。しかし、その一方で基板上への生体分子の固定化は、様々な作製段階で操作的な困難さがあり、また検出感度にもまだまだ改良する余地が残っているのが現状である。

既に報告されている関連技術として、例えばＳＰＯＴ技術によりセルロースメンブラン上で直接ペプチドを合成し、その後チップ上に固定化する技術が知られている。この技術を利用して、ｐ６０チロシンキナーゼの基質をチップ上に固定化し、蛍光物質もしくは放射性物質を用いてキナーゼ活性を評価したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、同様の技術で作製されたペプチドアレイを用いて、プロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡと示すこともある。）やＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄキナーゼ６（ＮＥＫ６）などの活性を、放射性物質を用いてアッセイしたことについての報告（例えば、非特許文献２及び３参照）もある。その他、アビジンでコートした基板上にビオチン結合したペプチドを固定化し、ＰＫＡ活性を検討した例（例えば、非特許文献４参照）もある。しかしながら、上記いずれの方法においても、検出の際のバックグラウンドがスポットを観察する上で悪影響し、その低減が大きな課題となっている。更には、放射性物質を用いる方法が主流であることから、その安全性の問題はもとより専用施設を設置する必要性もあり、限られた研究機関でしか実施できないという問題がある。あるいは抗体を用いる方法の場合には、そのコストや要求特性が十分でないなどの課題があり、必ずしも満足なものであるとは言い難いのが実情である。

ビーズ上に固定化された基質ペプチドのリン酸化を、マイケル付加反応により検出する方法が報告されている（非特許文献５及び特許文献１を参照）。この方法は、リン酸化されたセリン、スレオニンは塩基性条件下で容易にリン酸基が脱離し、不飽和カルボニルが生成され、これがマイケル反応受容体となることを応用したものである。例えば、チオール基のようなマイケル付加が可能な官能基を有する蛍光化合物（クマリン）をリン酸化されたセリンもしくはスレオニン残基に作用させるものであり、ビーズ表面にプロテインキナーゼの基質ペプチドを固定化して、ビーズ上でのリン酸化反応を行い、蛍光標識されたマイケル付加試薬を作用させることにより、リン酸化を検出するものである。しかしながら、オンビーズアッセイの場合、分子サイズの大きなキナーゼには適用しにくいこと、アッセイ効率に限界があり、ハイスループット化に際しては有利な方策とはいい難い。
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，３１５，２００２Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４３，２６７１，２００４ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ１，２７，２００４Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２７８３９，２００２Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．７，５５６５，２００５特開２００６−１０１７６７号公報

本発明の目的は、簡便で特異性にも優れ、アレイを用いることによりハイスループット化も可能であるような、種々のプロテインキナーゼにおける活性を網羅的にプロファイリングできる方法を確立しようとするものである。

本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、プロテインキナーゼの基質となるペプチドもしくは蛋白質に対し、塩基処理及びその後のマイケル付加反応を施すことが種々のプロテインキナーゼ活性を網羅的に解析する上で極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
（１）リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質のリン酸化セリンもしくはリン酸化スレオニン残基の側鎖リン酸基をβ脱離させた後、マイケル付加反応を行うことによりペプチドもしくは蛋白質のセリンもしくはスレオニン残基の側鎖水酸基のリン酸化を検出するための化合物であって、式（Ｉ）（式中、ｎは１〜３０の整数を表す）に示す化学構造を有することを特徴とする化合物。

（２）基板上におけるペプチドもしくは蛋白質のセリンもしくはスレオニン残基の側鎖水酸基のリン酸化を検出する方法であって、リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質のリン酸化セリンもしくはリン酸化スレオニン残基の側鎖リン酸化基をβ脱離させた後、式（Ｉ）（ｎは１〜３０の整数を表す）に示す化学構造を有する化合物を用いてマイケル付加反応を行うことを特徴とするリン酸化検出方法。
（３）基板がガラスであることを特徴とする（２）のリン酸化検出方法。
（４）基板表面が金であることを特徴とする（２）又は（３）のリン酸化検出方法。
（５）末端にシステイン残基の付加されているペプチドが固定化されてなることを特徴とする（２）〜（４）のいずれかのリン酸化検出方法。
（６）キナーゼによりリン酸化され得るセリンもしくはスレオニン残基を有するペプチドもしくはタンパク質を有する基質を固定化したアレイ、塩基及び式（Ｉ）（ｎは１〜３０の整数を表す）に示す化学構造を有する化合物を含有する、キナーゼによるリン酸化検出用のキット。

