JP2007505643A

JP2007505643A - 融合蛋白質

Info

Publication number: JP2007505643A
Application number: JP2006533432A
Authority: JP
Inventors: ヴォルフガング・グレースナー; ローン・リー・ミリカン・ジュニア; ティアン・ユ; シェン−フン・レインボー・チャン; アンドリュー・マーク・ビック
Original assignee: イーライリリーアンドカンパニー
Priority date: 2003-06-12
Filing date: 2004-06-10
Publication date: 2007-03-15
Also published as: AU2004247042A1; DE602004011770T2; US20070253966A1; EP1641483B1; CA2526169A1; PL1641483T3; EP1641483A2; ES2298785T3; DE602004011770D1; MXPA05013564A; BRPI0411112A; ATE385806T1; SI1641483T1; WO2004110472A3; WO2004110472A2; CN1802167A; PT1641483E; CY1107248T1; DK1641483T3

Abstract

本発明は特異的ＩｇＧ４−Ｆｃ誘導体に融合する治療用活性ペプチドを提供する。こういう融合蛋白質は、半減期が長く、半抗体形成が少なく、エフェクター活性も少なく、しかも免疫原生がない。融合蛋白質は、人の疾患および種々の他の症状や障害の処置に有効である。

Description

本発明は、治療用活性ペプチドおよび治療用活性ペプチドのインビボ半減期を長くする効果を有する免疫グロブリンの定常Ｈ鎖（Ｆｃ）部分を含む非相同融合蛋白質に関する。

治療用活性ペプチドの多くが、種々の疾患の処置のための臨床試験で将来性を示している。しかし、こういうペプチドを含む治療の有効性は、多くのペプチドの活性が低く、インビボで急速に排泄されてしまう、インビボの半減期が非常に短いという事実により制限されている。生物活性を維持すると同時に、こういうペプチドの半減期を長くする、またはこういうペプチドの排泄を減少させるための種々の試みが行なわれている。その中の1つの試みは、治療用活性ペプチドを免疫グロブリンの定常Ｈ鎖（Ｆｃ）部分に融合させることに関係している。免疫グロブリンは通常インビボで長い半減期を有している。例えば、ヒトのＩｇＧ分子は２３日までの半減期を有している。インビボの安定性に部分的に関係しているのが、免疫グロブリンのＦｃ部分である。こういう非相同融合蛋白質は、ペプチドの生物活性を維持しながら、免疫グロブリンのＦｃ部分が提供する安定性も利用する。

こういうアプローチはペプチド療法として有効ではあるが（ＷＯ０２／４６２２７を参照）、半抗体形成、好ましくないエフェクター機能、グリコシル化部位、および不均質発現に関して問題がある。本発明は、分子のＦｃ部分の種々の位置に存在して半抗体を減少させエフェクター機能を減少または排除するアミノ酸を同定し、置換することにより、この問題を乗り越えようと試みている。更に本発明は、分子のＦｃ部分の種々の位置に存在し、グリコシル化部位を持たず、発現のとき不均質性の少ないアミノ酸を同定し、置換する方法も提供する。更に、分子のＦｃ部分の種々の位置にあるアミノ酸を同定し、置換したとしても、非相同融合蛋白質の反復および長期投与の後も免疫反応を引き起こさないことが望ましい。

本発明の化合物には、ＳＥＱＩＤＮＯ：１である配列

（ここで、
位置１のＸａａは、Ａｌａであるか、存在しない、
位置１６のＸａａは、ＰｒｏまたはＧｌｕであり、
位置１７のＸａａは、Ｐｈｅ、ＶａｌまたはＡｌａであり、
位置１８のＸａａは、Ｌｅｕ、ＧｌｕまたはＡｌａであり、
位置８０のＸａａは、ＡｓｎまたはＡｌａであり、
位置２３０にあるＸａａは、Ｌｙｓであるか、存在しない）
を含む免疫グロブリンのＦｃ部分に融合した治療用活性ペプチドを含む非相同融合蛋白質が含まれる。

本発明のペプチド部分とＦｃ部分は直接一体となって、またはリンカーを通して融合される。リンカーの例としては、配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:2)を有するＧに富むペプチドである。リンカーの他の例としては、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (1.5L) (SEQ ID NO:4)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (2L) (SEQ ID NO:6)、Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys (SEQ ID NO:7)、およびAsn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg (SEQ ID NO:8)などが含まれるが、これに限定するものではない。

ペプチド部分のＣ末端とＦｃ部分のＮ末端を融合する。あるいは、ペプチド部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端を融合する。更に、ペプチド部分のＣ末端とＦｃ部分のＮ末端を融合し、別のペプチド分子のＮ末端とそのＦｃ部分のC末端を融合し、その結果、ペプチド−Ｆｃ−ペプチド融合蛋白質を得る。

本発明は、本発明の非相同融合蛋白質をコード化するポリヌクレオチド、およびそういうポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も含んでいる。非相同融合蛋白質の投与を含む、ヒトの疾患および種々の他の症状または障害で苦しんでいる患者を処置する方法も、本発明に含まれる。

本発明の非相同融合蛋白質には、治療用活性ペプチド部分とＦｃ部分が含まれる。Ｆｃ部分には、Ｆｃ配列と融合していない治療用活性ペプチドと比較してインビボ安定性が増大した非相同融合蛋白質を提供するヒトＩｇＧ４配列への置換体も含まれる。

本発明の非相同融合蛋白質には、ヒトＩｇＧ４由来であるがヒトの野生型配列と比べて１つまたはそれ以上の置換体を含むＦｃ部分が含まれる。免疫グロブリンのＦｃ部分と言うのは、本出願で使用される場合、免疫学の分野で一般的に使用されている意味で言及されている。特にこの用語は、２つの抗原結合部位(Ｆａｂ断片)を含まない抗体断片を意味する。Ｆｃ部分は、非共有結合の相互作用とジスルフィド結合を通して関連している２つのＨ鎖を含む抗体の定常部で構成されている。Ｆｃ部分はヒンジ部位を含み、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを通して抗体のＣ末端へ延びている場合がある。Ｆｃ部分には１つまたはそれ以上のグリコシル化部位が含まれる場合もある。

