JP2010057500A - 細胞における局在性が改変された免疫ポリペプチドに基づく抗腫瘍組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】少なくとも１つがその天然の局在性とは異なる細胞局在性を有するよう改変された、１または数種の免疫ポリペプチドを治療薬として含んでなる抗腫瘍組成物を提供する。
【解決手段】免疫ポリペプチドを発現する組換えベクターに基づく組成物。それはさらに、局在性が改変されたパピローマウイルスの初期および／または後期領域に由来する免疫ポリペプチドをコードする少なくとも１つの配列を含んでなる組換えベクター、ならびにそのベクターを含んでなるウイルス粒子。この組成物、組換えベクターおよびウイルス粒子の治療上の使用。
【選択図】なし

Description

発明の背景

本発明の主題は、天然の局在性とは異なる細胞での局在性を有するよう改変された免疫ポリペプチドを治療薬または予防薬として含んでなる抗腫瘍組成物である。それはまた、そのポリペプチドを発現する組換えベクターに基づく組成物に関する。かかる組成物はさらに詳しくは、パピローマウイルスに関連した病巣の治療または予防を意図したものである。

一般に、癌は細胞増殖の制御の欠如に起因する疾病であると解釈されている。その原因にはいろいろあろうが、特に細胞の遺伝子の機能不全（潜在的癌遺伝子の例えば体細胞変異による活性化；発現の脱制御；腫瘍抑制遺伝子の発現の阻害）またはウイルス遺伝子の望ましくない発現による可能性がある。

ヒトにおいては、パピローマウイルス（ＨＰＶ）は皮膚の良性感染から疣贅、および悪性腫瘍にわたる病院に関与する。これまでに確認された７５タイプのＨＰＶのうち、２０の異なる分離株が生殖道に極めて特異的であり、そのうち５株（ＨＰＶ−１６および１８、そしてより程度は低いがＨＰＶ−３１、３３および４５）が子宮頸部および生殖道下方の癌に明確に関与している。一連の全体の研究は、これらのウイルスの形質転換に果たす役割、新生細胞のゲノムへのそれらの特異的な組み込み、癌性細胞におけるそれらの遺伝子の活性、および悪性の表現型のＨＰＶ陽性新生細胞を維持する際のあるウイルス遺伝子の発現の重要性を実証するものである(Monsenego, J. Impact Medecin, 11 March 1994)。

一般に、パピローマウイルスは、キャプシドタンパク質に取り巻かれた約７９００塩基対の環状ゲノムを有るＤＮＡウイルスである。いくつかのタイプのパピローマウイルス、特にウシ・パピローマウイルス（ＢＰＶ）およびヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）が確認されており(Pfister, 1987, in The papovaviridae: The Papillomaviruses, Salzman and Howley edition, Plenum Press, New York, p 1-38)。それらのゲノムは、リーディングフレームＥ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６およびＥ７を包含する初期領域と、キャプシドタンパク質Ｌ１およびＬ２をコードする後期領域を含んでなる。

初期タンパク質はＤＮＡに結合する能力を有し、優先的に核で見られる。Ｅ１およびＥ２の発現産物はウイルスの複製とウイルス遺伝子の発現を調節し、一方、Ｅ５、Ｅ６およびＥ７領域の発現産物は感染細胞の発癌転換のプロセスに関与する。このことに関して、ＢＰＶ−１ Ｅ５タンパク質がin vitroで細胞を形質転換可能なことが実験的に示されている(Schlegel et al., 1986, Science 233, 464-467)。Ｅ７の形質転換力はＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８に関して実証されており(Kanda et al., 1988, J. Virol. 62, 610-613; Vousden et al., 1988, Oncogene Res. 3, 1-9; Bedell et al., 1987, J. Viorol. 61, 3635-3640)、網膜芽細胞種（Ｒｂ）遺伝子の産物と結合する能力と関連している(Munger et al., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Heck et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446)。さらに、Crook et al (1991, Cell 67, 547-556)はＨＰＶ−６および１８のＥ６抗原がｐ５３遺伝子の産物を合成することができることを示したが、このことは細胞の形質転換におけるその有力な役割を説明している。

ＨＰＶウイルスに関連する病状はそれらの持続性および再発性のために治療上問題がある。通常のアプローチは依然として外科手術と化学療法であるが、これらの疾病の治療のため、今般、免疫療法が考案されている。理想的なワクチン候補は、予防目的（免疫予防）としては、感染が永続的に確立されないようにする、また隣接する組織に広がらないようにし、治療目的（免疫療法）としては、感染した患者における腫瘍発達を軽減するべきである。これまでには、キャプシド抗原を使用して、ウイルス粒子の表面に局在するエピトープに対する抗体の産生を誘導すること、および初期タンパク質を使用して、ウイルスＤＮＡの組み込み後に感染した細胞に対して細胞性免疫を確立することが提案されている。

このことに関して、欧州特許ＥＰ０，４６２，１８７では、パピローマウイルス初期遺伝子を発現するポックスウイルスの投与を含む治療的アプローチが記載されている。ＷＯ９３／０２１８４に記載されている予防接種的アプローチは、免疫物質としてのキャプシド抗原、特にin vitroで再構成されたＤＮＡを含まないウイルス粒子（ウイルス様粒子のＶＬＰ）の使用に基づいている。仏国出願第９６ ０９５８４号では、パピローマウイルス初期ペプチドによってもたらせれる予防効果と後期ペプチドによって与えられる治療効果を組み合わせた組成物が開示されている。しかしながらこれまでに、所望によりそれらの形質転換活性を無効にするよう変異させてはいるが、それらの細胞局在性という観点では天然型であるウイルスタンパク質が使用されてきた。

本発明は、それが特異的であれ、非特異的であれ、また体液型（抗体の産生）であれ、細胞型（細胞傷害性応答ＣＴＬ）であれ、治療される腫瘍または癌に対する免疫応答を増強するまたは刺激するために、宿主の免疫系に対するそれらの接近性を高める目的でその局在性が改変された免疫タンパク質を使用することを提案する。

今般、ＨＰＶ−１６ Ｅ６およびＥ７核抗原が、適当な付着配列および分泌配列を導入して、そこでのトランスメンブラン型での提供を付与することにより改変された。局在性の変化は免疫応答に関して有益な効果を持ち、その結果、膜Ｅ６およびＥ７抗原およびヒトＩＬ−２を同時発現するワクシニアウイルスで処理した動物は、核抗原を産生する同等のウイルスを受容させたものに比べて抗腫瘍活性が高くなる。本発明の目的は、腫瘍もしくは癌の確立または発達を少なくとも部分的に阻害することに関して先行技術の組成物よりも効果的な公知の抗腫瘍組成物へ利用できるようにすることである。特に有用な用途はＨＰＶ感染の、さらに詳しくは子宮頸部癌などの重篤な病状の治療である。

従って、本発明の主題は、１以上の免疫ポリペプチドを治療薬または予防薬として含んでなる組成物であり、これらポリペプチドの少なくとも１種はその天然の局在性とは異なる局在性を持つよう改変されている。

本発明の目的のため、「免疫ポリペプチド」とは、それと同じものが正常な細胞には存在しないポリペプチドを表す。好ましい例としては、腫瘍特異的抗原がある。例としては、その発現が胎胚期に起こり、誕生時にそれが消失するまで退縮する細胞抗原、通常は非常に低レベルで発現し、高レベルで発現すると腫瘍の特徴を持つようになる抗原、その構造またはコンホメーションが改変されている細胞抗原、あるいは非細胞抗原、特に発癌ウイルスに由来するウイルス抗原が挙げられる。それらは、例えば、遺伝子ＢＲＣＡ−１(Miki et al., 1994, Science 226, 66-71)、ＢＲＣＡ−２(Wooster et al., 1995, Nature 378, 789-792)、ＭＵＣ−１(Hareuveni et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9498-9502)、CEAなどの発現産物であり得、これらのある変異または過剰発現が癌の発達に関与している。ウイルス抗原については、より詳しくは、パピローマウイルス初期もしくは後期遺伝子、エプスタイン・バーウイルスＥＢＮＡ−１の発現産物、ＨＴＬＶ（ヒトＴリンパ球ウイルス）ＩおよびＩＩウイルスまたはＢ型およびＣ型肝炎ウイルスの抗原が挙げられる。腫瘍特異的抗原は当業者が入手できる文献に広く記載されている。

発明の具体的説明

本発明で使用されるポリペプチドの不可欠な特徴としては、その天然の局在性とは異なる局在性を持つことである。輸送のメカニズムおよび関与するシグナルは細胞生物学の書物に記載されている（例えば、Molecular Biology of the Cell, Third Ed. garland Publishing Inc. NY & Londonを参照）。便宜には、大部分のポリペプチドがサイトソル中の遊離リボゾームで合成され、そこでそれらは活性を示す。しかしながら、いくつかのポリペプチドは異なる細胞内指向性を持っており（それは一般に適当なペプチドシグナルの存在によって確認される）、そこまで輸送されなければならない。このように、原形質膜への輸送されるよう、または細胞外へ分泌されるよう意図されたポリペプチドは、小胞体（ＥＲ）と会合したリボゾームによって、通常はそれらのアミノ末端に、ＥＲへの送達を開始させる分泌配列（またはシグナルペプチド）を含んでなる前駆体の形態で合成される。次いでそれは特異的エンドペプチダーゼによって除去され、成熟ポリペプチドとなる。分泌配列は通常、１５〜３５疎水性の必須アミノ酸を含んでなる。非共通配列が存在し、これがエンドペプチダーゼによる認識を決定する分泌配列であるものと思われる。しかしながら、グリシン、セリンまたはアラニン残基の後でタンパク質分解的切断がしばしば起こらなければならない。

膜タンパク質は一般に、原形質膜に依然として挿入されている、疎水性の高い付着配列を含んでなる。ポリペプチドはトランスメンブラン型であると考えられ、一方の末端は細胞外に露出し、付着配列は膜をわたり、もう一方の末端はサイトソル側にある。ほとんどの場合、ポリペプチド鎖は膜の脂質二重層に埋め込まれており、αらせんコンホメーションを有している（例えば、Branden and Tooze, 1991, in Introduvtion to Protein Structure p. 202-214, New Garlandを参照）。

核局在性に関しては、主としてリジンおよびアルギニンなどの陽電荷残基からなった、短い、いわゆる核局在化配列（ＮＬＳ）の存在によって与えられると考えられる。例としては、ＨＰＶ Ｌ１およびＬ２ポリペプチドに存在する核転座シグナルＫＲＫＫＲＫおよびＲＫＲＲＫＲが挙げられる(Zhou et al., 1991, Virology 185, 625-632)。しかしながら、核内でそれらの機能を発揮するポリペプチドには、典型的なＮＬＳ配列を持っていないものがある。パピローマウイルスＥ６およびＥ７抗原の場合がそうである。

本発明の組成物中に含有される免疫ポリペプチドは、天然のポリペプチド、その断片、異種起源の配列を含んでなるキメラ、または変異体（１以上のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換）内の適当な局在化シグナルの導入および／または欠失から得てもよい。さらに詳しくは、そのアミノ酸配列は、それに由来する天然ポリペプチドの配列の総てまたは一部と７０％を越える、有利には８０％を越える、特には９０％を越える同一性を示す。この同一性は適当なコンピュータープログラムを用いて、あるいは最高の相同性が得られるように配列を並べることにより、そして２つの配列のアミノ酸が全番号の位置と比べて同一であるとわかった位置の数を計数することにより容易に算出できる。