本発明は、安全でかつ簡便な操作により、特異性や感度の点でも非常に優れたＯｎ−ｃｈｉｐでのリン酸化の検出方法を提供することができるものである。アレイでの解析を行うことにより、ハイスループット化への対応も可能である点でも有用である。特に製薬業界に対して、キナーゼ阻害剤などの新規な創薬スクリーニングのための評価系として非常に有用なものとして期待される。

図１に、本発明におけるリン酸化検出に関する反応系の原理を示した。本発明は、まずセリン残基もしくはスレオニン残基のリン酸化されているペプチドもしくは蛋白質を塩基処理し、リン酸基をβ脱離させた後、マイケル付加反応を行うことを特徴としている。リン酸化されているセリン残基もしくはスレオニン残基は塩基性条件下で容易にリン酸基が脱離して不飽和カルボニルが生成する。したがって、このβ脱離は通常アルカリ溶液により処理することにより進行される。塩基としては、アルカリ金属やアルカリ土類金属の水酸化物（水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化バリウム等）、アルカリ金属炭酸塩（炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等）、有機塩基（ジアザビシクロウンデゼン（ＤＢＵ））などが挙げられ、アルカリ金属水酸化物や水酸化バリウムが特に好ましい。具体的には０．０１〜１．０規定、好ましくは０．１〜０．５規定濃度の水酸化ナトリウム、水酸化カリウムもしくは水酸化バリウムなどの溶液が好適に用いられる。該アルカリ溶液は水溶液であってもよいが、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような水溶性の有機溶媒が混在していてもよい。反応温度は室温付近が好ましく、具体的には２５〜４０℃程度である。反応時間は３０〜１２０分程度が好ましく、６０〜９０分程度がより好ましい。

上述のように生成されたα，β−不飽和カルボニルはマイケル付加反応の受容体となりうる。マイケル付加反応による付加の可能な化合物としては、例えばチオール基を有する化合物が挙げられる。したがって、蛍光発色団にチオール基を修飾させたもの（図１中の「Ｓ−蛍光団」）を作用させることにより、セリン残基もしくはスレオニン残基のリン酸化されているペプチドもしくは蛋白質において特異的に蛍光発色を確認することができ、リン酸化を検出することができる。本発明は、この原理を、ハイスループット解析に対応しやすいアレイでの解析系に応用したものである。この反応原理を利用することにより、様々な検出系を構築することができる。

マイケル付加反応とは、α，β−不飽和カルボニル化合物に対して求核剤が１，４−付加する反応のことをいう。エチレンのような通常のアルケンは一般的には求核剤との反応は起こらないが、アクリル酸メチルのように、電子求引性基によって（求核攻撃に対して）活性化されたアルケンは、グリニャール試薬やエノラートのような求核剤と反応することが可能である。同様に、電子求引性基であるニトロ基やシアノ基の結合したビニル化合物についても同様の反応が起こる。一般のカルボニル化合物と求核剤との反応では、求核剤がカルボニル炭素に対して求核攻撃するが、マイケル付加反応においては、求核剤の付加はカルボニルとの共鳴によりδ＋となったβ位の炭素に対して起こり、求核剤上にあった負電荷は酸素へと移る。

本発明において用いられるアレイの基板としては、ガラスが最も一般的で好ましいが、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類も挙げることができる。透明な基板が好ましい。透明なガラスは容易に入手しやすく、汎用性の点でも有利である。ガラス基板を用いる場合、ガラスの種類や基板の厚さは特に限定されるものではないが、厚さとしては０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく、例えば１〜２ｍｍ程度の基板が用いられる。大きさや形状に関しても特に限定されるものではないが、一般に普及されている解析装置への対応性を考慮すると、通常市販されているスライドグラスのサイズと同じものを用いるのが好ましい。