ヒトの免疫グロブリンは５種類あり、それぞれ異なるエフェクター機能と薬物動態特性を有している。ＩｇＧは５種類のうち最も安定しており、ヒト血清の半減期は約２３日である。ＩｇＧには４種類のサブクラス（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、およびＧ４）があり、それぞれエフェクター機能と呼ばれる異なる生物機能を有している。こういうエフェクター機能は通常Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用を通して仲介される。または免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＭのＨ鎖を認識し、それと結合して、古典的補体活性化経路を開始する補体１（Ｃ１ｑ）の亜成分と結合することにより仲介される。ＦｃγＲとの結合は抗体依存細胞仲介で細胞を溶解する場合があり、補体因子との結合は補体仲介で細胞を溶解する場合がある。非相同融合蛋白質をデザインするにあたり、半減期を長くする機能のためだけにＦｃ部分を利用する場合、エフェクター機能を抑えることが重要である。従って、本発明の非相同融合蛋白質は、ＦｃγＲおよび補体因子との結合能力がＩｇＧの他の亜型と比べて低いＩｇＧ４Ｆｃ部位に由来する。しかしＩｇＧ４はヒトの標的細胞を枯渇させることが証明されている［アイザックス（Ｉｓｓａｃｓ）等, Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６：４２７−４３３（１９９６）］。本発明の非相同融合蛋白質は体内の種々の器官の細胞を標的にするので、非相同融合蛋白質にＩｇＧ４由来の部位を使用すれば、非相同融合蛋白質と標的細胞に存在する受容体との相互作用を通して、免疫反応が始まる場合がある。従って、本発明の非相同融合蛋白質の一部であるＩｇＧ４Ｆｃ部位には、エフェクター機能を排除する置換体が含まれている。本発明の非相同融合蛋白質のＩｇＧ４Ｆｃ部分は、残基２３３のグルタミン酸塩をプロリンで置換、残基２３４のフェニルアラニンをアラニンまたはバリンで置換、および残基２３５のロイシンをアラニンまたはグルタミン酸塩で置換（ＥＵ番号付け, カバット（Ｋａｂａｔ）、Ｅ．Ａ．等（１９９１）免疫学的関心の蛋白質の配列（ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ）, 第５版, 米国保健福祉省, メリーランド州べテスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）, ＮＩＨ出版番号９１−３２４２)、の１つまたはそれ以上を含んでいる場合がある。こういう残基はＳＥＱＩＤＮＯ：１の位置１６、１７、および１８に対応している。更に、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の位置８０に相当する残基２９７（ＥＵ番号付け）のＡｓｎをＡｌａで置換することによりＩｇＧ４Ｆｃ部位のＮ連結グリコシル化部位を除去するのも、非相同融合蛋白質の残基作動体活性を排除する方法である。

更に、本発明の非相同融合蛋白質のＩｇＧ４Ｆｃ部分には、Ｈ鎖ダイマー形成を安定化し半ＩｇＧ４Ｆｃ鎖の形成を阻害する置換体も含まれる。本発明の非相同融合蛋白質は、ジスルフィド結合と種々の非共有結合の相互作用により結合するダイマーとして存在するのが望ましい。野生型ＩｇＧ４には、残基２２４（ＥＵ番号付け）で始まるPro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys (SEQ ID NO:3)が含まれている。治療用活性ペプチドＦｃ鎖のこのモチーフは、それに対応する別の治療用活性ペプチドＦｃ鎖のモチーフとジスルフィド結合を形成する。しかしモチーフ内にセリンが存在すれば、単鎖の非相同融合蛋白質が形成される。本発明には、ＩｇＧ４配列が更に修飾され、位置２２８（ＥＵ番号付け）のセリンをプロリン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸残基１１）で置換した非相同融合蛋白質も含まれる。

天然分子に存在するＣ末端のリジン残基は、本出願記載の非相同融合蛋白質のＩｇＧ４由来Ｆｃ部分から削除されている場合がある（ＳＥＱＩＤＮＯ：１の位置２３０、削除されたリジンはｄｅｓ−Ｋと呼ばれる）。リジンがＣ末端コドンでコード化されているある種の細胞（例えばＮＳＯ細胞）で発現される非相同融合蛋白質は、分子のある部分がＣ末端アミノ酸としてリジンを有し、別の部分のリジンが削除されているので、非均質である。削除が起きるのは、ある種の哺乳類細胞で発現するときに生じる蛋白質分解酵素の作用の所為である。従って、この非均質性を避けるため、非相同融合発現物は、リジン用のＣ末端コドンが欠如していることが望ましい。

治療用活性ペプチドのＣ末端アミノ酸をグリシンの豊富なリンカーを通して、ＩｇＧ４Ｆｃ類似体部分のＮ末端に融合するのが望ましい。本発明の非相同融合蛋白質のインビボ機能と安定性は、小ペプチド・リンカーを加え、望ましくないドメイン間の相互作用の可能性を防止することにより、最適化が可能である。更に、グリシンの豊富なリンカーは構造上の柔軟性を提供するので、治療用活性ペプチド部分が標的細胞の受容体と生産的に相互作用できるようになる。しかしこういうリンカーは、非相同融合蛋白質がインビボで免疫原生となる可能性を有意に高める場合がある。従って、望ましくないドメイン間の相互作用を阻止するのに必要な長さ、および／または生物活性および／または安定性を最適化するのに必要な長さ以上の長さにしないのが望ましい。グリシンの豊富な好ましいリンカーには、配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:2)も含まれる。本発明の非相同融合蛋白質では、このリンカーのコピーを増やすのも可能ではあるが、長期および反復投与に伴う免疫原生の危険性を最小限に抑えるには、この単一のリンカーを使用するのが望ましい。

治療用活性ペプチドには、これだけに限定されるものではないが、酵素、酵素阻害剤、抗原、抗体、ホルモン、凝固のコントロールに関係している因子、インターフェロン、サイトカイン、成長因子および/または分化因子、骨組織の発生・吸収に関係する因子、細胞の運動性と移動に関係する因子、抗菌性または亢真菌性因子、走化性因子、細胞増殖抑制因子、血漿または間質性の接着性分子または細胞外基質、あるいは循環器系および間質性部分の病理および動脈・静脈血栓の形成、癌の転移、腫瘍血管形成、炎症性ショック、自己免疫疾患、骨および骨関節疾患などに関係する細胞および／または細胞間相互作用の拮抗薬または作用薬であるペプチド配列などが含まれる。治療用活性ペプチドの具体例としては、これだけに限定されるものではないが、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、好酸球（ＥＯＳ）−ＣＳＦ、マクロファージ（Ｍ）−ＣＳＦ、ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ（造血幹細胞増殖因子）、赤血球（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ｃ−ｋｉｔリガンド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２１、幹細胞因子（ＳＣＦ）、肥満細胞成長因子、赤血球強化活性（ＥＰＡ）、ラクトフェリン（ＬＦ）, Ｈ−サブユニット・フェリチン（すなわち酸性イソフェリチン）、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ１およびＥ２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、−β（すなわちリンフォトキシン）、インターフェロン（ＩＦＮ）−α（１ｂ、２ａ、および２ｂ）、−β、−ω、および−γ、形質転換成長因子（ＴＧＦ）−β、アクチビン、インヒビン、白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、マクロファージ炎症蛋白（ＭＩＰ）−１−α（すなわち幹細胞阻害物質）、マクロファージ炎症蛋白（ＭＩＰ）−１β、マクロファージ炎症蛋白（ＭＩＰ）−２−α（すなわちＧＲＯ−β）、ＧＲＯ−α、ＭＩＰ−２−β（すなわちＧＲＯ−γ）、血小板因子−４、マクロファージ走化性および活性因子、ＩＰ−１０、カルシトニン、成長ホルモン、ＰＴＨ、ＴＲ６、ＢＬｙＳ、ＢＬｙＳ単鎖抗体、レジスチン、成長ホルモン放出因子、ＶＥＧＦ−２、ＫＧＦ−２、Ｄ−ＳＬＡＭ、ＫＤＩ、ＴＲ２、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、エキセンディン４、神経ペプチド脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）またはその受容体ＰＡＣ−１、ＶＰＡＣ−１またはＶＰＡＣ−２のいずれか１つ、あるいは前述のペプチドのいずれかの類似体、断片または誘導体などが含まれる。