当業者ならば、ポリペプチドの細胞への提供を変化させるシグナルを知っている。免疫ポリペプチドが分泌することが望ましい場合、そのアミノ末端へ分泌配列を付加すれば、ＥＲを介してそれを宿主細胞の外へ輸送することが可能となる。この挿入は、翻訳の開始に関するコドンのすぐ下流で起こることが好ましい。本発明のでは、干渉を避けるために、天然の局在性を決定する残基の総てまたは一部を変異／欠失させることが有利であろう。例えば、天然のポリペプチドが膜指向性を持つならば、それは分泌配列をすでに含んでなり、疎水性付着配列を所望により変異／欠失させる。さらに、天然のシグナルの不活性化（変異／欠失による）により細胞質への局在化が可能となる。通常、細胞での局在性が異なる（例えば、核、膜、分泌など）免疫ペプチドを細胞質に供されると、in vivoにおいては主要組織適合性複合体のクラスＩ抗原とＣＴＬ応答によって媒介されるポリペプチドの提を促すことができる(Tobery and Siliciano, 1997, J. Exp. Med. 5, 909-920)。意図し得るもう１つの具体例としては、有効なＣＴＲ応答を刺激する目的でも、免疫ポリペプチドとユビキチンを融合させることである。

有利には、本発明の組成物は、好ましくは膜付着配列を、および天然のポリペプチドが分泌配列を欠いている場合にはそれを挿入することにより、膜局在性を持つよう改変された免疫ポリペプチドを含んでなる。分泌配列の好ましい挿入部位は、前記されたようにＮ末端であり、膜付着配列のそれは、例えば停止コドンのすぐ上流のＣ末端である。本明細書ではまた、天然の局在化シグナル（例えば、ＮＬＳ配列）の総てまたは一部の変異／欠失させて、新たな場所で干渉することがないようにすることが有利であり得る。

本発明で使用できる局在化シグナルの選択肢は広い。それは、それが処置される細胞に認識される限り、それを含んでなる、真核生物起源またはそれ以外（ウイルス、寄生体、真菌類など）いずれのタンパク質に由来するものであってもよい。それは天然でも合成でもよく、後者に関して異種であっても同種であってもよい。それはまた、それが由来するシグナルに対する１以上の改変を含んなる（ただし、それ／それらはその機能に影響を及ぼさない）。指針としては、狂犬病糖タンパク質、ＨＩＶウイルスｅｎｖ糖タンパク質、または麻疹ウイルスＦタンパク質の膜付着配列および／または分泌配列を使用することが好ましいであろう。免疫ポリペプチドの改変がいくつかの局在化シグナルを含む場合には（例えば、膜付着配列および分泌配列）、これらは共通に起源であっても、異なる起源であってもよい。

また、特定の細胞コンパートメントをターゲッティングする局在化シグナルを使用することもできる。特に、エンドサイトーシスに関する共通配列（例えば、配列ＩＰＮＹＲＮＭを有する免疫グロブリンＩｇＧ１重鎖のＣ末端領域に存在する；Kaisho et al., 1997, Science 276, 412-414）、またはゴルジ体膜へのターゲッティングを可能にする配列(Mochamer and Rose, 1987, J. Cell Biol. 105, 1205-1214; Mochamer, 1993, Curr. Opin. Cell Biol. 5, 606-612)が挙げられる。特に、Ｐ１１２２２の受託番号でＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクに開示されているコロナウイルスＥ１糖タンパク質由来配列の使用が意図される。免疫ポリペプチドのＣ末端にこの種の配列を組み込むことが好ましい。

さらに、細胞局在性の改変は、いずれの常法により行ってもよく、特に位置指定突然変異誘発、異種シグナルの連結、またはＰＣＲによって行ってもよい。

好ましい具体例によれば、本発明の抗腫瘍組成物は、パピローマウイルス感染およびその結果起こる疾患、特に軽度子宮頸部形成異常および子宮頸部癌の治療または予防を意図したものである。この具体例によれば、それはパピローマウイルス、特にＨＰＶ−１６、１８、３１、３３または４５などの危険性の高いウイルスの初期および／または後期領域に由来する少なくとも１種の免疫ポリペプチドを含んでなる。

本発明によって追求される目的によれば、１種異常のいずれかの種の免疫パピローマウイルスポリペプチドが使用できる。先に想起されたように、それらのゲノムは８種のポリペプチド、すなわちウイルスキャプシドを含んでなる２種の後期ポリペプチドＬ１およびＬ２と、調節、ウイルスゲノムの維持および感染した細胞の形質転換に関与する６種の初期ポリペプチド（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６およびＥ７）をコードする。

初期型の免疫ポリペプチドに関しては、特に膜局在性を有するよう改変されたＥ６またはＥ７由来のポリペプチドを使用することを選択するのが有利である。先に想起された観察を形質転換力に与えると、細胞の形質転換プロセス関与する領域で変異した非発癌性変異体を使用するのが好ましい。かかる変異体は文献に記載されている(Munger et al., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Crook et al., 1991, Cell 67, 547-556; Heck et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446; Phelps et al., 1992, J. Virol. 66, 2418-2427)。本発明の目的に特に好適な免疫ポリペプチドは、残基１１１〜１１５（＋１、天然のウイルス抗原の１番目のアミノ酸を表す）が欠失し、かつ、麻疹ウイルスＦタンパク質の分泌または付着シグナルと融合したＨＰＶ−１６ Ｅ６抗原である（配列番号１）。また、残基２２〜２５が欠失し、狂犬病糖タンパク質の付着配列および分泌配列と融合したＨＰＶ−１６ Ｅ６抗原も使用できる（配列番号２）。

本発明の抗腫瘍組成物はまた、Ｌ１またはＬ２に由来の、パピローマウイルスの後期領域に由来する免疫ポリペプチドを含んでなってもよい。

もちろん、本発明の抗腫瘍組成物は、そのうちの少なくとも１つがその天然の局在性とは異なる細胞局在性を有する、数種の免疫ポリペプチドを含んでなってもよい。パピローマウイルス由来の数種のポリペプチドを組み合わた組成物の例としては、共通の起源であっても異なる起源であってもよいもの（例えば、活性スペクトルを広くする目的では、ＨＰＶ−１６および１８）が挙げられる。初期起源の数種のポリペプチドを組み合わせた組成物は治療効果を増強することができる。Ｌ１およびＬ２由来のポリペプチドの組合せは、組成物の予防特性に有益な効果を持ち得た。最後に、本発明により追求される目的に最も特に好適な組成物は、予防効果と治療効果を併せ持つよう、パピローマウイルスの少なくとも１種の初期ポリペプチドと少なくとも１種の後期ポリペプチドを含んでなる。好ましい具体例によれば、初期起源の少なくとも１種の免疫ポリペプチドが、先に挙げたもののような分泌または付着配列の付加によって膜局在性を有するよう改変される。

これに関して、本発明の好ましい具体例は、
（１）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、
（２）配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、
（３）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、および配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、
（４）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチド、
（５）配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチド、
（６）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチド
を含んでなる。

「相同」とは、その配列との７０％を越える、有利には８０％を越える、好ましくは９０％を越える、最も好ましくは９５％を越える同一性の程度をいう。

有利には、本発明の抗腫瘍組成物は、免疫応答の強度を特異的に、または特異的にではなく増強する目的で、その抗腫瘍作用を増強する少なくとも１種の化合物さらに含んでなってもよい。アジュバントの他、免疫刺激剤は特に好ましい化合物を表す。「免疫刺激剤」とは、免疫ポリペプチドに向けられた抗体の産生を増幅するために体液性免疫応答を、あるいは、腫瘍または感染細胞に対する有意な細胞傷害性応答を誘発するために細胞性免疫応答を強める能力を有する化合物を意味するものと理解される。指針としては、免疫刺激剤は、癌の動物モデルにおいて、免疫ポリペプチドで処置した動物の拒否反応率を免疫刺激剤の存在下と不在下で比較することにより評価すればよい。より一般には、免疫刺激を証明する手段はＲｏｉｔｔ(Immunology, 4^ｔｈ edition, Moby Ltd)に示されている。かかる組成物の利点の１つは、それが免疫ポリペプチドによって誘導される特異的免疫と免疫刺激分子によって誘導される非特異的免疫を併せ持つことである。

本発明では、特にヒト起源の天然の免疫刺激剤、その一部、異なる起源の配列との融合から得られたキメラ、または変異体（しかしながら免疫刺激作用は保存されている条件で）を使用することができる。考えられ得るあらゆる分子のうち、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２および付着分子Ｂ７．１およびＢ７．２から選択される免疫刺激剤を使用することが好ましい。

一般に、免疫ポリペプチドおよび免疫刺激ポリペプチドは通常の化学合成法によって、または組換えＤＮＡ技術によって作製され得る（例えば、Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。さらに詳しくは、製造方法は、問題のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片で形質転換した細胞を培養して産生細胞を作出する行為と、その培養物からポリペプチドを回収する行為を含んでなる。産生細胞はいずれの起源であってもよく、限定されるものではないが、考慮されているＤＮＡ断片がそのゲノムに組み込まれているか、または適当な発現ベクターに組み込まれているかのいずれかである限り、細菌、酵母菌、または哺乳類細胞であってもよい。もちろん、ＤＮＡ断片は、産生細胞中でその発現を可能にする転写および翻訳シグナルの制御下に置かれる。発現ベクターおよび制御シグナルは当業者に公知である。

本発明はまた、１以上の免疫ポリペプチドをコードする配列を含んでなる少なくとも１種の組換えベクター、その天然の局在性とは異なる局在性を有するよう改変されている少なくとも１種のポリペプチド、および所望により抗腫瘍作用を増強する化合物を、治療薬または予防薬として含んでなる抗腫瘍組成物に関する。この種の組成物は生産が高い費用がかからない、また、種々の環境条件下で安定性が高いという利点を持つ。特に、保存条件は制限が少ない。これらのポリペプチドは先に定義したような特徴を持つ。

免疫ポリペプチドをコードする、または抗腫瘍作用を増強する配列は、一般の用法で、また文献のデータを用いて、クローン化によって、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって、または化学合成によって得られる。好ましい具体例に関しては、パピローマウイルスポリペプチドをコードする配列は、患者からまたはコレクションから得られるパピローマウイルス陽性細胞から選択すればよい。適当な局在化シグナルの挿入は、分子生物学的技術によって行ってよい。免疫刺激剤をコードする配列は、細胞ＤＮＡから、またはそれが発現している細胞のメッセンジャーＲＮＡからクローン化すればよい。当業者ならば、公開されたデータから適当なプローブまたはプライマーを作製することができる。ＨＰＶ−１６および１８ゲノムのヌクレオチド配列はそれぞれ受託番号Ｋ０２７１８およびＸ０５０１５でＧｅｎｂａｎｋに開示されていることを記載しておくべきであろう。ヒトＩＬ−２遺伝子の配列は、仏国特許第８５ ０９４８０号およびTaniguchi et al. (1983, Nature 302, 305-311)に記載され、Freeman et al. (1989, J. of Immunology 143, 2714-2722)においてはＢ７．１をコードしている。

本発明で使用できるベクターは、プラスミドまたは特にポックスウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来するウイルスベクターであってよい。病原性を弱めた非組み込みベクターであれば有利である。かかるベクターおよびそれらの調製法は当業者に公知である。

アデノウイルスベクターが使用される場合には、複製のために不可欠な領域、特に宿主生物または環境にそれが伝播しないようにするにはＥ１領域の大部分を欠失させることにより、非反復因子を使用することが好ましい。欠陥のある必須機能がトランスで相補される限り、アデノウイルスゲノムの他の領域、特にＥ２、Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５領域内を改変または欠失させてもよい。これらの具体例を例示するためには、Ｅ２Ａ領域のＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質に関するもの）遺伝子に作用する熱感受性変異体が挙げられる(Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339)。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）６および７をコードする配列を除く、Ｅ４領域の部分的欠失もまた意図され得る(Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048)。もう１つの可能性としては転写単位Ｅ４の全欠失がある。さらに、本発明のアデノウイルスベクターは、非必須領域Ｅ３の総てまたは一部を欠いていてもよい。この選択肢によれば、やはり、宿主の免疫系を逃れることが可能となるポリペプチド、特に糖タンパク質ｇｐ１９ｋをコードするＥ３配列を保存することが有利であり得る(Gooding et al., 1990, Critical Review of Immunology 10, 53-71)。本発明の好ましいアデノウイルスベクターは包膜に不可欠な配列、すなわち５’および３’ＩＴＲ（逆方向末端反復）および包膜領域の最小限の保持を示すであろう。それはヒトまたは動物のアデノウイルスに、またいずれかの抗原型に由来してもよい。Ｃ亜群ヒト・アデノウイルス、特にアデノウイルス２（Ａｄ２）および５（Ａｄ５）が、本発明を実施するのに特に最も適している。種々のアデノウイルスベクターならびにそれらの調製技術は通常のものであり、Graham and Prevect (1991, in Methods in Molecular Biology, vol 7, p 109-128; Ed: E.J. Murey, The Human Press Inc.)および国際出願ＷＯ９４／２８１５２に記載されている。例えば、それはin vitroにおいて大腸菌(E. coli)で、連結反応または相同組換え（例えば、国際出願ＷＯ９６／１７０７０を参照）によって、または相補ラインにおける組換えによって作出してもよい。