基板表面に関しては、例えばガラス表面に公知の方法に基づいてシランカップリングのような化学修飾を行い、官能基を導入されたものを用いることができる。具体的な官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、エポキシ基などが挙げられる。あるいは、基板の表面が金属薄層でコーティングされていてもよい。コーティングされる金属の種類としては、金、銀、白金などが例示されるが、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定性の高い金が好ましい。金を用いる場合、上述したような官能基を末端に有してなるようなアルカンチオール化合物を用いることによる表面化学の改質に関しては、その実績や知見も数多く報告されていることからも、金表面に対して官能基を容易に導入する事ができる点で有用である。

金属、特に金をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するためには、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールするのが好ましい。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には２０〜１００ｎｍ、好ましくは３０〜８０ｎｍの範囲で選択される。また、金属薄層の剥離を抑制するために、０．５〜１０ｎｍ程度のクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。

本発明において、ペプチドもしくは蛋白質はプロテインキナーゼの活性をプロファイリングすることが可能な基質を指し、１種類のペプチドもしくは蛋白質は１種類のプロテインキナーゼによってのみリン酸化され、他のプロテインキナーゼによってはリン酸化されないのが好ましい。ここで、ペプチドもしくは蛋白質とは、複数のアミノ酸が縮合結合されて連結された通常のポリペプチド全般を指すものである。プロファイリングの対象となるプロテインキナーゼとしては、蛋白質のセリン、スレオニンなどのアミノ酸の側鎖をリン酸化する酵素が挙げられ、例えばｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）、などが例示できるが、基本的にはセリンもしくはスレオニンの側鎖水酸基をリン酸化可能なあらゆる種類のプロテインキナーゼに関して適用することが可能である。

これら該プロテインキナーゼの基質となるペプチドもしくは蛋白質は公知のものであってもよいが、アミノ酸配列は公知の配列に基づき適宜選択することも可能である。ペプチドの長さは一般的に１００アミノ酸残基以下のものが用いられるが、好ましくは５〜３０アミノ酸残基からなるもの、より好ましくは８〜２５アミノ酸残基、更に好ましくは１０〜２０アミノ酸残基からなるものが用いられる。また、蛋白質を用いる場合の分子量は特に限定されるものではない。上記ペプチドもしくは蛋白質の生成手法は特に限定されるものではなく、化学的もしくは遺伝子工学的な公知の手法により生成することが可能である。

本発明においては、ペプチドもしくは蛋白質が上述したような基板上に固定化されたアレイを用いる。ペプチドもしくは蛋白質は、プロテインキナーゼの基質として機能しうるようなアミノ酸配列を含有するものを少なくとも１つ、好ましくは異なる種類のプロテインキナーゼによりリン酸化を受けるアミノ酸配列のものを複数種が用いられる。更には、予めリン酸化されたアミノ酸残基を含むもの（ポジティブコントロール）、あるいはリン酸化されるアミノ酸残基を含まないもの（ネガティブコントロール）も同じ基板上に固定化されているのが好ましい。ネガティブコントロールを用いる場合は、リン酸化部位がセリン残基、スレオニン残基の場合はアラニン残基に置換されたものが好ましい。合成のしやすさ、取り扱いやすさ、保存安定性などの点では、比較的低分子量のペプチドを用いる方が好ましい。

本発明のペプチドアレイにおけるペプチドもしくは蛋白質の基板への固定化方法に関しては特に限定されるものではなく、ポリペプチド配列において存在するアミノ基やチオール基を介した方法、あるいはＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ等を用いる方法など様々な様式が挙げられる。この中では、特にチオール基を介してペプチドを固定化する方法が、特異性、感度の両面から特に好ましい。