特定の非相同融合蛋白質に関して本出願で使用されている命名法は、次の通りである。Ｌは配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:2)を有するリンカーである。Ｌの直前の番号はＦｃ部分から治療用活性ペプチド部分を分離しているリンカーの数を示す。１．５Ｌで示されるリンカーは、配列
Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:4)を意味する。２Ｌで示されるリンカーは、配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:6)を意味する。ＩｇＧ４は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるヒトＩｇＧ４Ｆｃ配列の類似体を意味する。非相同融合蛋白質のＩｇＧ４Ｆｃ部分の置換体は括弧内に示される。野生型アミノ酸は一般的な略号で表され、その後にＥＵ番号付けシステムを使って全ＩｇＧ４配列内の位置番号が付され、その後にその位置に置換されたアミノ酸が一般的な略号により示される。

本発明の非相同融合蛋白質は、非相同融合蛋白質の様々な大きさのゆえに、種々の方法を使って作成可能ではあるが、好ましいのは組み換え法である。本出願で開示・請求されている本発明の目的に照らし、分子生物学の一般用語と略号を以下のように定義する。

本出願で使用される“塩基対”または“ｂｐ”は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。略号Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴは、それがＤＮＡ分子に関係している場合、それぞれデオキシリボヌクレオチドの（デオキシ）アデノシン、（デオキシ）シチジン、（デオキシ）グアノシン、およびチミジンの５’−モノリン酸塩に相当する。略号Ｕ、Ｃ、Ｇ、およびＡは、ＲＮＡ分子に関係している場合、それぞれリボヌクレオシドのウリジン、シチジン、グアノシン、およびアデノシンの５’−モノリン酸塩に相当する。二本鎖ＤＮＡにおいては、塩基対はＡとＴまたはＣとＧの対を意味する。ＤＮＡ／ＲＮＡにおいては、ヘテロ二本鎖塩基対はＡとＵまたはＣとＧの対を意味する（後出の相補の定義を参照）。

ＤＮＡの“消化”または“制限”と言うのは、ＤＮＡのある配列だけに作用する制限酵素（配列特異的エンドヌクレアーゼ）でＤＮＡを触媒的に開裂することを意味する。本出願で使用される種々の制限酵素は商業的に容易に入手可能であり、反応条件、補助因子、および他の要求事項も当業者には良く知られている。特定の制限酵素の適切な緩衝液および基質量は製造業者により明記されているか、文献ですぐ見出せる。

“ライゲーション”と言うのは、２つの二本鎖核酸断片間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味する。特別の記載がない限り、ライゲーションは、既知の緩衝液と条件を使い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡリガーゼを使って達成される。

“プラスミド”と言うのは、（通常）自己複製する染色体外の遺伝子要素を意味する。

“組み換えＤＮＡクローン化ベクター”と言うのは、本出願で使用される場合、自動的に複製する因子すべてを意味し、例えば、これだけに限定されるものではないが、プラスミドやファージなどが該当し、１つまたはそれ以上のＤＮＡ断片が付加できるまたは付加されているＤＮＡ断片もその中に含まれる。

“組み換えＤＮＡ発現ベクター”と言うのは、本出願で使用される場合、挿入ＤＮＡの転写をコントロールするプロモーターが導入されている組み換えＤＮＡクローン化ベクターのすべてを意味する。

“転写”というのは、ＤＮＡの核酸配列に含まれている情報が相補的ＲＮＡ配列に移されるプロセスを意味する。

“形質移入”と言うのは、コード化されている配列が実際に発現しているか否かに関係なく、発現ベクターが宿主細胞に取り込まれることを意味する。形質移入の数多くの方法が当業者に知られている。例えば、リン酸カルシウム共沈降反応、リポソーム形質移入、エレクトロポレーション法などである。宿主細胞内でベクターの作用を示すものが何か生じた場合、一般に形質移入が成功したと認識される。

“形質転換”と言うのは、ＤＮＡが複製できるように、染色体外の要素としてまたは染色体の取り込みにより、生物体にＤＮＡを導入することを意味する。細菌および真核宿主を形質転換する方法は当業者には良く知られており、そのうちの多く、例えば、核注入、原形質融合、塩化カルシウムを使ったカルシウム処理法などがＪ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等により要約されている（分子クローニング：実験室マニュアル（１９８９））。ＤＮＡを酵母に導入する場合、一般的に、形質移入と言う用語ではなく形質転換と言う用語が使用される。

本出願で使用される“翻訳”と言う用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の遺伝情報がポリペプチド鎖の合成を特定し方向付けるのに使用されるプロセスを意味する。

“べクター”と言うのは、適切なコントロール配列との組み合わせにより形質移入および／または形質転換の対象となる宿主細胞に特定の性質を付与する適切な蛋白質分子が存在し、それに対応するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子操作において、細胞の形質移入および／または形質転換に使用される核酸化合物を意味する。プラスミド、ウイルス、およびバクテリオファージは適切なベクターである。人工的なベクターは、制限酵素とリガーゼを使って、異なる起源のDNAを切断・結合することにより作成される。本出願で使用されるベクターと言う用語には、組み換えＤＮＡクローン化ベクターおよび組み換えＤＮＡ発現ベクターも含まれる。

本出願で使用される“相補的”または“相補性”と言う用語は、二本鎖核酸において水素結合により連結している塩基対（プリンおよびピリミジン）を意味する。グアミンおよびシトシン、アデニンおよびチミン、そしてアデニンおよびウラシルの塩基対が相補的である。

“プライマー”と言うのは、酵素または合成による伸長のための開始基質として機能する核酸断片を意味する。

“プロモーター”と言うのは、ＤＮＡからＲＮＡへの転写を開始するＤＮＡ配列を意味する。

“プローブ”と言うのは、別の核酸化合物とハイブリダイズする核酸配列またはその断片を意味する。

“リーダー配列”と言うのは、目的のポリペプチドを生産するため、酵素的または化学的に除去可能なアミノ酸配列を意味する。

“分泌シグナル配列”と言うのは、一般的に分子量の比較的大きいポリペプチドのＮ末端部位に存在し、そのポリペプチドと細胞膜の一部との結合を開始する機能を行い、原形質膜を通してそのポリペプチドを分泌するアミノ酸配列を意味する。

ヒトの野生型ＩｇＧ４蛋白質は、種々の源から入手可能である。例えば、そういう蛋白質は、目的のｍＲＮＡを検出可能なレベルで発現する細胞を使って調製されるｃＤＮＡライブラリーから得られる。ライブラリーのスクリーニングは、公表されているＤＮＡまたは蛋白質配列を使って目的の蛋白質用にデザインしたプローブを使用すれば実現できる。例えば、免疫グロブリンのＬ鎖またはＨ鎖の定常部に関しては、次の文献に記載されている：アダムス（Ａｄａｍｓ）等, 生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９：２７１１−２７１９（１９８０）；ゴーゲット（Ｇｏｕｇｈｅｔ）等, 生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９：２７０２−２７１０; ドルビー（Ｄｏｌｂｙ）等, （１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：６０２７−６０３１（１９８０）; ライス（Ｒｉｃｅ）等, Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：７８６２−７８６２（１９８２）; フォークナー（Ｆａｌｋｎｅｒ）等、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９８：２８６−２８８（１９８２）; モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）等, Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−２５６（１９８４））。