レトロウイルスが使用されるならば、ＬＴＲ（長い末端反復）および包膜配列（例えばNaviaux and Verma, 1992, Current Opinion in Biotechnology 3, 540-547を参照）が保存される。免疫ポリペプチドをコードする配列はレトロウイルスＬＴＲ、または下記に記載されるもののような内部プロモーターの制御下に置いてもよい。それはいずれの起源（ネズミ、霊長類、ネコ、ヒトなど）のレトロウイルスに由来してもよく、特にＭｏＭｕＬＶ（モロニーネズミ白血病ウイルス）、ＭＶＳ（ネズミ肉腫ウイルス）またはフレンドネズミレトロウイルス（Ｆｂ２９）に由来していてもよい。それはまた、特にＬＴＲ（真核生物プロモーターによるプロモーター領域の置換）のレベル、または包膜領域（異種の包膜領域、例えばＶＬ３０型による置換）のレベルでの改変を含んでなる（仏国出願第９４ ０８３００号および第９７ ０５２０３を参照）。

有利な具体例によれば、本発明の組換えベクターはポックスウイルス、特にカナリア痘ウイルスのような鳥類痘ウイルス、鶏痘ウイルス、またはワクシニアウイルスに由来し、後者が好ましい。本発明において意図され得るあらゆるワクシニアウイルスのうち、コペンハーゲン、ワイエスおよび改変型アンカラ（ＭＶＡは、改変型ワクシニアウイルスアンカラ）株が選択されることが好ましい。

一般に、挿入部位は、組換えウイルスの複製能および増殖能が損なわれないように、複製に不可欠でない領域中で選択される。指針としては、コペンハーゲン株のウイルスを使用する場合は、好ましい挿入部位はＴＫ遺伝子座であり、それは後者を後者を不活性化する作用を有し、それにより組換え体の選択が容易になる。また、Ｋ１Ｌ遺伝子座を使用することもできる。ＭＶＡウイルスに関しては、組換え体（免疫型および免疫刺激型）配列の挿入は、切除部位Ｉ〜ＶＩの少なくとも１つ、特にＩＩまたはＩＩＩ内で行われてよい(Mayer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040)挿入はまた、Ｄ４Ｒ領域などのウイルスの必須領域で起こってもよく、欠損のある機能は、例えば相補ラインによりトランスで提供することができる。

もちろん本発明では、免疫ポリペプチドをコードする、または抗腫瘍作用を増強する配列は、宿主細胞または宿主生物での発現のために必要なエレメントの制御下に置かれる。それらは転写を調節するエレメント、ならびに翻訳の開始および終結のシグナルを含む。それらの中で、プロモーターが特に重要である。一般に、宿主生物または宿主細胞中で機能し、治療に望ましく、かつ、使用されるベクターに好適なプロモーターが使用されよう。さらに、それは調節配列、例えば転写を活性化するエレメントまたは特定の細胞シグナルに応答する配列を含むよう改変してもよい。このことに関して、パピローマウイルスに関連する病巣は生殖道のレベルに位置するので組織特異的プロモーターを、あるいは腫瘍細胞のみに対して過剰発現を制限するよう、腫瘍に特異的なシグナルに応答するプロモーター（例えば、一般に腫瘍細胞によって過剰発現する増殖因子の存在下で活性化される）を使用することが有利であろう。

本発明において意図し得るプロモーターの中で、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）プロモーター、ＨＭＧ（ヒドロキシ−メチル−グルタリル−補酵素Ａ）プロモーター、ＴＫ（チミジンキナーゼ）プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、アデノウイルスベクターに好適なＭＬＰプロモーター（主要後期プロモーター）およびレトロウイルスベクターにより特異的なＭｏ−ＭＬＶ（モロニーネズミ白血病ウイルス）のＬＴＲが挙げられる。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターが最も特に好ましい。それはまた腫瘍または癌細胞中での発現を刺激するプロモーターであってもよい。特に、乳癌および前立腺癌で過剰発現するＭＵＣ−１遺伝子のプロモーター(Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782)、黒色腫で過剰発現するチロシノース遺伝子(Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864)および乳癌および膵臓癌で過剰発現するＥＲＳ−２遺伝子(Harris et al., 1994, Gene Thetapy 1, 170-175)が挙げられる。問題のプロモーターが文献に記載されており、常法によって細胞ゲノムまたはウイルスゲノムからクローン化され得る。

ポックスウイルスベクターに関しては、ポックスプロモーター、例えば７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、ＴＫ、ｐ．２８、ｐ．１１またはワクシニアウイルスのＫ１Ｌを使用してもよい。合成プロモーターもまた本発明の実施に適している（例えば、Chakrabarti et al., 1997, Biotechniques 23, 1094-1097; Hammond et al., 1997, J. Virological Methods 66, 135-138およびKumar and Boyle, 1990, Virology 179, 151-158を参照）。これに関しては、後期プロモーターと初期プロモーターとの間のキメラプロモーターであることが有利である。

さらに、発現に必要なエレメントはまた、宿主細胞中での発現または維持を増大させる配列（イントロン、転写を終結させる配列、翻訳の開始部位など）を含んでももよい。しかしながら、ポックスウイルスベクターの場合には、イントロンの使用は避けられる。

本発明の組成物は、独立または共通のエレメントの制御下に置かれた選ばれたポリペプチドに相当する配列を発現する１以上の組換えベクターを含んでもよい。後者の選択によれば、内部に翻訳を開始させる配列（ＩＲＥＳ）または異なる遺伝子相における融合物を使用してもよい。

本発明で使用される組換えベクターを産生する一般条件は、当技術分野の現状において広く記載されている。ポックスウイルスベクターに関しては、欧州特許ＥＰ ８３ ２８６に言及されており、その内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。これらの条件は、発現単位が組み込まれるゲノム領域を有するベクターとして許容されるその他のウイルスにも適用できる。もちろん、それらを同一の遺伝子座または異なる遺伝子座に挿入してもよい。

本発明によって追求される目的に従って、組換えウイルスの単離および精製工程を容易にするため、組換えベクターは選択可能なマーカー遺伝子を発現するための単位をさらに含んでなってもよい。特に、抗生物質Ｇ４１８耐性を与えるｎｅｏ遺伝子、プロマイシン耐性を与えるｐａｃ遺伝子、ガンシクロビルまたはアシクロビルのようなあるヌクレオシド類似体に対する感受性を与える１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）のＴＫ遺伝子、ｇｐｔ（キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコードする細菌遺伝子ＬａｃＺおよびβ−グルクロニダーゼをコードするｇｕｓ Ａが挙げられる。後者２つの酵素マーカーによって、それぞれ基質Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）およびＸｇｌｃＡ（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコロニド）の存在下での染色により組換えウイルスを同定することが可能になる。

好ましい抗腫瘍組成物はパピローマウイルス感染または腫瘍の治療および予防を意図し、
（１）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、
（２）配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、
（３）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、および配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、
（４）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチド、
（５）配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチド、
（６）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチド
が挿入された少なくとも１種のワクシニアウイルスのコペンハーゲン株またはＭＶＡ株を含んでなる。

この組成物はまた、好ましくはＩＬ−２またはＢ７．１から選択される免疫刺激剤をコードする配列を含んでなってもよい。免疫遺伝子を発現させる組換えベクターの１つによって、または独立のベクターによってそれを行ってもよい。

本発明の組成物はワクチンの分野で公知の方法に従って調製してもよく、利用可能用量は広い範囲で変化させ得る。それらは特に、用いられるポリペプチドおよびベクター、治療される病状、患者の状態および臨床医が評価し得るその他のパラメーターに依存する。しかしながら、一般に、治療薬がウイルスベクターである場合にはウイルスの用量は１０^４〜１０^１３、有利には１０^５〜１０^１２、好ましくは１０^５〜１０^９プラーク形成単位（ｐｆｕ）であり、治療薬がポリペプチド由来のものである場合には０．０５〜５００ｍｇ、有利には０．５〜２００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇである。

本発明の組成物は通常の投与経路のいずれかによって、好ましくは全身的経路によって、特には筋肉内、静脈内、肺内、皮下もしくは上皮下経路によって、または乱刺法によって投与してもよい。接触可能な腫瘍の場合には、腫瘍の部位もしくはその付近への直接注射、または局所塗布を用いることもできる。ワクチンとしては、本発明の組成物を当技術分野で一般的な実施に従い、例えば１回用量として、またはある一定の時間間隔の後に１回もしくは数回繰り返す用量として投与してもよい。他方、治療処置に関しては、治療が効果的であるに十分な周期で頻繁にそれを投与することができる。治療薬がウイルスベクターである場合には、ウイルスは生きている形態であることが好ましい。ポックルウイルスベクターに関しては、ＭＶＡ株またはチミジンキナーゼ陰性コペンハーゲン株のような弱毒株を使用するのが好ましい。最後に、組換えウイルスベクターは、当業者にとって公知である適当な化学処理によって弱毒化してもよい。しかしながら、死滅した組換えベクターの注射を意図することもできる。

好ましい具体例によれば、本発明の抗腫瘍組成物は、治療上有効量の治療薬を医薬上許容される担体と組み合わせて含んでなる。担体は、注射によってヒトまたは動物へ投与できるように選択する。それはまたビヒクル、賦形剤および／またはアジュバントを含んでもよく、液体または凍結乾燥形態で提供されてもよい。これに関して、ベクターのトランスフェクション効率および／または安定性を増大させることができる１以上の物質の組み合わせが意図され得る。これらの物質は当業者が利用できる文献に広く記載されている（例えば、Felgner et al., 1989, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342, Remy et al., 1994, Bioconjugte chemistry 5, 647-654を参照）。限定されるものではないが例として、それらはポリマー、脂質、特に陽イオン脂質、リポソーム、核タンパク質および中性脂質であってもよい。意図し得る組み合わせは、陽イオン脂質（ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＧＳなど）、および中性脂質（ＤＯＰＥ）と組み合わせたプラスミドベクターがある。この物はまた、その他の物質、特に抗癌物質と組み合わせてもよく、後者は個々にまたは同時に投与することが可能である。リガンドＦｌｔ３はその他の一例である（Lynch et al., 1997, Nature Medicine 3, 625; Brasel et al., 1996, Blood 88, 2001-2012; Marakovsky et al., 1996, J. Exp. Med. 184, 1953-1962）。この組成物はポリペプチドＬ１および／またはＬ２を含んでなる場合には模倣粒子の形態であってよいことを記載すべきであろう。

本発明の主題はまた、パピローマウイルスの初期および／または後期領域に由来して先に定義された特徴を有する免疫ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの配列を含んでなる組換えベクターである。それは注目されるその他の配列、例えば先に定義されたように、１以上の免疫ポリペプチドおよび／または免疫刺激ポリペプチドをコードする配列をさらに有してもよい。

本発明のベクターの選択肢は広い。それは先に挙げたもののようなプラスミドまたはウイルスベクターであってもよい。好ましい具体例はポックスウイルスベクターからなり、最も特別にはワクシニアウイルスのコペンハーゲンまたはＭＶＡ株からなる。発現される注目の配列の挿入部位および発現に必要な要素は前記のものから選択され得る。