固定化されるペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在することが好ましい。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端のみに付加されてなる方がよい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして１乃至数残基のアミノ酸配列をさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基及び／又はアラニン残基が１乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。あるいは、末端のシステイン残基と基質配列との間には、上述のようなアミノ酸配列の替わりに例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような親水性高分子が挿入されていてもよい。

上述のように、チオール基を介してペプチドを基板上に固定化する場合、ヘテロ二官能基型リンカーを導入するのが好ましい。ヘテロ二官能基型リンカーの化学構造は特に限定されるものではないが、予めアミノ基を表面に導入した後、スクシンイミジルエステル（ＮＨＳエステル）もしくは硫酸スクシンイミジルエステルとマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いることが特に好ましい。このようなヘテロ二官能型架橋剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性高分子の両端がＮＨＳエステルとＭＡＬ基で修飾されたものを用いることも可能であるが、ペプチドの固定化収率を向上させるためには、より低分子量のものを用いてもよい。具体的には、式（ＩＩ）に示す化合物Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくは式（ＩＩＩ）に示す化合物Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）が挙げられる。なお、式（ＩＩ）もしくは式（ＩＩＩ）に示す化合物と完全に同一構造のものだけを指すのではなく、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物をも包含される。また、本発明においてはＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。

ＰＥＧのような親水性高分子の両端がＮＨＳ基とＭＡＬ基で修飾されたものを用いる場合、特にサイズは限定されるものではない。好ましくは、例えば分子量が５００〜５０００程度であることが好ましく、より好ましくは６００〜２０００程度、更に好ましくは８００〜１２００程度のものが用いられる。

上述のように表面に官能基が導入された基板上にペプチドもしくは蛋白質溶液を作用させてアレイを作製するが、その際には自動スポッターのようなスポッティング装置を用いて行う方が好ましい。自動スポッターの形式や種類は特に制約されるものではなく、一般的に普及されているようなスポッティング装置を用いることが可能である。スポットの大きさについても特に限定されないが、１〜１０００μｍ程度が好ましく、１０〜５００μｍがより好ましい。スポットするペプチドもしくは蛋白質溶液は、ＰＢＳのような緩衝液に溶解させたものを用いるのが好ましいが、ＤＭＳＯのような有機溶媒を混合してあるいはそのまま用いてもよい。

プロファイリングの対象となるプロテインキナーゼは市販されているような試薬であってもよいが、細胞由来の抽出液中に既に含まれる、もしくは含まれると推定されるものを用いることも可能である。例えば、バッファーもしくは細胞抽出液または両者混合液中にプロテインキナーゼ試薬もしくは細胞抽出液中に既に含まれるプロテインキナーゼとヌクレオシド三リン酸を加えたものを直接アレイに作用させることにより固定化基質のリン酸化を行うことができる。リン酸化の条件はプロテインキナーゼの種類により変動するが、通常は１０〜４０℃程度、好ましくは２０〜４０℃程度の温度で５分〜８時間程度、好ましくは１０分〜５時間程度反応させることで、ペプチドもしくは蛋白質をリン酸化することができる。必要に応じてリン酸化反応液中には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋などのリン酸化を補助、促進する物質を共存させてもよい。

アレイ上のリン酸化の検出に際しては、上述したように、β脱離を行った後でマイケル付加反応を行う。マイケル付加に際しては、例えばチオール基を有する化合物の作用が推奨されるが、この化合物の選択は、優れた検出を達成するうえで非常に重要な意味を持つ。本発明においては、特に式（Ｉ）に示すような構造のローダミン誘導体化合物を用いることを特徴とする。式中、ｎは１〜３０の整数を表すが、２〜２４が好ましく、４〜１２が更に好ましい。このような本発明のローダミン誘導体化合物は、高い水溶性、親水性を有することから、扱いが容易であるうえ、ペプチドへの非特異的な吸着を抑えられる点でも有用である。式（Ｉ）（ｎは１〜３０の整数を表す）で示される本発明のローダミン誘導体化合物は、化学合成により得ることが可能である。