選択プローブによるｃＤＮＡまたはゲノム・ライブラリーのスクリーニングは、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等, 分子クローニング：実験室マニュアル, コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ），ＮＹ（１９８９）に記載されているような標準の方法を使って行なっても良い。免疫グロブリン蛋白質をコード化する遺伝子を単離する別の方法は、ＰＣＲ法である（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等，前出；ディーフェンバック（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）等, ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）、ＮＹ（１９９５））。ＰＣＲプライマーは、公表されている配列を基にデザインできる。

一般的に、特定のライブラリーからクローン化される全長の野生型配列は、非相同融合蛋白質の一部である治療用活性ペプチドの血漿半減期を長期化させる機能を保持している本発明のＩｇＧ４Ｆｃ類似体断片の作成用テンプレートとして利用できる。ＩｇＧ４Ｆｃ類似体の断片は、目的の断片の端に対応する配列にハイブリダイズするようにデザインしたプライマーを使って、ＰＣＲ法により生成できる。ＰＣＲプライマーは、制限酵素部位を作成するようにデザインして、発現ベクター中でのクローニングを簡便化することも可能である。

本発明の治療用活性ペプチドをコード化するＤＮＡは、種々の方法を使って作成できる。例えば、上述のようなクローニング方法や化学合成方法などである。コード化されているペプチドが短いので、化学合成は優れた選択であるかもしれない。治療用活性ペプチドのアミノ酸配列は一般的に良く知られており、公表もされている（ロペス（Ｌｏｐｅｚ）等, Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．,ＵＳＡ、８０：５４８５−５４８９（１９８３）；ベル（Ｂｅｌｌ）等、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０２：７１６−７１８（１９８３）；ハインリッヒ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，Ｇ．）等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．, １１５：２１７６−２１８１（１９８４）；ギグリオン（Ｇｈｉｇｌｉｏｎｅ、Ｍ．）等、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ２７：５９９−６００（１９８４））。

非相同融合蛋白質をコード化する遺伝子は、治療用活性蛋白をインフレームでコード化するＤＮＡを本出願記載のＩｇＧＦｃ蛋白質をコード化するＤＮＡと結合させることにより作成できる。治療用活性蛋白とＩｇＧ４Ｆｃ断片をコード化するＤＮＡは、ライゲーションの前または非相同融合蛋白質全体をコード化するｃＤＮＡのいずれかにおいて、突然変異させることができる。種々の変異誘発技術が当業者には知られている。治療用活性蛋白をコード化する遺伝子およびＩｇＧ４Ｆｃ類似体蛋白をコード化する遺伝子は、Ｇに富むリンカー・ペプチドをコード化するＤＮＡを使ってインフレームで結合させることも可能である。本発明の非相同融合蛋白質の１つをコード化するＤＮＡ配列の例として、Gly⁸-Glu²²-Gly³⁶-GLP-1(7-37)-1L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, des-K)
は、次のＳＥＱＩＤＮＯ：５として示される
CACGGCGAGGGCACCTTCACCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGAGGAGCAGGCCGCCAAGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGCGGCGGTGGTGGTGGCTCCGGAGGCGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGCTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT (SEQ ID NO:5)。

宿主細胞は、本出願記載の非相同融合蛋白質用の発現ベクターまたはクローン化ベクターを使って形質移入または形質転換させ、プロモーターの誘発、形質転換体の選択、または目的の配列をコード化する遺伝子の増幅用に修飾した従来の培地で培養する。培地、温度、ｐＨなどの培養条件は、過度の予備実験なしに、当業者により選択可能である。細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、および実際的な技術は、次の文献に見出せる：哺乳類細胞バイオテクノロジー（ＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：実践的アプローチ（ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ）、バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ、Ｍ．）編、（ＩＲＬプレス（ＩＲＬＰｒｅｓｓ）、１９９１）およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等, 前出。形質移入の方法は、当業者には良く知られている。例えば、ＣａＰＯ４およびエレクトロポレーションなどである。哺乳動物の細胞宿主系の形質転換については、一般的な説明が米国特許番号４，３９９，２１６に記載されている。酵母への形質転換は、通常、次の方法に従って行なわれる。バン・ソリンゲン（ｖａｎＳｏｌｉｎｇｅｎ）等, ＪＢａｃｔ．１３０（２）：９４６−７（１９７７）およびシャオ（Ｈｓｉａｏ）等, Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６（８）：３８２９−３３（１９７９）。しかし、ＤＮＡを細胞に導入する他の方法、例えば、核微量注入法、エレクトロポレーション、細菌の原形質と無傷の細胞の融合、ポリブレンやポリオメチンなどのポリカチオンなども使用できる。哺乳動物の細胞の形質転換に使用される種々の技術に関しては、ケオウン（Ｋｅｏｗｎ）等, 酵素学の方法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１８５：５２７−３７（１９９０）およびマンサウア（Ｍａｎｓｏｕｒ）等, ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３３６（６１９７）：３４８−５２（１９８８）を参照の事。

本出願のベクターを使って核酸（例えばＤＮＡ）をクローン化または発現させるための適切な宿主細胞には、酵母や高等真核細胞が含まれる。

糸状真菌や酵母などの真核微生物は、非相同融合蛋白質ベクターのクローン化宿主または発現宿主として適している。サッカロミセス属のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、よく使われる下等真核宿主微生物である。他には、分裂酵母のＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ［ビーチ（Ｂｅａｃｈ）およびナース（Ｎｕｒｓｅ）、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９０：１４０−３（１９８１）；ＥＰ１３９，３８３、１９９５年５月２日出版］、Ｋｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４）［ド・ルーベンコート（ｄｅＬｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ）等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４（２）：７３７−４２（１９８３）］などのＭｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主［米国特許番号４，９４３，５２９；フリート（Ｆｌｅｅｒ）等, Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９（１０）：９６８−７５（１９９１）］、Ｋ．ｆｉａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６．９０６）［バン・デン・バーグ（ＶａｎｄｅｎＢｅｒｇ）等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８（２）：］１３５−９（１９９０）］、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｉｅｒａｎｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）、ピチア属のＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）［スリークリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）等, Ｊ．ＢａｓｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８（４）：２６５−７８（１９８８）］、カンジダ属、トリコデルマ属のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）［ケース（Ｃａｓｅ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ７６（１０）：５２５９−６３（１９７９）］、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓｏｃｃｉｄｅｎｔｕｌｉｓなどのシュワニオミセス属（ＥＰ３９４，５３８, １９９０年１０月３１日出版）、そしてアカパンカビ属、ペニシリン属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属（ＷＯ９１／００３５７, １９９１年１月１０日出版）、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ［バランス（Ｂａｌａｎｃｅ）等, Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１２（１）：２８４−９（１９８３）；ティルバーン（Ｔｉｌｂｕｒｎ）等, 遺伝子（Ｇｅｎｅ）２６（２−３）：２０５−２１（１９８３）；イェルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）等, Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１（５）：１４７０−４（１９８４）］およびＡ．ｎｉｇｅｒ［ケリー（Ｋｅｌｌｙ）およびハインズ（Ｈｙｎｅｓ）、ＥＭＢＯＪ．４（２）：４７５−９（１９８５）］などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主などの糸状真菌などが含まれる。メチロトローフ酵母は、ハンセニューラ属、カンジダ属、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ属、ピチア属、サッカロミセス属、トルロプシス属、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｉａ属からなる属から選択される。このクラスの酵母の特定の種のリストは、Ｃ．アントニー（Ａｎｔｏｎｙ）のメチロトローフの生化学（ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＭｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ）２６９（１９８２）に掲載されている。