好ましいベクターは、
（１）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチドをコードする配列、
（２）配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチドをコードする配列、
（３）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、および配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチドをコードする配列、
（４）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチドをコードする配列、
（５）配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチドをコードする配列、
（６）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチドをコードする配列
が挿入されたワクシニアウイルスのコペンハーゲンまたはＭＶＡ株である。

それは所望によりＩＬ２またはポリペプチドＢ７．１をコードする配列を含んでもよい。

本発明はまた、本発明の組換えウイルスベクターから調製したウイルス粒子に関する。アデノウイルスベクターに関しては、このウイルス粒子はその欠損に好適な相補細胞にベクターをトランスフェクトすることによって作出してもよい。例えば、Ｅ１機能を効果的に相補する、ヒト胎児腎臓細胞から確立された２９３ライン(Graham et al.,1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72)、Ａ５４９−Ｅ１ライン(Imler et al., 1996, Gene Therapy 3, 75-84)または二重相補を可能にするライン(Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565; Krougliak and Graham, 1995, Human Gene Therapy 6,1575-1586; Wang et al., 1995 Gene Therapy 2, 775-783;国際出願ＷＯ９７／１４１１９)を使用してもよい。相補細胞とは、ウイルス粒子を作出するために欠損ベクターをトランスで相補することができる細胞を意味するものと理解される。この細胞はベクターの欠損機能の総てをそれ自身で相補するわけではなく、この場合には部分的な相補としてヘルパーウイルスを使用することができる。ウイルス粒子は培養上清からだけでなく細胞からも回収してもよい。一般に用いられる方法の１つとしては、連続凍結／解凍サイクルによって細胞を溶解させて細胞溶解の上清中のビリオンを回収することである。これらを増幅して先行技術（クロマトグラフィー法、特に塩化セリウム勾配による超遠心分離など）に従い精製してもよい。

レトロウイルス粒子は、適切なライン、例えば、それらの配列がベクター中において欠損している／機能しないウイルスポリペプチドｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖをトランスで提供することができるラインにレトロウイルスベクターをトランスフェクトすることによって得ることができる。かかるラインは文献に記載されている（ＰＡ３１７、Ｐｓｉ ＣＲＩＰＧＰ ＋ Ａｍ−１２など）。

ポックスウイルスベクターに関しては、異種遺伝子を発現することができるワクシニアウイルスを産生するための一般条件は、欧州特許ＥＰ ８３ ２８６および出願ＥＰ ２０６ ９２０に教示されている。ＭＶＡウイルスに関しては、Mayr et al (1975, Infection 3, 6-14)およびSutter and Moss (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851)にさらに詳しく記載されている。便宜には、in vivoにおけるその（それらの）発現に適当なエレメントの制御下に置かれた導入される遺伝子を、挿入部位のいずれかの側にウイルス配列を含む導入ベクター中に挿入する。それを感染性ワクシニアウイルスに感染させた細胞中に導入する。組換え遺伝子は、この感染性ウイルスと導入ベクターの相同配列の間の相同組換えによってウイルスのゲノムへ組み込まれる。

組換えベクターまたはウイルス粒子は、所望により、ベクターのトランスフェクション効率および／または安定性を増大させる１以上の前記物質と組み合わせてもよい。

本発明では、この免疫ポリペプチドはウイルス粒子を取り巻くタンパク質構造（キャプシド、包膜など）に付着されていてもよい。

ポックスウイルスは多重膜に取り巻かれた複雑な構造である。２種のウイルス粒子が産生され、それは細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）と細胞外包膜ビリオン（ＥＥＶ）である。ＩＭＶの表面は二重膜からなり、ＥＥＶの包膜は原形質膜をはじめとする４つの膜からなる。本発明により追求される目的に従い、免疫ポリペプチドをコードする配列はまた、免疫応答を増強する目的とする、ポックスウイルス膜の一方または他方（ＩＭＶまたはＥＥＶ）への挿入によって改変されていてもよい。有利な具体例によれば、免疫ポリペプチドはＥＥＶ粒子の包膜の外膜に付着している(Katz et al. 1997, AIDS Res. Hum. Retrov. 13, 1497-1500)。これを行うために、その外膜のタンパク質成分であるＢ５Ｒタンパク質のＣ末端部分をコードする配列が、停止コドンのすぐ上流の免疫ポリペプチドのコード領域の３’に挿入される。全く好ましい例としては、ポリペプチドＥ７またはその非発癌性変異体とＢ５Ｒタンパク質の４２個のＣ末端残基との間の融合物がある。免疫応答に対する有益な効果は、種々の組成（天然の局在性、細胞膜における付着、ウイルス膜における付着）を比較する以下の実施例に記載されたプロトコールに従う免疫予防および免疫治療研究によって評価され得る。

本発明はまた、癌または腫瘍の、特に子宮頸部癌、軽度子宮頸部形成異常またはパピローマウイルス感染の治療または予防用医薬を製造するための、本発明の抗腫瘍組成物、組換えベクターまたはウイルス粒子の使用に関する。好ましい使用は筋肉内経路により注射可能な医薬の製造のためもののである。

最後に、本発明はまた、医薬上有効量の本発明の抗腫瘍組成物、組換えベクターまたはウイルス粒子をかかる治療を必要とする患者に投与することにより、先に挙げた病状の治療または予防方法に関する。

以下、本発明を実施例によって詳しく説明するが、結果として限定されるものではない。

以下に記載した構築体は、Maniatis et al., (1989, 前記)に詳述されている一般的な遺伝子工学および分子クローニング技術に従い、または市販のキットを用いる場合には製造業者の推奨に従って作製する。in vitroでの合成オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発は、Ａｍｅｒｓｈａｍにより供給されるキットによって実施する。ＰＣＲ増幅技術は当業者にとっては公知である（例えば、Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Press Incにより出版されているPCR Protocols - A guide to methods and applications, 1990を参照）。制限部位の修復に関しては、用いられる技術は大腸菌（Ｋｌｅｎｏｗ）のＤＮＡポリメラーゼＩの大断片で、突出している５’末端を埋めることからなる。クローニング工程に関しては、組換えＭ１３バクテリオファージを寒天最小培地（寒天７．５％）または豊富な液体ＬＢＭ培地中の大腸菌ＮＭ５２２株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上で増殖させる。１００μｇ／ｍｌの抗性物質を補った寒天または液体培地で大腸菌Ｃ６００株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＢＪ５１８３(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580)およびＮＭ５２２においてアンピシリン耐性遺伝子を運ぶ組換えプラスミドを反復させる。クローニングが相同組換えによって行われる場合には、ＢＪ５１８３株を使用することが好ましい(Bubeck et al., 1993, Nucleic Acid Res. 21, 3601-3602)。

組換えワクシニアウイルス構築体は、すでに挙げた文献ならびにMackett et al., (1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419)およびMackett et al. (1984, J. Virol. 49, 857-864)に開示されている当技術分野の標準技術に従って行う。

in vivoでの試験（免疫予防または免疫治療）は、６〜８週齢のメスＣ５７Ｂ１６マウス(C. Rivers Rouen, France)またはヌードマウス(Janvier, Le Genest St. Isle, France)について行う。一般に、試験されるウイルス、用量または投与経路によって動物を２０の群に分ける（指定されている場合は除く）。腫瘍細胞ＴＣ１(Wu, John Hopkins University, Baltimore, USA)は、２種のレトロウイルス、すなわちＨＰＶ−１６天然Ｅ６およびＥ７遺伝子を発現するものと、ｒａｓ癌遺伝子を発現するもので形質転換したＣ５７Ｂ１６マウスから採取した肺細胞から得る。この細胞は、Ｇ４１８（０．５ｍｇ／ｍｌ）の存在下、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）で培養する。その細胞をトリプシンで処理して等張液で３回洗浄した後に動物の抗原投与に使用する。

実施例１： トランスメンブラン局在化シグナルを供給したＨＰＶ−１６ Ｅ６およびＥ７の非発癌性変異体をコードする配列を運ぶベクターの構築
Ｅ６およびＥ７遺伝子を欧州特許ＥＰ ０，４６２，１８７の実施例２および３に記載されているＣａｓｋｉ細胞系から単離する。それ以後のクローニング工程を容易にするように、２つの構築体をＨＰＶ−１６ Ｅ６およびＥ７遺伝子を含有するクローンＭ１３Ｅ７／Ｅ６から誘導した。１つめのＭ１３ＴＧ８１８８と示されるものは指定突然変異誘発によってＥ７遺伝子のそれぞれ上流および下流のＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位の導入の結果得られ、２つめのＭ１３ＴＧ８１８９はＥ６遺伝子の上流のＰｓｔＩ部位を含んでなる。開始暗号ＡＴＧの上流および停止コドンの下流における点突然変異の導入は、当業者の能力の範囲内である。

ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質と網膜芽細胞腫遺伝子の産物との組合せが、種々の著者によって実証され（例えば、Munger et al., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105を参照）、その形質転換力と相関している。明白な安全上の理由で、形質転換作用に関与している天然のＥ７タンパク質のコドン２１〜２６を欠失させた非発癌性変異体は、オリゴヌクレオチドｏＴＧ５１１８（配列番号３）によるベクターＭ１３ＴＧ８１８８の指定突然変異誘発によって作出する。以下Ｅ７^＊と示される変異型Ｅ７タンパク質を有するＭ１３ＴＧ９１０４が得られる。

狂犬病糖タンパク質に対する分泌シグナルおよび付着シグナルは、Ｂｇ１ＩＩの形態でｐＢＲ３２７（仏国特許８３ １５７１６に記載されているｐＴＧ１５０）に挿入された狂犬病糖タンパク質遺伝子から単離し、ベクターＭ１３（Ｍ１３ＴＧ１７７）にサブクローン化する。ＢａｍＨＩ部位はオリゴヌクレオチドｏＴＧ５７４５（配列番号４）による指定突然変異誘発によって、それらと同じ位相にあるこれらシグナルの間に導入する。得られた構築体はＭ１３ＴＧ９１２８と呼ばれる。次いで分泌配列および付着配列をＰｓｔＩ消化によってＭ１３ＴＧ９１２８から単離し、ＰｓｔＩで線状化したベクターｐＴＧ５００３にワクシニアウイルスｐ７．５の天然のプロモーターの３’に挿入すると、ｐＴＧ５０１６が得られる。指針としては、ｐＴＧ５００３をＳａｌＩ消化によってｐＴＧ１８６ポリ（仏国特許２，５８３，４２９に記載）から誘導し、Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理し、次いでＳｍａＩで消化して再連結すると、結果としてそれはここでそのポリリンカー中に他のもの総てを除きＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩのみを含むようになる。位相中にＥ７^＊配列および狂犬病糖タンパク質の分泌シグナルおよび付着シグナル（本明細書では以下Ｅ７^＊ＴＭＲと示す）をもたらすように、ベクターＭ１３ＴＧ９１０４をオリゴヌクレオチドｏＴＧ６３９０およびｏＴＧ６８８０（配列番号５および６）による指定突然変異誘発によって改変する。得られた構築体はＭ１３ＴＧ９１５０と呼ばれる。

同様に、ＨＰＶ−１６ Ｅ６タンパク質は腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の発現産物と相互作用することができるということが実証されている(Crook et al., 1991, Cell 67, 547-556)。この相互作用に関与するドメインは明確に定義されており、天然のタンパク質の残基１１１と１１５との間に位置している。ベクターＭ１３ＴＧ９１２５は、オリゴヌクレオチドｏＴＧ５３７７（配列番号７）によるＭ１３ＴＧ８１８９の突然変異誘発によって作出される。Ｅ６遺伝子λ１１１−１１５を以下Ｅ６^＊と呼ぶ。