式（Ｉ）（ｎは１〜３０の整数を表す）で示される本発明のローダミン誘導体化合物によるマイケル付加に際した反応温度は室温付近が好ましく、具体的には２５〜４０℃程度である。反応時間は１０〜１２０分程度が好ましく、３０〜９０分程度がより好ましい。また、反応溶液の種類は特に限定されるものではなく、水、緩衝液、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯのような有機溶媒、あるいはこれらの混合系が挙げられる。付加反応に用いられる化合物の特性に応じて適宜調整することが好ましい。

式（Ｉ）（ｎは１〜３０の整数を表す）で示される本発明のローダミン誘導体化合物を用いてマイケル付加反応を行うことにより、上述のように本発明のローダミン誘導体化合物を作用させたアレイは、一般に普及されているアレイスキャナのような解析装置を用いることによる蛍光イメージングを行うことにより解析することができる。リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質においては、特異的に蛍光発色を観察することができる。本発明においては、特にアレイを用いることにより、多数のペプチドもしくは蛋白質に関するリン酸化のプロファイリングを行うことが可能であり、網羅的なプロテインキナーゼ活性の解析において非常に有用なものである。創薬のスクリーニング、特にプロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニングに際して大いに役立つものと考えられる。

以下、実施例を挙げることにより本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
[実施例１]
（ローダミン誘導体化合物の合成−１）
式（Ｉ）においてｎ＝４の化合物を、以下のようなスキームにより合成した。

Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ（５．４９ｇ，４０．０ｍｍｏｌ）とｐｈｔｈａｌｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ（スキーム１の化合物ａ）（２．９６ｇ，２０．０ｍｍｏｌ）を乳鉢で混和し、１８０℃で２４時間撹拌した。室温まで放冷した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％メタノール／ＣＨ_２Ｃｌ_２）で精製した。ここで得られた固体を６００ｍＬの１規定ＮａＯＨに溶解、この溶液をＮａＣｌで飽和させた後、ＥｔＯＡｃで抽出した（３ｘ４００ｍＬ）。ＥｔＯＡｃ層をｂｒｉｎｅで洗浄、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥後、濃縮し、紫色固体（スキーム１の化合物ｂ）２．２２ｇを得た。収率２９％。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ８．０１−７．９９（ｍ，１Ｈ），７．６５−７．５６（ｍ，２Ｈ），７．１９−７．１６（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），６．４８（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，２Ｈ），６．３８（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．５Ｈｚ，２Ｈ），２．９７（ｓ，１２Ｈ）。ＭＳ（ＦＡＢ^＋）：３８７［Ｍ＋Ｈ］^＋。

Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ（１．３５ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解後、Ａｒ雰囲気下０ oＣで撹拌した。この溶液に１．８ＭＡｌＭｅ_３／ｔｏｌｕｅｎｅ（４．５ｍＬ，８．１ｍｍｏｌ）を滴下して加え、室温まで昇温して６０ｍｉｎ撹拌した。その後式スキーム１、２の化合物ｂのＣＨ_２Ｃｌ_２溶液（０．２０ｇ／ｍＬ，５ｍＬ，２．５９ｍｍｏｌ）を滴下して加え、２４時間還流した。反応溶液を０℃まで冷却し、０．１ＮＨＣｌ（２０ｍＬ）を滴下して反応を停止後、有機溶媒を濃縮し、０．５規定ＨＣｌ（３００ｍＬ）で希釈した。ＣＨ_２Ｃｌ_２（４ｘ１５０ｍＬ）で洗浄し、水層をＮａＣｌで飽和させ、ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝２／１（６ｘ１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥後、減圧濃縮し、残渣を２．５％Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液（３００ｍＬ）に溶解した。ＮａＣｌで飽和させた後、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｘ１５０ｍＬ）で抽出し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥後、減圧濃縮し、黒紫色固体（スキーム２の化合物ｃ）６３６ｍｇを得た。収率５４％。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ７．６９−７．６４（ｍ，２Ｈ），７．５６−７．５４（ｍ，１Ｈ），７．３７−７．３５（ｍ，１Ｈ），７．２８−７．２５（ｍ，２Ｈ），７．１０−７．０７（ｍ，２Ｈ），６．８２（ｓ，２Ｈ），３．４２−３．３３（ｍ，１６Ｈ），２．６７（ｂｒｓ，４Ｈ）。ＭＳ（ＦＡＢ^＋）：４５６［Ｍ＋Ｈ］^＋。