本発明の非相同融合蛋白質の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から導かれる。無脊椎生物の細胞には、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２、ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｐ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｈｉｇｈ−５などの昆虫の細胞および植物の細胞が含まれる。哺乳動物の有効な宿主細胞株には、ＮＳＯ骨髄腫細胞、チャイニーズ・ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＰ２細胞、およびＣＯＳ細胞などが含まれる。より具体的な例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）により形質転換したサルの腎臓ＣＶｌ株、ヒトの胎児の腎臓株［２９３細胞または懸濁培養で成長させるためにサブクローン化した２９３細胞, グラハム（Ｇｒａｈａｍ）等、Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．、３６（１）：５９−７４（１９７７）］、チャイニーズ・ハムスターの卵巣細胞／−ＤＨＦＲ［ＣＨＯ、ウルラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチャシン（Ｃｈａｓｉｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７（７）：４２１６−２０（１９８０）］、マウスのセルトリ細胞［ＴＭ４, メザー（Ｍａｔｈｅｒ）, Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１）：２４３−５２］（１９８０）］、ヒトの肺の細胞（Ｗ１３８．ＡＴＣＣＣＣＬ７５）、ヒトの肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）、マウスの乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）などが挙げられる。本発明の非相同融合蛋白質の生産にとって好ましい細胞株はＮＳＯ骨髄腫細胞株であり、これはヨーロッパ細胞培養コレクション（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）ｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ）（ＥＣＡＣＣ、カタログ番号８５１１０５０３）から入手可能で、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ、Ｇ．）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ.）に記載されている（１９８１）酵素学の方法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）７３（１３）：３−４６；および単クローン抗体の調製（ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）：戦術および方法（ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓａｎｄＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、アカデミック・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク州ニューヨーク市（Ｎ．Ｙ．、Ｎ．Ｙ．））。

本発明の非相同融合蛋白質は遺伝子組み換えで直接生成しても良いし、シグナル配列を有する蛋白質または成熟した非相同融合蛋白質のＮ末端に特異的な開裂部位を作成する他の追加配列を有する蛋白質として生成しても良い。一般的に、シグナル配列はベクターの成分であっても良いし、ベクターに挿入される非相同融合蛋白質をコード化するＤＮＡの一部であっても良い。酵母の分泌では、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼ・リーダー、アルファ因子リーダー（サッカロミセス属およびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属のｃｃ因子リーダーを含む；後者は米国特許番号５，０１０，１８２に記載されている）、酸性リン酸分解酵素リーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼ・リーダー（ＥＰ３６２，１７９）、またはＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルであっても良い。哺乳動物の細胞発現では、蛋白質の分泌をコントロールするのに、哺乳動物のシグナル配列、例えば同種または関連種の分泌ポリペプチドのシグナル配列などやウイルスの分泌リーダーを使用しても良い。

発現ベクターにもクローン化ベクターにも、１つまたはそれ以上の選択された宿主細胞でベクターの複製を可能にする核酸配列が含まれている。発現ベクターにもクローン化ベクターにも、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子が含まれている。典型的な選択遺伝子は、（ａ）ネオマイシン、メトトレキサート、テトラサイクリンなどの抗生物質や他の毒素に抵抗性を与える蛋白質、（ｂ）独立栄養欠乏を補足する蛋白質、または（ｃ）天然培地では入手できない重要な栄養素、例えば、バチルス菌用のＤアラニン・ラセマーゼをコード化する遺伝子等を供給する蛋白質、をコード化する。

哺乳動物の細胞に適した選択可能マーカーの例は、非相同融合蛋白質をコード化する核酸を取り込むことのできる細胞の同定を可能にするもので、例えばＤＨＦＲやチミジンキナーゼなどである。野生型ＤＨＦＲが使用される場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠如しているＣＨＯ細胞株で、［ウルラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチャシン（Ｃｈａｓｉｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７（７）：４２１６−２０（１９８０）］に記載されているように調製・増殖される。酵母で使用される適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐｌ遺伝子である［スティンクコーム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）等, ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２８２（５７３４）：３９−４３（１９７９）；キングスマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）等、遺伝子（Ｇｅｎｅ）７（２）：１４１−５２（１９７９）；チュンパー（Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ）等、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１０（２）：１５７−６６（１９８０）］。このｔｒｐｌ遺伝子は、トリプトファンで成長できない酵母の変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ．４４０７６またはＰＥＰＣ１に選択マーカーを提供する［ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）, 遺伝学（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）８５：２３−３３（１９７７）］。

発現ベクターおよびクローニングベクターは、ｍＲＮＡ合成をコントロールするため、非相同融合蛋白質をコード化する核酸配列と操作可能な状態で結合しているプロモーターを通常含んでいる。種々の宿主細胞で認識されるプロモーターは良く知られている。酵母宿主と一緒に使用するのに適したプロモーター配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター［ヒッチェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（２４）：１２０７３−８０（１９８０）］、または他の解糖酵素［ヘス（Ｈｅｓｓ）等、Ｊ．Ａｄｖ．ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ．７：１４９（１９６８）；ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１７（２３）：４９００−７（１９７８）］、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、へキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭素酵素、ホスフォフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェート・イソメラーゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グルコキナーゼなどのプロモーターが含まれる。増殖条件で転写をコントロールするという別の特長も有している誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連している変性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、およびマルトースとガラクトースの利用に関係している酵素のプロモーターである。酵母発現の使用に適したベクターおよびプロモーターは更にＥＰ７３，６５７にも記載されている。非相同融合蛋白質をコード化するｍＲＮＡを哺乳類の宿主細胞のベクターから転写する場合、例えば、次のようなプロモーターを使ってその転写をコントロール可能である：ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシの乳頭腫ウイルス、鳥の肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるプロモーター、アクチン・プロモーターや免疫グロブリン・プロモーターなどの非相同哺乳類プロモーターから得られるプロモーター、および熱ショックプロモーターから得られるプロモーター。但し、そういうプロモーターは宿主細胞系と適合性であることを条件とする。