麻疹ウイルスＦタンパク質に対する分泌シグナルおよび付着シグナルは、麻疹ウイルスＦタンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミド構築体ｐＴＧ２１４８（欧州特許ＥＰ ０，３０５，２２９に記載）からＰＣＲによって単離する。これらの配列とＥ６^＊をコードするものとの間の融合は、直接ＰＣＲによって行われ、すなわち、分泌配列を５’にＸｂａＩ部位を有するオリゴヌクレオチドｏＴＧ１０８２９（配列番号８）およびＥ６の５’末端を覆うｏＴＧ１０８３０（配列番号９）により増幅し、変異型Ｅ６^＊をコードする配列をＦタンパク質の分泌シグナルの３’末端との融合を可能にするオリゴヌクレオチドｏＴＧ１０８３５（配列番号１０）およびＦタンパク質の付着配列の５’末端との融合を可能にするｏＴＧ１０８３６（配列番号１１）により、Ｍ１３ＴＧ９１２５から増幅される。付着配列に関しては、Ｅ６^＊の３’と付着配列の５’との間における融合を可能にするプライマーｏＴＧ１０８３３（配列番号１２）ならびに３’にＫｐｎＩおよびＳｐｈＩ部位を作り出すｏＴＧ１０８３４（配列番号１３）が使用される。それぞれＮおよびＣ末端でＦタンパク質の膜分泌配列および付着配列と融合したＥ６^＊配列を有する増幅断片（本明細書では以下Ｅ６^＊ＴＭＦと示す）をＸｂａＩおよびＳｐｈＩで消化し、次いで同一部位にベクターＭ１３ＴＧ１３１に挿入する(Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99)。このようにして得られた構築体はＭ１３ＴＧ９１９９と呼ばれる。

実施例２： トランスメンブラン局在性のＥ６およびＥ７抗原ならびにヒトＩＬ−２を発現する組換えウイルスＭＶＡＴＧ８０４２の構築
ＭＶＡウイルスは、ワクシニアウイルスのアンカラ株に由来する。それは哺乳類細胞では感染性粒子を生ずることはできないが、胎芽鶏繊維芽細胞では正常に発達する。これらの細胞への適応は、この種の細胞でのその発達およびその感染サイクルに不可欠でない６領域の除去を引き起こした（ウイルスゲノムの約１５％の消失；Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038）。外来の遺伝物質の組み込みは、これらの除去領域のいずれのレベルで達成されてもよい。本発明では、ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片ＮおよびＡ各々のレベルに位置する除去ＩＩおよびＩＩＩが用いられる（Altenburger et al., 1989, Arch. Virol. 105, 15-27)。

第一に、ＭＶＡウイルスの除去ＩＩＩ領域への挿入を可能にするベクターｐＴＧ６０１９を構築する。除去領域ＩＩＩのいずれかの側の相同組換えアームは、ＰＣＲによりウイルスゲノム、ならびに左のアームについてはプライマーｏＴＧ７６３７およびｏＴＧ７６３８（配列番号１４および１５）、ならびに右のアームについてはｏＴＧ７６３５およびｏＴＧ７６３６（配列番号１６および１７）から単離する（米国特許第５，１８５，１４６号を参照）。増幅した断片をベクターｐＴＧ１ＥのＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、ｐＴＧ６０３９を得る。導入される遺伝物質は２個の組換えアームの間に挿入される。ベクターｐＴＧ１Ｅは多重クローニング部位の代わりにＥｃｏＲＩアダプターが存在することを除けばｐＴＧ１Ｈ（仏国特許第２，５８３，４２９号）と同様である。

第一に、マーカー遺伝子ｇｕｓＡを発現するカセットを挿入する。まず７．５ＫプロモーターをｐＴＧ６０１９のＢａｍＨＩ部位へクローン化する。そのＢａｍＨＩ部位へＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の形で作出されたｇｕｓＡ遺伝子が挿入されているｐＴＧ６０２１が得られる。後者は文献に開示されている配列から得てもよい。得られた構築物はｏＴＧ６０２２と呼ばれる。マーカーの存在により、ＸｇｌｃＡ基質を用いてＧＵＳ酵素活性を検出することによって野生型ウイルスを組換えウイルスと識別することが可能となろう。赤色はβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。しかしながら臨床適用の点では、組換えウイルスを選択した後の最終産物から、この細菌性マーカーを除去できることが有用であろう。このために２つの相同部位間の配列を欠失させるワクシニアの能力が利用される。従って、第２のｐ７．５Ｋプロモーターは、後者の発現を命令するのに適切なセンス方向でｇｕｓＡ遺伝子の下流に挿入される。ベクターｐＴＧ６０２５は、付着端を提供したｐ７．５断片のｐＴＧ６０２２のＢａｍＨＩとＳａｃＩ部位間への挿入の結果生ずる。

さらに、ヒトインターロイキン−２をコードするｃＤＮＡを、ＰｓｔＩ消化によってプラスミドｐＴＧ３６（仏国特許第２，５８３，７７０号）から単離し、次いでプラスミドｐＴＧ１８６（仏国特許第２，５８３，４２９号）のＰｓｔＩ部位へ挿入すると、ｐＴＧ１８８が得られる。相同組換えによって得られるウイルスはＶＶＴＧ１８８と呼ばれる。ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化後、Ｍ１３ＴＧ９１３２のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位でＩＬ−２配列を天然のワクシニアプロモーターｐＨ５Ｒの３’に挿入し、Ｍ１３ＴＧ９１８５を得る。指針として、ベクターＭ１３ＴＧ９１３２は、ＰＣＲによってウイルスゲノムから単離されたＨ５Ｒ遺伝子のプロモーターの、多重クローニング部位の外に位置する内部ＢｇｌＩＩ部位の突然変異によってＭ１３ＴＧ１３１（Kieny et al., 1983, 前記） から誘導されるファージＭ１３ＴＧ６１３１への挿入から得られる。

次いで、ＨＰＶ−１６およびＩＬ−２遺伝子をＭＶＡゲノムの除去ＩＩＩ領域へクローン化する。Ｅ７^＊ＴＭＲ配列はＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって単離し、次いでワクシニアプロモーターｐ７．５の３'においてｐＴＧ６０２５のＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入する。得られる構築体はｐＴＧ６０５０と呼ばれる。ヒトＩＬ−２遺伝子の発現カセットの挿入部位は、相同組換えにより、オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０５０２およびｏＴＧ１０５０３（配列番号１８および１９）の挿入によってｐＴＧ６０５０のＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩ部位の間に作り出される。次いで作出したベクターｐＴＧ６０７４をＨｉｎｄＩＩ／ＫｐｎＩ消化により線状化し、さらにＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化によってＭ１３ＴＧ９１８５から単離された発現カセットｐＨ５Ｒ−ＩＬ−２を用いて相同組換えを行う。最後に、得られた構築体ｐＴＧ６０８８をＫｐｎＩで線状化し、次いでＫｐｎＩ／ＸｂａＩ消化によってＭ１３ＴＧ９１９９から単離されたＥ６^＊ＴＭＦ遺伝子、およびＸｂａＩ／ＫｐａＩ消化によってＭ１３ＴＧ９１３６から単離されたプロモーターｐ７．５と連結する。得られた構築体はｐＴＧ８０４２と呼ばれる（図１）。ベクターＭ１３ＴＧ９１３６は、ｏＴＧ５９２５を用いる指定突然変異誘発（ｐ７．５プロモーターの３'におけるＰｓｔＩ部位の作出；配列番号２０）ならびにｏＴＧ５９２４を用いる指定突然変異誘発（ｐ７．５プロモーターの５’におけるＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位の作出；配列番号２１）によって改変されたＭ１３ＴＧ５１０７から得られる。

ウイルスＭＶＡＴＧ８０４２は、先行技術の規定に従ってＭＶＡゲノムを用いる相同組換えによって作出する。組換え体の単離はｇｕｓＡマーカー遺伝子の存在によって容易になる。

ＨＰＶ初期抗原の細胞局在性の改変がその発現を阻害しないことを確かめる。抗Ｅ７抗体を用いてＭＶＡＴＧ８０４２に感染させた細胞抽出物のウェスタンブロット解析は、２０〜３５ｋＤａの間の分子量を有する３個のバンドの検出を可能にする。この不均一性は狂犬病糖タンパク質の膜付着領域における可能性のあるＯ−糖分解部位の存在によって説明され得る。ウェスタンブロット解析がフェニル−Ｇａｌ−Ｎａｃ（フェニルＮ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、Sigma、p4023）の存在下で繰り返す場合には、２０ｋＤａの１形態のみが検出され、これはＥ７^＊ＴＭＲ遺伝子の発現産物のＯ−糖分解を確実にする。

Ｅ６^＊ＴＭＦ遺伝子の発現産物の抗Ｅ６抗体によるウェスタンブロット検出は、予測された２０ｋＤａの分子量に移動する１個のバンドのみを示し、これは翻訳後の修飾がないことを確実にする。指針として、 前記抗Ｅ６およびＥ７抗体は精製された抗原の投与によって得られたウサギ抗血清である。しかしながら、モノクローナルでもポリクローナルでも、いずれの他の特異的抗体も好適であり得る。

ｈＩＬ−２遺伝子の発現は、ＥＬＩＳＡ（Quantikine R&D系）およびＩＬ−２依存性細胞増殖試験により評価する。培養条件にもよるが、産生されるＩＬ−２の量は０．１ｐｆｕ／細胞を用いて感染させた１０^６細胞あたり２００〜８００ｎｇ／ｍｌ／２４時間まで様々である。

実施例３： ウイルスＭＶＡＴＧ８０４２のin vivoにおける効率（免疫療法）
Ｃ５７ＢＬ６マウスに皮下経路によって植え付けられた１０^３個のＢＭＫ−１６ｍｙｃ細胞を接種する。指針として、 細胞系統はＨＰＶ−１６ゲノムおよびネズミｃ ｍｙｃ遺伝子でトランスフェクトした新生マウスの腎臓細胞に由来する。次いで、ＭＶＡＴＧ８０４２ウイルスの１０^７ｐｆｕ（プラーク形成単位）もまた、Ｄ３、Ｄ６およびＤ９に皮下経路により投与し、腫瘍の発達を定期的にモニターする。処理されたマウスは非組換えＭＶＡウイルスを受容した動物からなる対照と比べてＤ１５までの腫瘍成長において遅延を示す。さらに、処理はＤ３０〜３５での腫瘍の部分的な抑制を伴い、これは同等のＭＶＡを用いる場合には観察されず、またこれは天然の核局在性を有するＥ６^＊およびＥ７^＊変異体を発現する。

実施例４： トランスメンブラン局在性のＥ７ ^＊ 抗原を発現する組換えウイルスＶＶＴＧ５０９５の構築
Ｅ７^＊ＴＭＲ配列をＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ消化によってＭ１３ＴＧ９１５０から単離し、ｐＴＧ５０１６のＢａｍＨＩ部位に挿入する。得られた構築体はｐＴＧ５０９５と呼ばれ、ｐ７．５プロモーターの制御下に狂犬病糖タンパク質の分泌シグナルおよび付着シグナルと融合したＥ７^＊配列を含む。ウイルスＶＶＴＧ５０９５はワクシニアゲノムを用いた相同組換えによって作出する。

実施例５： トランスメンブラン局在性のＥ７ ^＊ 抗原および免疫刺激剤Ｂ７．１を発現する組換えウイルスＶＶＴＧ６００２の構築
ヒトＢ７．１遺伝子をプライマーｏＴＧ６３５３およびｏＴＧ６３５２（配列番号２２および２３）を用いた逆ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によってダウジ（Ｄａｕｄｉ）ヒト細胞系統から単離し、Ｍ１３ＴＧ６１３１のＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩ部位の間に挿入する。Ｍ１３ＴＧ９１４９は、ｐ７．５プロモーターの３’においてＭ１３ＴＧ５１０７の同じ部位の間にサブクローン化されている、ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離したものから得られる（Ｍ１３ＴＧ５１０７はＭ１３ＴＧ１３０のＢａｍＨＩ部位へクローン化されたｐ７．５プロモーター配列を運ぶ）。ｐ７．５−Ｂ７．１カセットは、このようにして得たＭ１３ＴＧ９１５２と呼ばれる構築体からＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ消化によって単離し、ｏＴＧ１０８６（５’ＡＡＴＴＧＣＡ３’）を用いてｐＴＧ５０９５のＥｃｏＲＩ部位へ導入する。得られた構築体はｐＴＧ６００２と呼ばれ、次いでワクシニアゲノムを用いる相同組換えによって組換えウイルスＶＶＴＧ６００２を作出する。
同等の構築体は、実施例２で開発されたような同様の技術に従う、Ｅ７^＊およびＢ７．１遺伝子を発現するカセットのＭＶＡＮ３３遺伝子の除去領域ＩＩＩへの挿入によって調製される。