スキーム２、３の化合物ｃ（２６ｍｇ，５７μｍｏｌ）をＣＨ_３ＣＮ（３ｍＬ）に溶解し、Ｓ−ａｃｅｔｙｌｄＰＥＧ４ＮＨＳｅｓｔｅｒ（ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ製）のメタノール溶液（１００ｍｇ／ｍＬ，２００μＬ，４７μｍｏｌ）を加えて、遮光し、室温で２４時間撹拌した。溶液を濃縮後、Ｈ_２Ｏ（１．７ｍＬ）に溶解させ、逆相ＨＰＬＣにて精製した。凍結乾燥して、粘性の高い紫色ｏｉｌ（スキーム３の化合物ｄ）を３０ｍｇ得た。収率６０％（ＴＦＡ塩として算出）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）：δ ７．７９−７．７６（ｍ，２Ｈ），７．７１−７．６７（ｍ，１Ｈ），７．５２−７．４７（ｍ，１Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１０（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．４Ｈｚ，２Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．６１−３．５２（ｍ，１４Ｈ），３．４３（ｂｒｓ，４Ｈ），３．４０（ｂｒｓ，４Ｈ），３．３１（ｓ，１２Ｈ），３．００（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．６０（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ）。ＭＳ（ＦＡＢ^＋）：７６２［Ｍ＋Ｈ］^＋。

スキーム３、４の化合物ｄ（２８ｍｇ，３２μｍｏｌ）をメタノール（４ｍＬ）に溶解し、凍結脱気した。１ＮＮａＯＨ（１．２ｍＬ，１．２ｍｍｏｌ）を滴下して加え、Ａｒ雰囲気下、遮光して、３０ｍｉｎ撹拌した。反応溶液を０℃に冷却後、２ＮＨＣｌ（０．６５ｍＬ）を滴下して加え、反応を停止した。メタノールを濃縮後、ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＣＥＰ）（１５ｍｇ，５２μｍｏｌ）を加え、１規定ＮａＯＨでｐＨ４〜７に調節し、４oＣで一晩放置した。逆相ＨＰＬＣにて精製し、凍結乾燥して、粘性の高い紫色ｏｉｌ（スキーム４の化合物ｅ）を２３ｍｇ得た。収率８４％（ＴＦＡ塩として算出）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ７．７１−７．６９（ｍ，２Ｈ），７．５６−７．５４（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．２９（ｍ，１Ｈ），７．２７−７．２３（ｍ，２Ｈ），７．０６−７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９３−６．９０（ｍ，２Ｈ），６．７８（ｓ，１Ｈ），３．７３（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．６３−３．５９（ｍ，１４Ｈ），３．４０−３．２９（ｍ，２０Ｈ），２．７２−２．５９（ｍ，４Ｈ），１．６０（ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ）。ＭＳ（ＦＡＢ^＋）：７２０［Ｍ＋Ｈ］^＋。

[実施例２]
（ローダミン誘導体化合物の合成−２）
式（Ｉ）においてｎ＝８の化合物を、以下のようなスキームにより合成した。

スキーム２、５の化合物ｃ（３８ｍｇ，８３μｍｏｌ）をＣＨ_３ＣＮ（３ｍＬ）に溶解し、Ｓ−ａｃｅｔｙｌｄＰＥＧ８ＮＨＳｅｓｔｅｒ（ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ製）のメタノール溶液（１００ｍｇ／ｍＬ，４００μＬ，６７μｍｏｌ）を加えて、遮光し、室温で２４時間撹拌した。Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（２５μＬ，７１μｍｏｌ）を加えて、更に１２時間撹拌した。溶媒を濃縮後、Ｈ_２Ｏ（３．５ｍＬ）に溶解し、逆相ＨＰＬＣにて精製した。凍結乾燥して、粘性の高い紫色ｏｉｌ（スキーム５の化合物ｆ）を５５ｍｇ得た。収率６３％（ＴＦＡ塩として算出）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ７．７２−７．７０（ｍ，２Ｈ），７．５６−７．５４（ｍ，１Ｈ），７．３９−７．３８（ｍ，１Ｈ），７．２７−７．２５（ｍ，２Ｈ），６．９７−６．８０（ｍ，４Ｈ），３．７３（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．６９−３．５９（ｍ，３０Ｈ），３．４０−３．２７（ｍ，２０Ｈ），３．０９（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．５７（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．３３（ｓ，３Ｈ）。ＭＳ（ＦＡＢ^＋）：９３８［Ｍ＋Ｈ］^＋。