高等真核生物の非相同融合蛋白質をコード化するポリヌクレオチドの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大できる。エンハンサーはＤＮＡのｃｉｓ作用性要素で、通常１０から３００ｂｐで、プロモーターに作用して転写を増大させる。今では、哺乳動物の遺伝子から多くのエンハンサー配列が知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−ケト蛋白質、およびインスリン）。しかし、通常は、真核細胞のウイルスから得られるエンハンサーが使用される。例には、複製開始点の後部側にあるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーター・エンハンサー、複製開始点の後部側にあるポリオマ・エンハンサー、アデノウイルス・エンハンサーなどである。エンハンサーは、ベクターの中の非相同融合蛋白質をコード化する配列の５’または３’の位置に挿入して良いが、プロモーターの５’の位置に位置するのがより好ましい。

真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物体由来の有核細胞）で使用される発現ベクターには、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含まれる。そういう配列は、通常、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時には３’の未翻訳部位から得られる。こういう部位には、非相同融合蛋白質をコード化するｍＲＮＡの未翻訳部分に、ポリアデニル化された断片として転写されているヌクレオチド断片が含まれている。

非相同融合蛋白質の種々の形態を、培養培地または宿主細胞の溶解産物から回収できる。膜結合している場合は、適切な洗浄液（例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）または酵素による開裂により、膜から遊離させることができる。非相同融合蛋白質の発現に使用された細胞は、凍結溶解サイクル、音波処理、機械的分断、細胞溶解剤などの種々の物理的または化学的方法で破砕できる。

本発明の非相同融合蛋白質が適切な宿主細胞で発現すると、このアナログを単離し精製する。精製には、カルボキシメチルセルロース上での分画、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５などのゲル濾過、ＤＥＡＥまたはＭｏｎｏ−Ｑなどの陰イオン交換樹脂、ＣＭまたはＭｏｎｏ−Ｓなどの陽イオン交換樹脂、ポリペプチドのエピトープ標識物と結合させる金属キレートカラム、逆相ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシング、シリカゲル、エタノール沈降、および硫酸アンモニウム沈降、の方法が適切である。

種々の蛋白質精製方法が使用できる。そういう方法は当業者には良く知られており、様々な文献にも記載されている（例えば、ドイチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）, 酵素学の方法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１８２：８３−９（１９９０）およびスコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）、蛋白質精製（ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：原理と実践（ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ）、シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク（１９８２））。どの精製方法を選択するかは、使用する精製プロセスの性質および生成する非相同融合蛋白質の内容次第である。例えば、Ｆｃ断片を含む非相同融合蛋白質は、プロテインＡまたはプロテインＢアフィニティーマトリックスを使えば、効果的に精製できる。アフィニティーマトリックスから非相同融合蛋白質を溶出するには、低または高ｐＨの緩衝液を使えば良い。マイルドな溶出条件を使用すれば、非相同融合蛋白質の不可逆的変性を防止できる。

本発明の非相同融合蛋白質は、１つまたはそれ以上の賦形剤と共に調剤しても良い。本発明の非相同融合蛋白質は、製薬的に容認できる緩衝液と組み合わせ、容認可能な安定性を得るためのｐＨおよび非経口投与などの投与に適したｐＨに調整しても良い。適宜、１つまたはそれ以上の製薬的に容認可能な抗菌剤を加えても良い。製薬的に容認可能な抗菌剤としては、メタクレゾールおよびフェノールが好ましい。イオン強度または張度を調整するのに、１つまたはそれ以上の製薬的に容認できる塩を加えても良い。調剤の等張性を更に調整するため、１つまたはそれ以上の賦形剤を加えても良い。等張性を調整する賦形剤にはグリセリンなどがある。製薬的に容認できると言うのは、ヒトまたは他の動物への投与に適している、従って毒性物質や好ましくない汚染物が含まれておらず、活性成分の活性を阻害しないことを意味する。

本発明の非相同融合蛋白質は、溶液として、または適切な希釈剤を用いて溶液にし得る凍結乾燥粉末として製剤してもよい。非相同融合蛋白質が安定している形態の１つが凍結乾燥方法であり、緩衝剤を使っても使わなくても、溶液化した製品の貯蔵期間にわたり溶液のｐＨを維持できる。本出願記載の非相同融合蛋白質を含む溶液は、元に戻したときに等張性の溶液を得るため、凍結乾燥の前に十分等張性にしておくのが望ましい。

本発明の非相同融合蛋白質の製薬的に容認できる塩も、本発明の範囲に含まれている。酸付加塩を形成するのに一般的に使用される酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨー化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、およびｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、琥珀酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などの有機酸である。好ましい酸付加塩は、塩酸や臭化水素酸などの無機酸を使って形成される塩である。

塩基付加塩には、アンモニウムまたはアルカリまたはアルカリ性の土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩などの無機塩基から導かれる塩が含まれる。従って、本発明の塩を調製するのに有効な塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどが含まれる。

本発明の非相同融合蛋白質は生物活性を有している。生物活性を有するとは、インビボで受容体に結合し、それを活性化し、反応を引き出す機能が非相同融合蛋白質にあることを意味する。いくつかの代表的な非相同融合蛋白質について、インビボおよびインビトロ活性の試験を行った。実施例１および２は、ヒトＧＬＰ−１受容体と相互作用しそれを活性化する非相同融合蛋白質の機能に基づいて、インビトロ活性の代表例を提供する。両試験では、ヒトＧＬＰ−１受容体を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞が使用される。この細胞におけるＧＬＰ−１受容体の活性はアデニル酸シクラーゼを活性化し、それがサイクリックＡＭＰ反応要素（ＣＲＥ）が作用するレポーター遺伝子の発現を促す。実施例１（表１）は、レポーター遺伝子がベータラクタマーゼである場合の代表的なデータを提供する。実施例２（表２）は、レポーター遺伝子がルシフェラーゼである場合の代表的なデータを提供する。実施例３は、本発明の非相同融合蛋白質をラットに投与した場合の代表的なデータを提供する。実施例４（表６）は、本発明の非相同融合蛋白質をサルに投与した場合の代表的なデータを提供する。実施例５（表７）は、非相同融合蛋白質を反復皮下注射した後の抗体形成の可能性について、代表的な評価データを提供する。実施例６（表８）は、非相同融合蛋白質をサルに注射した後の薬力学的研究に関して、代表的なデータを提供する。実施例７（表９）は、３種類の投薬量をラットに注射した後の薬力学的研究に基づいて、代表的なデータを提供する。実施例８（表１０）は、本発明の別の非相同融合蛋白質をマウスに投与した場合の代表的なデータを提供する。代表的データを総合すると、非相同融合蛋白質は、受容体に結合しそれを活性化し、治療用活性ペプチドよりも効力が高く、インビボでも活性であり、治療用活性ペプチドよりも長い半減期を有し、免疫原生ではなく、用量応答的であることが証明される。

非相同融合蛋白質は、通常の技術を有する医師が有効であると知られる経路であればどの経路を使って投与しても良い。非経口末梢投与はその１つである。非経口投与は、滅菌した注射器または注入ポンプなどの他の機械装置を使って投与量を体に注射するものとして、医学文献で一般的に理解されている。非経口末梢経路には、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内経路も含まれる。