実施例６： ウイルスＶＶＴＧ５０９５およびＶＶＴＧ６００２のin vivoにおける効率（免疫予防）
Ｃ５７ＢＬ６マウスに１０^７ｐｆｕのＶＶＴＧ５０９５またはＶＶＴＧ６００２を用いて皮下経路によって３回ワクチン接種した。最後の免疫化の３日後、皮下に植え付けた１０^３個のＥ７Ｗ１細胞を用いて、これらの動物に抗原投与する。指針として、Ｅ７Ｗ１細胞はＨＰＶ−１６の発癌性Ｅ７遺伝子を発現するベクターでトランスフェクトされたネズミリンパ腫系統から得られる。時間の関数としての動物の生存率（％）を１０^７ｐｆｕの非組換えワクシニアウイルスＶＶＴＧ１８６（前記に記載のベクターＴＧ１８６に由来する）で処置した対照マウスで得られたものと比較する。死亡率のモニタリングは３群の間の差異を示す。Ｄ３６で対照群では１００％の動物が死亡したのに対し、ＶＶＴＧ５０９５でワクチン接種した動物では約４分の１の生存が観察される。防御はＢ７．１抗原をコードする配列を含む構築体ＶＶＴＧ６００２により実質的に増強される。

実施例７： ＨＰＶ１６の改変された初期遺伝子および後期遺伝子を発現するＭＶＡＴＧ９９３６の構築
ＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２タンパク質をコードする断片をＰＣＲによって一般的な先行技術に従ってカスキ（Ｃａｓｋｉ）細胞のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ１５５０）から単離する。Ｌ１配列を保持する増幅断片をＭ１３ＴＧ１３０(Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99)へサブクローン化し、構築体Ｍ１３ＴＧ８１７１を得る。クローン化されたＬ１遺伝子の配列はＧｅｎｅｂａｎｋに含まれる配列（受託番号Ｋ０２７１８）と比較して数箇所の突然変異、すなわち、２４８番におけるＡの代わりのＣ、２５３番におけるＡの代わりのＣ、５３７番におけるＡの代わりのＧ、６８２番におけるＣの代わりのＧ、８７４番におけるＡの代わりのＧ、１３９３番におけるトリプレットＡＣＴの挿入、１３９０番におけるトリプレットＧＡＴの欠損を示す。この配列をZhou et alによって発表されたもの(1991, Virology 185, 251-257)と適合させるよう、かつ、ワクシニアの初期段階の発達を妨げることのできる初期転写終結に関して可能性ある部位を構成するＴＴＴＴＴＮＴ配列のレベルでサイレント変異を導入するよう点突然変異によって補正する。部位指定突然変異誘発の技術は当業者の能力の範囲内である。補整された配列を運ぶベクターはＭ１３ＴＧ４０４１と呼ばれる。

Ｌ２配列を運ぶＰＣＲ断片のベクターＭ１３ＴＧ６１３１への挿入により、Ｍ１３ＴＧ９１２６が得られる。Ｇｅｎｅｂａｎｋに開示された配列と比較して５個の点突然変異、すなわち、３７８番におけるＴの代わりのＣ、６９１番におけるＧの代わりのＡ、７０２番におけるＧの代わりのＡ、９９０番におけるＡの代わりのＧおよび１０９２番におけるＡの代わりのＣが確認される。指針として、ベクターＭ１３ＴＧ６１３１は、多重クローニング部位の外に位置する内部ＢｇｌＩＩ部位の突然変異によってＭ１３ＴＧ１３１(Kieny et al., 1983, Gene 26, 91-99)から誘導される。

ベクターＭ１３ＴＧ４０４１をＸｂａＩ−ＳａｃＩを用いて消化し、次いでＬ１配列を有する断片をＬ２遺伝子の下流でかつ、反対の方向に、Ｍ１３ＴＧ９１２６のＸｂａＩ−ＳａｃＩ部位の間に挿入する。このようにして作出された構築体はＭ１３ＴＧ４０４２と呼ばれる。次いで、Ｌ１およびＬ２配列をＢｇｌＩＩ消化によって単離し、後期ｐ１１Ｋと初期ｐ７．５プロモーターの融合の結果生じる合成プロモーターｐ１１Ｋ７．５を含むベクターＭ１３ＴＧ４０５２のＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩ部位の間にサブクローン化する。２つの方向のうち、Ｍ１３ＴＧ４０５５と呼ばれるプロモーターのＬ１遺伝子の下流に位置するものを選択する。次いで、ｐＨ５ＲプロモーターおよびｈＩＬ−２遺伝子を有する発現カセットを、Ｌ１とＬ２遺伝子の間に位置するＭ１３ＴＧ４０５５のＨｉｎｄＩＩＩ部位へ導入するのに先立ち、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によってｐＴＧ８０４２から単離する。最後に、得られた構築体Ｍ１３ＴＧ４０５７をＢｇｌＩＩで消化し、次いでＨＰＶ１６後期配列を有する断片を、合成プロモーターｐ４ＢＫ１Ｌのクローン化の結果生じるＭ１３ＴＧ４０６０のＢａｍＨＩ部位へ挿入する。後者は初期プロモーターｐ４Ｂ(Davidson and Moss, 1989, J. Mol. Biol. 210, 749-769)と後期プロモーターｐＫ１Ｌ(Davidson and Moss, 1989, J. Mol. Biol. 210, 771-784)間のハイブリッドプロモーターである。ｐ１１Ｋ７．５の制御下にあるＬ１遺伝子、Ｌ１配列に対して反対の方向でｐ４ＢＫ１Ｌの制御下にカセットｐＨ５Ｒ−ＩＬ２およびＬ２遺伝子を含んでなるＭ１３ＴＧ４０６２が得られる。

Ｅ７^＊ＴＭＲおよびＥ６^＊ＴＭＦをコードする配列を含む多シストロン性カセットを構築する。第一に、ＥＭＣウイルス（脳心筋炎ウイルス；Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｍ２２４５８）のＩＲＥＳ配列を常法によってｐＴＧ６００２のＥｃｏＲＩとＮｃｏＩ部位の間にＥ７^＊ＴＭＲ遺伝子の下流が導入されたＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩ断片の形で単離して（実施例５）ｐＴＧ８０８４を得る。次いでＥ６^＊ＴＭＦ遺伝子を各５’末端にＮｃｏＩ部位を作り出す適当なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。Ｅ７^＊ＴＭＲ遺伝子およびｐＴＧ８０８４から得られたＩＲＥＳ配列を有するＢｇｌＩＩ−ＮｃｏＩ断片ならびにＮｃｏＩおよびＳａｃＩによって消化されたＥ６^＊ＴＭＦ遺伝子を有するＰＣＲ配列を、予めＢｇｌＩＩおよびＳａｃＩで消化されたベクターＭ１３ＴＧ６１３１（実施例２）中で再構築する。Ｍ１３ＴＧ４０５９が得られる。次いで、後者からＥ７^＊ＴＭＲ−ＩＲＥＳ−Ｅ６^＊ＴＭＦ単位をＢｇｌＩＩ断片の形で単離し、ｐ７．５ＫプロモーターのｐＴＧ８０９３下流のＢａｍＨＩ部位へ挿入する（ｐＴＧ８０９３はｐ７．５ＫプロモーターのベクターｐＴＧ６０２５へのクローン化の結果生じる）。このようにして得られた構築体はｐＴＧ９９０１と呼ばれる。

Ｍ１３ＴＧ４０６２のＳａｃＩ断片をｐＴＧ９９０１のＳａｃＩ部位へクローン化し、ｐＴＧ９９０２を得る。以下の方法でベクターｐポリＩＩ(Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201)において、選抜可能なｇｐｔ遺伝子(Falkner and Moss, 1988, J. Virol. 62, 1849-1854)を後期およびＩＬ２遺伝子とともに構築する。最初のものはＢｇｌＩＩ−ＮｃｏＩ消化によってＭ１３ＴＧ４０７６（このベクターはその２つの末端にｐ４ＢＫ１Ｌプロモーター配列によってフランクされたｇｐｔ遺伝子を含む）から、２番目のものはＮｃｏＩ−ＳａｃＩ消化によってｐＴＧ９９０２から単離する。精製された断片をｐポリＩＩのＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩ部位の間にクローン化する。ｐＴＧ９９３３は、ＳａｃＩによって切断されたベクターｐＴＧ９９０１へ導入されているＳａｃＩ断片が得られるものから得られる。このようにして得られた構築体ｐＴＧ９９３６は図２に示されている。
ＭＶＡＴＧ９９３６ウイルスは、ＭＶＡＮ３３ゲノムを用いる相同組換えによって作出する。クローンの単離は先行技術の規定に従って行ってよい。

実施例８： 免疫予防におけるウイルスの効率
Ａ．ウイルスの処方の重要性（実験Ｎ１２１）
この前臨床試験の目的はウイルス株（ＭＶＡに対するコペンハーゲンワクシニアウイルス）および抗腫瘍防御に関する処方（天然の核局在性に対するトランスメンブラン型での提供）を比較することである。

Ｃ５７Ｂ１６マウスを１０^７ｐｆｕのウイルスで３回ワクチン接種する。注射は腹膜内経路によって１０日毎に（Ｄ１、Ｄ１１、Ｄ２１）行う。最後の免疫化の７日後に、それらの右手側面への５×１０^４個のＴＣ１細胞の皮下投与によって動物に抗原投与する。ウイルスおよび投与される溶液、各々：
１ ＭＶＡＴＧ８０４２(実施例２、Ｅ６^＊ＴＭＦ、Ｅ７^＊ＴＭＲ、ＩＬ−２）、
２ ＭＶＡＴＧ６０３７(実施例５、Ｅ７^＊ＴＭＲ、Ｂ７．１）、
３ ＶＶＴＧ５０９５(実施例４、Ｅ７^＊ＴＭＲ）、
４ ＭＶＡＴＧ６０９０（Ｅ６^＊、Ｅ７^＊、ＩＬ−２）、
５ ＶＶＴＧ５０６１ｘ１８８（Ｅ６^＊、Ｅ７^＊、ＩＬ−２）、
６ ＶＶＴＧ１８６（非組換えワクシニアウイルス）、
７ ＭＶＡＮ３３（非組換えＭＶＡウイルス）、および
８ 塩溶液（ＰＢＳ）
に従って２０個体の動物の８群を形成する。

１〜３群は少なくとも１種のトランスメンブランＨＰＶ抗原を発現する本発明のウイルスでワクチン接種するが、４および５群は天然の核局在性のＨＰＶ１６初期抗原を発現するウイルスを、また６〜８群は非組換え対照ウイルスまたは塩溶液を施す。ウイルスＭＶＡＴＧ６０９０およびＶＶＴＧ５０６１ｘ１８８は国際出願ＷＯ９８／０４７０５に記載されているということを記載すべきであろう。種々の群の動物の生存率（％）を腫瘍の抗原投与に続いて１２週間モニターする。結果は以下のように要約できる。

一般に、３つの対照群における死亡率は高く、９５％（ウイルスＭＶＡＮ３３およびＶＶ１８６を用いて）および８１％（ＰＢＳを用いて）に達する。
ＨＰＶ核抗原を発現するウイルスで免疫化した動物の生存においては有意な増加が観察される。例えば、ウイルスＭＶＡＴＧ６０９０を受容したマウスの５５％は腫瘍を持たないが、ＶＶＴＧ５０６１ｘ１８８の投与は７５％の腫瘍排除レベルを誘導する。

他方、ＨＰＶ１６トランスメンブラン抗原を発現するウイルスでワクチン接種された動物の大部分では腫瘍が排除されたか、または腫瘍成長において実質的な遅延を示す。さらに正確には、ＭＶＡＴＧ８０４２によれば１００％の排除が、ＭＶＡＴＧ６０３７によれば９５％の排除が、またＶＶＴＧ５０９５によれば９０％の排除が観察される。