スキーム５、６の化合物ｆ（４３ｍｇ，４１μｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、凍結脱気した。１ＮＮａＯＨ（１．５ｍＬ，１．５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、Ａｒ雰囲気下、遮光して、３０ｍｉｎ撹拌した。反応溶液を０℃に冷却後、１ＮＨＣｌ（１．５５ｍＬ）を滴下して加え、反応を停止した。ＭｅＯＨを濃縮後、ＴＣＥＰ（３０ｍｇ，１０５μｍｏｌ）を加え、１規定ＮａＯＨでｐＨ４−７に調節し、４℃で一晩放置した。逆相ＨＰＬＣにて精製し、凍結乾燥して、粘性の高い紫色ｏｉｌ（スキーム６の化合物ｇ）を３３ｍｇ得た。収率８０％（ＴＦＡ塩として算出）。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ ７．７１−７．６９（ｍ，２Ｈ），７．５６−７．５４（ｍ，１Ｈ），７．３９−７．３７（ｍ，１Ｈ），７．２７−７．２３（ｍ，２Ｈ），７．００−６．７６（ｍ，４Ｈ），３．７３（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．７１−３．５８（ｍ，３０Ｈ），３．４０−３．３０（ｍ，２０Ｈ），２．７０（ｍ，２Ｈ），２．５７（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），１．６０（ｔ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ）。ＭＳ（ＦＡＢ^＋）：８９６［Ｍ＋Ｈ］^＋。

[実施例３]
（ペプチドアレイの作製）
スライドグラス（松浪硝子工業製Ｓ１２２６；サイズ：２６ｍｍ×７６ｍｍ×１ｍｍ）に金を蒸着処理した金スライド（コート内容：１層目クロム２０Å、２層目金４５０Å）を、１ｍＭ濃度の８−Ａｍｉｎｏ−１−ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（同仁化学製）のエタノール溶液中に室温で１．５時間浸漬させた。こうしてアミノ基が金表面に導入された金スライドを、エタノール及び水で洗浄して乾燥を行い、０．４ｍｇ／ｍｌ濃度のＳＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ製）溶液（１５０ｍＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸バッファー；ｐＨ７．４に溶解して調製した。）を各々のガラス基板上のペプチドを固定化する領域を覆うように、３００μｌをドロップして溶液を広げて、室温で１５分間置反応させた。こうして、基板上にマレイミド基表面を形成させることができた。その後ガラス基板をエタノール、水の順で洗浄し乾燥させた。