本発明の非相同融合蛋白質は、腸管経路である経口、直腸、鼻腔または下気道経路で投与しても良い。こういう腸管経路の中では、下気道経路と経口が好ましい。

本発明の非相同融合蛋白質は、様々な疾患や症状を処置するのに使用できる。

本出願記載の非相同融合蛋白質の有効量は、治療用活性ペプチド受容体の刺激を必要としている被験者に投与される場合、容認できない副作用を生じることなく、好ましい治療効果および／または予防効果をもたらす量である。“好ましい治療効果”には、（１）疾患または症状に伴う症候の改善、（２）疾患または症状に伴う症候の開始の遅延、（３）処置しない場合と比べた場合の寿命の延長、（４）処置しない場合と比べた場合のクオリティー・オブ・ライフの向上、の内容の1つまたはそれ以上が含まれる。

本発明の非相同融合蛋白質は、２週間に１回または週１回投与するのが好ましい。処置される疾患によっては、より頻繁に、例えば週２〜３回非相同融合蛋白質を投与した方が良い場合もある。

ここで本発明をこれだけに限定されるものではないが、以下の実施例を用いて記載する。

インビトロＧＬＰ−１受容体活性化アッセイ：
ＣＲＥ−ＢＬＡＭシステムを使い、２０，０００から４０，０００細胞／ウェル／１０％ＦＢＳを含む１００μｌＤＭＥＭ培地の濃度で、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現するＨＥＫ−２９３細胞をｐｏｌｙ−ｄ−ｌｙｓｉｎｅでコーティングした透明な底を持つ９６ウェルのブラックプレートに播種する。播種の翌日、培地をフリックオフし、血漿を含まない８０μｌのＤＭＥＭ培地を加える。播種の3日後、様々な濃度の種々のＧＬＰ−１−Ｆｃ非相同融合蛋白質を含む２０μｌのＤＭＥＭ血漿不含培地（０．５％ＢＳＡ入り）を各ウェルに加え、用量応答曲線を作成する。通常、３ナノモルから３０ナノモルの非相同ＧＬＰ−１Ｆｃ融合蛋白質の希釈液を使って用量応答曲線を作成し、それを基にＥＣ５０値を決定する。融合蛋白質を５時間インキュベートした後、２０μｌのβ−ラクタマーゼ基質（ＣＣＦ２／ＡＭ、パンベラ社（ＰａｎＶｅｒａＬＬＣ））を加え、更に１時間インキュベーションを続け、その時点でｃｙｔｏｆｌｕｏｒを使って蛍光を測定する。このアッセイに関しては、ズロカルニック（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ）等、（１９９８）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２７８：８４−８８に更に詳しく記載されている。種々のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合蛋白質を試験し、ＥＣ_５０値を表１に示した。この値は、全実験で内部コントロールとして使用したＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの値を基準にしてある。

インビボＧＬＰ−１受容体活性化アッセイ：
ＣＲＥ−ルシフェラーゼ・システムを使い、３０，０００細胞／ウェル／８０μｌ低血清ＤＭＥＭＦ１２培地の濃度で、ヒトＧＬＰ−１受容体を安定的に発現するＨＥＫ−２９３細胞を９６ウェルプレートに播種する。播種の翌日、０．５％ＢＳＡに溶解した試験蛋白質の２０μｌを細胞と一緒に混合し、５時間インキュベーションする。細胞に添加する前に、各試験蛋白質の５倍濃度で３ｐＭから３ｎＭを含む１２の希釈液を調製し、用量応答曲線を作成し、それを基にＥＣ５０値を決定する。インキュベーションの後、１００μｌのルシフェラーゼ試薬を各プレートに直接加え、２分間穏やかに撹拌する。プレートをＴｒｉ−ｌｕｘルミノメーターに載せ、ルシフェラーゼ発現により生じる発光量を計算する。種々のＧＬＰ−１−Ｆｃ融合蛋白質が試験され、ＥＣ５０値は表２に示してある。値は、全実験で内部コントロールとして使用されたＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの値を基準にしてある。試験された非相同融合蛋白質はダイマーなので、値は、モル濃度の２倍の違いを考慮に入れ修正を施してある。

ラットの静脈内耐糖能試験：
非相同融合蛋白質
Gly⁸-Glu²²-Gly³⁶-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A)
をラットの静脈内耐糖能試験（ＩＶＧＴＴ）で評価する。３つのグループのそれぞれに少なくとも４匹のラットが含まれている。グループＩは溶媒を摂取し（表３）、グループＩＩは１．７９ｍｇ／ｋｇのGly⁸-Glu²²-Gly³⁶-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A)を１回の皮下注射で摂取し（表４）、グループＩＩＩは０．１７９ｍｇ／ｋｇのGly⁸-Glu²²-Gly³⁶-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A)を1回の皮下注射で摂取する（表５）。ラットには１日目の朝皮下注射する。最初の注射の２４時間後、ラットの体重１グラム当たり１μｌのグルコース（Ｄ５０）をボーラスとして注入する。血液のサンプルをグルコースのボーラス注入の後、２、４、６、１０、２０、および３０分後に採取する。

カニクイザル（ＣｙｎｏｍｏｌｇｕｓＭｏｎｋｅｙ）に1回皮下注射した後の薬物動態試験：
雄のカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍｏｎｋｅｙ）に非相同融合蛋白質
Gly⁸-Glu²²-Gly³⁶-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A)を０．１ｍｇ／ｋｇ皮下（ＳＣ）注射したときの薬物動態（ＰＫ）を調べる試験を行う。ＲＩＡ抗体はＧＬＰの中間部分に特異的である。ＥＬＩＳＡはＮ末端に特異的な捕捉抗体およびＦｃに特異的な検出抗体を使用する。
ＥＬＩＳＡとＲＩＡの両方から得られる血漿濃度を使用して、薬物動態パラメーター値を決定した。

ＰＫパラメーター値の代表値を表６に示す。ＲＩＡの単一用量ＳＣＰＫは、平均Ｃ_ｍａｘ４４６．７ｎｇ／ｍＬとそれに対応するＴ_ｍａｘ１７．３時間に関連している。消失半減期の平均値は約７９．３時間（３．３日）である。ＥＬＩＳＡのＰＫは平均Ｃ_ｍａｘ２９２．２ｎｇ／ｍＬとそれに対応するＴ_ｍａｘ１６．７時間に関連している。消失半減期の平均値は約５１．６時間（２．２日）である。

ａ観察された最大血漿濃度
ｂ最大血漿濃度が観察された時間
ｃ 0から無限まで測定した血漿濃度時間曲線の下の面積
ｄ消失半減期
ｅ全身クレアランス、生物学的利用能の関数として
ｆ分布容積、生物学的利用能の関数として
ＳＤ＝標準偏差