図３は対照（ＭＶＡＮ３３およびＰＢＳ）と比較して、ＭＶＡＴＧ８０４２およびＭＶＡＴＧ６０９０でワクチン接種された動物を用いて得られた生存曲線を示す。

全体として、これらのデータはコペンハーゲンワクシニアウイルスとＭＶＡに由来するウイルス間に有意な差異がないこと、ならびに膜型での提供によって与えられたより優れた免疫原性を実証するものである。試験した総てのウイルスのうち、この免疫予防の動物モデルにおいて１００％の腫瘍排除が起こるので、ウイルスＭＶＡＴＧ８０４２が最も効果的である。

Ｂ．記憶反応の研究（実験Ｎ１２２）
Ｃ５７Ｂ１６マウスに、Ｄ８２にそれらの右手側面への５×１０^４個のＴＣ１細胞の皮下投与によって抗原投与するに先立ち、Ｄ１、Ｄ１１およびＤ２１に１０^７ｐｆｕのウイルスを用いて腹膜内経路によって免疫化する。従前の実験（Ｎ１２１）と同一の８群を形成する。腫瘍の発達を時間の関数としてモニターする。腫瘍の抗原投与の５０日後に得られたデータは腫瘍の排除に関して最も効果的なウイルスはウイルスＭＶＡＴＧ８０４２であるということを確実とする。その投与は１００％の動物を防御し、長期免疫を誘導する能力を示す。

Ｃ．用量効果（実験Ｎ１２７）
Ｃ５７Ｂ１６マウスに、Ｄ２８に５×１０^４個のＴＣ１細胞のそれらの右手側面への皮下投与によって抗原投与するに先立ち、Ｄ１、Ｄ１１およびＤ２１に１０^５、１０^６または１０^７ｐｆｕのＭＶＡＴＧ８０４２ウイルスを用いて腹膜内経路によって免疫化する。対照動物には同量のＭＶＡＮ３３を施す。腫瘍の発達を１週間に２回、１２週間モニターする。結果（図４）は、投与されたＭＶＡＴＧ８０４２の用量にかかわらず１００％の防御を示すが、対照動物の大部分は腫瘍を発達させる。これらのデータは、低用量であってもＭＶＡＴＧ８０４２ウイルスの効力を確実とする。

Ｄ．投与経路の効果（実験Ｎ１３４）
Ｃ５７Ｂ１６マウスに、Ｄ４４に５×１０^４個のＴＣ１細胞のそれらの右手側面への皮下投与によって抗原投与するに先立ち、Ｄ１、Ｄ１１およびＤ２１に１０^７ｐｆｕのウイルスを用いて種々の投与経路（乱刺、皮下、腹膜内または筋肉内）によって免疫化する。腫瘍の発達を週に２回、１２週間モニターする。図５に示されるように、腹膜内または筋肉内経路は、ウイルスＭＶＡＴＧ８０４２による最高レベルの防御を与える。

実施例９： 免疫治療におけるウイルスの効力
Ａ．免疫治療の観点におけるウイルスの効力（実験Ｎ１２５）
この研究の目的は予め確立された腫瘍に対する、膜または核形態でＨＰＶ抗原を示すウイルスの治療能力を比較することである。このために、５×１０^４個のＴＣ１細胞を皮下経路によってＣ５７Ｂ１６マウスの右手側面へ投与する（Ｄ０）。次いで１０^７ｐｆｕのウイルスをＤ７、Ｄ１４およびＤ２１に腹膜内経路によって注射する。４つの動物群を、各々ＭＶＡＮ３３（負の対照）、トリス−ＨＣｌ／ＮａＣｌの塩溶液（負の対照）、ＭＶＡＴＧ８０４２（トランスメンブラン型）およびＭＶＡＴＧ６０９０（核型）という投与されるウイルスに従って形成する。腫瘍の発達を週に２回、１２週間評価する。結果は治療上の観点での抗腫瘍防御に関して、膜型での提供のより優れた効力を示す。ＭＶＡＴＧ８０４２を施したマウスは１００％が腫瘍細胞の植え込み１４０日後に生存したが、ＭＶＡＴＧ６０９０を接種した動物に関しては生存率は約６０％であり、対照動物に関しては極めて低い。

Ｂ．毒性研究−用量の効果
ヒト腫瘍へのそれらの適用を意図するに先立ち、ウイルスの毒性がないことを確かめることは重要である。１０^６または１０^７ｐｆｕのＭＶＡＴＧ８０４２またはＭＶＡＮ３３ウイルスまたは野生型コペンハーゲンワクシニアウイルス（ＶＶｗｔ）を頭蓋内経路によってヌードマウス（５個体／群）へ投与する。マウスの生存率を２０日間モニターし、得られたものを以下の表１に示す。

表１

ウイルス 生存しているヌードマウスの数
１０ ^６ ｐｆｕ １０ ^７ ｐｆｕ
ＭＶＡＮ３３ ５／５ ５／５
ＭＶＡＴＧ８０４２ ５／５ ５／５
ＶＶｗｔ − ０／５

１０^７ｐｆｕのＭＶＡＴＧ８０４２ウイルスの頭蓋内投与後の副作用は検出されないが、野生型ワクシニアウイルスで処理したマウスの総てが注射後３日で死亡した。対照ＭＶＡウイルスはどちらの動物に対しても有毒でなく、これは、すでに文献に記載されているワクシニアウイルスに比べ、その弱毒性を確実とするものである。

［配列表］
（１）一般情報
（ｉ）特許出願人：
（Ａ）名称： Transgene SA
（Ｂ）通り： 11 rue de Molsheim
（Ｃ）市： Strasbourg
（Ｄ）国：フランス
（Ｆ）郵便番号：６７０８２
（Ｇ）電話：（３３）０３ ８８ ２７ ９１ ００
（Ｈ）テレファックス：（３３） ０３ ８８ ２７ ９１ １１
（ｉｉ）発明の名称：細胞における局在性が改変された免疫ポリペプチドに基づく抗腫瘍組成物
（ｉｉｉ）配列数：２３
（ｉｖ）読み取り可能なコンピューター：
（Ａ）媒体形態：テープ
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換機
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：PatentIn リリース＃1.0、バーション1.25(EPO)

（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２４３個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：タンパク質
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト・パピローマウイルス
（Ｂ）株：ＨＰＶ−１６
（Ｃ）個体／単離物：Ｅ６タンパク質とＦタンパク質の融合シグナル
（ｖｉｉ）直接の起源：
（Ｂ）クローン：Ｅ６^＊ＴＭＦ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１
Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala Val Leu Leu
1 5 10 15

Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Met His Gln Lys
20 25 30

Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys Leu Pro
35 40 45

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu
50 55 60

Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe
65 70 75 80

Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala
85 90 95

Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg
100 105 110

His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn
115 120 125

Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro
130 135 140

Leu Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly
145 150 155 160

Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg
165 170 175

Arg Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ser Ser Thr Ser Ile Val Tyr Ile Leu
180 185 190

Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly Ile Pro Ala Leu Ile Cys
195 200 205

Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys Gly Glu Gln Val Gly Met Ser
210 215 220

Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Val
225 230 235 240

Arg Ser Leu


（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１８５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：タンパク質
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト・パピローマウイルス
（Ｂ）株：ＨＰＶ−１６
（Ｃ）個体／単離物：狂犬病糖タンパク質のＥ７融合シグナル
（ｖｉｉ）直接の起源：
（Ｂ）クローン：Ｅ７^＊ＴＭＲ
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
1 5 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Gly Ser Met His Gly Asp Thr Pro Thr
20 25 30

Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Gln Leu Asn
35 40 45

Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala
50 55 60

Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys
65 70 75 80

Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg
85 90 95

Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile
100 105 110

Cys Ser Gln Lys Pro Arg Ser Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu
115 120 125

Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val
130 135 140

Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu
145 150 155 160

Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser
165 170 175

His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu
180 185

（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ヒト・パピローマウイルス
（Ｂ）株：ＨＰＶ−１６
（Ｃ）個体／単離物：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ５１１８（Ｅ７欠損２１２６）
（ｘｉ）配列の記載：配列番号３
TCTGAGCTGT CATTTAATTG AGTTGTCTCT GGTTGC 36

（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：狂犬病ウイルス
（Ｂ）株：ＨＰＶ−１６
（Ｃ）個体／単離物：突然変異誘発オリゴヌクレオチドｏＴＧ５７４５
（ｘｉ）配列の記載：配列番号４
TGCACTCAGT AATACATAGG ATCCAATAGG GAATTTCCCA AA 42

（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖｉ）起源：
（Ｃ）個体／単離物：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ６３９０
（ｘｉ）配列の記載：配列番号５
GTATCTCCAT GCATGGATCC TGCAGGGTTT CTCTACGT 38

（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖｉ）起源：
（Ｃ）個体／単離物：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ６８８０
（ｘｉ）配列の記載：配列番号６
GGATCCGCCA TGGTAGATCT TGGTTTCTGA GAACAG 36

（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：狂犬病ウイルス
（Ｂ）株：ＨＰＶ−１６
（Ｃ）個体／単離物：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ５３７７（Ｅ６欠損１１１ないし１１５）
（ｘｉ）配列の記載：配列番号７
TGTCCAGATG TCTTTGCAGT GGCTTTTGAC AG 32

（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖｉ）起源：
（Ｂ）株：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０８２９
（ｘｉ）配列の記載：配列番号８
GCGCGCTCTA GAATTATGGG TCTCAAGGTG AACG 34

（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖｉ）起源：
（Ｂ）株：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０８３０
（ｘｉ）配列の記載：配列番号９
CAGTTCTCTT TTGGTGCATG CCCCAATGGA TTTGA 35

（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖｉ）起源：
（Ｂ）株：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０８３５
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１０
ATGCTAGTGC TCGATAAACC CAGCTGGGTT TCTCTACG 38

（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖｉ）起源：
（Ｂ）株：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０８３６
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１１
TCAAATCCAT TGGGGCATGC ACCAAAAGAG AACTG 35

（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３８個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖｉ）起源：
（Ｃ）個体／単離物：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０８３３
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１２
CGTAGAGAAA CCCAGCTGGG TTTATCGAGC ACTAGCAT 38

（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖｉ）起源：
（Ｃ）個体／単離物：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０８３４
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１３
GCGGGCATGC GGTACCTCAG AGCGACCTTA CATAGG 36

（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ワクシニアウイルス
（Ｂ）株：改変型アンカラ
（Ｃ）個体／単離物：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ７６３７（ＰＣＲ領域ＩＩＩ）
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１４
GGGGGGGAAT TCAGTAAACT TGACTAAATC TT 32

（２）配列番号１５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ワクシニアウイルス
（Ｂ）株：改変型アンカラ
（Ｃ）個体／単離物：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ７６３８（ＰＣＲ領域ＩＩＩ）
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１５
GGGGGGGGAT CCGAGCTCAC CAGCCACCGA AAGAGCAAT 39

（２）配列番号１６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ワクシニアウイルス
（Ｂ）株：改変型アンカラ
（Ｃ）個体／単離物：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ７６３５（ＰＣＲ領域ＩＩＩ）
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１６
GGGGGGGGAT CCGGAAAGTT TTATAGGTAG TT 32

（２）配列番号１７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ワクシニアウイルス
（Ｂ）株：改変型アンカラ
（Ｃ）個体／単離物：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ７６３６（ＰＣＲ領域ＩＩＩ）
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１７
GGGGGGGAAT TCTTTGTATT TACGTGAACG 30

（２）配列番号１８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７７個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖｉ）起源：
（Ｂ）株：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０５０２
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１８
AGCTTTTTAT TCTATACTTA AAAAATGAAA ATAAACTCGA GTTGTCAAAG CATCATCTCA 60
ACACTGACTT GAGGTAC 77