乾燥後、ガラス基板上に基質となる合成ペプチド５種（以下、基質ペプチドとも示す。）をスポッター（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）自動スポッター）を用いて１０ｎＬずつスポットし、湿度を保った状態で、室温で１６時間静置して基質ペプチドを固定化させた。用いた基質ペプチドは、配列表に示したアミノ酸配列のものである。ＰＫＡ基質として知られているＫｅｍｐｔｉｄｅのアミノ酸配列を有するものであり、図２に各基質ペプチドの固定化された配置を示した。図２中、Ｎｏ．１はＰＫＡ基質のセリン型基質（配列番号１）、Ｎｏ．２は予めセリン残基がリン酸化されたポジティブコントロール（配列番号２）、Ｎｏ．３はセリン残基がアラニンに置換されたネガティブコントロール（配列番号３）、Ｎｏ．４はＰＫＡ基質のスレオニン型基質（配列番号４）、Ｎｏ．５は予めスレオニン残基がリン酸化されたポジティブコントロール（配列番号５）である。いずれのペプチドも末端にシステイン残基が付加されてなり、このシステイン残基の有するチオール基が、基板表面のマレイミド基とカップリング反応することにより基板上に基質ペプチドが固定化されるものである。基質ペプチド溶液は、１５０ｍＭＮａＣｌ及び１ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（東京化成工業製）を含む１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中に１，０．１及び０．０１ｍｇ／ｍｌ濃度になるように溶解したものを用いた。
（リン酸化の検出）
上記のように作製されたアレイをＰＢＳ、水の順で洗浄した後、０．１規定濃度のＮａＯＨ溶液（水／ＤＭＳＯ／エタノール；容量比４：３：１）の混合溶媒）中に浸漬して、室温で１時間の反応をさせることによりβ脱離を行った。その後、１００ｍＭＨＣｌで反応を停止させて、アレイをＰＢＳ、水の順に洗浄して乾燥させた。次に、実施例１及び２で合成されたローダミン誘導体化合物を、５０μＭ濃度で、５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．５；３．５％Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍＮ−ｏｘｉｄｅ含む）に溶解して、５００μｌをアレイ上にドロップした。遮光しながら、室温で１時間、Ｏｎ−ｃｈｉｐでのマイケル付加反応を行った。

マイケル付加反応を行った上記アレイを、ミリＱ水で３回洗浄した後、５％ＳＤＳ溶液（１００ｍＭＨＣｌ溶液）中に浸漬させて、ゆっくりとシェーキングさせながら1時間の洗浄を行った。ミリＱ水で３回洗浄した後、更にエタノール中に浸漬させて、ゆっくりとシェーキングさせながら1時間の洗浄を行った。洗浄されたアレイをエアーブローによって乾燥させた後、蛍光イメージング解析を行った。アレイ解析に際しては、マイクロアレイスキャナＧｅｎｅＰｉｘ４２００ＡＬ（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて、５３２ｎｍの波長で測定を行った。結果を図３に示した。

図３に示すように、リン酸化アミノ酸を含むＮｏ．２とＮｏ．５のペプチドにおいて、蛍光発色を確認することができている。したがって、リン酸化されているペプチドを特異的に検出することができているものと考えられた。

本発明を利用することにより、多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。

本発明におけるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化検出に関する反応系の基本概念を示した図である。実施例において作製したアレイパターンを示す図である。実施例においてリン酸化検出を行った結果を示す図である。

Claims

リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質のリン酸化セリンもしくはリン酸化スレオニン残基の側鎖リン酸基をβ脱離させた後、マイケル付加反応を行うことによりペプチドもしくは蛋白質のセリンもしくはスレオニン残基の側鎖水酸基のリン酸化を検出するための化合物であって、式（Ｉ）（式中、ｎは１〜３０の整数を表す）に示す化学構造を有することを特徴とする化合物。
基板上におけるペプチドもしくは蛋白質のペプチドもしくは蛋白質のセリンもしくはスレオニン残基の側鎖水酸基のリン酸化を検出する方法であって、リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質のリン酸化セリンもしくはリン酸化スレオニン残基の側鎖リン酸基をβ脱離させた後、式（Ｉ）（ｎは１〜３０の整数を表す）に示す化学構造を有する化合物を用いてマイケル付加反応を行うことを特徴とするリン酸化検出方法。
基板がガラスであることを特徴とする請求項２に記載のリン酸化検出方法。
基板表面が金であることを特徴とする請求項２又は３に記載のリン酸化検出方法。
末端にシステイン残基の付加されているペプチドが固定化されてなることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
キナーゼによりリン酸化され得るセリンもしくはスレオニン残基を有するペプチドもしくはタンパク質を有する基質を固定化したアレイ、塩基及び式（Ｉ）（ｎは１〜３０の整数を表す）に示す化学構造を有する化合物を含有する、キナーゼによるリン酸化検出用のキット。