反復皮下注射の後の抗体形成の可能性評価：
直接ＥＬＩＳＡを使い、指定されたカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍｏｎｋｅｙ）の血清サンプルをGly⁸-Glu²²-Gly³⁶-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A)に対する抗体形成の可能性試験に供する。マイクロタイター・プレートを０．１μｇ／ｍＬの濃度のGly⁸-Glu²²-Gly³⁶-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A)でコーティングする。サルの血清サンプルを５０倍、５００倍、１０００倍、そして５０００倍のブロッキング液で希釈し、０．０５ｍＬサンプル／ウェルを約１時間インキュベートする。二次抗体であるヤギ＜ヒトＦａｂ’２＞−ペルオキシダーゼ（ヒトへの７５％交差感受性）を１０，０００倍のブロッキング液に希釈し、０．０５ｍＬ／ウェル加え、約１時間インキュベートする。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を使って発色させ、それを光学密度４５０ｎｍ〜６３０ｎｍで読み取る。読取りを２回行い平均する。ＧＬＰ−１抗体を正の対照として使い、ヤギ＜ウサギ＞（Ｈ＋Ｌ）−ペルオキシダーゼコンジュゲートを検出用に二次的に使用する。ポイント血清サンプルを投与前、第２投与の２４時間後、そして第１と第２のＳＣ投与の１６８時間後に集め、免疫原生の可能性を評価する。Ｇ８Ｅ２２−ＣＥＸ−Ｌ−ｈＩｇＧ４に対する抗体力価の存在は、投与前の血清サンプルおよび正の対照と比較して解釈する。結果の代表例を表７に示す。

絶食状態およびグルコースの段階的静脈内注射期間中のカニクイザル（ＣｙｎｏｍｏｌｇｕｓＭｏｎｋｅｙ）に単回の皮下注射をした後の薬力学的試験：
第一段階（試験第１日目）：溶媒を皮下注射する。溶媒の注射の直後、グルコース（２０％ブドウ糖）の段階的（５、１０、および２５ｍｇ／ｋｇ／分）静脈内注射を行なう。第二段階（試験第３日目）：ＧＬＰ−１融合蛋白質（０．１ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射する。第３段階：ＧＬＰ−１融合蛋白質の注射の約９６時間後グルコースの段階的静脈内注射を行なう。

一晩（１６時間）絶食状態の後に鎮静剤を投与されたサルに、グルコースの段階的静脈内注射を行なう。両方の静脈内グルコース注射について、ベースラインサンプルの抽出を１０分毎に２０分間行い、ベースラインを決める。グルコースの段階的注入を５ｍｇ／ｋｇ／分で開始２０分後に行い、次に１０ｍｇ／ｋｇ／分、そして２５ｍｇ／ｋｇ／分と増加させる。各注入は２０分間ずつ行なう。血液サンプルを１０分間隔で採取し、グルコース、インスリン、そしてグルカゴンの測定を行なう。第１段階と第３段階で、グルコース注入前２０分、１０分、０分、そしてグルコース注入後の１０、２０、３０、４０、５０、および６０分目に血液を１．０ｍＬずつ採取する。

データの代表例を表８に示す。

グルカゴン値に関しては、溶媒を投与されたサルとＧＬＰ−１融合蛋白質を投与されたサルの間に統計的差は見られなかった。

絶食状態およびグルコースの段階的静脈内注射期間中のラットに３種類の用量の単回皮下注射を行なった後の薬力学的試験：
慢性的にカニューレを挿入されたラットを溶媒対照（生理食塩水）または３つの処置グループ（ＧＬＰ−１融合蛋白質：０．０１７９ｍｇ／ｋｇ、０．１７９ｍｇ／ｋｇまたは１．７９ｍｇ／ｋｇ）のいずれかに割り当てる。処置の２４時間後、一晩絶食状態（１６時間）にあるラットにグルコースの段階的静脈内注射試験を行う。グルコースの段階的静脈内注射は、生理食塩水注入のベースライン期間（２０分）、次に３０分のグルコース注入を２度（５ｍｇ／ｋｇ／分および１５ｍｇ／ｋｇ／分）行なう期間で構成される。血漿サンプルの採取は、グルコース注入（ベースライン）前２０分、１０分、０分、そして１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、および６０分後に行なう。

データの代表例を表９に示す。

＊Ｐ≦０．０５対溶媒

ＦＧＦ−２１融合蛋白質の薬物動態分析：
用量０．４ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ−２１融合蛋白質を静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）経路でＣＤ−１マウスに投与する。投与後０から３３６時間の間に、様々な時点でマウスを採血する。各サンプルから血漿を集め、ラジオイムノアッセイで分析する。薬物動態パラメーターをモデル依存（ＩＶデータ）および独立（ＳＣデータ）方法（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＰｒｏ）を使って計算する。その結果を以下の表１０に示してある。ＩＶ投与によれば、天然のＦＧＦ−２１の消失半減期０．５時間と比べ、ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合蛋白質の消失半減期は約５３．９時間である。ＳＣ投与によれば、天然のＦＧＦ−２１の消失半減期０．６時間と比べ、ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合蛋白質の消失半減期は約２４時間である。両投与経路とも、ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合蛋白質は、天然のＦＧＦ−２１と比べ長い作用期間を示している。

ａ観察された最大血漿濃度
ｂ最大血漿濃度が観察された時間
ｃ０から無限まで測定した血漿濃度時間曲線の下の面積
ｄ消失半減期(時間)
ｅ全身クレアランス、生物学的利用能の関数として
ｆ生物学的利用能％

Claims

ＳＥＱＩＤＮＯ：１である配列

（ここで、
位置１のＸａａは、Ａｌａであるか、存在しない、
位置１６のＸａａは、ＰｒｏまたはＧｌｕであり、
位置１７のＸａａは、Ｐｈｅ、ＶａｌまたはＡｌａであり、
位置１８のＸａａは、Ｌｅｕ、ＧｌｕまたはＡｌａであり、
位置８０のＸａａは、ＡｓｎまたはＡｌａであり、
位置２３０のＸａａは、Ｌｙｓであるか、存在しない）
を含む免疫グロブリンのＦｃ部分に融合した治療用活性ペプチドを含む非相同融合蛋白質。
a) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:2)、
b) Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:4)、
c) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:6)、
d) Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys (SEQ ID NO:7)、
e) Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg (SEQ ID NO:8)
からなる群から選択される配列を含むペプチド・リンカーを介し、治療用活性ペプチドのＣ末端アミノ酸がＦｃ部分のＮ末端アラニン残基と融合している、請求項１記載の非相同融合蛋白質。
請求項１または２に記載の非相同融合蛋白質をコード化するポリヌクレオチド。
請求項３記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項４記載のベクターを含む宿主細胞。
請求項１または２に記載の非相同融合蛋白質を発現する宿主細胞。
宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６記載の宿主細胞。
宿主細胞がＮＳＯ細胞である、請求項６記載の宿主細胞。
非相同融合蛋白質が検出可能な量で発現する条件の下に、請求項３記載のポリヌクレオチドを転写および翻訳するステップを含む、非相同融合蛋白質の産生方法。
治療的有効量の請求項１または２記載の非相同融合蛋白質を投与することを含む、患者を処置する方法。
非相同融合蛋白質が週１回投与される、請求項１０記載の方法。
請求項１または２に記載の非相同融合蛋白質の医薬品としての使用。