（２）配列番号１９の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６９個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖｉ）起源：
（Ｂ）株：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ１０５０３
（ｘｉ）配列の記載：配列番号１９
CTCAAGTCAG TGTTGAGATG ATGCTTTGAC AACTCGAGTT TATTTTCATT TTTTAAGTAT 60
AGAATAAAA 69

（２）配列番号２０の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｖｉ）起源：
（Ｃ）個体／単離物：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ５９２５
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２０
TCAGATCTGT CGAGGGATCT GCAGCTTCTT CTAGAGGTA 39

（２）配列番号２１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４４個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖｉ）起源：
（Ｂ）株：改変型アンカラ
（Ｃ）個体／単離物：合成オリゴヌクレオチドｏＴＧ５９２４
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２１
AGTGAATTGC TGCAGGTACC CGGATCCGCA TCGACTATCG ACAT 44

（２）配列番号２２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（Ｂ）株：ダウジ細胞系統
（Ｃ）個体／単離物：ＰＣＲプライマーｏＴＧ６３５３（クローンニングＢ７．１）
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２２
TCAGCCCCTG AATTCTGCGG ACACTGTTAT ACAGG 35

（２）配列番号２３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３個の塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖
（ｉｉ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（Ｂ）株：ダウジ細胞系統
（Ｃ）個体／単離物：ＰＣＲプライマーｏＴＧ６３５２（クローンニングＢ７．１）
（ｘｉ）配列の記載：配列番号２３
TTGACCCTAA AGATCTGAAG CCATGGGCCA CAC 33

ｐＴＧ８０４２の模式図である。ＢＲＧ３およびＢＲＤ３は、ＭＶＡウイルスの除去領域ＩＩＩのレベルでの挿入が可能な左および右の組換えアームを表す。ｐＴＧ８０４２は、７．５ｋプロモーターによって命令される、麻疹ウイルスＦタンパク質のシグナル配列（ＳＦ）およびトランスメンブラン領域（ＴＭＦ）と融合したＨＰＶ１６ Ｅ６遺伝子を発現させるためのカセット；プロモーターｐＨ５Ｒの制御下に置かれたＩＬ−２遺伝子を発現させるためのカセット；ｐ７．５プロモーターの制御下に置かれた狂犬病糖タンパク質のシグナル配列（ＳＦ）およびトランスメンブラン領域（ＴＭＦ）と融合したＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子を発現させるためのカセットならびにｐ７．５プロモーターの制御下に置かれたｇｕｓＡ遺伝子（ｕｉｄＡ）を発現させるためのカセットを含んでなる。 ベクターｐＴＧ９９３６の模式図である。ＢＲＧ３およびＢＲＤ３は、ＭＶＡゲノムの除去領域ＩＩＩのレベルでの挿入が可能な左および右の組換えアームを表す。ｐＴＧ９９３６は、ｇｐｔマーカー遺伝子の発現を命令するプロモーターｐ４ＢＫ１Ｌ、ＨＰＶ１６ Ｌ２遺伝子の発現を命令するプロモーターｐ４ＢＫ１Ｌ、ＩＬ−２の発現を命令するプロモーターｐＨ５Ｒ、ＨＰＶ１６ Ｌ１遺伝子の発現を命令するプロモーターｐ１１ｋ７．５、狂犬病糖タンパク質のシグナル配列（ＳＦ）およびトランスメンブラン領域（ＴＭＦ）、続いてＩＲＥＳ配列と融合したＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子、ならびに麻疹ウイルスＦタンパク質のシグナル配列（ＳＦ）およびトランスメンブラン領域（ＴＭＦ）と融合したＨＰＶ１６ Ｅ６遺伝子の発現を命令するプロモーターｐ７．５を有する。 ウイルスＭＶＡＴＧ８０４２、ＭＶＡＴＧ６０９０、ＭＶＡＮ３３で、またはＰＢＳによる腫瘍の抗原投与前にワクチン接種した動物の生存率（％）を時間（日）の関数として表すことによって実験Ｎ１２１を図示している。 １０^７、１０^６および１０^５ｐｆｕのウイルスＭＶＡＮ３３またはＭＶＡＴＧ８０４２の投与後の腫瘍を持たない動物の割合（％）を時間（日）の関数として表す（実験Ｎ１２７）。 乱刺法、皮下（ＳＣ）、腹膜内（ＩＰ）または筋肉内（ＩＭ）により、ウイルスＭＶＡＴＧ８０４２でまたは対照ＭＶＡＮ３３で処置した動物の生存率（％）を時間（日）の関数として表すことによって実験Ｎ１３４を図示している。

Claims (39)

1. １以上の免疫ポリペプチドを治療薬または予防薬として含んでなる抗腫瘍組成物であって、少なくとも１種のポリペプチドが、その天然の局在性とは異なる局在性を有するよう改変されていることを特徴とする組成物。
2. ポリペプチドの改変が適当な局在化シグナルの誘導および／または天然の局在化シグナルの欠損または不活性化によって得られる、請求項１記載の抗腫瘍組成物。
3. 天然には膜以外、特に核局在性を有する免疫ポリペプチドが膜局在性を有するよう改変されている、請求項１および２のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。
4. 免疫ポリペプチドが膜付着配列および適当であれば分泌配列の挿入によって改変されている、請求項３記載の抗腫瘍組成物。
5. ポリペプチドがその核局在化配列に関して欠失している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 分泌および／または膜付着配列が、狂犬病糖タンパク質、ＨＩＶウイルスｅｎｖ糖タンパク質および麻疹ウイルスＦタンパク質のものからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。
7. 免疫ポリペプチドが、特にその天然の局在化シグナルの変異／欠損によって細胞質局在性を有するよう改変されている、請求項１、２または５のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。
8. 免疫ポリペプチドが、特定の細胞コンパートメントに局在させることを可能にする配列の、特にそのＣ末端での挿入によって改変されている、請求項１、２または５のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。
9. 免疫ポリペプチドが、特にエンドサイトーシス配列、特に配列ＩＰＮＹＲＮＭの、特にそのＣ末端での挿入によって改変されている、請求項８記載の抗腫瘍組成物。
10. 免疫ポリペプチドが、ゴルジ体の膜における付着を可能にする配列の、特にそのＣ末端での挿入によって改変されている、請求項８記載の抗腫瘍組成物。
11. 免疫ポリペプチドがパピローマウイルス、特にヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６、１８、３１、３３または４５型の初期および／または後期領域に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。
12. 免疫ポリペプチドがパピローマウイルスの初期領域のポリペプチド、特にＥ６またはＥ７に由来する、請求項１１記載の抗腫瘍組成物。
13. 免疫ポリペプチドがパピローマウイルスのＥ６またはＥ７ポリペプチドの非発癌性変異体に由来する、請求項１２記載の抗腫瘍組成物。
14. 免疫ポリペプチドがパピローマウイルスのＬ１またはＬ２ポリペプチドに由来する、請求項１１記載の抗腫瘍組成物。
15. パピローマウイルスの初期ポリペプチド由来の少なくとも１種の免疫ポリペプチドと後期ポリペプチド由来の少なくとも１種の免疫ポリペプチドを含んでなる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。
16. （１）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、
    （２）配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、
    （３）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、および配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、
    （４）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチド、
    （５）配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチド、
    （６）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチド
    を含んでなる、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。
17. 組成物の抗腫瘍作用を増強する少なくとも１種の化合物をさらに含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。
18. 化合物が免疫刺激剤である、請求項１７記載の抗腫瘍組成物。
19. 免疫刺激化合物が、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２および付着分子Ｂ７．１およびＢ７．２からなる群から選択される、請求項１８記載の抗腫瘍組成物。
20. １以上の免疫ポリペプチドをコードする配列を含んでなる少なくとも１種の組換えベクター、その天然の局在性とは異なる局在性を有するよう改変されている少なくとも１種のポリペプチド、および所望によりその組成物の抗腫瘍作用を増強する化合物を、治療薬または予防薬として含んでなる抗腫瘍組成物。
21. 抗腫瘍作用を増強する免疫ポリペプチドが請求項１〜１９のいずれか一項に記載の特徴を有する、請求項２０記載の抗腫瘍組成物。
22. 組換えベクターがポックスウイルス、特にワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルスおよび鶏痘ウイルスに由来する、請求項２０記載の抗腫瘍組成物。
23. 組換えウイルスが、コペンハーゲン、ワイエスおよび改変型アンカラ（ＭＶＡ）株から選択されるワクシニアウイルスに由来する、請求項２２記載の抗腫瘍組成物。
24. 組換えウイルスがワクシニアウイルスのコペンハーゲン株に由来し、かつ、そのポリペプチドをコードする配列がそのワクシニアウイルスのＴＫおよび／またはＫ１Ｌのレベルで挿入されている、請求項２３記載の抗腫瘍組成物。
25. 組換えウイルスがワクシニアウイルスのＭＶＡ株に由来し、かつ、そのポリペプチドをコードする配列がそのワクシニアウイルスの除去領域Ｉ〜ＶＩ、特にＩＩおよび／またはＩＩＩのうち少なくとも１つのレベルで挿入されている、請求項２３記載の抗腫瘍組成物。
26. そのポリペプチドをコードする配列が、ワクシニアウイルス遺伝子のプロモーター、特にチミジンキナーゼ（ＴＫ）、７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ ｐ２８、ｐ１１およびＫ１Ｌ遺伝子のプロモーターから選択されるプロモーターの制御下に置かれている、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。
27. パピローマウイルス感染または腫瘍の治療または予防を意図した、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物であって、
    （１）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチドをコードする配列、
    （２）配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチドをコードする配列、
    （３）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、および配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチドをコードする配列、
    （４）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチドをコードする配列、
    （５）配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチドをコードする配列、
    （６）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチドをコードする配列
    が挿入されたワクシニアウイルスのコペンハーゲンまたはＭＶＡ株に由来する少なくとも１種の組換えベクターを含んでなる組成物。
28. 好ましくはＩＬ−２またはＢ７．１から選択される免疫刺激化合物をコードする配列をさらに含んでなる、請求項２７記載の抗腫瘍組成物。
29. 組換えベクターが生きている、または殺されている、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。
30. ヒトまたは動物への注射によりその投与が可能となる医薬上許容される担体を含んでなる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物。
31. パピローマウイルスの初期および／または後期領域に由来して請求項１１〜１６で定義された特徴を有する免疫ポリペプチドをコードする、少なくとも１つの配列を含んでなる組換えベクター。
32. 注目されるポリペプチド、特に免疫ポリペプチドおよび／または免疫刺激ポリペプチドをコードする１以上の配列をさらに含んでなる、請求項３１記載の組換えベクター。
33. プラスミドまたはウイルスベクター、特にポックスウイルス、特にワクシニアウイルスのコペンハーゲンまたはＭＶＡ株に由来する、請求項３１または３２記載の組換えベクター。
34. （１）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチドをコードする配列、
    （２）配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチドをコードする配列、
    （３）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、および配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチドをコードする配列、
    （４）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチドをコードする配列、
    （５）配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチドをコードする配列、
    （６）配列番号１で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、配列番号２で示されるものの総てまたは一部と相同または同一の配列を有する免疫ポリペプチド、パピローマウイルスのタンパク質Ｌ１由来の免疫ポリペプチド、および／またはパピローマウイルスのタンパク質Ｌ２由来の免疫ポリペプチドをコードする配列
    が挿入されたワクシニアウイルスのコペンハーゲンまたはＭＶＡ株に由来する、請求項３３記載の組換えベクター。
35. 請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の組換えベクターを含んでなるウイルス粒子。
36. 免疫ポリペプチドがそのウイルス粒子を取り巻くタンパク質構造に付着されている、請求項３５記載のウイルス粒子。
37. 癌もしくは腫瘍の治療もしくは予防を意図した医薬を製造するための、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗腫瘍組成物、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の組換えベクター、または請求項３５もしくは３６記載のウイルス粒子の使用。
38. 子宮頸部癌、軽度子宮頸部形成異常およびパピローマウイルス感染の治療または予防を意図した医薬を製造するための、請求項３７記載の使用。
39. 筋肉内経路により注射可能な医薬を製造するための、請求項３７または３８記載の使用。

Images